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Descarte de material:
a) Materiais contaminados devem ser colocados nos recipientes prprios, existentes nos
laboratrios. NUNCA deix-los nas bancadas ou pias;
b) Placas de petri devero ser deixadas tampadas sobre a bancada;
c) Lminas fornecidas para visualizao devero ser deixadas sobre as bancadas;
d) Tubos com culturas devero ser deixados nas estantes.
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
Prof Jos Cals Gaspar Jnior
Monitor: Daniel Arajo Gis P. Guerra
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3. LAVAGEM
Os detergentes mais utilizados para lavagem de vidraria e utenslios de laboratrio so
detergentes aninicos, principalmente aqueles que contm compostos alcalinos. Eventualmente pode
ser necessria a aplicao de um agente mais forte para a remoo de resduos mais resistentes
ao dos detergentes (soluo sulfocrmica, constituda de cido sulfrico e dicromato de potssio, e
a soluo alcolica 1N de hidrxido de sdio).
O enxge dos utenslios deve ser feito de forma a garantir a completa remoo dos resduos
de detergente ou outro agente de limpeza utilizado, Os resduos desses compostos podem interferir
com os resultados das anlises, tanto por alterao das caractersticas dos meios de cultura, como por
inibio do crescimento dos microrganismos.
1.1 Procedimentos para lavagem
Remover todo o material descontaminado presente nos frascos e utenslios antes de iniciar a
lavagem;
Mergulhar todo o material em soluo detergente e deixar de molho por 2 horas ou mais
dependendo do grau de aderncia do material a ser removido;
Com o auxlio de escovas e esponjas esfregar os frascos e demais utenslios lembrando de
remover tambm as anotaes de caneta vidrogrficas. No conseguindo uma boa limpeza
(principalmente do material que no pode ser esfregado com escovas) mergulhar em soluo
sulfocrmica ou soluo alcolica 1N de NaOH e deixar de molho por alguns minutos ou ate horas,
dependendo da aderncia do material a ser removido;
Enxaguar bastante, a fim de garantir que nenhum resduo das solues permanea nas vidrarias
ou utenslios.
5. ESTERILIZAO
Todo o material de laboratrio vazio (placas, pipetas, tubo de ensaio, frascos, pinas,
tesouras etc.) pode ser esterilizado tanto em autoclave quanto em estufa de esterilizao. Na
esterilizao em estufa, o material deve permanecer a 170C/1h e, na esterilizao em autoclave, a
121C/15 minutos.
5.1 Uso da Autoclave
Esterilizao de meios e vidrarias: 121C / 15min.
Destruio de microorganismos: 121C / 30min.
Procedimento:
1
2
3
4
5
6
7 Quando todo o ar for removido, deixar que o fluxo de vapor persista por cerca de 3
minutos;
8 Fechar a torneira do vapor;
9 Deixar que a presso interna cresa at 15 lb/pol 2 ou 1 atm, correspondendo
temperatura de 121C;
10 Marcar o tempo;
11 Passados os 15 ou 30 minutos (dependendo o uso: para esterilizar ou
descontaminar), desligar;
12 Esperar que o manmetro volte ao ponto zero;
13 Abrir a tampa da autoclave;
14 Levantar a tampa e remover o material.
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Reduzem o
risco
No alteram o
risco
Aumentam o
risco
Caso 1 (3)
Caso 2 (3)
Caso 3 (3)
n=5
n=5
n=5
c=3
c=2
c=1
Caso 4 (3)
Caso 5 (3)
Caso 6 (3)
n=5
n=5
n=5
c=3
c=2
c=1
Caso 7 (3)
Caso 8 (3)
Caso 9 (3)
n=5
n=5
n=10
c=2
c=1
c=1
Caso 10 (2)
Caso 11 (2)
Caso 12 (2)
n=5
n=10
n=20
c=0
c=0
c=0
Caso 13 (2)
Caso 14 (2)
Caso 15 (2)
n=15
n=30
n=60
c=0
c=0
c=0
Onde:
n = nmero de unidades escolhidas separadamente e inteiramente ao acaso como representativas do
lote, ou seja, nmero de unidades examinadas na amostragem.
c = nmero de aceitao, ou seja, nmero mximo tolervel de unidades com resultados positivos.
