Universidad Nacional del Nordeste

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

y Agrimensura

CTEDRA:

HEMATOLOGA CLNICA
TRABAJOS PRCTICOS

ALUMNO:
GRUPO:.......
AO: 2012

INTEGRANTES DE LA CTEDRA:
PROFESORA RESPONSABLE: BQCA. MARIA CRISTINA GUEVARA
JTP ORDINARIA: BQCA. RINA MARINA TEJADA DE MARTNEZ
AUXILIAR DOCENTE ORDINARIA: BQCA. ALENJANDRA SNCHEZ
JTPs ADSCRIPTOS: BQCO. GONZALO ADRIN OJEDA - BQCA. CLAUDIA PATRICIA
SERRANO - BQCA. VICTORIA IVAN

AYUDANTES ALUMNOS: FLORES EZEQUIEL, TOANES CYNTHIA, DE FRACESCHI

CRISTINA, HOCHMUTH INGRID, RADOVANCICH VIRGINIA, ARECHAVALA
MILAGROS

NMINA DE TRABAJOS PRCTICOS

TP1: HEMOGRAMA 1 (HTO, HEMOGLOBINA, VSG, COLORACION MGG)
TP2: HEMOGRAMA 2 (FRMULA NORMAL, RECUENTO DE GB)
TP3: FRMULA PATOLGICA-ALTERACIONES SERIE BLANCA (MICROSCOPIA)
TP4: ANEMIA ARREGENERATIVAS (MICROSCOPIA)
TP5: ANEMIAS REGENERATIVAS (MICROSCOPIA Y RETICULOCITOS)
TP6: INMUNOHEMATOLOGA (GRUPO Y FACTOR, COOMBS D e I)
TP7: ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINA
TP8: CITOQUMICA
(MICROSCOPIA)

(MPO-PERLS-KLEIHAUER

BETKE)

MEDULOGRAMA

TP9: LMA (MICROSCOPIA)

TP10: LLA-SLPC (MICROSCOPIA)
TP11: LMC-SLPC (MICROSCOPIA)
TP12: HEMOSTASIA PRIMARIA (RECUENTO DE Pq, TIEMPO DE SANGRA, TIEMPO
DE COAGULACIN, RETRACCIN DE COGULO)
TP13: HEMOSTASIA
AUTOMATIZADOS)

SECUNDARIA

(TP,

KPTT,

MTODOS

MANUALES

MODELO DE INFORME (EL INFORME ES INDIVIDUAL)

TP N
GRUPO DE LABORATORIO:
FECHA
NOMBRE Y APELLIDO
1-ACTIVIDADES REALIZADAS (detallar en forma resumida las actividades realizadas)
2- RESULTADOS HALLADOS
Determinacin
Valor hallado
Mtodo
Valores de referencia
3- ELEMETOS OBSERVADOS
Para los TPs de microscopia especificar cada uno de los elementos observados (coloracin y
aumento) as como tambin, en caso de disponer de ellos, datos referentes al cuadro en que fue
encontrado (edad, datos de hemograma, patologa, tratamiento, etc).
Ej. Se observ un frotis con anisocitosis moderada (MGG 40x), correspondiente a un cuadro de
anemia ferropnica en recuperacin (Nio 8 aos, GB: 7300 cel/mm3 GR: 4,18 x 106 cel/mm3
Hb 11,2 g%, Hto: 37 %, VCM: 87,3 fL, HCM 26,7 pg, CHCM 30,2 g%, RDW 18 %, Pq
323x103 /mm3, Tratamiento: Hierro oral)
Ej. Se observaron numerosos esferocitos (MGG 100x) en un frotis perteneciente a un paciente
con AHAI.
4- DISCUSION DE RESULTADOS (variaciones fisiolgicas, patolgicas, posibles causas de
error, procedimientos para la validacin del resultado)

