Can Vet J 1990; 31: 181-189

Enfoques actuales para la preparacin de vacunas

Jiang-Jian Liu, Arnost Cepica

Resumen
Numerosas vacunas convencionales para uso animal estn disponibles actualmente, y muchas de estas
vacunas han sido instrumentales en el control de enfermedades infecciosas de mayor importancia
econmica. Una vacuna ha sido instrumental en la erradicacin de la viruela, una importante
enfermedad humana. Sin embargo, muchas de las vacunas actuales son deficientes en eficiencia,
potencia o seguridad. Se ha reconocido que las metodologas convencionales son una limitacin para el
desarrollo adicional de las vacunas. La introduccin de los anticuerpos monoclonales, del DNA
recombinante y las tcnicas de ingeniera de protenas han facilitado un ms bien rpido incremento en
el conocimiento de los mecanismos patognicos, as como de antgenos protectores a nivel molecular.
Este conocimiento proporciona la base para el desarrollo de una nueva generacin de vacunas. Como
regla, estas vacunas contienen inmungenos purificados, o an epitopes aislados, identificados y
preparados por tcnicas moleculares biolgicas. Los esfuerzos para encontrar mejores sistemas de
aplicacin y mejores adyuvantes acompaan la investigacin sobre vacunas.

Vacunas actuales
A pesar de que no es el propsito de este artculo revisar todos los mayores hitos histricos en
microbiologa e inmunologa que han conducido al desarrollo de las vacunas actuales, se
mencionarn las contribuciones intelectuales extraordinarias de Jenner y Pasteur. En 1798, el
primer reporte de una vacuna viva segura fue publicado por el mdico Edward Jenner quien us
el virus de vacuna para proteger exitosamente contra la viruela y as inici la nueva era de la
vacunacin profilctica (1). Sin embargo, no se realiz muchos progresos hasta que el gran
qumico francs Louis Pasteur report en 1880 que Pasteurella multocida, crecida in vitro,
inmunizaba a los pollos en contra el desafo con cultivos de Pasteurella multocida virulenta.
Esto ha sido reconocido como la piedra angular de la inmunologa (2). Siguiendo estos
experimentos iniciales con lo que fue en aquel tiempo conocido como colera de aves, Pasteur
adicionalmente desarroll vacunas contra el antrax y la rabia cultivando los agentes patognicos
bajo condiciones de crecimiento desfavorables (2), y as introdujo una tcnica para la
produccin a propsito de vacunas. Una dcada ms tarde, organismos enteros qumicamente
inactivados comenzaron a ser utilizados para prevenir enfermedades de humanos; las primeras
vacunas bacteriales muertas (bacterinas) contra la fiebre tifoidea y el clera, fueron producidas
en 1896 (2).
Despus de la alentadora invencin de varias vacunas, usando ambos, organismos atenuados
y muertos, apasionantes logros se continuaron haciendo en el campo de la preparacin de
vacunas. En la parte inicial del siglo XX, se alcanzaron tambin algunos xitos en la produccin
de vacunas frente a otros patgenos y agentes bioactivos, tales como rickettsiae (3) y toxinas
de ttanos (2). Ahora, hay numerosas vacunas para uso veterinario y aproximadamente 20
vacunas para uso humano (4). Muchas de estas vacunas juegan roles importantes en limitar
serias enfermedades animales y humanas. La viruela, una de las enfermedades ms
desvastadoras en los seres humanos, ha sido erradicada igualmente a travs de vacunacin,
mientras muchas otras enfermedades han sido puestas bajo control.
Las vacunas clsicas se pueden dividir en dos grupos de acuerdo al estatus del organismo o
agente bioactivo incluido como antgeno: vivas o muertas (inactivadas). El trmino muerto se
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usa cuando se discute de vacunas bacteriales o protozoales, mientras el trmino inactivadas se

