Escuela Militar de Ingeniera Mariscal Sucre.

Unidad Acadmica La Paz

Departamento de Ingeniera Ambiental. Carrera de Ingeniera Ambiental.
Ctedra de Microbiologa. Trabajo de Investigacin Semestral, Feb. - J un. 2014. T 000 008
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AISLIAMIENTO E IDENTIFIACION DE HONGOS MICORRIZICOS
OBTENIDOS DE PLANTAS DE TREBOL PARA LA FERTILIZACION DE LOS
CULTIVOS EN LEGUMINOSAS

Tavera Valverde Lorena
1
, Helguero Crdenas Geraldine
2
, Ortiz Ramos Andrea
3
, Torres Barba Nickole
4
, Fernndez
Bejarano Madeline
5




RESUMEN

Las micorrizas representan las asociaciones simbiticas entre las plantas y hongos basada
sobre el intercambio de metabolitos y nutrientes. Ms del 95 % de las plantas embriofitas
son capaces de formas simbiosis con micorrizas. Tanto los hongos como las plantas tienen
distribucin universal, presentndose de esta manera ecotipos adaptados a condiciones
diversas y extremas. Es de sealar que las plantas y las micorrizas tienen un origen comn.
Las micorrizas arbusculares estn ampliamente distribuidas en condiciones naturales, se
encuentran en todos los continentes, excepto en la Antrtida; se dan en todos los suelos,
incluyendo los de minas abandonadas, suelos agrcolas, suelos de pantanos y en hbitat
acuticos. Los suelos poseen naturalmente una diversidad de especies de micorrizas, que
pueden colonizar las races de la mayora de las plantas cultivadas, independientemente de
las condiciones ambientales, mejorando as el suministro de nutrientes, crecimiento y
produccin de las plantas hospederas especialmente en condiciones de nutrientes
deficientes.
Palabras claves: micorrizas, sostenibilidad, ecosistema, pastura.

ABSTRAC

Mycorrhizae represent symbiotic associations between plants and fungi based on the
exchange of metabolites and nutrients. Over 95% of embriofitas plants are capable of
forming with mycorrhizal symbiosis. Both plants and fungi occur worldwide, thus
presenting ecotypes adapted to different conditions and extreme. It is noteworthy that the
mycorrhizal and plants have a common origin. Arbuscular mycorrhizas are widespread in
natural conditions, are found in every continent except Antarctica, occur in all soils,
including abandoned mines, agricultural soils, wetland soils and aquatic habitats. Soils
naturally possess a diversity of mycorrhizal species that can colonize the roots of most crop
plants, regardless of environmental conditions, thereby improving nutrient supply, growth
and production of host plants especially in poor nutrient conditions.
Key words: mycorrhizae, sustainability, ecosystem, grazing.


Introduccin

La micorriza es una asociacin constituida por
un conjunto de hifas fngicas (micelio) que, al
entrar en contacto con las races de las plantas,
las pueden envolver formando un manto y
penetrarlas intercelularmente a travs de las
clulas del crtex, como en el caso de la
ectomicorriza o, como en el caso de la micorriza
arbuscular, penetran la raz, pero no se forma
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ningn manto. Al mismo tiempo, las hifas se
ramifican en el suelo, formando una extensa red
de hifas capaz de interconectar,
subterrneamente, a las races de plantas de la
misma o de diferentes especies. Esta red de
micelio permite, bajo ciertas condiciones, un
libre flujo de nutrimentos hacia las plantas
hospederas y entre las races de las plantas
interconectadas, lo que sugiere que la micorriza
establece una gran unin bajo el suelo entre
plantas que, a simple vista, podran parecer
lejanas y sin ninguna relacin. As, la micorriza
ofrece a la planta hospedera y al ecosistema,
diferentes beneficios en trminos de
sobrevivencia y funcionamiento. (Perez, 2009)

El trmino micorriza fue acuado por Frank,
patlogo forestal alemn, en 1877, al estudiar
las races de algunos rboles forestales. Para
1900, el botnico francs Bernard resalt su
importancia al estudiar las orqudeas. Trappe
(1994) define a las micorrizas en trminos
funcionales y estructurales, como rganos de
absorcin dobles que se forman cuando los
hongos simbiontes viven dentro de los rganos
de absorcin sanos (races, rizomas o talos) de
las plantas terrestres, acuticas o epfitas. En
esta asociacin, la planta le proporciona al
hongo carbohidratos (azcares, producto de su
fotosntesis) y un microhbitat para completar
su ciclo de vida; mientras que el hongo, a su
vez, le permite a la planta una mejor captacin
de agua y nutrimentos minerales con baja
disponibilidad en el suelo (principalmente
fsforo), as como defensas contra patgenos.
Ambos, hongo y planta, salen mutuamente
beneficiados, por lo que la asociacin se
considera como un mutualismo. Evidencias
fsiles y estudios moleculares sugieren que la
asociacin micorrcica se origin hace A.C.
462-353 millones de aos y, desde entonces, su
formacin es indispensable para el xito
ecolgico de la mayora de las plantas sobre la
Tierra.