(3) = indica um plano de trs classes, no qual o alimento se enquadra em trs situaes, ou seja, o
lote inteiramente aceitvel quando todas as amostras analisadas apresentam resultados abaixo de
m; o lote aceito dependendo dos valores de c quando as contagens esto entre os valores de m e
M; e, finalmente, o lote inaceitvel quando uma ou mais amostras apresentam contagens acima de
M.
(2) = indica um plano de duas classes onde o produto classificado como aceitvel ou inaceitvel,
em funo de um valor ou ndice microbiolgico estabelecido como critrio de aceitao ou rejeio,
representado pelo valor de M.
Definio de m e M:
m = o limite que, em um plano de trs classes, separa o lote aceitvel do produto ou lote com
qualidade intermediria aceitvel.
M = o limite que, em plano de duas classes, separa o produto aceitvel do inaceitvel. Em um
plano de trs classes, M separa o lote com qualidade intermediria aceitvel do lote inaceitvel.
Valores acima de M so inaceitveis.
2.1 Coleta de amostras de alimentos em embalagens individuais
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
Prof Jos Cals Gaspar Jnior
Monitor: Daniel Arajo Gis Pinheiro Guerra
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b) Coliformes a 35C
c) Coliformes a 45C
d) Escherichia coli
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Preparo da Amostra
Misturar bem o contedo da amostra, invertendo o frasco 25 vezes, em arco de 30cm.
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Inocular 10ml da amostra de gua em cada um dos 10 tubos contendo Caldo Lauril Sulfato
Triptose concentrao dupla;
Incubar a 35C/24-48h;
Dos tubos positivos (com crescimento e produo de gs), transferir uma alada bem
carregada da cultura para tubos de Caldo Verde Brilhante Bile e tubos de Caldo E. coli;
NMP/100ml
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
<1,1
1,1
2,2
3,6
5,1
6,9
9,2
12,0
16,1
23,0
>23,0
Mximo
0
0,03
0,26
0,69
1,3
2,1
3,1
4,3
5,9
8,1
13,5
3,0
5,9
8,1
10,6
13,4
16,8
21,1
27,1
36,8
59,5
infinito
12
a) gua para consumo humano em toda e qualquer situao, incluindo fontes individuais como
poos, minas, nascentes, entre outras: ausncia de Escherichia coli ou coliformes a 45C em
100ml.
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2. OBJETIVO
Esta prtica se destina a estimar a carga microbiana em amostras de alimentos atravs de
tcnicas bsicas de contagem de bactrias em laboratrio - Nmero Mais Provvel (NMP) e
Contagem Padro em Placa (CPP) e verificar as caractersticas visuais de colnias de Escherichia
coli e Staphylococcus aureus em seus respectivos meios diferenciais.
3. MATERIAL
Material analisado: Alimentos processados.
Vidraria/equipamento:
lamparina
ou
bico
de
Bunsen;
Placas
de
Petri
Estufa bacteriolgica
4. PROCEDIMENTO
1 PARTE: Diluio de amostra
1. Utilizando pinas, luvas e/ou bisturi estreis, pesar assepticamente 25g
representativos da amostra, de forma a tomar partes diversas.
2. Diluir os 25g da amostra em 225ml de gua peptonada.
3. Homogeneizar. Esta a primeira diluio (10-1).
2 PARTE: Contagem de coliformes em alimentos lcteos e no-lcteos.
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No-Lcteos
1. Transferir 1ml do homogeneizado da amostra para um tubo com 9ml de gua
peptonada ou soluo salina. Esta se torna a diluio 10-2.
2. Proceder da mesma forma a partir da diluio 10 -2 para novo tubo com 9ml de gua
peptonada ou soluo salina, de forma a formar a diluio 10-3.
3. De cada uma das diluies partem sries de 3 tubos com Caldo Lauril Sulfato
Triptose (todos o tubos devem conter tubos Durham). Explicando: da diluio 10 -1
so retirados 3ml que sero distribudos por 3 tubos com o caldo (1ml por tubo). O
mesmo procedimento feito para as demais diluies.
4. Ao final da inoculao, os caldos so incubados em estufa a 35C por um perodo
de 24-48 horas.
5. A contagem de coliformes a 35C feita tomando os tubos de LST com produo
de gs e transferindo uma alada bem carregada de cada cultura para tubos de
Caldo Bile Verde Brilhante (BVB).
6. Incubar a 35C por 24-48 horas e observar se h crescimento com produo de gs.
7. Anotar os resultados de tubos de BVB com gs. Confirmativo da presena de
coliformes totais e determinar o Nmero Mais Provvel (NMP)/g ou ml em uma
tabela de NMP apropriada s diluies inoculadas.
