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UNIVERSIDAD CATOLICA DE SANTA MARIA

FACULTAD DE CIENCIAS FARMACEUTICAS, BIOQUIMICAS Y
BIOTECNOLOGICAS
PROGRAMA PROFECIONAL DE BIOTECNOLOGIA

CURSO:
PRACTICAS DE INGENIERIA GENETICA I
TEMA:
DEGRADACION Y SINTESIS DE ACIDOS NULEICOS
FECHA DE ENTREGA: 21/10/2014
CODIGO: 2011200822
ALUMNO:
CARDENAS HURTADO, ROSMERY
SEMESTRE: VI-PAR
AREQUIPA - PER
2014



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PR CTIC N 6
DEGRDCI N Y SI NTESIS DE CIDS NUCLEICS
OBJETIVO 1

Evaluar el mtodo de degradacin qumica de los cidos nucleicos.

MARCO TERICO 2

In Vivo, las sntesis y degradacin de los cidos nucleicos constituye su metabolismo. In
vitro se degradan y sintetizan cidos nucleicos controladamente con el fin de purificar o
manipular determinadas clases de molculas que se utilizarn como base en
experimentos complejos de Ingeniera gentica.

La degradacin de los cidos nucleicos puede ser qumica o enzimtica. La degradacin
qumica de los cidos nucleicos se produce a pH muy bajos, produciendo la rotura de los
grupos fosfodister, rompindose los enlaces N-glucoslicos entre las bases y azcares,
este tipo de degradacin se utiliza cuando se quiere determinar la composicin de la
bases de un cido nucleico.

A pH 4 aproximadamente se produce una depurinizacin, afectando ms a la molcula
del ADN que a la ARN. A pH neutro se invierte la tendencia y el ADN se hace unas 200
veces ms resistente a la hidrlisis que el ARN; a pH an ms alto el ADN es
prcticamente resistente a la hidrlisis, pero no as el ARN que a pH 11 y 37 C se
hidroliza totalmente en pocos minutos a una mezcla de nucletidos 3 y 2.

Tambin existe la degradacin enzimtica mediante enzimas denominas nucleasas si
actan a partir de los extremos (exonucleasas) o dentro de la cadena (endonucleasas).

El proceso inverso denominado Sntesis se realiza a partir de la enzima denominada
ADN polimerasa, esta permite sintetizar el ADN in vivo como in vitro.

MATERIALES 3
3.1 Obtencin de ADN (Scharomyces cerevisiae)
3.1.1 Reactivos
Cultivo de levadura en medio YPD
Fenol-cloroformo
Buffer TE
Perlas de vidrio pequeas
Buffer STES
Acetato de sodio 3M
Etanol absoluto
Etanol de 70 %
3.1.2 Materiales de laboratorio
Tubos ependorf
Bageta


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3.1.3 Equipos
Centrifuga
Congelador
Vrtex
3.2 Electroforesis
3.2.1 Reactivos
Agarosa 0.45 gr
Buffer TAE 1X
Bromuro de etidio
Loding buffer
3.2.2 Materiales de laboratorio
Micropipetas 20 L
Puntas de Micropipetas
3.2.3 Equipos
Cmara de electroforesis horizontal
Fuente de poder
3.3 Obtencin de ADN (hgado de pollo)
3.3.1 Reactivos
Hgado de pollo
Agua destilada
SDS 10%
ClNa 2M
Alcohol 96% frio
Buffer TE
3.3.2 Materiales de laboratorio
Micropipetas
Gasa
Mortero
Beaker
Bageta
3.4 Degradacin de acido nucleicos
PBS pH 1
PBS pH 4
PBS pH 7
DNA extrado
Gel de agarosa

PROCEDIMIENTO 4
4.1 Extraccin de ADN (levadura)

Se extrajo en dos tubos ependorf 1.5 ml de cultivo YPD



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Se centrifugo a 13000 RPM por 1 min a temperatura ambiente.



Se removi el sobrenadante, se resuspendi en 50l buffer STES luego se agreg 20L
buffer TE y micro perlas se mezclo y se agreg 60 L de fenol-cloroformo y se llevo al
vortex fuerte por 3 min.




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Centrifugar a 13000RPM por 5 min a temperatura ambiente luego extraer la fase acuosa y
colocarla en otro tubo ependorf aadir 1/10 de volumen de acetato de sodio 3M y 2
volmenes de etanol absoluto luego agitar suavemente en el Vrtex





Dejar reposar por 15 min y centrifugar 13000RPM por 10 min a 4 C, luego eliminar el
sobrenadante y quedarse solo con el pellet, re suspender suavemente 100L etanol 70%
luego nuevamente centrifugar por 2 min a 4 C y eliminar suavemente la solucin y dejar
secar para luego re suspenderlo con 40 ml de buffer TE







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4.2 Electroforesis:
Preparacin de AGAROSA



Se coloca 18L de muestra + 2L de loding buffer (buffer de carga)

Incubar por 15 min en bromuro de etidio (buffer de electroforesis) y luego se observa en el
cuarto oscuro.





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4.1 Obtencin de ADN (hgado de pollo)
Triturar el hgado de pollo aadiendo 50 ml de agua destilada luego filtrar con la ayuda de gasa
varias veces

Aadir 1 ml de SDS 10% + un volumen de ClNa 2M



Aadir 50 ml de alcohol 96% frio por las paredes del beaker y luego aadir buffer TE








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4.2 Degradacion de acidos nucleicos



A B C
DNA 100L 100L 100L
PBS pH 1 100L - -
PBS pH 4 - 100L -
PBS pH 7 - - 100L











A B
C


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CUESTINRI PRCTIC N 7
Describa los diferentes tipos de secuencializacion que existe 1
En los dos casos, la secuencia de la molcula se determina por diferencias en los tamaos de los
fragmentos generados.

El mtodo de degradacin qumica (Maxam and Gilbert, 1977):

El mtodo enzimtico (Sanger et al., 1977).
Cual es la diferencia entre el mtodo sanger y el de Maxan y Gilbert 2


El mtodo de
degradacin
qumica (Maxam
and Gilbert, 1977):
En este mtodo, un fragmento de ADN de
cadena doble o sencilla se marca en los
extremos 5 o 3 de una o ambas hebras
con 32P. Despus, la muestra de ADN se
divide en cuatro alcuotas y se fragmenta
en cuatro reacciones qumicas distintas.
Posteriormente, los fragmentos de ADN
generados pueden ser separados por
electroforesis en cuatro carriles distintos
con base en su tamao.
El mtodo
enzimtico (Sanger
et al., 1977).
Con este mtodo se generan fragmentos
de ADN de todos los tamaos posibles
que se puedan distinguir entre s, por el
tipo de marcaje que llevan o por la
incorporacin de un terminador
especfico.


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Dibuje u gel en el que se de el resultado de una secuencia de ADN por el 3
mtodo de sanger y el de Maxan y Gilbert

Ilustracin 1 Maxan and Gilbert