TRABAJO PRCTICO N 1
HEMOGRAMA 1 (HTO, HEMOGLOBINA, VSG, COLORACION MGG)
Ojetivos Generales
- Puesta en prctica de normas de bioseguridad bsicas.
- Prctica de los pasos para la obtencin de muestras de sangre venosa para la realizacin de las
determinaciones incluidas en el hemograma.
- Aplicacin de los criterios necesarios para la eleccin de anticoagulantes en funcin de las
determinaciones a realizar.
- Manejo del material necesario para las prcticas a desarrollar.
- Interpretacin de resultados.
1 -Instructivo para la obtencin de sangre perifrica por puncin venosa
1. Durante la toma de muestra deben guardarse las ms estrictas normas de higiene.
2. El material descartable a usar se abrir slo al momento de su utilizacin y, una vez
manipulado, no podr guardarse nuevamente an cuando se lo considere nuevo.
3. Una vez realizada la toma de muestra, descartar inmediatamente los materiales usados en
recipientes para ese fin.
4. Al momento de hacer la extraccin colocarse los guantes desechables, los cuales se
mantendrn puestos durante todo el procedimiento.
5. Antes de iniciar la toma de muestra, tener TODO el material preparado.
6. Elegir una vena bien visible en el antebrazo, localizndola visualmente y por palpacin.
Colocar el lazo y volver a palpar la vena, indicarle al paciente que abra y cierre el puo para
facilitar la extraccin.
7. Una vez identificada la vena, limpiar el rea circundante con algodn empapado en alcohol.
Dejar secar.
8. En este momento se romper el sello de garanta de la aguja, se la colocar en la jeringa sin
tocar con los dedos, controlando el correcto funcionamiento del mbolo.
9. La aguja se insertar en la vena elegida con el bisel hacia arriba, dejando que la sangre fluya
en la jeringa aspirando suavemente con el mbolo. La escala de la jeringa debe estar visible
(hacia arriba).
10. Despus de la toma, se le indica al paciente que abra la mano, se retira el torniquete y luego
la aguja, presionando el lugar de la puncin con un trozo de algodn seco.
11. LA AGUJA SE DESCARTAR EN EL CONTENEDOR DESTINADO PARA ESE
FIN.
12. La sangre que est en la jeringa se descargar en los tubos o frascos que contienen los
anticoagulantes correspondientes, evitando hacer espuma y homogeneizando
inmediatamente por inversin suave.
13. Rotular los tubos o frascos con los datos del paciente.
14. En el sitio de la puncin se pondr un apsito despus de controlar que no haya ms
sangrado.
15. La persona que hace la extraccin deber quitarse los guantes al finalizar la toma de muestra
y desecharlos inmediatamente. NO REUTILIZARLOS.
16. Si hay algn dato que haya interferido con el procedimiento, aclararlo en el registro de
muestras.
2 - Descripcin de los anticoagulantes usados en Hematologa
Los anticoagulantes se utilizan para obtener plasma o muestras de sangre total para estudiar las
caractersticas morfolgicas y realizar los recuentos celulares. Deben intentar que las clulas
sanguneas a estudiar se encuentren en el estado ms parecido al fisiolgico. Para ello los
anticoagulantes no deben alterar la morfologa de los leucocitos, el tamao eritrocitario, no
producir hemlisis e impedir la agregacin plaquetaria, posibilitando al mismo tiempo el

mximo perodo de conservacin de la muestra (generalmente no ms de 24 horas incluso

refrigerada a 4 C).
Los anticoagulantes ms utilizados son:

