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UIVERSIDADE DE BRASLIA
FACULDADE DE AGROOMIA E MEDICIA VETERIRIA






OCORRCIA DE Ehrlichia spp. O DISTRITO FEDERAL E SUAS
ALTERAES LABORATORIAIS





MARIAA ACCIOLY LIMA





Braslia
2013
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MARIAA ACCIOLY LIMA





OCORRCIA DE Ehrlichia spp. O DISTRITO FEDERAL E SUAS
ALTERAES LABORATORIAIS



Monografia apresentada para a concluso do Curso
de Medicina Veterinria da Faculdade de
Agronomia e Medicina Veterinria da
Universidade de Braslia
Orientadora:
ProfDrGiane Regina Paludo





Braslia
2013
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Lima, Mariana Accioly
Ocorrncia de Ehrlichia spp. no Distrito Federal e suas alteraes laboratoriais/
Mariana Accioly Lima; orientao de Giane Regina Paludo Brasilia, 2013.

29 p.: il.

Monografia Universidade de Braslia/Faculdade de Agronomia e Medicina
Veterinria, 2013.
1. Erliquiose canina. 2.PCR. 3. Distrito Federal


Cesso de Direitos
Nome do Autor: Mariana Accioly Lima
Ttulo da Monografia de Concluso de Curso: Ocorrncia de Ehrlichiasp. no
Distrito Federal e suas alteraes laboratoriais
Ano: 2013
concedida a Universidade de Braslia permisso para reproduzir cpias desta
monografia e para emprestar ou vender tais cpias somente para propsitos acadmicos
e cientficos. O autor reserva-se a outros direitos de publicao e nenhuma parte desta
monografia pode ser reproduzida sem a autorizao por escrito da autora.


Mariana Accioly Lima




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FOLHA DE APROVAO
Nome do autor: LIMA, Mariana Accioly
Ttulo: Ocorrncia de Ehrlichia spp.no Distrito Federal e suas alteraes laboratoriais


Monografia apresentada para a concluso do Curso
de Medicina Veterinria da Faculdade de
Agronomia e Medicina Veterinria da
Universidade de Braslia
Orientadora:
ProfaDraGiane Regina Paludo


Aprovado em:

Banca examinadora:
Profa. Dra. Giane Regina Paludo Instituio: UnB
Julgamento:________________________ Assinatura: __________________
Profa. Dra. Simone Perecmanis Instituio: UnB
Julgamento: ________________________ Assinatura: __________________
Laurcio Monteiro Cruz Instituio: Diretoria de Vigilncia Ambiental
Julgamento: ________________________ Assinatura: __________________


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AGRADECIMETOS
A Deus, pela minha vida e por todas as oportunidades ao longo do caminho que
me trouxeram at aqui.
Aos meus pais, por me incentivarem sempre e investirem na minha educao ao
longo de todos esses anos.
Ao meu namorado, por estar sempre ao meu lado, me ajudando e dando foras
para seguir em frente, tornando minha jornada mais tranquila.
A minha orientadora, pelo apoio, pelos ensinamentos e pelas ideias e correes,
que contribuiram para a elaborao da pesquisa e do trabalho.
A Marcela, que passou muitas horas comigo, ensinando a fazer uma extrao de
DNA, como mexer num termociclador, o que fazer para no contaminar uma amostra e
esteve comigo em todas as minhas corridas de gel, esperando junto para ver se deu tudo
certo.
Aos meus amigos que me apoiaram ao longo de todo esse processo.
Ao pessoal do Laboratrio de Patologia Clnica Veterinria do Hospital
Veterinrio da Universidade de Braslia e a todos os outros que ajudaram na coleta das
amostras.
Ao Laboratrio de Microbiologia e Patologia Molecular do Hospital Veterinrio
da Universidadede Braslia, que forneceu a estrutura e os recursos para a realizao da
pesquisa.

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RESUMO
LIMA, M. A. Ocorrncia de Ehrlihcia spp.no Distrito Federal e suas alteraes
laboratoriais. [Occurence of Ehlichia spp. in Distrito Federal and their clinical
pathologic alterations].2012. 29 p. Monografia (Concluso de Curso de Medicina
Veterinria) Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinria, Universidade de
Braslia, Braslia, DF.
A erliquiose canina uma doena causada pela riquetsiaEhrlichia canis e
transmitida pelo carrapato Rhipicephalussanguineus. Tem distribuio mundial e
encontra-se bastante difundida no Brasil. O presente estudo teve como
objetivodeterminar a presena e a distribuio de Ehrlichia spp.em ces de diferentes
regies do Distrito Federal por meio da Reao de Polimerase em Cadeia (PCR) e
comparar os resultados com os exames hematolgicos dos animais. Para a anlise, foi
utilizado o sangue de sessenta ces de cinco regies do Distrito Federal, colhido durante
a Campanha de Vacinao de Raiva realizada nos dias19 e 26de maio de 2012. A PCR
detectava sequncias da regio 16S rRNA de Ehrlichia spp.A ocorrncia de infeco
por Ehrlichia spp. nos ces amostrados no Distrito Federal foi de 21,67% (13/60), sendo
que quatro (4/11) animais positivos eram de Vicente Pires, trs (3/12)do Guar, quatro
(4/16) da regio 1 de Ceilndia e 2 (2/10) da regio 2 de Ceilndia. No foram
encontrados animais positivos em Planaltina (0/11).Foi observada diferena (p<0,05) ao
se comparar VG e contagem de hemcias de animais positivos e negativos,
caracterizando a presena de anemia. As principais alteraes hematolgicas mais
encontradas nos animais positivos foram: hiperproteinemia plasmtica (73,84%),
monocitopenia (61,54%), anemia microctica (46,15%),trombocitopenia (30,77%) e
linfopenia (30,77%). Como as alteraes clnicas e hematolgicas foram discretas,
pode-se concluir que os animais se encontravam na fase subclnica da doena no
momento da colheita do sangue.
Palavras-chave: erliquiose canina, PCR, Distrito Federal