Esta asociacin se presenta en aproximadamente
el 90% de las plantas, por lo que se ubica en
todos los ecosistemas del mundo y, por lo tanto,
en diferentes gradientes latitudinales. Adems,
es importante destacar que existen hongos que
pueden encontrarse en varios tipos de suelo y
climas, teniendo un patrn de distribucin
mundial, el cual indica que estn,
aparentemente, adaptados a diversos hbitats;
no obstante, los factores fsicos y qumicos del
suelo pueden restringir su distribucin (Read,
1991; Finlay, 2008), por lo que las asociaciones
micorrcicas pueden considerarse cosmopolitas
y generalistas. Sin embargo, dependiendo del
ambiente y las especies interactuates, los
participantes pueden ser facultativos u obligados
(Finlay, 2008). Por ejemplo, en Mxico se han
reportado en todos los ecosistemas. Los
encontramos desde las dunas en las lneas
costeras, hasta ambientes secos, como los
desiertos o los muy hmedos como las selvas
lluviosas, as como en los bosques de conferas.

Se pueden distinguir tres grupos fundamentales
segn la estructura de la micorriza formada:
Ectomicorrizas o formadoras de manto;
Ectendomicorrizas, que incluye Arbutoides y
Monotropoides; y las Endomicorrizas,
caracterizadas por la colonizacin intracelular
del hongo, y que a su vez se subdividen en
Ericoides, Orquidoides y Arbusculares (Read,
1999).
A continuacin se caracterizan cada uno de los
tipos de micorrizas:

- Ectomicorrizas:
Se caracterizan porque desarrollan una espesa
capa de micelio sobre la zona cortical de las
races absorbentes de la planta las hifas del
hongo no penetran en el interior de las clulas
de la raz, si no que se ubican sobre y entre las
separaciones de stas. Se pueden observar a
simple vista. Este tipo de micorrizacin
predomina entre los rboles de zonas templadas,
se producen principalmente sobre especies
forestales y leosos, siendo especialmente
caracterstico en hayas, robles, eucaliptus y
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pinos. Los hongos que la forman son tanto
Basidiomycota como Ascomycota.
- Endomicorrizas:
Los hongos que las producen se caracterizan
por colonizar intracelularmente el crtex radical
o sea que no hay manto externo que pueda verse
a simple vista. Las hifas se introducen
inicialmente entre las clulas de la raz, pero
luego penetran en el interior de stas, formando
vesculas alimenticias y arbsculos. Por ello este
grupo se las conoce tambin como micorrizas
vesculo-arbusculares (MVA) los cuales
constituyen la simbiosis ms extendida sobre el
planeta. Los hongos que la forman pertenecen a
la divisin Glomeromycota y se dan en todo
tipo de plantas, aunque predominan en hierbas y
gramneas.

Abundan en suelos pobres como los de las
praderas y estepas, la alta montaa y las selvas
tropicales. En el bosque atlntico aparecen junto
a las ectomicorrizas.