usa con vacunas contra virus o toxinas. Se reconoci muy temprano que los m.o. muertos o
inactivados preparados bajo ciertas condiciones de inactivacin preservaron la
inmunogenicidad, y estas vacunas han sido ampliamente usadas. Las exotoxinas bacteriales
colectadas a partir del sobrenadante se pueden usar tambin, como en los casos de las
vacunas para la fiebre embaque (shipping fever) del ganado (Pasteurella haemolytica), ttanos,
y difteria (5-7).
Las vacunas vivas se pueden obtener seleccionando los patgenos que existen naturalmente
los cuales pueden ser virulentos para determinadas especies, pero son avirulentos para las
especies inmunizadas (vacunas heterlogas). La enfermedad de Marek, una de las
enfermedades de los pollos ms importantes econmicamente, ha sido controlada exitosamente
con el virus herpes de los pavos (turkey) (8). Incidentalmente, esta es la primera y la nica
vacuna exitosa contra los tumores inducidos viralmente. Alternativamente, se pueden usar los
organismos patognicos va una ruta de infeccin no natural, o el agente de la enfermedad
puede ser atenuado artificialmente. La primera estrategia an se usa en la proteccin de ovejas
contra la dermatitis pustular de ovejas causada por el parapoxvirus. La escarificacin dentro de
la piel de la pierna al mes de edad previene la ocurrencia de lesiones orales; sto protege
contra las prdidas econmicas debidas a la reduccin en la ingesta de alimento, causadas por
infeccin tarda en la vida que conduce principalmente a lesiones orales. Siguiendo el principio
del descubrimiento de Pasteur de la atenuacin microbial debida al cultivo de agentes
infecciosos in vitro (clera aviar) o debido a la propagacin de un agente en un hospedero no
natural (rabia canina propagada en conejos), se desarrollaron muchas vacunas. La introduccin
de huevos embrionados durante los aos 20 s y el cultivo de clulas durante los 40 s para el
cultivo de virus proporcionaron an otro vehculo para la reduccin apropiada de la
patogenicidad.
Ambos tipos de vacunas, vivas e inactivadas tienen desventajas (Tabla 1).
La facilidad con la cual algunos patgenos cambian su maquillaje (dando como resultado su
diversidad antignica) contribuye a la ineficacia de algunas vacunas actuales (7, 9). Mutacin y
recombinacin son las principales fuentes de la inestabilidad antignica de los m.o. Los virus
con genoma de RNA estn particularmente sujetos a una alta frecuencia de mutaciones porque
las clulas hospederas no poseen las enzimas necesarias para corregir la incorporacion
errnea de nucletidos de RNA, mientras que tales enzimas estn disponibles para DNA.
Muchos patgenos veterinarios importantes estn en la categora de virus altamente mutables,
ej. el virus de la enfermedad del pie y boca, virus de la diarrea viral bovina, virus de la influenza,
virus de la distemper canina, virus de la rabia, corona virus y rotavirus.
Los virus de RNA con genomas segmentados, ej. los virus de la influenza, rotavirus, y orbivirus
(lengua azul), pueden, adems de la mutacin, intercambiar segmentos individuales de cidos
nucleicos cuando dos virus diferentes del mismo grupo se replican concomitantemente en el
mismo individuo. Siempre y cuando estos cambios genticos que ocurren continuamente
involucren importantes determinantes antignicos, las vacunas basadas en el genotipo viejo se
vuelven ineficientes. Adems, algunas de las vacunas manufacturadas al presente exhiben
patogenicidad residual y causan efectos laterales indeseables tales como eritema local e
hinchazn, fiebre, irritabilidad, convulsiones, seizures, shock, dao cerebral irreparable, y an la
muerte (4, 10, 11).
Ms an, la visin simplista de que la respuesta inmune conduce a proteccin, an si el mismo
m.o. est involucrado, no puede mantenerse ms. Esto est bien demostrado en el caso de la

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fibre por infeccin con el virus del dengue hemorrgico (12). En este caso el anticuerpo
especfico ha estado implicado en el incremento de la patogenicidad por facilitacin de la
entrada del virus en los macrfagos, seguido por la prdida de la funcin de los macrfagos. Se
sospecha que el mismo mecanismo se da con el VIH (13-15). Por tanto, es obvio que la idea
tradicional de usar organismos enteros no patognicos o subunidades burdamente purificadas
para estimular respuesta inmune contra agentes infecciosos patognicos tiene que ser
abandonada a favor de anlisis ms meticulosos de los mecanismos inmunoprotectores, y los
determinantes antignicos involucrados.

Las vacunas convencionales tambin pueden no tener xito en situaciones donde la

inmunopatologa, tal como la inmunosupresin, hipersensibilidad, inflamacin crnica,
potenciacin de la infeccin por anticuerpos, o autoinmunidad desencadenada por mimetismo
antignico (inmunidad contra tejidos normales provocada por antgenos microbiales que imitan
antgenos de tejidos normales), es prominente. Por tanto, el desarrollo de vacunas se debe
basar en un conocimiento slido de las estructuras antignicas superficiales elementales

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(epitopes o determinantes antignicos), dado que ellos pertenecen a la proteccin e

