Resultados Prctica 1.

Anabel Milln Leiva

PRCTICA 5: Deteccin de estructuras secundarias de DNA

diferentes al DNA B

Los plsmidos son molculas de DNA de doble cadena circulares. La tensin de torsin de
enrollamiento a la que esta sometido el DNA hace que el plsmido adopte un estado o estructura de
superenrollamiento. Para estabilizar la tensin producida por el desplazamiento de supervueltas y la
obertura del DNA (por ejemplo, en la replicacin y transcripcin) el DNA cambia la estructura de
pequeos fragmentos de manera diferente al DNA B, como por ejemplo, DNA Z.
La endonucleasa S1 reconoce secuencias de DNA y RNA de cadena simple inespecfica de
secuencia. No reconoce estructuras de doble cadena, por lo que resulta de gran utilidad en la
deteccin de estructuras diferentes al DNA B, que dejen un fragmento nucletido en desapareado,
como son los cruciformes, las horquillas o los cambios de estructura de DNA B a DNA Z.
Estudiaremos el estado de superenrollamiento en el plsmido pUC18 de E. coli mediante la
digestin con nucleasa S1 a diferentes concentraciones.
En condiciones normales encontramos el plsmido en modo Circular Covalentemente
Cerrado (CCC), por tanto presentara superenrollamiento que har que este en un volumen ms
compacto.
Cuando se trata de DNA circular con nucleasa S1, el corte en una de las cadenas hace que
se pierda la tensin de superenrollamiento por los extremos libres, y el plsmido se relaja. Este
queda en forma Circular Relajado o Abierto (OC, Open Circle). Una cadena permanece no cortada,
por eso mantiene la estructura circular, pero la otra presenta un nick, y al no estar anclado estos
extremos, puede girar libremente perdiendo la energa positiva de tensin. Esta estructura presenta
la misma masa molecular, ya que no se ha perdido ninguna base, pero ocupa un volumen mayor al
estar relajada.
Si la nucleasa S1 tiene oportunidad, tambin corta la cadena antiparalela simtricamente al
primer sitio de corte, dejando una molcula de DNA lineal (L). Estas molculas presentan los
extremos libres, por tanto no habr ningn tipo de tensin sobre ella ni superenrollamiento.

La deteccin de estos tipos diferentes de estructura del plsmido se puede realizar fcilmente
mirando la movilidad electrofortica en un gel de agarosa. En estos geles la movilidad del DNA en

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una campo elctrico depende de la densidad del DNA. Los tres tipos de estructura que estudiaremos
presentan la misma masa, ya que se trata del mismo plsmido, as que slo afectar a su movilidad
el volumen de las molculas de DNA.
Los plsmidos cerrados, o CCC, presentan un volumen menor como causa de la
compactacin por el superenrollamiento, y tendr una movilidad electrofortica mayor que las
formas OC y L, que no estn superenrolladas.
El plsmido OC ocupan un volumen mayor, pero son menos flexible por presentar una
cadena cerrada. Este tipo de estructura migrara ms lentamente que el resto.
Los plsmidos en que se hayan cortado las 2 cadenas sern lineales, o L, y tendrn un
volumen mayor que los CCC, porqu no presentan superenrollamiento; sin embargo, al tener los 2
extremos libres son ms flexibles y pueden doblarse al desplazarse entre los poros del gel de
agarosa, por tanto su migracin en el gel ser mayor que en la forma OC. La movilidad de
electrofortica de la forma L sera intermedia entre las formas CCC y OC.
Realizaremos diferentes replicas a concentracin de S1 diferente, estas son: 10 u/L, 5 u/L,
1 u/L, 0,5 u/L y 0,15 u/L, para la digestin de 1,5 g de plsmido pUC18.
Al variar la concentracin de enzima obtendremos diferentes tasas de digestin, que estarn
reflejadas en la densidad de las bandas para cada tipo de estructura. Conforme aumente la
concentracin de enzima S1, deber aumentar el nmero de molculas con cortes (OC y Lineal), y
sobretodo con cortes en las 2 cadenas (Lineales).

Resultados y conclusiones.
En la fotografi del gel (Imagen 5.2) se observan las

Imagen 5.1: Movilidad de las

diferentes formas estructurales.

diferentes movilidades obtenidas para cada

grupo y concentracin de enzima utilizada.
La imagen 5.1 muestra un ejemplo de la movilidad de cada
tipo de estructura adoptada por el plsmido.
En el gel se observa que en ausencia de S1, a concentracin 0,
prcticamente todo el plsmido esta en la forma CCC. Se observa una
banda muy tenue que se corresponde a la zona de OC que puede ser
debido a las roturas causadas en el plsmido por su manipulacin,
como el pipeteo o la agitacin fuerte.

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Conforme se va aumentando la concentracin de nucleasa S1 la banda para la forma no

digerida se hace ms dbil y se aumenta la densidad en las bandas de OC y Lineal. En las
concentraciones de 0 a 0,5 unidades/L de S1 slo aparecen las formas CCC y OC, ya que como
consecuencia a la baja cantidad de S1 solo se ha cortado una de las cadenas. Al aumentar la
concentracin de enzima la probabilidad de corte aumenta, y se observa tambin la forma Lineal. A
mayor concentraciones hay mayor nmero de molculas de enzima que pueden actuar, y en nmero
de molculas del plsmido que digiere tambin es mayor, por eso para la concentracin de 10
unidades/L apenas quedan molculas en estado CCC.
Imagen 5.2: Gel electroforesis de la reacciones con nucleasa S1.
A0 A0.15 A0.5 B1 B5 B10 C0 C0.15 C0.5 D1 D5 D10

E0 E0.15 E0.5 F1 F5 F10

En la parte superior de cada pocillo se indica el el grupo al que pertenece la muestra, y la

concentracin de nucleasa S1 esta determinada en el subndice.
Con este mtodo de anlisis solo podemos detectar la presencia de estructuras de cadena
sencilla en el plsmido pUC18, pero no podemos su nmero, ni su localizacin en la secuencia, para
saber si son variables o se mantienen en el mismo lugar. Cuando la S1 corta una cadena se pierde
toda la tensin de superenrollamiento y el plsmido se relaja, deshaciendo el resto de lugares
susceptibles de corte, por tanto, para cada molcula, la nucleasa S1 slo podr cortar en una
posicin, y aunque esta sea diferente entre molculas no podemos diferenciarlas por la movilidad
electrofortica.
Si quisiramos establecer el nmero de lugares susceptibles al corte por la S1 se deberan
hacer varias rplicas de digestiones del pUC18 (o el DNA de inters) con la nucleasa S1.
Posteriormente, el producto de estas digestiones seria digerido nuevamente con endonucleasas tipo
III especificas de secuencia, de las que conocemos el lugar de restriccin. Con solo un enzima de
restriccin no se podra determinar correctamente el lugar de corte por la S1, por tanto se
necesitaran al menos 2 enzimas de restriccin de lugar de corte conocido.