EDTA (C10H16N2O8) o sal disdica, dipotsica o tripotsica del cido

etilendiaminotetraactico, actua mediante un efecto quelante sobre el calcio (Ca++),
impidiendo el proceso de la coagulacin al fijarlo. ES EL ANTICOAGULANTE DE
ELECCIN PARA HEMOGRAMA. Este anticoagulante se utiliza fundamentalmente
para la realizacin de recuentos celulares, sobretodo en los autoanalizadores y permite
adems la realizacin del hematocrito y del frotis sanguneo hasta dos horas despus de la
extraccin de la muestra al mismo tiempo que impide la aglutinacin de las plaquetas. Las
sales de potasio tienen la ventaja, respecto a las de sodio, de ser ms fcilmente solubles en
sangre cuando las usamos a partir del producto slido, sin embargo , las tres sales afectan el
tamao del eritrocito, especialmente despus del almacenamiento de la sangre anticoagulada
por espacio de algunas horas. El International Council for Standardization in Hematology
(ICSH) recomienda la sal dipotsica como anticoagulante para recolectar muestras
sanguneas destinadas al recuento y caracterizacin del tamao celular y especialmente
cuando los valores del hematocrito se requieren para la calibracin de los contadores
automticos. El K2EDTA . 2H2O posee un peso molecular relativo de 404,1g; 1g quela 100
mg de calcio inico y el pH para una solucin al 1% es de 4.8 1,0. La cantidad de
EDTA dihidratado agregada a la sangre debe ser de 1.5-2.2 mg/mL. de sangre total. Esta
cantidad es un compromiso entre la cantidad requerida para evitar la coagulacin y la
cantidad a la cual se producen las alteraciones celulares. Los productos habitualmente
comercializados consisten en una solucin equilibrada de sales sdicas y potsicas de
EDTA (0,342 mol/l) pH 7,2, con estas la proporcin recoemendad es 1/100 Ej: 10 L de
anticoagulante para 1 mL de sangre (990 L estrictamente hablando).

HEPARINA SDICA. HEPARINA DE LITIO, es un anticoagulante fisiolgico que acta

impidiendo que la protrombina se transforme en trombina. Estructuralmente es un
mucopolisacrido cido. Los frotis realizados con muestras sanguneas anticoaguladas con
heparina producen en las tinciones panpticas un color azulado y una pseudovacuolizacin
celular por lo tanto no se lo recomienda para tal fin. La proporcin adecuada es de 15-20 UI
(0.1-0.2 mg) de heparina por ml de sangre.

CITRATO TRISDICO, C6H5O7Na3, acta impidiendo que el calcio se ionice, evitando

as la coagulacin. Se utiliza para realizar las pruebas de Hemostasia en una proporcin
sangre: anticoagulante 9:1 (Por Ej.:2mL sangre con 250L anticoagulante); as como
para la velocidad de eritrosedimentacin en una proporcin sangre: anticoagulante 4:1
(Por Ej.: 2 mL sangre con 500 L anticoagulante).

ACD se emplea fundamentalmente en Bancos de Sangre para conservar las unidades de

sangre y estudios metablicos eritrocitarios por permitir una buena conservacin de los
hemates. Se utiliza en una proporcin de un volumen de ACD por cada cuatro volmenes
de sangre. La proporcin de la mezcla del anticoagulante es de: Acido Ctrico 0.9 g, Citrato
disdico 2 g, Dextrosa 2 g, H2O destilada 120 mL.

3 - Recuento de hemates
RECUENTO MANUAL
Consiste en hacer el recuento en una dilucin de sangre entera anticoagulada. Es un mtodo
poco usado debido al elevado error que presenta.

Lquido diluyente: solucin fisiolgica o citrato de sodio 3,8%., o Solucin de Hayem (HgCl2
0,25%, Na2SO4 2,5%, NaCl 0,5%)
La dilucin empleada es de 1/200, para lo cual se mide exactamente:
Solucin fisiolgica o citratada: 3,98 mL
Sangre:
0,02 mL
El recuento se realiza en la cmara de Neubauer (40X) cuyo esquema es el siguiente:

El recuento de hemates se realiza en el cuadrado central, se eligen 5 de los cuadrados que se

encuentran subdivididos en 16 cuadrados pequeos, como se muestra a continuacin:

Las lneas reforzadas, o triples, sirven nicamente como lmites de cada cuadrado que contiene
los 16 cuadrados pequeos. Se deben contar 5 de estos cuadrados. La superficie de este
cuadrado es de 1 mm2 y la cmara tiene una profundidad de 0,1 mm.

