Biotecnologa y ADN recombinante

Tcnicas de Ingeniera Gentica

Enzimas que cortan el ADN en secuencias especficas
(palindrmicas)
Herramientas 1 : Enzimas de restriccin
Enzimas de restriccin
Organism
Enzyme
designation
Recognition
sequence
Escherichia coli EcoRI G AATTC
Escherichia coli EcoRII CCAGG
Haemophilus
influenzae
HindII
GTPPy
PuAC
Haemophilus
hemolyticus
HhaI GCG C
Bacillus subtilus BsuRI G CC
Brevibacterium
albidum
BaII TGG CCA
Thermus aquaticus Taql T CGA
Enzimas de restriccin
Electroforesis en gel de agarosa
Extraccin de la clula (in vivo)

Extraccin de un gel (in vitro)

PCR (sinttico)

Herramientas 2 : Obtencin de ADN
Extraccin y purificacin del ADN
1. ADN monocatenario

2. Unir a filtro de nitrocelulosa

3. Aadir una sonda monocatenaria marcada

4. Lavar para quitar el ADN no hibridado

5. Deteccin de la hibridacin
Herramientas 3: Hibridacin de cidos nucleicos
Hibridacin de cidos nucleicos
Obtencin de la secuencia de los cidos nucleicos
Herramientas 4: Secuenciacin
Amplificacin del ADN: reaccin en cadena de la
polimerasa
ITS : 5 TGC GGC TGG ATC ACC TCC TT 3
5 CCG GGT TTC CCC ATT CGG 3
Herramientas 5: PCR
Clonacin molecular

Incluye el aislamiento, purificacin y replicacin
de fragmentos especficos de ADN.

Implica crear ADN recombinante, e introducirlo en
una clula hospedadora en dnde se replicar.

Pasos en la clonacin:
1. Aislar y fragmentar el ADN
2. Unir el ADN a un vector de clonacin
3. Incorporar el ADN dentro del husped
4. Detectar y purificar el clon deseado
5. Replicar el clon muchas veces
Pasos en la clonacin:
1. Aislar y fragmentar el ADN :
extraccin del ADN
corte con enzimas de restriccin
Pasos en la clonacin:
1. Aislar y fragmentar el ADN
2. Unir el ADN a un vector de clonacin
Plsmidos como vectores de clonacin
Pequeo tamao: fciles para manipular y aislar
Circular (ms estables)
Replicacin independiente de la clula husped
Pueden existir varias copias por clula
Presencia de marcadores seleccionables (resistencia a
antibiticos)
Plsmidos como vectores de clonacin
Fagos como vectores de clonacin:
Fago (transduccin especializada)
Fagos como vectores de clonacin
Pasos en la clonacin:
1. Aislar y fragmentar el ADN
2. Unir el ADN a un vector de clonacin
3. Incorporar el ADN dentro del husped:
utilizar los mecanismos de gentica in
vivo ( transformacin conjugacin,
transduccin)
Fagos incorporacin al husped
Hospedadores para vectores de clonacin
Caractersticas:
crecimiento rpido
crecimiento en medio de cultivo barato
no daino ni patgeno
estable (genticamente) en el cultivo
Procariotas: Escherichia coli, Bacillus subtilis

Eucariotas: Saccharomyces cereviciae
Pasos en la clonacin:
1. Aislar y fragmentar el ADN
2. Unir el ADN a un vector de clonacin
3. Incorporar el ADN dentro del husped
4. Detectar y purificar el clon deseado:
marcador molecular (antibitico),
hibridacin, PCR....

Deteccin del Clon deseado
Deteccin:
En el vector de clonacin:
marcadores moleculares:
resistencia a los antibiticos
gen lacZ, galactosidasa

Biotecnologa: uso de organismos vivos para llevar a
cabo procesos qumicos definidos destinados a la
aplicacin industrial o comercial.



Ingeniera Gentica: procedimientos para el
aislamiento, manipulacin, secuenciacin y expresin
del material gentico.

Biotecnologa industrial: fermentaciones microbianas
Productos farmacuticos,
Productos alimenticios
Bioqumicos
Bioplsticos y biopolmeros
Biotecnologa en industria textil
Enzimas en aplicaciones industriales
Aumento de la recuperacin de petrleo por
microorganismos (Microbial Enhanced Oil Recovery:
MEOR
Aplicaciones prcticas de la Ingeniera gentica
Medicina
Sistemas diagnsticos de deteccin de enfermedades
Vacunas de virus (Hepatitis B, Sarampin, Rabia)
Protenas de mamferos (Insulina, Hormona de crecimiento)
Terapia gnica
Aplicaciones prcticas de la Ingeniera gentica
Biotecnologa agrcola

Vegetales y animales transgnicos:

Resistencia a herbicidas (glifosato) (soja)
Resistencia a los insectos (Bt) (maz)
Resistencia a virus (mosaico del tabaco)
Tomates Larga vida
Dolly Pampa.
Aplicaciones prcticas de la Ingeniera gentica
Biotecnologa ambiental

Biorremediacin
Biosensores
Bioenerga
Bioetanol
Biodiesel
Biogas
Lixiviacin microbiana
Biolixiviado
Biooxidacin
Aplicaciones prcticas de la Ingeniera gentica
Plantas transgnicas:

Mtodos de incorporacin del ADN :


1. Can de partculas (biobalstica)
2. Agrobacterium tumefasciens


Biotecnologa Agrcola
Inyeccin mecnica del ADN
Agrobacterium tumefasciens:
Bacilo Gram negativo
Habita los suelos
Produce tumores cancerosos en el punto
de infeccin
Las clulas de la planta producen opinas
Tumor: es el resultado de la insercin de
un plsmido (linear) en el genoma de las
clulas de las plantas
Plsmido Ti : (Tumor inducing DNA), 2 partes

1. Ti-T-ADN (integrado en el Ti)
2. Genes vir (35kb)