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ABSTRACT
LIMA, M. A. Occurrence of Ehrlichia spp. in Distrito Federal and their clinical
pathologic alterations.[Ocorrncia de Ehrlichia spp. no Distrito Federal e suas
alteraes laboratoriais]. 2012. 29 p. Monografia (Concluso de Curso de Medicina
Veterinria) Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinria, Universidade de
Braslia, Braslia, DF.
Canine ehrlichiosis is a tickbome disease(Rhipicephalussanguineus) caused by
the rickettsia Ehrlichia canis.It is worldwide distributed and is commonly found in
Brazil. This study determines the presence and distribution of Ehrlichia spp.in dogs
from five different regions in Distrito Federal using the Polymerase Chain Reaction
(PCR) and compares the results of hematological exams ofthese dogs. Blood samples
from sixty dogs from five different regions in Distrito Federal were collected during the
Rabies Vaccination Campaign realized on May 19
th
and May 26
th
, 2012. Ehrlichia spp.
was identified by PCR amplification of16S rRNA gene sequence. The occurrence of
Ehrlichia spp. in these dogs from Distrito Federal was 21,67% (13/60), which four of
them (4/11) were from Vicente Pires, three (3/12) from Guar, four (4/16) from region 1
from Ceilndia and two (2/10) from region 2 from Ceilndia. There were no positive
animals from Planaltina (0/11). There was difference (p<0.05) between positive and
negative animals when comparing the hematocritandthe number of erythrocytes
whichcharacterizes anemia. The most hematological alterations seen in positive dogs
were: hyperproteinemia(73.84%), monocytopenia (61.54%), microcytic anemia
(46.15%), thrombocytopenia (30.77%) and lymphopenia (30.77%). As the clinical and
hematological alterations were discrete, it could be concluded that these animals were at
the subclinical phase of the disease by the time the blood was collected.
Key-words: canine ehrlichiosis, PCR, Distrito Federal






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SUMRIO
1. ITRODUO 9
2. ERLIQUIOSE MOOCITOTRPICA CAIA (Ehlichia canis) 10
2.1 Patognese 11
2.2 Sinais clnicos 12
2.3 Alteraes laboratoriais 13
2.4 Diagnstico 14
2.5 Tratamento 15
2.6 Controle 16
2.7 Potencial Zoontico 16
3. MATERIAIS E MTODOS 17
3.1 Anlise hematolgica 17
3.2 Extrao de DNA 17
3.3 PCR 17
4. RESULTADOS 18
5. DISCUSSO 21
6. COCLUSO 26
REFERCIAS 27



