Los beneficios en el medio natural, la micorriza
no se trata simplemente de una interaccin entre
la raz de una planta y una especie de hongo en
particular, sino de una comunidad muy
compleja formada por diferentes especies de
hongos y la raz de una planta. Esta asociacin
se define como un continuo mutualismo-
parasitismo; es decir, se analiza desde una
perspectiva de costo-beneficio,
correlacionado con el estado de desarrollo, tanto
de la planta como del (los) hongo (s)
involucrado (s), y con las condiciones
ambientales y edficas, as como con factores de
reconocimiento gentico mutuo (Johnson et al.,
1997). Actualmente, se considera que los
hongos micorrizgenos (HM) fueron cruciales
para que las plantas pudieran colonizar el medio
terrestre y responder adecuadamente a las
condiciones ambientales cambiantes (Smith y
Read, 1998).
La funcin principal de la micorriza es
facilitarle a la planta la adquisicin y absorcin
de agua, fsforo y nitrgeno, principalmente;
sin embargo, esta asociacin proporciona otros
beneficios a las plantas, entre los que destacan:
la proteccin ante el ataque de parsitos, hongos
patgenos y nemtodos, el aumento de su
resistencia a la herbvora, influyendo en la
produccin de sustancias defensivas por parte
de la misma planta, la limitacin de la absorcin
de metales pesados txicos como el zinc y el
cadmio que son alojados en sus hifas, aumento
del rea de exploracin de la raz, lo que
incrementa el flujo de agua del suelo a la planta
(ver revisiones hechas por Camargo- Ricalde,
1999; 2001; 2002); adems de mejorar las
propiedades fsicas y qumicas del suelo
mediante el enriquecimiento de materia
orgnica y la formacin de agregados por medio
de la adhesin de partculas debida a una
protena exudada por el micelio, la glomalina,
contribuyendo a darle estructura y estabilidad al
suelo, lo que reduce su erosin y mejora su
capacidad de retencin de agua (Guadarrama et
al., 2004; Finlay, 2008).
Las especies vegetales que forman micorrizas
presentan una fisiologa y una ecologa
diferentes de aqullas que no forman esta
asociacin y se considera a la asociacin
micorrcica como uno de los factores
promotores de la diversidad vegetal, al aumentar
la adecuacin de las plantas (supervivencia,
crecimiento y reproduccin) y facilitar su
establecimiento, incluso bajo condiciones de
estrs ambiental, lo cual tiene un impacto
positivo en la diversidad de plantas, tanto a una
escala poblacional como de las comunidades
vegetales (Van der Heijden, 2002).
Adems, como parte de la cadena trfica, las
hifas de estos hongos son consumidas por la
fauna del suelo, como los nemtodos y los
microartrpodos. Asimismo, las hifas
constituyen una parte importante de la biomasa
del suelo y son un importante sumidero de
carbono, ya que los hongos micorrizgenos
asociados a las especies vegetales reciben entre
el 57% y 90% del carbono de los rboles, y
llegan a representar hasta el 50% de la biomasa
microbiana total del suelo (Olsson et al., 1999).
Existen estudios que reportan que la micorriza
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genera una extensa red de micelio externo que
explora el suelo en la bsqueda de recursos (por
ejemplo nutrimentos y agua) e interconecta a las
races de plantas de la misma especie e, incluso,
de especies diferentes (Simard y Durall, 2004).
Usando tcnicas isotpicas para marcar el
carbono (C14), estos estudios han demostrado
que las plantas interconectadas por la red
micorrcica pueden transferir carbono entre ellas
(Simard et al., 1997; Finlay, 2008; Smith y
Read, 1998).

Igualmente, ante los problemas ambientales y
ecolgicos que enfrentamos hoy en da, la
asociacin micorrcica nos ofrece mltiples
beneficios, debido a que las plantas
micorrizadas, ya sean de inters agrcola o
forestal, son ms resistentes a condiciones
ambientales adversas, como: la falta de agua y
de nutrimentos esenciales, y el ataque de
microorganismos fitopatgenos o plagas,
adems de estimular un mayor crecimiento
(biomasa) y una mejor adecuacin (Finlay,
2008; Smith y Read, 1998).
Actualmente, la asociacin micorrcica se
considera fundamental en las prcticas
agrosilvopastoriles sostenibles y en los
programas de restauracin ambiental, ya que
aumenta sus posibilidades de xito.


En cuanto a la fertilizacin nitrogenada, un
suelo altamente poblado de actividad biolgica
mantiene mejor la humedad, reduciendo tanto
evapotranspiraciones como lixiviaciones. Desde
este punto de vista estamos ya reduciendo la
prdida de nitratos del suelo.
Pero, la micorriza tambin consume nitrgeno
para realizar sus actividades biolgicas y lo
almacena en las vesculas antes mencionadas
producindose el mismo fenmeno de digestin
por parte de la planta. De esta forma
garantizamos que una mayor parte de nitrgeno,
no se mueva con las corrientes subterrneas de
agua y permanezca el mayor tiempo posible en
el estrato de suelo que sirve de soporte a
nuestros cultivos.
Por ltimo, la alta capacidad de movilidad de
nutrientes dentro de las hifas y la alta extensin
de suelo colonizada por las hifas de las
micorrizas, hace posible que los nutrientes
discurran desde superficies con mayor
contenido en algn nutriente se equiparen con el
resto. Alejandro Prez
(alejandro.agracon@nolaboreo.es)

Por el presente trabajo se hizo el aislamiento e
identificacin de hongos micorrizicos con el fin
de contribuir a la fertilidad para la produccin
de cultivos de leguminosas.