Con la dilucin indicada, luego de agitar adecuadamente, se carga la cmara y se cuentan los
glbulos rojos de los 80 cuadrados pequeos (zona sombreada). La cmara puede ser cargada
con un capilar, evitando que queden burbujas y que la misma quede cargada uniformemente.
Considerando entonces, que el retculo tiene 400 cuadrados pequeos en total, el clculo que se
debe hacer es el siguiente:
N x D x FC x ST
TC

= n de glbulos rojos/mm3

Donde:
N: nmero de eritrocitos contados.
D: Ttulo de la dilucin realizada (200).
FC: Factor de correccin de la profundidad, para llevar a 1 mm3 (10).
ST: Total de cuadrados pequeos en la superficie de 1 mm2 (400).
TC: Total de cuadrados pequeos contados.
Causas de error en el recuento en cmara de Neubauer
El recuento manual de eritrocitos tiene un error del 10%, el cual puede deberse a:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.

Errores de extraccin: dilucin o hemoconcentracin. Coagulacin parcial. Hemlisis.

Mala homogeneizacin por agitacin insuficiente de la sangre.
Utilizacin de material mal calibrado, sucio o hmedo.
Falta de suficiente agitacin de la sangre diluida.
Cmara de Neubauer mal ajustada, sucia o mojada.
Llenado incompleto de la cmara Neubauer.
Empleo de cubreobjetos deformable, no rgido.
Clulas mal distribuidas en el fondo de la cmara.
Errores del operador al realizar el recuento.
Errores al efectuar los clculos.

VALORES DE REFERENCIA
Edad
Recin nacidos
Nios (2-12 aos)
Adultos jvenes (12-18 aos)
Adultos jvenes (19-60 aos)

Sexo
ambos
ambos
mujeres
varones
mujeres
varones

Intervalo de referencia
4,7x1012/L - 6,3x1012/L
4,0x1012/L - 5,3x1012/L
4,1x1012/L - 5,1x1012/L
4,5x1012/L - 5,3x1012/L
4,1x1012/L - 5,2x1012/L
4,6x1012/L - 5,9x1012/L

4 - Hematocrito
DEFINICION
El hematocrito (Hto) es la relacin existente entre el volumen de eritrocitos y el volumen total
de sangre, expresado como porcentaje. Est directamente relacionado con la concentracin de
hemoglobina, por lo que su determinacin constituye el procedimiento ms simple para el
diagnstico de anemia. As, un descenso del Hto es indicativo de anemia, mientras que el
aumento lo es de poliglobulia.

El mtodo de referencia para la determinacin del Hto es la centrifugacin de sangre total en

tubo capilar (micromtodo), es una tcnica sencilla, barata y accesible a laboratorios de baja
complejidad.
En la actualidad, todos los autoanalizadores hematolgicos suministran, dentro del contexto del
hemograma automatizado, un valor de Hto que resulta de un clculo electrnico a partir del
Volumen Corpuscular Medio (obtenido por conductividad o campo oscuro) y la concentracin
de eritrocitos. Obviamente este valor obtenido electrnicamente difiere del obtenido por
centrifugacin en que no considera el efecto del plasma atrapado entre los eritrocitos ni el efecto
de las restantes clulas sanguneas, por lo que es siempre algo inferior (1-3 %).
Tanto el Hto. obtenido por microcentrifugacin o por mtodos automatizados, son un buen
parmetro del estado de la serie eritroide.
El Hto refleja la concentracin y no la masa total de glbulos rojos. Por Ej., un paciente en
estado de shock acompaado de hemoconcentracin, el Hto. puede ser normal o alto, an
cuando la masa eritrocitaria total disminuye por la prdida de sangre. Por lo tanto no es
confiable como indicador de anemia poco despus de una hemorragia o una transfusin.
METODO MANUAL
Micromtodo (microhematocrito)
Es una tcnica muy utilizada, por necesitar muy poca cantidad de sangre, muy sencilla y
poderse realizar en gran nmero de muestras a la vez y en muy poco tiempo.
Se utilizan tubos capilares de vidrio de 7 a 7,5 cm. de longitud por 1mm. de dimetro interno.
Heparinizados o no, dependiendo del tipo de muestra (sangre entera anticoagulada o sangre
capilar). Si se utiliza sangre capilar, se desechar la primera gota despus de la puncin.
Se llena el tubo capilar hasta tres cuartas partes de su capacidad con la sangre
(aproximadamente 50 L). El llenado de los tubos se realiza por capilaridad, favoreciendo el
proceso inclinando el capilar hacia abajo a medida que se va llenando. Limpiar con papel o gasa
el capilar y tapar el extremo limpio con plastilina o sellndolo a la llama del mechero. Una vez
cerrados se colocan los capilares en la centrfuga con el extremo del capilar cerrado hacia fuera
y de modo que quede perfectamente equilibrada. Se centrifugan durante cinco minutos a 12.000
rpm. Tan pronto se detiene la centrfuga se extraen los capilares y se procede a su lectura. Esta
se puede realizar con los lectores de hematocrito (ABACO), que nos darn el resultado
directamente, o con una regla milimetrada, aplicando la siguiente regla de tres:
A------- 100
B------- x