inmunopatologa. De otro modo, las vacunas pueden conducir a la potenciacin de la
enfermedad como est perfectamente documentado con las vacunas del virus del sarampin y
del virus de sincicial (16, 17). La gente vacunada con estas vacunas inactivadas, cuando son
infectadas naturalmente, desarroll sntomas clnicos ms severos que los controles no
vacunados. La razn para esto parece ser la modificacin antignica de la protena de fusin
debida a procesos de inactivacin. Por todas estas razones, el inters en desarrollar vacunas
de segunda generacin se est incrementando grandemente.
Vacunas de nueva generacin
Las nuevas vacunas se caracterizan por el uso de tcnicas que involucran DNA recombinante,
anticuerpos monoclonales e ingeniera de protenas (sntesis qumica de antgenos proteicos).
Estas tcnicas se llaman comnmente y quizs inapropiadamente biotecnologa.
La confusin algunas veces deriva de dos usos diferentes de la palabra biotecnologa. Fuera
del significado limitado de la palabra, usado para indicar tecnologas de DNA recombinante e
ingeniera de protenas, este trmino se usa con frecuencia para incluir todas las tecnologas
biolgicas. sto causa confusin, nos gustara usar esta oportunidad para argumentar contra la
terminologa ambivalente que encierra implicaciones que llegan ms alla, ej en la distribucin de
los fondos de investigacin por agencias de donacin. Mientras que el DNA recombinante y la
ingeniera de protenas son indudablemente tecnologas estratgicas de importancia nacional
extremadamente alta, otras tecnologas biolgicas no tienen la misma importancia. Creemos
que Canad no est ganando con la tecnologa del DNA recombinante en la extensin que
algunos otros pases estn, parcialmente porque los recursos correctamente marcados para la
tecnologa estratgica de DNA recombinante ha sido dirigida con frecuencia a otras reas
debido al resquicio de terminologa ambivalente.
Esta seccin sobre los esfuerzos actuales hacia la produccin de vacunas est organizada bajo
los siguientes apartados:
1.0
Vacunas subunitarias
1.1
Preparacin de antgenos protectores mediante tcnicas de DNA recombinante (clonado
de los genes correspondientes a partir de m.o. patognicos en hospederos de expresin
procariotes y eucariotes).
1.2
Pptidos sintticos
2.0
Vacunas antiidiotpicas
3.0
Vacunas vivas atenuadas y virales recombinantes
3.1
Atenuacin por mutacin
3.2
Seleccin de mutantes de epitope usando anticuerpos monoclonales neutralizantes.
3.3
Virus recombinantes usados como vectores para antgenos protectores heterlogos.
4.0
Adyuvantes
1.0 Vacunas subunitarias
Los patgenos enteros, tales como bacterias y virus, contienen muchos antgenos. Cuando
esos agentes completos estn en una vacuna, no todos los antgenos estn involucrados en la
respuesta protectora del hospedero; algunos pueden causar hipersensibilidad,
inmunosupresin, u otros efectos laterales (11). Sin embargo, al usar los puros antgenos
protectores (vacunas subunitarias), se pueden evitar esos problemas. Hay dos vas bsicas de
preparar vacunas subunitarias:

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1. los componentes se pueden purificar a partir de agentes infecciosos mediante el uso de

tcnicas fsico-qumicas convencionales. Las exotoxinas bacteriales de Corynebacterium
diphtheriae y clostridium tetani pierden toxicidad pero retienen antigenicidad despus de la
inactivacin con formaldehdo. Estos toxoides son capaces de provocar la formacin de
anticuerpos neutralizantes en contra de las exotoxinas. Las citotoxinas de los
sobrenadantes de los cultivos de Pasteurella haemolytica han sido usados exitosamente
para vacunar ganado contra la pasteurelosis pneumnica (5,6).
2. En segundo lugar, se pueden preparar mediante tecnologa de DNA recombinante o por
sntesis qumica (ingeniera de protenas). La investigacin que precede la produccin de
tales vacunas debe indentificar primero los pptidos inmunolgicamente relevantes. Antes
de que un pptido sea usado en una vacuna, se lo debe identificar como
inmunolgicamente relevante. Esto se puede hacer de varias maneras (18). Los fragmentos
obtenidos mediante protenas nativas aisladas y qumica o enzimticamente partidas son
filtrados en funcin de su capacidad para enlazar anticuerpos especficos o para interferir
con la interaccin entre anticuerpos y antgenos intactos. Tambin se usan estudios
cristalogrficos de las estructuras tridimensionales de las protenas (11). La cristalografa de
rayos X (anlisis tridimensional de la protena pura cristalizada) suministra informacin
sobre la movilidad atmica relativa de diferentes regiones de la protena. Esto es importante
porque se ha mostrado que reas mviles en las protenas son ms probables de enlazar
anticuerpos a pptidos sintticos que las reas menos mviles (19). En algunos casos el
determinante antignico se puede identificar mediante un grfico de hidrofilicidad (20). El
punto del promedio local ms alto de hidrofilicidad en la secuencia de aminocidos de una
protena antgeno est localizada invariablemente en, o inmediatamente adyacente a, un
determinante antignico. Esto puede ser mas bien identificado rpidamente mediante
programas de computador, una vez que se conoce la secuencia de nucletidos del
determinante en cuestin.
Otro enfoque para identificar epitopos de una protena dada es sintetizar sistemticamente
pptidos que se superponen de protenas previamente identificadas y medir su reactividad
con los anticuerpos contra la protena nativa. Los pptidos que muestran la ms alta
reactividad presumiblemente contienen epitopos (11). Los epitopos inmunognicos pueden
ser continuos (por ej. una secuencia lineal corta de aminocidos) o discontinuos (ej.
residuos lineales distantes que se aproximan mediante el plegado para formar el epitopo)
(21). Un epitopo discontinuo puede ser imitado mediante secuencias lineales sintticas de
solo aquellos aminocidos que participan en la formacin de aquel epitopo. El exceso de la
secuencia de aminocidos es removido del epitopo discontinuo, y tales secuencias de
aminocidos se llaman minotopes porque imitan los epitopos continuos (11).
Hemos dado anteriormente las principales razones para la necesidad de incluir en la vacuna
solo los epitopos que provocan la inmunidad protectora. Sin embargo, la reduccin del
tamao de los antgenos de la vacuna da como resultado el debilitamiento de la
inmunogenicidad, debido a la carencia de estructuras circundantes que normalmente actan
como portadores inmunolgicos. Por tanto, a fin de estimular un alto nivel de proteccin, los
pptidos son acoplados frecuentemente con molculas portadoras ms grandes tales como
la albmina de suero bovino, o la hemocianina de la lapa de ojo de cerradura (una
metaloprotena grande multisubunitaria que se encuentra en la hemolinfa de la lapa ojo de
cerradura gigante que vive en las costas de california desde la baha de monterrey a la isla
de asuncin de baja california). A pesar de que esto parece contrario al esfuerzo original
para reducir el tamao del pptido, esta vez el exceso de protena es inerte con respecto a
la patogenicidad. Se consigue acoplar los pptidos pequeos y las molculas de protena
portadoras con glutaraldehdo, reactivos bifuncionales tales como N-succinimidil 3-[2-piridil