Materiales y mtodos

rea de estudio

Trboles obtenidos del mercado Rodrguez,
sembrados en el invernadero de Aranjuez.

Mtodos
- Toma de muestras
Se tom la muestra en forma selectiva simple,
se escogi una planta de trbol del genero
Trifolium obtenida del mercado Rodrguez. Le
la puso en una bolsa hasta ser transportada al
laboratorio.
- Aislacin del hongo
Una vez en el laboratorio se procedi a separar
las races de la tierra, se las lavo con abundante
agua para extraer los restos de tierra, se cortaron
las races en segmentos de 2 cm. Se observaron
los segmentos de las races en el estreo
microscopio LABOMED en condiciones
estriles para evitar contaminacin, se
identificaron los pelotones de hongos
micorrizicos y se procedi a cortar el segmento
identificado. Los pelotones fueron trasferidos a
la cmara de flujo laminar LABCONGO clase
II.
Los hongos micorrizicos fueron aislados usando
el mtodo de Masuhara y Katsuya. Los
segmentos de las races fueron tratadas con una
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solucin de hipoclorito de sodio (NaOHCl) al
5% para su esterilizacin. Despus de mezclar
durante 5 minutos, fueron enjuagadas tres veces
en agua destilada estril (H
2
O
2
). Se sembraron
las races en el medio de cultivo Papa Dextrosa
Agar (PDA), se incubaron las muestras en la
oscuridad a 35C en el Pupinel Shel Lab durante
3 das en el Laboratorio de la Escuela Militar de
Ingeniera CICYT.
- Identificacin del hongo
Una vez pasado los 3 das se procedi a tomar
muestras de las colonias de hongos en
crecimiento; se tom con un aza bacteriolgica
una pequea cantidad de muestra y se esparci
en un porta objetos con una gota de agua
destilada, se lo en el microscopio, y se identific
el hongo micorrizico.

RESULTADOS
En los resultados obtenidos, se observaron,
diferentes muestras extradas de esta colonia en
la cual se pudieron determinar caractersticas
morfolgicas tales como:



DISCUSIONES


RECOMENDACIONES Y SUGERENCIAS

Para la realizacin de este trabajo se recomienda
trabajar en un rea de completa esterilizacin y
con el material previamente auto clavado,
adems de contar con los reactivos indicados.
Se recomienda contar con una balanza analtica
calibrada.
La manipulacin de las muestras se debe
realizar con sumo cuidado y precisin.
Se debe contar con todo el material personal
requerido de proteccin para evitar accidentes y
la contaminacin de la muestra.
Al momento de la preparacin del medio de
cultivo se debe ser preciso en las cantidades
requeridas.

PROPUESTA

Con este trabajo buscamos un mtodo efectivo
de fertilidad que pueda ser aplicable en cultivos
de leguminosas, para evitar el uso de
fertilizantes qumicos que daan la estructura
gentica de las plantas y los suelos.
Este consiste en la extraccin de las micorrizas
para realizar un concentrado de hongos
nitrificantes, con la finalidad de que estos
cultivos sean regados con este concentrado, y
puedan contribuir a un mejor desarrollo de los
cultivos.

CONCLUSIONES
Con el trabajo realizado se pudo hacer el
aislamiento requerido de la microrriza y su
identificacin, siendo esta una endomicorriza,
que crece dentro de la raz de las plantas,
generando una simbiosis funcional, beneficiosa
para ambos

BIBLIOGRAFIA

Revista Digital Universitaria
Sara Luca Camargo-Ricalde, No Manuel
Montao, Claudia Janette De la Rosa-Mera y
Susana Adriana Montao Arias.
MICORRIZAS: UNA GRAN UNIN
DEBAJO DEL SUELO. julio 2012 Volumen
13 Nmero 7

Carolina Kalinhoff, et al. 2009 CAMBIO EN LA
BIOMASA DE RAICES Y MICORRIZAS
ARBUSCULARES EN CULTIVOS
ITINERANTES DEL AMAZONAS VENEZOLAN
Rev. Inteligencia. Venezuela. (agosto) Vol 34
N8

Pornpimon Athipunykom et al. 2004
ISOLATION AND IDENTIFICATION OF
MYCORRHIZAL FUNGI FROM ELEVEN
TERRESTRIAL ORCHIDS. Rev. Kasetsart
university. Bangkok, thailand. (junio)

Leonor Carrillo 2003. MICROBIOLOGIA
AGRICOLA
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ANEXOS
- Medio de cultivo papa dextrosa
Para la realizacin de este medio se procedi a
pelar 200 gramos de papas, se las hervido hasta
cocinarlas en el ay realizamos los clculos
necesarios para la preparacin de 8 cajas Petri.