x: hematocrito en tanto por ciento

A: longitud total
B: longitud de la parte corpuscular

La determinacin del Hto debe realizarse por duplicado y la diferencia entre los dos valores
obtenidos no debe ser nunca superior a 0,01%.
Causas de error

Las fugas de muestra al no quedar bien sellado los capilares producen una disminucin en
el valor, al perderse mayor proporcin de clulas que de plasma.
El uso de anticoagulantes lquidos provoca un error por dilucin de la muestra
En muestras capilares no descartar la primer gota, produce una mezcla con los lquidos
tisulares que provoca hemodilucin.

En muestras de sangre venosa, el lazo colocado durante un cierto tiempo produce

hemoconcentracin.
La lectura no inmediata de los capilares, provoca que el sedimento de hemates vaya
tomando forma de bisel si el capilar permanece en posicin horizontal.

VALORES DE REFERENCIA ( x 2 DE)

El valor de Hto vara con la edad y el sexo.
Edad y sexo
Hematocrito %
Fraccin
Recin Nacidos
54 10
0,54 0,1
Nios (hasta 10 aos)
38 5
0,38 0,05
Mujeres (18-50 aos)
42 5
0,42 0,05
Embarazadas
39 5
0,39 0,05
Varones (18-50 aos)
45 5
0,45 0,05
5 - Determinacin de hemoglobina: mtodo de la cianmetahemoglobina
FUNDAMENTO
Este mtodo tiene como fundamento la transformacin previa de la hemoglobina en
cianmetahemoglobina (HiCN), que es muy estable y posee un color caracterstico cuya
absorbancia a 540 nm puede ser cuantificada comparndola con la de varias soluciones de
concentraciones conocidas de hemoglobina preparadas a partir del patrn de referencia (curva
de calibracin). Los distintos compuestos de hemoglobina, excepto la sulfohemoglobina que
casi nunca es significativa, se transforman en HiCN segn el siguiente proceso:
Hemoglobina + [K3 Fe(CN) 6] metahemoglobina
Metahemoglobina + [CNK] cianmetahemoglobina
MATERIAL
1. Espectrofotmetro o fotocolormetro: Estos instrumentos deben ser calibrados
peridicamente mediante la solucin patrn de HiCN, preparada de acuerdo a las
especificaciones del International Committee for Standardization in Haematology (ICSH)
2. Tubos: 12 x 100 mm.
3. Sangre venosa total: anticoagulada con EDTA-Na2 (1,5 mg/ml) o con heparina (10 UI/ml).
Puede emplearse sangre capilar.
4. Pipetas volumtricas: de vidrio y de 5 mL.
5. Pipetas automticas: de 20 L, debidamente calibradas.
6. Reactivo de Cianmetahemoglobina:
Composicin (pH 7-7,4)
Ferricianuro potsico [K3 Fe(CN) 6 ]
Cianuro potsico [CNK]
Fosfato monopotsico [KH2 PO4]
Detergente no inico*
Agua destilada hasta

200 mg
50 mg
140 mg
1 mL
1000 mL

Detergentes no inicos: Tritn X-100, Nonic 218, Nonidet/40, Quolac Nic 218.