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ditio] propionato, o dihidrocloruro de bencidina (19). La investigacin sobre los adyuvantes

como medios de incrementar la inmunogenicidad de los pptidos pequeos se discutir ms
tarde. Una vez que el pptido inmunognico ha sido identificado, se puede conseguir la
produccin en masa mediante clonado del gen en un vector, o por sntesis qumica.
1.1 Preparacin de antgenos protectores por tcnicas de DNA recombinante (clonado de
los genes correspondientes a partir de m.o. patognicos en hospederos de expresin
procariticos y eucariticos).
Desde 1981, cuando Kleid y colaboradores tuvieron xito en la clonacin del polipptido
antignico VP3 del virus de la enfermedad de la boca y del pie en E. coli y lo prepararon como
una vacuna usada para ganado y cerdo (22), se han hecho muchos intentos para utilizar
tcnicas de DNA recombinante para preparar vacunas. Este mtodo se basa en el hecho de
que una porcin seleccionada de un genoma de patgeno (uno que codifica para determinantes
antignicos importantes para la induccin de la inmunidad protectora) se puede expresar en, y
purificar a partir de, clulas vectores de bacterias, levaduras, o mamferos (23). Hasta aqu, los
genes para componentes de bacterias, parsitos protozoos, virus, y genes para toxinas han
sido clonados y expresados en E. coli, Salmonella typhimurium, Sacaromyces cereviciae, y
otros vectores (23-25). Un polipptido manufacturado a travs de esta tecnologa se puede usar
como una protena de fusin que contiene, aparte del pptido antignico de inters codificado
mediante la secuencia de DNA insertada, un pptido codificado para las secuencias de DNA
adyacentes al vector. Estas secuencias extra pueden servir como portadores inmunolgicos,
haciendo innecesarios no solo la ruptura y purificacin sino tambin la conjugacin a una
molcula de portador.
1.2 pptidos sintticos
En 1971, Arnon et al reportaron que pptidos qumicamente sintetizados podan inducir la
produccin de anticuerpos hacia la protena intacta (26). Desde aquel tiempo, pptidos
sintticos que imitan componentes de virus, bacterias y parsitos han sido ampliamente
estudiados. Se ha mostrado que estos pptidos suscitan anticuerpos y proteccin frente al
virus de la enfermedad del pie y la boca (27), el virus de la influenza humana (28), y el virus de
herpes simplex 2 (29). Un problema difcil en la preparacin de vacunas para algunos
patgenos es causado por su antigenicidad mltiple y sin sentido (a la derivado) drift antignico.
La induccin de la respuesta inmune contra secuencias tipo comunes o conservadas de un
organismo podran estar mediadas por vacunas multivalentes construidas para contener las
secuencias deseadas. Tales productos han comenzado a emerger en el estudio del virus de la
influenza humana, donde un pptido hbrido sinttico que contiene determinantes antignicos
de ms de una cepa, y que facilita la proteccin contra todas estas cepas, ha sido descrito. Se
ha reportado que un pptido sinttico enlazado covalentemente a fragmentos copia de
antgenos de Streptococcus pyogenes, de la toxina de la difteria, virus de la hepatitis B y del
Plasmodium knowlesi estimula la produccin de altos niveles de anticuerpos para cada uno de
estos antgenos (30). Un pptido sinttico que representa los 37 aminocidos carboxilo
terminales de la subunidad beta de la gonadotropina chorionica humana tambin ha sido usado
como vacuna. Esta vacuna redujo significativamente la velocidad de fertilidad de baboons,
sugiriendo la posibilidad de una ruta no quirrgica nueva para esterilizacin de animales (31).
2.0 Vacunas antiidiotpicas
Los anticuerpos son protenas, y como tales son antignicos cuando son tomados de un animal
e inoculados en especies no relacionadas.sto fue descrito primero por Kunkel y colaboradores
(33) en 1963 cuyos estudios, contrariamente a la opinin entonces aceptada, demostraron que
los anticuerpos individuales podran provocar anticuerpos secundarios en otras especies. El
grupo de epitopes que se encuentran dentro de regiones hipervariables de enlazamiento al