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1. ITRODUO
A erliquiose canina uma doena causada por uma bactria gram-negativa intra-
celular obrigatria de moncitos, sendo conhecidas tambm como erliquiose
monocitotrpica canina. Pertence a famliaAnaplasmataceae, sendo que o gnero
Ehrlichia foi includo nela a partir de 2001, retirado da famlia Rickettsiaceae, quando
houve uma reclassificao das bactrias devido a anlisemolecular dos genes 16S rRNA
e groESL. Algumas espcies desse gnero tambm sofreram uma reclassificao, sendo
uma delas a Ehrlichia platys, que passou a pertencer ao gnero Anaplasma desde ento
(GREENE, 2012).
uma doena que possui distribuio mundial e necessita de vetores para ser
transmitida, sendo o carrapato marrom, Rhipicephalus sanguineus, o transmissor mais
comum(TAYLOR, 2007; GREENE, 2012).
A doena pode ser dividida nas fases: aguda, sub-clnica e crnica. Na fase
aguda, que dura cerca de 2 a 4 semanas, o animal pode apresentar febre, anorexia, perda
de peso, mucosas plidas devido a anemia, corrimento culo-nasal e linfadenopatia
(ALMOSNY, 2002). Durante a fase sub-clnica, no so observadas alteraes clnicas,
podendo encontrar apenas alteraes laboratoriais (NELSON E COUTO, 2010). A fase
crnica possui caractersticas de doena imunomediada, sendo os sintomas mais
comuns: mucosas plidas devido a anemia, perda de peso, febre, petquias e equimoses
pela trombocitopenia, glomerulonefrite, artrite, entre outros (ALMOSNY, 2002;
HIRSH, 2003).
Existem diversos mtodos diagnsticos para a infeco, mas normalmente so
utilizados sinais clnicos compatveis associados a deteco da bactria por meio de
esfregao sanguneo ou a resultados sorolgicos. Porm, devido a baixa sensibilidade ou
a presena de reaes cruzadas com agentes semelhantes, tem se observado a
necessidade de exames mais precisos (AGUIAR, 2006; NAKAGHI, 2008; RAMOS,
2009;ISOLA, 2012a).
Com isso, os objetivos desse trabalho foram: determinar a presena e a
distribuio de Ehrlichia canis em ces de diferentes regies do Distrito Federal por
meio da Reao de Polimerase em Cadeia (PCR) e comparar os resultados com os
exames hematolgicos dos animais.
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2. ERLIQUIOSE MOOCITOTRPICA CAIA (Ehrlichia canis)
A erliquiose monocitotrpica canina uma doena causada por bactrias
intracelulares obrigatrias do gnero Ehrlichia, sendo a E. canis a espcie mais estudada
e a nica descrita at o momento no Brasil. caracterizada por infectar os moncitos
dos ces, podendo afetar tambm macrfagos.So cocos Gram negativos e formam
aglomerados intracitoplasmticos, chamados de mrulas (AGUIAR, 2006; TAYLOR,
2007; GREENE, 2012). Tambm pode ser chamada de rickettsiose canina, tifo canino,
febre hemorrgica canina e sndrome hemorrgica idioptica (PRICE; SAYER, 1983).
uma doena que tem distribuio mundial (Europa, sia, frica e Amricas,
exceto Austrlia, que aparentemente est livre), especialmente naqueles pases de zona
tropical e temperada. A maioria dos casos geralmente ocorre em pocas quentes, quando
o vetor mais abundante no ambiente,porm a doena clnica pode ocorrer em qualquer
poca do ano, devido ao curso demorado da fase sub-clnica. Os hospedeiros
vertebrados so animais pertencentes a famlia Canidae, como coiotes, raposas e ces
domsticos. Acredita-se que essa bactria ou alguma outra com caractersticas similares
possa infectar tambm gatos (GREENE, 2012).
No Brasil, considerada por muitos como uma das principais doenas
transmissveis em ces, devido a inexistncia de vacinas, a grande quantidade presente
do vetor e a sua casustica crescente ao longo dos anos (AGUIAR, 2006). De acordo
com alguns estudos, acomete cerca de 20 a 30% dos ces atendidos em hospitais e
clnicas veterinrias no Brasil, sendo que os valores podem variar de 1,7% a 43%,
dependendo da regio de estudo (LABARTHE, 2003; BULLA, 2004; CARLOS, 2007).
Tem como vetores artrpodes conhecidos o carrapato
marromRhipicephalussanguineus e oDermacentorvariabilis(NELSON E COUTO,
2010). O carrapato marrom encontra-se disseminado na rea urbana de todo o Brasil
(AGUIAR, 2006).
O carrapato se infecta ao exercer hematofagia em ces com as bactrias
circulantes, ou seja, duas a trs semanas aps o co ter sido infectado pela riqutsia.
mais difcil para os ces com a doena crnica infectarem carrapatos (HIRSH, 2003;
SANTARM, 2003).
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Os vetores transmitem a infeco por meio da saliva ao fazerem o repasto em
outros hospedeiros. Esta transmisso pode ocorrer em qualquer um dos seus estgios de
desenvolvimento: larvas, ninfas ou adultos.Pode ocorrer ainda transmisso transestadial,
mas no ocorre transmisso transovariana. importante destacar que carrapatos adultos
podem transmitir a doena at 155 dias aps ingerir a bactria, fazendo com que o
micro-organismo persista por mais tempo no ambiente(SANTARM, 2003; TAYLOR,
2007; GREENE, 2012; ISOLA, 2012a).
2.1.Patognese
A doena dividida nas fases aguda, sub-aguda e crnica, segundo os sinais
clnicos e laboratoriais de animais infectados experimentalmente. Cada fase possui
algumas caractersticas prprias, mas muitas vezes difcil diferenci-las na rotina
veterinria.A intensidade dos sinais varia com a cepa infectante, a resposta imune do
animal, a alimentao do animal e se h ou no infeces concomitantes de outros
agentes (GREENE, 2012; ISOLA 2012a).
Os hospedeiros vertebrados se infectam quando o carrapato que possui saliva
contaminada pela bactria faz repasto no animal sadio, ou quando h transfuso de
sangue de um animal com a infeco para um livre dessa doena (GREENE, 2012).
O perodo de incubao geralmente de 8 a 20 dias, nos quais o micro-
organismo se multiplica por fisso binria no sistema fagoctico mononuclear, formando
as mrulas. Como a bactria se divide em vacolos protegidos da ao dos lisossomos
da clula,consegue desta forma sedisseminar pelo organismo, alojando-se
principalmente no fgado, bao e linfonodos, infectando outras clulas com a ruptura da
membrana celular aps a formao de um estgio mais tardio da mrula. (DAGNONE,
2001;HIRSH, 2003; SANTARM, 2003;GREENE, 2012; TAYLOR, 2007; ISOLA,
2012a).Em seguida,tem incioa fase aguda, que dura de 1 a 4 semanas. Com o
tratamento adequado, o animal pode se recuperar normalmente. Se no tratado, ou
tratado de forma inadequada, comea o estgio sub-clnico da doena, no qual h
recuperao clnica do paciente, que passa a aparentar estar saudvel, apesar de
continuar sendo um carreador de E. canis. Nessa fase, a contagem de plaquetas continua
abaixo dos valores de referncia. Acredita-se que o bao tenha um importante papel na
persistncia da doena no animal (GREENE, 2012).
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Animais imunologicamente competentes conseguem debelar a infeco sem
tratamento, mas, caso isto no ocorra, desenvolvem o estgio crnico da doena. Essa
fase caracterizada por apresentar caractersticas de uma doena auto-imune, com
diminuio da produo de clulas pela medula ssea provavelmente devido a um
mecanismo imunomediado, gerando uma pancitopenia. O prognstico nessa fase
reservado e o animal pode vir a bito por infeces secundrias, sangramentos
descontrolados ou pela associao dos dois.Os sangramentos ocorrem pela reduo da
produo de plaquetas pela medula ssea e diminuio de sua funo de agregao,
como ocorre comumente em animais infectados (THRALL, 2007; GREENE, 2012;
ISOLA, 2012a).
Alm disso, a infeco por E. canis gera um grande aumento da produo de
imunoglobulinas, podendo ocorrer tambm a produo de anticorpos contra as plaquetas
ou ento a deposio de imunocomplexos em rgos, como rins e articulaes, gerando
outras alteraes no paciente (GREENE, 2012; ISOLA 2012a).
2.2.Sinais Clnicos
A erliquiose canina uma doena multissistmica. Na fase aguda, comum se
observar febre, corrimento oculonasal seroso ou purulento, anorexia, perda de peso,
dispneia, tendncias hemorrgicas, com a presena de epistaxes ou a formao de
petquias ou equimoses, e linfadenopatia. Podem ser observados carrapatos infestando o
animal (SANTARM, 2003; NELSON E COUTO, 2010; GREENE, 2012).
Na fase subclnica, no h evidncia de sinais clnicos, havendo apenas algumas
alteraes laboratoriais. Podem ser encontradas sorologia e PCR positivas. Os
carrapatos podem no ser mais observados (NELSON E COUTO, 2010).
Na fase crnica, h uma grande variedade de sinais, devido a deposio de
anticorpos em diversos tecidos.Alm disso, os sinais clnicos podem variar com a
presena de infeces concomitantes por outros agentes, como Babesia canis ou
Hepatozoon canis, e se h presena de infeces secundrias por bactrias, fungos ou
protozorios.Alguns sinais que podem ser encontrados so: depresso, perda de peso,
palidez de mucosas, dor abdominal, evidncias de hemorragia, como epistaxe,
petquias, etc., linfadenopatia, esplenomegalia, hepatomegalia, dor articular devido a
artrite, alteraes oculares como uvete, retinite, hifema, etc., arritmias cardacas,
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poliria e polidipsia devido a glomerulonefrite e alteraes no sistema nervoso central,
como convulses, paresia, entre outros (HIRSH, 2003; GREENE, 2012; NELSON E
COUTO, 2010).
2.3.Alteraes Laboratoriais
Durante a fase aguda, podem ser observadas moderada a severa
trombocitopenia, moderada anemia normoctica normocrmica no regenerativa devido
a resposta inflamatria, caso no haja hemorragia, e leucopenia, seguida de leucocitose
por neutrofilia e monocitose. Pode haver neutropenia e hipoalbuminemia devido a
vasculite (NAKAGHI, 2008; NELSON E COUTO, 2010). Alm disso, nessa fase em
que podem ser observadas mrulas nos moncitos circulantes. A trombocitopenia
ocorre devido ao consumo das plaquetas e a diminuio de sua meia-vida, pelo
seqestro esplnico ou destruio imunomediada. Podem ser observadas plaquetas
gigantes, indicando resposta medular a trombocitopenia (DAGNONE, 2001;
ALMOSNY, 2002; HIRSH, 2003; TAYLOR, 2007; GREENE, 2012). Nos exames
bioqumicos podem ser observados aumentos das enzimas alaninaaminotransferase,