Una vez realizada esta operacin debemos
ponerlas en agua destilada y hacerlas coser en el
agitador de placa a mayor potencia para
apresurar su coccin, cuando se empiezan a
deshacer se vaca el lquido en una botella de
vidrio de 500ml para su auto clavado una vez
mesclado el agar y la dextrosa, se las mezcla
evitando que se formen grumos. Una vez
esperado el tiempo del auto clavado se procede
a vaciar los medios de cultivo a las cajas Petri.
- Medio de cultivo de agar nutritivo y
EMB
Para preparar este agar se debe pesar la cantidad
requerida para el numero de cajas Petri que se
va a utilizar, se pesa el agar y se afora segn el
volumen de los clculos en un una botella
esterilizada que luego se llevara a calentar en el
auto clave, una vez que estos estn bien diluidos
se procede a vaciarlo en las cajas Petri. Se deja
solidificar el agar.

EMB = 37,5gramos por litro
Cajas Petri = 5 x 20 ml

Se usa el agar nutritivo, ya que la mayora de los
microorganismos, pueden desarrollarse sin
problemas en el medio y el agar EMB se utiliza
mayormente para detectar si la muestra sufre de
alguna contaminacin por materia fecal.

- Siembra de muestras

SOLO MENCIONAR EL METODO DEL
CARGADO NOMBRE Y CITA
BIBLIOGRAFICA
Para el sembrado de muestras se utilizaron las
siguientes formas:
- Inundacin
Se pesaron las races y se procedi a molerlas en
el mortero, luego estas se diluyeron en un
matraz de 50 ml con agua destilada, de esta
mezcla se sac 3 ml y se realiz tres diluciones
de 1/10, de la ltima se tom 0,1 y se sembr
en la caja Petri. Este procedimiento se repiti
para las cajas que contenan agar EMB.
- Cargado
Se lavan muy bien las races con agua del grifo
y se las enjuaga por ltima vez con agua
destilada, previniendo que toda la tierra salga de
la muestra.
Se corta en pequeos pedazos y se los pone en
agua destilada, una vez que todo est listo se
prosigue a sembrar las muestras con el mtodo
de cargado, lo cual hace referencia a que se
colocaran en la superficie de la caja Petri que
tiene el agar nutritivo.

- Aislamiento de las posibles colonias

Una vez que ya identificamos las colonias
posibles se prosigue a sembrar con el aza
bacteriolgica en nuevas cajas Petri que
contienen el medio de cultivo del agar nutritivo,
los cuales una vez que ya tengan las colonias
crecidas se proceder a realizar la tincin de
Gram.
- Tincin Gram

A cada porta objetos limpio, se pone una gota
de agua destilada y se seca en el mechero. Con
el aza bacteriolgica tomamos la muestra y la
esparcimos en el porta objetos. Se tie la
muestra del porta objetos de la siguiente:
1. Violeta de Genciana. 3 gotas y se espera
por 1 min y luego se enjuaga con agua destilada.
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2. Lugol 3 gotas por 30 seg y se lo enjuaga
con el decolorante.
3. Safranina. 3 gotas y espera 1 min, luego
se enjuaga con agua y se seca con el mechero,
teniendo cuidado de no quemar la muestra.
Luego de realizar el procedimiento anterior se
procede a observar por el microscopio y ver los
resultados, segn los colores:
Gram positivos= rosados a rojo
Gram negativo= violeta, azulado.

- Tincion con tinta china
Seleccionar races menores a 1mm. Lavarlas
con agua para sacar la tierra. Se colocan en un
vaso de precipitado y se ponen en KOH al 10%
y se lleva a bao Mara durante 30 minutos. Se
sacan y lavan con agua oxigenada al 10%, se
retir inmediatamente y se enjuagaron con agua
destilada.
Se colocaron las races en un vaso de
precipitado limpio y se cubrieron con una
solucin de tinta china al 5% y cido actico al
5%, se colocaron las races en bao mara
durante 20 min, dejar enfriar, luego se destien
con 3 lavados de agua corriente acidificadas con
gotas de cido actico. Para una observacin
ms clara.