El detergente no inico facilita la solubilizacin de protenas insolubles y acelera la

transformacin de la hemoglobina en HiCN, de forma que aquella se completa en 3 min.
Este reactivo debe tener un color amarillo plido, ser completamente transparente y tener un
pH entre 7 y 7,4. La lectura de absorbancia a 540 nm utilizando agua destilada como blanco
debe ser igual a cero. Para su conservacin utilizar botellas de vidrio de borosilicato opacas
y mantener a temperatura ambiente (el fro modifica el color del reactivo).
7. Patrn de referencia (solucin comercial): Es una solucin de HiCN cuya absorbancia
corresponde a una determinada concentracin de hemoglobina. Todo patrn de HiCN debe
cumplir las especificaciones del llamado patrn primario de HiCN.
METODO
Se determinar la concentracin de Hemoglobina de una muestra problema siguiendo los pasos
detallados a continuacin:
1. Conectar el espectrofotmetro.
2. Homogeneizar bien la sangre mediante agitacin suave con un sistema automtico
(rodillos/disco giratorio) durante un tiempo mnimo de 5 min o manualmente por inversin
del tubo 20 veces.
3. Pipetear (CON PROPIPETA) 5 ml de reactivo de Drabkin en un tubo de ensayo limpio.
4. Mediante la micropipeta aadir 20 l de sangre homogeneizada al tubo que contiene 5 ml
de reactivo de Drabkin. Al realizar esta operacin, es fundamental eliminar el exceso de
sangre que pueda quedar en las paredes externas del capilar antes de introducirlo en el
reactivo y procurar asimismo que no quede sangre adherida a las paredes internas de la
pipeta.
5. Agitar el tubo mediante inversin (4 o 5 veces) con el fin de conseguir homogeneizar bien
la mezcla sangre-reactivo y esperar un mnimo de 5 min para que se produzca la hemlisis
total y se complete la transformacin de toda la hemoglobina en cianmetahemoglobina.
6. Leer la A de la solucin a 540 nm, utilizando agua destilada como blanco.
7. Para calcular la concentracin de hemoglobina es recomendable disponer de una curva de
calibracin.
Curva de calibracin de hemoglobina
Se toma un Kit. de calibracin con estndar de CC. Normal, de una CC. Alta y otro de una CC
.baja, y se miden las absorbancia de cada una de ellas o se toma un Standard de CC. conocida y
se hacen diluciones mayores y menores que el normal y se miden las absorbancia y se determina
un factor que es el promedio de las tres diluciones. Teniendo que A= . b. C y como b=1 cm
=> A/ = C para facilitar el calculo A . (1/ ) = C donde (1/ )= F y es la inversa de la
pendiente de la curva tendremos que C= F . A. Dicho en otras palabras la recta se ajusta a
una ecuacin del tipo y=ax+b.
Grafico:

10

De esta manera controlo:

La linealidad del equipo
El deterioro que sufre el reactivo
Puedo trabajar con un estndar diario, procesado por cada operador que realiza la determinacin
de hemoglobina, como si fuese una muestra ms y determino el factor del estndar.
Procesando un estndar todos los das:
CONTROLO EL DETERIORO QUE PUEDE SUFRIR EL REACTIVO DESDE EL DIA
QUE SE LO PREPARO Y SE REALIZ LA CURVA.
CONTROLO EL FACTOR HUMANO
CAMBIOS EN LA TENSIN DE
LMPARA DEL FOTOCOLORMETRO