fosfatase alcalina, bilirrubinas e das protenas, devido ao aumento das globulinas e
diminuio dos nveis da albumina (ALMOSNY, 2002; ISOLA, 2012a; GREENE,
2012).
Na fase sub-clnica, podem ser encontradas: hiperglobulinemia, moderada
trombocitopenia, neutropenia, linfocitose e monocitose (NELSON E COUTO, 2010;
GREENE, 2012). Estudos indicaram que em aproximadamente 50% dos animais a
anemia, a trombocitopenia e a leucopenia desaparecem nessa fase, sendo observadas
apenas neutropenia e linfocitose (ALMOSNY, 2002).
Na fase crnica, podem ocorrer: monocitose, linfocitose, com linfcitos podendo
conter grnulos azuroflicos, trombocitopenia, anemia no regenerativa,
hiperglobulinemia, hipoplasia da medula ssea, hipoalbuminemia pela perda
glomerular, proteinria, rara azotemia, aumento da atividade da alanina
aminotransferase e da fosfatase alcalina. Se houver supresso da medula ssea,
encontrada pancitopenia. Outras alteraes que podem ser encontradas so aumento no
tempo de sangramento devido a trombocitopenia ou m funo plaquetria, hematria e
gamopatia monoclonal(ALMOSNY, 2002; THRALL, 2007; NELSON E COUTO,
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2010; GREENE, 2012).Segundo Almosnyet. al(2002), a evoluo da doena para a
mortalidade tem relao direta com o estado imunitrio do co.
2.4.Diagnstico
O diagnstico da erliquiose feito associando-se o histrico dos animais, os
sinais clnicos e os exames hematolgicos aos testes sorolgicos ou
moleculares.(AGUIAR, 2006; NAKAGHI, 2008; ISOLA, 2012a)
Nos exames hematolgicos, a trombocitopenia um achado comum, podendo
ser observados tambm anemia e leucopenia (NAKAGHI, 2008; NELSON E COUTO,
2010; GREENE, 2012). No freqente encontrar mrulas intracitoplasmticas das
bactrias, mas na fase aguda da doena quando elas podem ser mais visualizadas,
sendo que quando o esfregao feito com o sangue perifrico (da ponta da orelha), as
chances deste achado aumentam (ALMOSNY, 2002).
Em reas endmicas, a erliquiose deve ser considerada como um dos diferenciais
quando for encontradatrombocitopenia no exame. Apesar de existirem outras causas
para a trombocitopenia, como trombocitopenia imunomediada, neoplasias, doenas
inflamatrias e outros agentes infecciosos, um estudo realizado por Bulla et al. (2004)
mostrou que em um grupo de 84 animais trombocitopnicos em uma rea endmica,
63,1% eram positivos na PCR paraE. canis. Alm disso, a doena tambm no deve ser
completamente descartada de animais que possuam a contagem de plaquetas normal
nessas reas, j que esse mesmo estudo mostrou que 1,4% dos 71 animais com
contagem de plaquetas normal foi positivo na PCR.
A avaliao sorolgica til para auxiliar no diagnstico rpido da doena na
clnica veterinria, sendo que de acordo com Machado (2004),Nakaghi (2008) e Isola et
al (2012b) o Dot-Elisa considerado mais sensvel se comparado a Reao de
Imunofluorescncia Indireta (RIFI). Os testes ELISA ajudam no diagnstico da
erliquiose nas fases sub-clnica e crnica, porm, na fase aguda podem ser encontrados
resultados falso-negativos (ALMOSNY, 2002).
AReao de Imunofluorescncia Indireta (RIFI) o teste sorolgico mais
utilizado, sendo considerado como teste de ouro. No entanto, h uma grande
variabilidade nos resultados do teste devido a variaes no procedimento e na
quantidade e qualidade dos antgenos para E. canis utilizados em diferentes laboratrios
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(GREENE, 2012).Quando se encontram ttulos superiores a 1:40, h indcios de que
houve exposio ao agente infeccioso. recomendado a realizao dedois testes
consecutivos com 1 a 2 semanas de intervalo para a confirmao de infeco ativa,
quando observa-se um aumento de quatro vezes nos ttulos de anticorpos (TAYLOR,
2007). Geralmente, aps o tratamento adequado, os nveis de anticorpos diminuem at
finalmente desaparecerem da circulao. Porm, alguns estudos mostraram a
persistncia de nveis de anticorpos elevados um ano aps o tratamento e at mesmo
quando no h deteco da bactria na circulao por meio da PCR. Podem acontecer
reaes cruzadas com . helminthoeca e . risticii (GREENE, 2012).
O gene 16S rRNA o mais usado para a deteco da bactria em animais por
meio da PCR, tendo sido seqenciada segundo um fragmento de 398 pares de bases em
Jaboticabal (MACHADO, 2004).A PCR um mtodo bastante promissor, pois pode ser
positivo antes da soroconverso do animal. Alm disso, mostra a presena da infeco,
enquanto a sorologia mostra apenas a exposio ao agente, ajudando na diferenciao
de animais cronicamente infectados daqueles para os quais o tratamento foi efetivo, mas
os nveis de anticorpos continuaram elevados. Tambm til para saber qual espcie de
riqutsia est infectando o animal. Porm,deve ser feita uma associao da PCR com a
sorologia, e no sua substituio, j que ainda no h uma padronizao dos
laboratrios. Pode haver resultados falso-negativos pela dificuldade de extrao do
DNA da bactria, problemas de tcnica, amostra inadequada ou pelo uso de antibiticos,
pois eles induzem ao aparecimento de resultados negativos na PCR do sangue.
Resultados falso-positivos podem ocorrer devido a contaminao da amostra ou
amplificaes no especficas(MCBRIDE, 1996; NAKAGHI, 2008; NELSON E
COUTO, 2010; GREENE, 2012).
2.5.Tratamento
Como tratamento podem ser usados diversos antibiticos, como tetraciclinas,
oxitetraciclina, dipropionato de imidocarb, minociclina e doxiciclina, sendo que este
ltimo o medicamento de eleio (WANER, 2000; HIRSH, 2003; GREENE, 2006;
NELSON E COUTO, 2010; ISOLA, 2012a).Deve ser realizado por cerca de 3 a 4
semanas na fase aguda da doena, prolongando um pouco mais paraces que se
encontram na fase sub-clnica, enquanto ces na fase crnica dificilmente respondem a
terapia escolhida (VARELA, 2003; TAYLOR, 2007).
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A resposta observada com a melhora nas condies clnicas e laboratoriais do
paciente, como volta a normalidade dos valores hematolgicos, retorno do apetite, entre
outros(ISOLA, 2012a). Aps duas semanas do fim do tratamento, deve ser realizada
PCR para ver se o animal ainda est positivo. Caso esteja, o tratamento deve ser feito
novamente por mais quatro semanas e, depois, repetir o teste novamente. Se ainda assim
for positivo, outro medicamento deve ser usado para o tratamento. Se o resultado for
negativo, aps oito semanas deve ser realizado o teste novamente e, se der negativo de
novo, h a confirmao de que a teraputica foi eficiente (NELSON E COUTO, 2010).
2.6. Controle
essencial o controle de carrapatos no ambiente para a preveno da doena,
pois o vetor deste e de vrios outros agentes etiolgicos. Para isso, indispensvel que
haja a limpeza constante e a higiene adequada do ambiente, podendo ser necessrio o
uso de acaricidas, como o fipronil(HIRSH, 2003; VARELA, 2003;ISOLA, 2012a;). O
tratamento dos animais tambm importante, pois assim, novos carrapatos no ficaro
infectados, j que no h transmisso transovariana. Ces doadores de sangue devem ser
monitorados frequentemente por meio da sorologia e aqueles positivos no podero
doar sangue (NELSON E COUTO, 2010).
2.7. Potencial Zoontico
A erliquiose uma doena com potencial zoontico, sendo que as espcies j
descritas causando doena em humanos at o momento foram: E. chaffeensis, quepode
causar erliquiose monocitotrpica canina;E. ewingii eAnaplasmaphagocytophilum, que
causam a erliquiose granuloctica canina;e eorickettsiasennetsu (Ehrlichia sennetsu),
que causa a febre sennetsu em humanos.Um micro-organismo semelhante a E. canis
foi isolado de uma pessoa cronicamente infectada e assintomtica na Venezuela, sendo
que a mesma bactria foi isolada de ces da regio. Porm, ainda so necessrios mais
estudos para se determinar o potencial zoontico desta espcie (SPICKLER, 2005).
Em humanos, a E. chaffeensis pode ser fatal em at 5% dos pacientes e a
erliquiose granuloctica, em at 10% dos doentes (DAGNONE, 2001). Os sinais
clnicos podem variar de assintomticos a severos, podendo ser observadas dores de
cabea, febre, dores musculares, vmitos, dor abdominal, conjuntivite, tosse, entre
outros (SPICKLER, 2005).
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3. MATERIAIS E MTODOS
Durante a campanha de vacinao contra a raiva realizada nos dias19 e 26 de
maio de 2012, foi colhido o sangue de ces de cinco regies diferentes do Distrito
Federal: Guar, Planaltina, Vicente Pires eduas regies de Ceilndia, totalizando 60
animais. O sangue foi acondicionado em tubos com anticoagulante (EDTA). As
amostras foram processadas no mesmo dia da colheita.
3.1.Anlise Hematolgica
Parte do sangue presente no tubo foi utilizadapara a realizao de hemograma,
executado no Laboratrio de Patologia Clnica Veterinria do Hospital Veterinrio da
Universidade de Braslia (UnB), Distrito Federal.
Foi utilizado o contador semiautomtico de clulas para uso veterinrio modelo
Micros ABC Vet (Horiba ABX) para determinar o nmero total de hemcias, leuccitos
e plaquetas e a concentrao de hemoglobina. O volume corpuscular mdio (VCM) e a
concentrao de hemoglobina corpuscular mdia (CHCM) foram determinados usando
o clculo padro.O volume globular (VG) foi determinado pela tcnica do
microhematcrito. As protenas plasmticas (PPT) foram determinadas com o auxlio do
refratmetro. Foram confeccionados esfregaos de sangue total corados com pantico
para a realizao do diferencial leucocitrio e observao morfolgica das clulas.
3.2.Extrao do DA
A outra parte do sangue foi armazenada congelada at a extrao de seu DNA
para a realizao da PCR de Ehrlichia spp. A extrao foi realizada no laboratrio de
Microbiologia e Patologia Molecular (MPM) do Hospital Veterinrio da UnB.
Foiutilizado o kit comercialIllustrabloodgenomicPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare) e
o processamento foi realizado seguindo as recomendaes do fabricante. O produto
desse processamento foi armazenado congelado a -20 Celsius at a realizao da PCR,
voltando depois para a temperatura anteriormente citada.
3.3.PCR
18