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antgeno de los anticuerpos se conocen como idiotipos (Id). Las regiones hipervariables de las
molculas de los anticuerpos secundarios, complementarias a los idiotipos, tienen una
configuracin del antgeno que da lugar al idiotipo (34).
Los idiotipos y antiidiotipos, como cualquier otro par de antgenos y anticuerpos, tienen una
complementaridad de llave cerradura a sus superficies tridimensionales. En 1974, la teora de la
red para regular la respuesta inmune basada en el fenmeno descrito antes fue propuesta por
Jerne (35). Jerne razon que la respuesta del hospedero a un antgeno es controlada por una
serie de reacciones idiotipo-antiidiotipo que podra incrementar o suprimir la respuesta inmune
al antgeno. Un idiotipo dado est bajo el control de un anti-Id, o Ab-2, mientras el anti-Id puede
ser regulado por otro grupo de anticuerpos conocidos como anti-anti-Id, o Ab-3. Este grupo
complejo de reacciones opera va un mecanismo de retroalimentacin para controlar la
respuesta inmune (36). Cuando el equilibrio de la interaccin idiotipo-antiidiotipo se rompe
mediante inmunizacin con un antgeno, una interaccin Id particular domina y una respuesta
inmune sera inducida (37). La propiedad inmunolgica doble de los idiotipos, tambin conocida
como Ab-1, ha sido bien documentada (36-38). El anti Id inducido cuando se usa el idiotipo
sobre Ab como antgeno es nuevamente complementario, y por tanto imita la estructura del
determinante del determinante antignico original (36). Para el diagrama vea la Figura 1.
Una nueva estrategia de vacunacin ha sido extrapolada a partir de esta teora, concretamente
empleando anti Id en las vacunas como antgenos subrogantes. Se podra inducir las
respuestas inmunes humoral y mediada por clulas (40, 41). Esto sera especialmente til
cuando solo la inmunidad a un nico epitope de un agente infeccioso es adecuada para la
proteccin. Las vacunas anti-Id tendra algunas ventajas. Primera, tal vacuna podra no
contener cido nucleico o protenas indeseables e incrementara la seguridad de la vacuna. Se
ha reportado que la vacuna anti-Id fue capaz de estimular una respuesta inmune en recin
nacidos insensibles a esa edad a antgenos polisacardeos (39). Esto proporciona una forma de
eludir la insensibilidad a antgenos bacterianos capsulares en neonatos (19, 37, 38). Las
vacunas anti-Id son buenas candidatas para la manufactura de vacunas en las cuales los
antgenos son polisacridos y carbohidratos porque estos no pueden ser producidos por
tecnologa de DNA recombinante. Con el uso de tcnicas de anticuerpos monoclonales, los
anticuerpos anti-idiotpicos se pueden hacer a partir de antgenos impuros, y, una vez que se
establecen los hibridomas requeridos, la produccin en grandes cantidades es mas bien no
cara. Alternativamente, los anti-idiotipos usados en vacunas podran ser sintetizados
qumicamente (por ingeniera de protenas) (33).

Figura 1. Representacin esquemtica de un

anticuerpo antiiodiotpico que sirve como
antgeno en vacunas. Note que la forma del
sitio de enlazamiento (idiotipo) del anticuerpo
antiidiotipo es la misma que aquella del epitope
del antgeno. Por tanto, el idiotipo de un
anticuerpo anti-idiotpico imita el epitopo (tiene
la misma propiedad antignica) que fue usada
en la produccin del primer anticuerpo, que fue
usadas subsecuentemente para producir
anticuerpo antiidiotpico.

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Mtodo para construir una vacuna de vector

vrico que porta un gen seleccionado de otro
virus.
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Inspirados por la teora de Jerne, Sacks iniciaron la vacuna anti-Id contra la tripanosomiasis
africana experimental (42). Desde entonces, se ha usado la anti-Id para inducir respuestas a
antgenos asociadas con un gran nmero de parsitos, bacterias y virus (Tabla 2). Se ha
mostrado que la anti-Id se liga al idiotipo desplegado en los tumores de las clulas B y causan
inhibicin del crecimiento o lisis de estos tumores sin afectar los tejidos normales (43, 44). Este
mtodo inmunoteraputico proporciona una exitante nueva va para la terapia de la leucemia
bovina, algunas formas de la leucemia felina, y otros tumores de las clulas B. A pesar de la
considerable cantidad de informacin disponible el uso de las vacunas anti-Id est an en la
fase experimental (19).
3.0 Vacunas vivas atenuadas y virales recombinantes
En el pasado, muchas vacunas atenuadas fueron producidas pasando el agente etiolgico a
travs de un hospedero no natural, y fueron usadas exitosamente sin el conocimiento de la
base gentica subyacente. Avances recientes en gentica viral y biologa molecular
proporcionan la base para la construccin racional de mutantes atenuados estables para usar
en inmunoprofilaxis.
3.1 Atenuacin por mutacin
La atenuacin se puede alcanzar tericamente mediante cualquier mutacin que disminuya la
capacidad de replicarse de un virus en un hospedero. Se estableci que en el caso del virus de
la rabia, la atenuacin est asociada con la sustitucin de un solo aminocido (79). Una
propiedad esencial de cualquier vacuna viral viva atenuada es la estabilidad de la atenuacin
del fenotipo. La reversin a la patogenicidad ocurre primariamente por supresin, por ej,