LA

RED

DESGASTE

DE

LA

Causas de error en la determinacin de la concentracin de hemoglobina

La determinacin de hemoglobina est sometida a posibles errores que deben ser tenidos en
cuenta. Algunos de ellos obedecen a caractersticas peculiares del espcimen como la presencia
de hiperlipemia o leucitocitosis intensa (50 x 109/l). No obstante, la mayora de las veces los
errores se deben a defectos tcnicos en la manipulacin y el anlisis del espcimen.
Errores en la obtencin del espcimen de sangre:
1. Errores de extraccin
2. Empleo de anticoagulantes no recomendados
3. Coagulacin parcial de la sangre
Errores de la dilucin:
1. Empleo de pipetas automticas descalibradas u otras pipetas sucias o hmedas
2. No eliminacin del exceso de sangre adherida a las paredes externas del capilar antes de
introducirlo en el reactivo
3. Dilucin incompleta de la sangre en el reactivo
Errores de la transformacin de la hemoglobina en HiCN:
1. Empleo de reactivo de Drabkin mal preparado o vencido
2. Lectura antes del tiempo necesario para la completa transformacin de la Hb en HiCN
Errores de la determinacin:
1. Empleo de instrumentos no calibrados
2. Cubetas sucias o deterioradas
3. Soluciones turbias de HiCN
Errores en la conservacin del reactivo:
1. Congelacin del reactivo, lo que produce transformacin de K3 Fe(CN) 6 en K4 Fe(CN) 6 y
una oxidacin parcial de la Hb.
Conservacin del reactivo en botellas de polietileno: se pierden grupos CN con formacin
exclusiva de metahemoglobina, en vez de HiCN, con lo que los valores de concentracin de Hb
obtenidos son inferiores a los reales.

11

6 - Velocidad de sedimentacin globular (VSG) o Eritrosedimentacin

FUNDAMENTO
El test de velocidad de sedimentacin globular (VSG) mide la sedimentacin de eritrocitos en
su plasma nativo.
VSG es un test no especfico que puede ser utilizado para detectar un amplio rango de
enfermedades y para monitorear el curso evolutivo de ciertas enfermedades crnicas como los
procesos inflamatorios crnicos (artritis reumatoidea, polimialgia reumtica y tuberculosis) o la
respuesta a la terapia, por ejemplo con citostticos (enfermedad de Hodgkin, linfomas y
mieloma mltiple). Sin embargo en ocasiones cuadros tan graves como neoplasias y la cirrosis
pueden presentar una VSG normal. Constituye uno de los tests ms utilizados como screening
en el laboratorio clnico. Se trata de un mtodo sencillo para realizar y que requiere
equipamiento simple.
MECANISMO
El mecanismo por el cual se produce la eritrosedimentacin no est completamente dilucidado,
pero parece obedecer a interacciones electrostticas entre la superficie de los GR y diversas
protenas del plasma que favorecen (fibringeno y globulinas) o disminuyen (albmina) la
agregabilidad de estas clulas.
Desde el punto de vista fsico, este fenmeno depende de los siguientes factores:
a.
b.
c.
d.

Tamao de los GR
Diferencia de densidad entre los eritrocitos y el plasma,
Viscosidad del plasma.
Temperatura.

Estos factores se hallan relacionados entre s a travs de la ley de Stokes si se considera al GR

como una esfera suspendida en un medio infinito (relacin entre la resistencia R que encuentra
una partcula esfrica de radio r al desplazarse en el seno de un fluido de viscosidad a una
velocidad v: R = 6vr
La sedimentacin ocurre en 3 etapas: 1) una etapa en que se produce la aglutinacin de los GR
con formacin de agregados en forma de "pilas de monedas", 2) un perodo durante el cual los
agregados de GR sedimentan a velocidad constante, y 3) una etapa final donde la velocidad de
sedimentacin se hace ms lenta al mismo tiempo que los GR se acumulan en el fondo del
recipiente.
La etapa ms importante es la primera o de aglutinacin, ya que de ella depender la velocidad
de todo el proceso. As, cuanto ms pequeo sean los agregados, ms lentamente se producir
la sedimentacin y viceversa.
Dado que, como se mencion ms arriba, el test tambin est influenciado por la forma y el
tamao de los GR, ste resulta poco confiable como un ndice de enfermedad en la anemia
falciforme o cuando hay una marcada poiquilocitosis.
La velocidad de sedimentacin se incrementa por las altas concentraciones de fibringeno y
otras protenas de fase aguda e inmunoglobulinas. La albmina retarda la VSG. El mecanismo
por el cual el fibringeno y las globulinas facilitan la aglutinacin de GR no se conoce
fehacientemente aunque se cree que actan disminuyendo la fuerza de repulsin que
normalmente existe entre GR debido a su carga superficial o potencial zeta. El potencial zeta es
producido por una intensa carga negativa a nivel de la superficie de los GR, lo que explica que