Para a PCR de Ehrlichia spp., foram usados os oligonucleotdeosEHR16sd (5-
GGT-ACC-YAC-AGA-AGA-AGT-CC-3) e EHR16sr (5-TAG-CAC-TCA-TCG-
TTT-ACA-GC-3) que detectavam o gene 16S rRNA da bactria.Esses
oligonucleotdeos amplificam: E. canis, E. chaffeensis, E. muris, E. equi, E.
phagocytophila, E. platys (Anaplasmaplatys), A. marginale, A. centrale,
Wolbachiapipientis, E. sennetsu, E. risticii e eorickettsiahelminthoeca(INOKUMA,
2000). A gua foi usada como controle negativo para verificar se houve contaminao
de algum reagente. Para o controle positivo foi usado o sangue de um animal infectado
com a observao de mrulas de erliquia em esfregao sanguneo.
As reaes eram compostas por:cerca de 10 ng de DNA, 1X tampo de
PCR(Invitrogen), 0,2mM de cada deoxinucleotdeo (Invitrogen), 1,6 mMde
MgCl
2
(Invitrogen), 1M de cada oligonucleotdeo,0,5U de Taq DNA polimerase
(Invitrogen) para um volume final de 25l.As condies de amplificao utilizadas
foram: desnaturao inicial a 95C por 5 minutos; 34 ciclos repetidos de desnaturao
(95C por 30 segundos), anelamento (53C por 30 segundos) e extenso (72C por 90
segundos); e extenso final de 72C por 5 minutos.Todas as reaes foram realizadas
utilizando o mesmo termociclador C1000ThermalCycler (Bio-Rad).
O resultado das PCRs foi analisado por eletroforese em gel de agarose a 1,5%
corado com brometo de etdio e observado em transiluminador de fluorescncia. As
amostras foram consideradas positivas quando resultavam em um produto de 345 pares
de base (pb), como descrito por Inokuma et. al. (2000). Estes processamentos foram
realizados no Laboratrio de Microbiologia e Patologia Molecular (MPM) do Hospital
Veterinrio da UnB, Distrito Federal.
4. RESULTADOS
Foram utilizadas 60 amostras de sangue de ces, independente do sexo e idade.
Destes animais, 11 pertenciam a regio de Vicente Pires, 12 a regio do Guar, 11 a
regio de Planaltina e 26 a regio Ceilndia, sendo destes ltimos 16 pertencentes a uma
rea da cidade e 10 pertencentes a outra.
Detodos os animais estudados, 78,33% (47/60) foram considerados negativos e
21,67% (13/60) positivos na PCR para deteco de Ehrlichia spp. A figura 1 mostra o
resultado de uma PCR para Ehrlichia spp.em gel de agarose, corada com brometo de
19