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mediante el desarrollo de un segundo sitio de mutacin que corrige el defecto causado por las
mutaciones originales. Por tanto, la atenuacin del fenotipo debe ser estabilizada induciendo
tantas mutaciones como sean consistentes con la viabilidad e inmunogenicidad satisfactoria
(79). Los mutantes por supresin, tales como aquellos usados recientemente para el virus de la
pseudorrabia (gen suprimido el de la timidina quinasa)(81,82), debe ser estable porque la
ausencia de un gen no puede ser sustituido por una mutacin en cualquier sitio del genoma. Se
ha mostrado que los mutantes de supresin del virus del herpes simplex han reducido la
capacidad de ser reactivados a partir de las clulas de los gnglios (83). La eliminacin de un
gen adicional en el caso del virus de la pseudorabia hace a la respuesta inmune a esta vacuna
vrica distinguible de aquella contra los virus salvajes (81). Este es un rasgo muy deseable para
los esfuerzos de erradicacin porque los cerdos infectados con virus salvajes de pseudorabia
albergan el virus patognico de por vida, con la posibilidad de derramamiento en cualquier
momento.
3.2. Seleccin de epitopes mutantes usando anticuerpos monoclonales neutralizantes
La atenuacin tambin se puede alcanzar seleccionando mutantes espontneos de un virus
que resiste neutralizacin por anticuerpos monoclonales neutralizantes (nAb). Sin embargo,
solo unos pocos de estos mutantes exhiben atenuacin, y ms bien pueden revertir fcilmente.
El hecho de que los mutantes resistentes a la neutralizacin por mAB de retrovirus
neurovirulentos son estables (80) indica que este enfoque podra ser frutfero con al menos
algunos virus.
Anticuerpo neutralizante (NAb) es un anticuerpo que defiende a la clula de un antgeno o
cuerpo infeccioso inhibiendo o neutralizando cualquier efecto que tenga biolgicamente. Ej. la
antitoxina de la difteria que puede neutralizar los efectos biolgicos de la toxina de la difteria.
3.3 Virus recombinantes usados como vectores para antgenos protectores heterlogos
Los virus recombinantes que expresan genes forneos de organismos patognicos son un caso
especial de vacunas virales vivas. Tales vacunas no han sido licenciadas an, pero las altas
expectaciones por estas vacunas se reflejan en los intensos esfuerzos de investigacin ahora
en camino en muchos laboratorios preocupados con vacunas contra importantes patgenos
veterinarios y humanos. Con el uso de tecnologa de DNA recombinante, se puede construir
virus genticamente alterados portadores de genes forneos que codifican para determinantes
antignicos de otros patgenos. Los genes forneos se deben expresar sobre la superficie de
aquellos virus, y los virus se deben replicar en una especie vacunada sin ningn efecto
peligroso para el hospedero. En el proceso de infeccin limitada por s misma con el virus
recombinante, los animales vacunados sern inmunizados concomitantemente contra el agente
del cual se adquiri el gen forneo.
Mucha de la investigacin hecha hasta aqu ha sido con el virus vaccinia como vector. Los
rasgos biolgicos que influenciaron el intenso inters en el virus vaccinia incluyen un DNA
genmico cercano a 200,000 pares de bases que permite el reemplazo de muchos genes sin
afectar la capacidad del virus para crecer en cultivo de tejidos (59). El virus vaccinia tambin
tiene un sistema de transcripcin codificado por el virus con secuencias regulatorias nicas,
aparente ausencia de empalme de RNA (exclusin de algunas secuencias de nucletidos del
mRNA despus de la transcripcin del DNA), y un sitio citoplasmtico de replicacin (60). El
procedimiento para la insercin del gen inmunizante forneo en el virus vaccinia es descrito
esquemticamente en la Figura 2.
El protocolo para insertar genes forneos en el virus vaccinia involucra, primero, el clonaje
molecular de aquel gen. El gen que codifica para el determinante antignico de inters

Traducido por: Cecilia Carpio

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previamente identificado es secuenciado. Una vez que se conoce la secuencia, endonucleasas