8. A contagem de coliformes a 45C feita tomando os tubos LST com produo de
gs e transferindo uma alada bem carregada de cada cultura para tubos E. coli
(EC).
9. Incubar em banho-maria a 44,5C por 24-48 horas e observar se h crescimento
com produo de gs.
10. Anotar o nmero de tubos de EC com produo de gs, confirmativo da presena de
coliformes fecais e determinar o NMP/g ou ml em uma tabela de NMP adequada s
diluies inoculadas.
Lcteos
1. De cada uma das diluies partem sries de trs tubos com Caldo Bile Verde
Brilhante (todos o tubos devem conter tubos Durham). Explicando: da diluio 10 -1
so retirados 3ml que sero distribudos por 3 tubos com o caldo (1ml por tubo). O
mesmo procedimento feito para as demais diluies. Observe que, neste caso,
partimos direto para a inoculao em BVB.
Procede-se com a mesma metodologia utilizada para alimentos no-lcteos- excluindo a
inoculao em Caldo Lauril Sulfato Triptose- para contagem de coliformes a 35C e a 45C.
16
), semear 0,1ml (de cada diluio) em gar Baird Parker pela tcnica SPREAD
PLATE.
2. Espalhar o inculo com ala de Drigalski por toda a superfcie do meio at que o
excesso de lquido seja absorvido.
3. Ao final da inoculao, as placas so incubadas em estufa a 35-37C por um
perodo de 24 a 48horas.
4. Aps este perodo, observar a presena de colnias negras com alo transparente ao
redor, que caracterizam colnias de positivas de S. aureus.
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5. FIXANDO O CONTEDO
Como se chega o nmero de bactrias nos meios de cultura pela Contagem Padro em
Placa? E pelo Nmero Mais Provvel?
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PRTICA
03
PESQUISA
DE
PRODUTOS
Data:
NATURAIS
ANTIBACTERIANOS
1. INTRODUO
Muitos vegetais contm compostos que so inibidores de crescimento de microrganismos e exercem
papel importante na resistncia destes vegetais a patgenos. Um importante exemplo deste processo
o alho.
A presena de substncias antimicrobianas pode ser verificada atravs de extratos ou partes
homogeneizadas de vegetais colocados frente a culturas de microrganismos.
2. OBJETIVO
Estudar a presena de compostos antimicrobianos em vegetais.
3. MATERIAL
4. PROCEDIMENTO
1. Mergulhar o cotonete na suspenso do microrganismo;
2. Espalhar sobre a superfcie do meio com o prprio cotonete embebido na cultura;
3. Macerar o alho e a cebola, separadamente, em graal,
4. Embeber os discos de papel de filtro no macerado e coloc-los sobre a superfcie do
meio semeado;
5. Incubar a 35C por 2 ou 3 dias e observar os halos de inibio.
RESULTADOS
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FIXANDO O CONTEDO
Pesquise e relate algum outro antimicrobiano natural . Pode ser algum j relatado na literatura ou
algum de conhecimento popular.
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3. Contagem de MESFILOS
POUR PLATE
a) Inocular 1ml de cada diluio em cada placa (duplicata);
b) adicionar aproximadamente 15ml do meio de cultura (PCA), homogeneizar;
c) incubar as placas invertidas a 35C/ 48horas.
4. Contagem de PSICROTRFILOS
SPREAD PLATE
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2. MEIO DE CULTURA
O meio de utilizado o Agar Batata Dextrose (PDA), acidificado com cido
tartrico 10% (esterilizado), para que haja inibio do crescimento de bactrias.
Os bolores apresentaro aspecto cotonoso em funo da presena do
agrupamento de hifas que forma o miclio e as leveduras apresentaro colnias
mucides, ambos em diversas coloraes.
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4. PLAQUEAMENTO E CONTAGEM
SPREAD PLATE
a) Inocular 0,1mL de cada diluio em placas (duplicata) com meio PDA
(acidificado) j solidificado;
b) Espalhar a alquota com auxlio de ala de Drigalski at completa absoro pelo
meio de cultura;
c) Incubar a 25C / 3-5 dias;
d) Contagem: contar as placas que tenham de 25 a 250 colnias.
Aplicar mdia das colnias x 10 =______UFC / g ou UFC / ml (unidade)
diluio
Esquema de Anlise
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