etdio e visualizada em transiluminador de fluorescncia, no qual podem ser observados
os produtos de 345 pares de bases.

Figura 1: Resultado da PCR para Ehrlichia spp. utilizando-se os oligonucleotdeos
EHR16sde EHR16sr. Legenda: 1: controle negativo (gua); 2: controle positivo; 3
e 4: animais negativos; 5 e 6: animais positivos; 7 a 14: animais negativos; m:
marcador de peso molecular (100 pb, Invitrogen).

Na tabela 1 podem ser observadas as porcentagens de animais positivos e
negativos na PCR para cada regio de estudo. A tabela 2 mostra as porcentagens de
animais positivos e negativos de cada uma das regies de Ceilndia.
Tabela 1. Porcentagem de animais positivos e negativos na PCR por local
estudado.
Animais Vicente Pires Guar Planaltina Ceilndia
Nmero/Total % Nmero/Total % Nmero/total % Nmero/total %
Positivos 4/11 36,36 3/12 25 0/11 0 6/26 23,08
Negativos 7/11 63,64 9/12 75 11/11 100 20/26 76,92

12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 m
345 pb
20


Tabela 2. Porcentagem de animais positivos e negativos na PCR em cada
regio de Ceilndia.
Animais Regio 1 Regio 2
Nmero/Total % Nmero/Total %
Positivos 4/16 25 2/10 20
Negativos 12/16 75 8/10 80

Na tabela 3 podem ser observados os valores mdios e desvio padro dos
parmetros hematolgicos de todos os ces positivos e negativos estudados. A tabela 4
mostra quais foram as alteraes hematolgicas encontradas nos animais positivos e sua
frequncia.
Tabela 3. Valores mdios e desvio padro dos parmetros hematolgicos
nos ces positivos e negativos de todas as localidades.
Parmetro
Positivos Negativos Valores de referncia
VG (%) 35,925,61
a
40,235,87
b
37-55
Hemcias (x10
6
/L) 6,390,71
a
6,950,99
b
5,5-8,5
Hemoglobina (g/dL) 15,212,53
a
16,482,67
a
12-18
VCM (fl) 56,024,54
a
58,196,71
a
60-77
CHCM (%) 42,372,94
a
41,144,71
a
30-36
Plaquetas (x10
3
/L)
258,41158,64
a
319,67145,10
a
200-500
PPT (g/dL)
8,011,13
a

7,410,99
a

6,0-8,0
Leuccitos (X10
3
/ L) 9,873,95
a
11,463,93
a
6,00-17,00
Neutrfilos (X10
3
/ L)
4,180,77
a
4,061,02
a
3,00-11,50
Linfcitos(X10
3
/ L)
1,460,72
a
1,940,94
a
1,00- 4,80
Eosinfilos (X10
3
/ L)
0,550,40
a
0,680,48
a
0,10-1,25
Moncitos(X10
3
/ L)
0,170,12
a

0,230,13
a
0,15- 1,35
21


Valores em uma mesma linha seguidos por letras diferentes diferiram (p<0,05) entre si pelo
teste t. Volume globular (VG), Volume Corpuscular Mdio (VCM), Concentrao de
Hemoglobina Corpuscular Mdia (CHCM), Protena Plasmtica Total (PPT). Valores de
referncia: fonte: Jain, 1993.
Tabela 4. Frequncia das alteraes hematolgicas dos animais positivos.
Alteraes Laboratoriais
Nmero de
animais/total de
animais positivos
%
Anemia 6/13 46,15
Anemia Microctica 6/13 46,15
Leucopenia 3/13 23,07
Linfopenia 4/13 30,77
Monocitopenia 8/13 61,54
Eosinopenia 1/13 7,69
Eosinofilia 1/13 7,69
Trombocitopenia 4/13 30,77
Trombocitose 1/13 7,69
Pancitopenia 1/13 7,69
Hiperproteinemia plasmtica 7/13 53,84