de restriccin especficas pueden usarse para disectar el gen, y luego el gen es insertado
dentro de un vehculo de clonado conveniente (con mayor frecuencia el plsmido pBR 322)
mediante ligazn. Al mismo tiempo, secuencias regulatorias transcripcionales especficas del
virus vaccinia y secuencias a partir de un gen no esencial del virus vaccinia (que determina el
lugar de insercin del DNA recombinante) son clonados en el mismo vector de modo que ellos
flanquean el gen forneo. El plsmido que contiene los insertos quimricos es luego introducido
en clulas de cultivo de tejidos va un proceso llamado transfeccin. Durante la transfeccin las
clulas del cultivo de tejidos son tratadas con CaCl2 para romper la barrera de permeabilidad de
la membrana celular, lo cual a su vez facilita la entrada del plsmido (61). Concomitantemente,
las clulas son infectadas con el virus vaccinia infeccioso eso es para incorporar las nuevas
secuencias de DNA hbrido. El virus vaccinia contacta las secuencias de DNA del plsmido
recombinante durante su replicacin, y a travs de recombinacin incorpora el DNA plasmdico
dentro de su propio DNA. La secuencia del virus vaccinia en el plsmido sirve como el lder para
la incorporacin en el sitio predeterminado. Una vez que esto ocurre, la replicacin del virus
vaccinia contina. Despus de la maduracin y liberacin, un nuevo virus vaccinia recombinante
es identificado entre los viriones por un ensayo inmunolgico tal como RIA (62), por hibridacin
de cido nucleico (63), o por otros mtodos basados en sus caractersticas fenotpicas (62, 63).

Fig. 1. Mtodo para construir un vector para vacuna vrica que porta un gen seleccionado de otro virus. TK = gen de
timidin quinasa del virus de vaccinia; BudR = Bromodeoxiuridina; codones de inicio ATG y parada-TAA para la
traduccin denotan la secuencia fornea de DNA a ser insertada en el virus de vaccinia.

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El uso de virus vaccinia recombinante tiene varias ventajas sobre los otros tipos de vacunacin.
El rasgo ms importante es su capacidad para estimular la inmunidad humoral y mediada por
clulas (19, 62,64). Se ha demostrado que el virus recombinante sonsaca ambas respuestas
inmunes, la primaria y la secundaria (61). Ms an los productos expresados por el virus
vaccinia recombinante estn adecuadamente glicosilados, procesados, y transportados a las
membranas, y consecuentemente imitan el estado nativo de los antgenos. Los genes nativos
son expresados por tanto en una manera similar a la sntesis nativa y estos presentan un
autntico antgeno para el sistema inmune (59). Esto no es cierto para los productos preparados
por expresin del gen en vectores de expresin procariotes y eucariotes. La estabilidad trmica,
la economa de manufactura y la facilidad de administracin son ventajas adicionales de estas
vacunas. La posibilidad de incluir genes responsables para la inmunizacin y excluir genes que
podran causar efectos laterales indeseables proporciona una base para la mayor seguridad de
estas vacunas. Se pueden tambin insertar mltiples genes en el virus vaccinia para producir
vacunas polivalentes para agentes que exhiben un nmero de protenas inmunognicas (62).
El obstculo ms serio para licenciar estas vacunas ha sido la preocupacin pblica sobre la
seguridad de la posible liberacin medioambiental de virus recombinantes. Hay una
preocupacin adicional con las vacunas recombinantes de vaccinia, la cual se basa en la
patogenicidad del mismo virus vaccinia no alterado para humanos con funciones inmune
mediadas por clula daadas. Se conoce que el virus vaccinia causa infecciones severas,
generalizadas raras en individuos con inmunodeficiencias del tipo mediado por clulas. As la
posibilidad de esparcirse de estos virus desde animales vacunadoa a humanos, a pesar de ser
remota, presenta otro obstculo para licenciarla. Sin embargo, se han emprendido intentos para
atenuar exitosamente el virus de vaccinia, esperanzadoramente pavimentando la va para
licenciar exitosamente estas vacunas (63).
Durante unos pocos aos pasados, otros virus tales como el adenovirus y el virus del herpes
han sido explorados como vectores. Se mostr al virus aviar como un vector adecuado para
especies aviar y no aviar (64). Las bacterias entercas apatognicas tienen algn potencial
como vectores, particularmente contra patgenos entricos y en situaciones donde la ruta
intestinal de vacunacin podra ser ventajosa (65).
El virus vaccinia es an el ms ampliamente usado con el propsito de producir vacunas
recombinantes. Las principales razones son: la capacidad para crecer en el laboratorio; la
estabilidad en preparaciones liofilizadas; amplio rango de hospederos; facilidad de
administracin (escarificacin u oralmente); y, lo ms importante, un gran genoma que permite
que ms de 25000 pares de bases sean insertaqdas y expresadas relativamente con facilidad.
Los virus quimricos de Vaccinia han sido construidos para expresar la glicoprotena de la
estomatitis vesicular (66), la hemaglutinina del virus de la influenza (67, 68), la protena de la
envoltura del retrovirus (69), la glicoprotena del virus de la rabia (70), y las protenas HA y F del
virus de la peste bovina (71). La lista de patgenos humanos importantes, los componentes
inmunizantes los cuales fueron expresados mediante los virus recombinantes de vaccinia,
incluyen la glicoprotena del virus Lassa (72), la glicoprotena del virus herpes simplex, las
protenas HA y F del virus del sarampin (75), la protena F del virus sincitial humano (76),
antgeno de superficie del virus de la hepatitis B (77), y la protena de la cubierta de HTLVIII/LAV (61). Todos estos virus recombinantes protegieron a animales experimentales contra el
desafo con los virus virulentos correspondientes.
4.0 Adjuvantes