5. DISCUSSO
Neste estudo, 21,67% (13/60) das amostras analisadas na PCR para Ehrlichia
spp. foram consideradas positivas.Bullaet al. (2004) encontraram 30,09% (67/217)
animais positivos em uma anlise na qual as amostras de sangue foram escolhidas
aleatoriamente dentre as recebidas durante a rotina do Laboratrio de Patologia Clnica
da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia da universidade Estadual Paulista em
Botucatu, que considerada uma rea endmica para a doena.Estudos realizados por
Basfilos (X10
3
/L)
00
a

00
a
Raros
22


Sousa (2006) e Menezes et al. (2008), no qual foram selecionadas amostras de sangue
de animais suspeitos para a realizao da PCR de Ehrlichia spp., foram encontrados,
respectivamente, 21,7% (13/60) e 33,3% (25/75) dos animais positivos. Considerando
que no presente estudo os animais estavam sem alterao clnica aparente, o nmero de
animais positivos pode ser considerado elevado, pois p resultado foi semelhante aquele
encontrado por autores que realizaram suas pesquisas com animais suspeitos.
Quanto a distribuio de animais positivos no Distrito Federal, Vicente Pires foi
a Regio Administrativa que mais apresentou ces com a presena da riqutsia, com
36,36% (4/11) dos animais positivos, seguido do Guar com 25% (3/12) e Ceilndia
com 23,08% (6/26), sendo que nestaltima, a regio 1 apresentou 25% (4/16) dos
animais positivos e a regio 2, 20% (2/10). Neste estudo, Planaltina foi a nica Regio
Administrativa que no apresentou ces positivos (0/11). Apesar do nmero de amostras
colhidas em cada local ter sido pequeno, a ausncia de positivos em Planaltina pode
indicar que nessa regio os ces sejammelhortratados que nos outros locais,
apresentando uma menor infestao de carrapatos, ou ento que a presena de
carrapatos infectados seja menor, se comparado as outras Regies Administrativas do
Distrito Federal.
O hemograma apresentou diferena (p<0.05) entre os animais positivos e
negativos no VG e na contagem de hemcias, caracterizando a presena de anemia. Dos
animais positivos, 46,15% apresentaram anemia, sendo ela do tipo microctica. Esse
resultado difere do que esperado para a doena, que caracterizada por
frequentemente causar uma anemia normoctica normocrmica nos animais, como
mostra os trabalhos deMendonaet al.(2005), Sousa(2006), Albernaz et al. (2007),
Meneses et al. (2008) e Borin et al.(2009).A anemia normoctica normocrmica causada
pela erliquiose durante a fase aguda caracterizada por ser uma anemia induzida por
doena inflamatria. Durante a fase crnica devido a aplasia da medula ssea. A
anemia tambm pode ser causada por mecanismos imunomediados, assim como a
destruio medular (THRALL, 2007; MENESES, 2008, GREENE, 2012). Por outro
lado, a microcitose acontece principalmente quandoh presena de deficincia crnica
de ferro, geralmente encontrada em casos de pouca ingesto desse mineral ou, mais
comumente, casos de hemorragia crnica ocasionada por: endoparasitas gastrintestinais,
ectoparasitas sugadores de sangue, lceras e neoplasias gastrintestinais,
trombocitopenia, entre outros. possvel aparecer tambm em anemia induzida por
23


doena inflamatria, apesar de ser um achado incomum. Nesses animais o teor srico de
ferro encontra-se diminudo, apesar da reserva desse mineral estar normal ou
aumentada. Isso acontece para que a disponibilidade de ferro necessria para o
crescimento bacteriano esteja reduzida (THRALL, 2007). Por se tratar de animais
pertencentes a regies de populaes de menor poder socioeconmico e que buscam
menos frequentemente o auxlio do profissional mdico veterinrio, possvel que esses
animais apresentassem grande quantidade de endoparasitas gastrintestinais associados
ou no com ectoparasitas sugadores de sangue. Alm disso, provvel que a
alimentao desses animais fosse deficiente de ferro, pois muitas vezes esses
proprietrios alimentam os ces com restos de alimentos.
A hipercromia encontrada tanto nos animais positivos quanto negativos pode ser
explicada por um teor falsamente aumentado de hemoglobina devido a hemlise
ocasionada durante ou aps a coleta do sangue.Fisiologicamente no possvel que as
hemcias possuam uma concentrao de hemoglobina maior do que a normal
(THRALL, 2007).
A monocitopenia foi encontrada em 61,54% (8/13) dos animais positivos. Esse
resultado foi bastante superior ao encontrado porSousa (2006), Albernazet al. (2007) e
Borin et al. (2009), que encontraram contagem baixa de moncitos em apenas
15,38%(2/13), 28% (62/219) e 12,81% (26/203) dos positivos, respectivamente.Apesar
do elevado nmero de animais apresentando essa alterao, a monocitopenia
considerada um achado insignificante no leucograma (THRALL, 2007).
Dos animais com monocitopenia, um apresentava eosinopenia associada
(7,69%). Sousa (2006), Albernazet al. (2007) e Borinet al. (2009) encontraram
eosinopenia em 23,07% (3/13), 24,20% (53/219) e 58,1% (118/213), respectivamente.
A eosinopenia um achado importante na erliquiose canina, especialmente na fase
aguda, porm seu mecanismo ainda no est bemelucidado. Acredita-se que haja lise
intravascular de eosinfilos, sequestro reversvel por rgos do sistema monoctico
fagocitrio e migrao para os tecidos (MENDONA, 2005; ALBERNAZ,
2007).Quando associado a linfopenia, decorrente da liberao de corticosteroides e
catecolaminas devido ao estresse provocado pela doena (MENDONA, 2005;
SOUSA, 2006).
24


Quatro dos animais monocitopnicos tambm apresentavam linfopenia
(30,77%).Mendona et al. (2005), Sousa (2006) e Albernaz et al. (2007) encontraram
resultados um pouco inferiores, com22,02% (24/109), 23,07% (3/13) e 17,35% (38/219)
animais positivos com a mesma alterao. A linfopenia aparece com a lise ou sequestro
dos linfcitos pelos tecidos, principalmente o tecido linfoide (MENDONA, 2005).
Um dos animais positivos (7,69%) apresentava eosinofilia. Santarm (2003) e
Albernaz et al. (2007) encontraram resultados inferiores, com 2,22% (1/45) e 3,65%
(8/219) dos animais positivos com a mesma alterao.J Sousa (2006) encontrou
resultados superiores, com 15,38% (2/13) dos animais positivos com eosinofilia. O
aumento da contagem de eosinfilos geralmente observada em reaes de
hipersensibilidade, como em dermatite alrgica a picada de pulgas, e em animais com
endoparasitas (THRALL, 2007).
Trs animais eram leucopnicos (23,07%). Esse achado foi semelhante a
Santarm (2003), Mendona et al. (2005) e Borin et al. (2009), que encontraram,
respectivamente, 24,44% (11/45), 24,77% (27/109) e 24,63% (50/203) animais
positivos tambm apresentando leucopenia. Na erliquiose, a leucopenia durante a fase
aguda pode acontecer com o sequestro e destruio dos leuccitos como resposta
inflamatria a infeco de E. canis, que tende a desaparecer com o tempo
(SANTARM, 2003).
Dois dos animais leucopnicos possuam intensa trombocitopenia associada
(15,38%), com contagens de plaquetas inferiores a 65.000, e um destes apresentava
pancitopenia (7,69%). Sousa (2006) e Albernaz et al. (2007) encontraram resultados
semelhantes, com pancitopenia em 7,69% (1/13) e 10,1% (22/219) animais positivos,
respectivamente. A pancitopenia geralmente encontrada na fase crnica da doena e
pode ser causada pela destruio imunomediada das clulas circulantes ou devido a
aplasia da medula ssea (ALBERNAZ, 2007; THRALL, 2007; GREENE. 2012). Na
fase aguda pode acontecer pela destruio do sangue perifrico, pois a medula ssea
hipercelular (SOUSA, 2006).Ao todo, quatro animais positivos apresentavam
trombocitopenia (30,77%). Esse resultado foi inferior ao encontrado por Santarm
(2003), Sousa (2006) e Meneseset al. (2008), nos quais97,77% (44/45), 53,84% (7/13)
e 60,0% (15/25) dos animais positivos eram trombocitopnicos.Porm, importante
salientar que nestes estudos os animais amostrados eram suspeitos de apresentarem
25


infeco por Ehrlichia canis. A trombocitopenia um achado comum em todas as fases
da erliquiose, diferindo apenas o mecanismo causador: na fase aguda a diminuio da
contagem de plaquetas acontece pelo aumento do consumo ou sequestro esplnico
delas; na fase crnica, h aplasia medular. Alm disso, mecanismos inflamatrios e
imunolgicos tambm podem causar o consumo e a destruio das plaquetas (SOUSA,
2006; THRALL, 2007; XAVIER, 2009).
Apesar de a trombocitopenia ser um achado comum na erliquiose canina, foram
encontrados 61,53% dos animais positivos (8/13) com a contagem de plaquetas dentro
dos valores de referncia, sendo que em trs animais os valores estavam prximos ao
limite inferior de 200.000/l. Esse achado foi bastante superior ao encontrado por
Bullaet al (2004), no qual 1,4% (1/71) dos animais positivos eram no-
trombocitopnicos. Isso mostra que mesmo animais no trombocitopnicos podem ser
positivos na PCR para erliquia (BULLA, 2004).
Dos treze animais positivos, um(7,69%) apresentava trombocitose.Esse
resultado semelhante ao encontrado em um estudo realizado por Sousa (2006), no qual
um dos treze animais positivos na PCR para Ehrlichia canis apresentava trombocitose.
J Albernazet al. (2007) encontrou trombocitose em 1,82% (4/219) dos animais
positivos para Ehrlichia spp. no esfregao sanguneo. Segundo um estudo experimental
realizado por Xavier (2009), a trombocitose pode aparecer em ces infectados com
Ehrlichia spp. at 15 semanas depois de serem infectados, variando com perodos de
contagem plaquetria dentro dos valores de referncia e perodos de trombocitopenia.
Esse achado evidencia a capacidade de reposio medular.
Em 53,84% (7/13) dos animais positivos foi observada hiperproteinemia
plasmtica.Esse resultado foi superior aos encontrados por Santarm (2003) e Sousa
(2006), pois observaram 11,11% (5/45) e 23,07% (3/13) animais positivos com
hiperproteinemia em seus estudos.Meneses et al. (2008), diferentemente do que a
literatura preconiza, no encontraram alteraes na protena plasmtica nos animais
positivos.Esse aumento da concentrao da protena plasmtica em decorrncia do
aumento da produo de gamaglobulinas, causadopelo estmulo antignico da bactria
(VARELA, 2003; SANTARM, 2003). Muitas vezes, acompanhada de
hipoalbuminemia, desencadeada pela diminuio da ingesto proteica, pelo edema
causado pela vasculite ou como mecanismo compensatrio devido ao aumento da
26


viscosidade sangunea provocado pela grande produo de globulinas (SANTARM,
2008).

6. COCLUSO
Pode-se observar que a Ehrlichia spp. est presente em diversas regies do
Distrito Federal.No foram encontrados animais positivos em Planaltina, mas
provvel que esse resultado se deva a pequena quantidade de amostras colhidas em cada
regio.
As alteraes hematolgicas relevantes mais encontradas foram anemia
microctica e hiperproteinemia plasmtica, sendo que o VG e a contagem de hemcias
apresentaram diferena (p<0,05) entre os animais positivos e negativos.
Como mais da metade dos animais positivos no apresentou alteraes clnicas
nem hematolgicas caractersticas da erliquiose, como anemia ou trombocitopenia,
pode-se concluir que estes se encontravam na fase subclnica da doena no momento da
colheita do sangue.






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