Traducido por: Cecilia Carpio

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La palabra adyuvante viene del latin adjuvare que significa ayudar o incrementar. Los
adjuvantes son compuestos que incrementan la respuesta inmune especfica contra antgenos
coinoculados.
El tamao pequeo de los antgenos producidos mediante las nuevas tecnologas dio como
resultado baja inmunogenicidad, y esto ha conducido a actividad investigativa incrementada
sobre los viejos adyuvantes inmunolgicos, as como a investigacin para adjuvantes nuevos y
ms potentes. A pesar de que la teora sobre los adyuvantes es inmensa, el propsito de este
prrafo es listar las reas de alta actividad investigativa en coneccin con la nueva generacin
de vacunas.
En 1936 Freund desarroll una emulsin de agua en aceite mineral conteniendo micobacteria
muerta, creando as uno de los ms potentes adyuvantes conocidos, el adyuvante completo de
Freund (FCA). A pesar de ser el adyuvante estndar de oro, FCA causa reacciones locales
severas y es considerado txico para uso humano. La emulsin de aceite en agua sin la adicin
de micobacterias se conoce como el adyuvante de Freund incompleto y, siendo menos txico,
ha sido usado en formulaciones de vacunas humanas.
Los adyuvantes de Freunds incompletos (FIA) y completos (FCA) son los candidatos ms
poderosos.Los FCA contienen micobacterias muertas, adems de aceite mineral y emulsificante
presente en FIA. Los efectos laterales indeseables causados por el componente micobacterial
del FCA se puede reducir mediante el uso de derivados del componente activo del
peptidoglicano micobacteral. Otros candidatos que estn en uso o bajo consideracin son la
preparacin de lpido metabolizado, liposomas sintticos y dipptido muramlico sinttico,
hidrxido de aluminio, saponinas que incluyen Quil A y ISCOMs (complejos
inmunoestimulantes), cpsulas biodegradables de liberacin lenta, surfactantes plurnicos
polimricos de bloque, estearil tirosina y estructuras relacionadas, lipopolisacridos bacteriales
y linfocinas (84-90).
En los 1950s, Johnson et al encontr que los lipopolisacridos (LPS) de bacterias Gramnegativas exhibieron actividad adyuvante y los LPS detoxificados o compuestos relacionados
tales como los lpidos A han sido usados como adyuvantes en estudios humanos.
Roles de los adyuvantes
Los adyuvantes se pueden usar para varios propsitos:
i.
Para incrementar la inmunogenicidad de antgenos recombinantes o altamente purificados.
ii.
Para reducir la cantidad de antgeno o el nmero de inmunizaciones necesitadas para
inmunidad protectora.
iii.
Para mejorar la eficacia de las vacunas en recin nacidos, ancianos y personas
inmunodeprimidas;
iv.
O como sistemas de aplicacin de antgeno para la absorcin de antgenos por la mucosa.
El modo de accin de los adyuvantes est bajo investigacin intensiva. Se ha sugerido que los
macrfagos son los blancos primarios para la accin de los adyuvantes y son estimulados para
liberar interleucina 1 que acta sobre las clulas ayudadoras T (Th) y tambin es importante en
las respuestas de las clulas B. Los adyuvantes pueden incrementar la eficiencia de la
interaccin de las clulas B con clulas accesorias y puede aumentar la actividad de las clulas
Th (24).

Traducido por: Cecilia Carpio

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Adems, varios otros enfoques estn siendo contemplados para incrementar la

inmunogenicidad de los antgenos. La lista de posibilidades incluye: conjugacin de pptidos
inmunognicos (construidas por las tecnologas previamente discutidas) con pptidos que
poseen afinidad para receptores de linfocito apropiados o con pptidos que imitan las linfocinas;
adicin de pptidos que incrementan la afinidad de los antgenos para la MHC clase II (MHC II
es una estructura de la membrana de la clula necesaria para la cooperacin entre clulas del
sistema inmune); y uso de anticuerpos bifuncionales con una especificidad para el antgeno y
otra especificidad para la clulas ayudadoras T de las clulas citotxicas (90, 91).
Resumen y conclusiones
La introduccin de las tecnologas del DNA recombinante y de los anticuerpos monoclonales en
los 70s caus la expansin del conocimiento de la estructura molecular de los antgenos
protectores individuales de microorganismos patognicos. Adems, una considerable cantidad
de conocimiento sobre los mecanismos patognicos han sido acumulados a travs de estudios
que utilizaron estas herramientas moleculares. Se vuelve obvio que los mtodos tradicionales
de preparacin de vacunas, a pesar de ser bastante exitosos en muchas situaciones en los
ltimos 100 aos, tendr que ser ahora reemplazado gradualmente por productos de
biotecnologa. Estas tcnicas moleculares harn posible que las vacunas sean construidas para
contener epitopes relevantes para la proteccin y que carezcan de componentes moleculares
que puedan ser peligrosos.
Bibliografa adicional
Nikolai Petrovsky and Julio Csar Aguilar. 2004. Vaccine adjuvants: current state and future
trends. Immunology and Cell Biology. 82: 488-496.

Traducido por: Cecilia Carpio

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