12

estas clulas se mantengan separadas. La intensidad del potencial zeta depende en gran medida
de la composicin proteica del plasma y especialmente de la relacin entre las concentraciones
de albmina, globulinas y fibringeno. As, mientras la albmina tiende a aumentar el potencial
zeta, las globulinas y sobre todo el fibringeno tienden a disminuirlo. Ello obedece a que tanto
el fibringeno como las globulinas tienen un mayor peso molecular y una conformacin menos
esfrica que la albmina, lo que aumenta la constante dielctrica del plasma y reduce el
potencial zeta eritrocitario. La disminucin del potencial zeta de los GR tiene como
consecuencia una mayor tendencia de stos a agregarse y formar las llamadas pilas de
moneda. De acuerdo con este mecanismo, el valor normal de la VSG resulta del equilibrio
entre las principales protenas plasmticas.
METODOLOGIA
Existen dos mtodos comnmente utilizados para medir la VSG: el mtodo de Westergren y el
mtodo de Wintrobe. Ambos mtodos poseen limitaciones. El mtodo de Westergren es menos
sensible a pequeos aumentos de los factores que causan la sedimentacin de los GR y as
puede ser levemente menos confiable como un procedimiento de screening.
El mtodo de Wintrobe, por el otro lado, puede dar lecturas bajas incorrectas cuando la VSG
Westergren es marcadamente elevada. Ambos mtodos son altamente sensitivos a la relacin
entre el plasma y los GR en la muestra, y un bajo hematocrito causa un aumento no especfico
de la VSG probablemente acelerando la agregacin y reduciendo las fuerzas de friccin entre
los agregados en sedimentacin. Se trataron de aplicar factores de correccin para anemias, pero
no resultaron confiables.
Tradicionalmente, la VSG se ha determinado ms frecuentemente por el mtodo de Westergren
que fue propuesto como mtodo de referencia por el International Council for Standardization
in Hematology (ICSH).
Durante los ltimos aos, han aparecido sistemas semiautomticos para medir la VSG que
emplean soportes especiales y pipetas de material plstico desechable. Estos sistemas, aunque
reproducen exactamente el mtodo de Westergren, se diferencian de ste por su carcter cerrado
(recogida de los especmenes en tubos al vaco que incorporan una cantidad precisa de
anticoagulante) y por el empleo de material complementario (bombas aspirativas) que aumentan
la rapidez y precisin del llenado de las pipetas.
MTODO DE WESTERGREN
Es el mtodo de referencia para medir la VSG. Sin embargo, continua siendo un mtodo poco
reproducible y sometido a diversas variables difciles de controlar, como es la necesidad de
prediluir la sangre.
A. MATERIALES.
A.1 Anticoagulante
Si utiliza citrato trisdico dihidratado (Na3C6H5O7.2H2O) en solucin acuosa 32,08 g/l.
A.2 Tubo de sedimentacin
Se utilizan tubos de vidrio especialmente diseados de una longitud de 300 + 1.5 mm y de un
dimetro de 2.55 + 0.15 mm. El dimetro del tubo debe ser uniforme (+ 0.05 mm) todo a lo
largo del tubo y ste debe poseer una escala graduada con exactitud en mm numerada de 200
mm en el fondo hasta 0 mm. Los tubos estandarizados que cumplen las especificaciones de
ICSH deben aprobados por Comits de Estandarizacin en los diferentes pases.

13

Los tubos deben ser cuidadosamente limpiados en acetona-agua. No se recomienda el uso de

detergentes o dicromatos para la limpieza.
Tubos plsticos descartables: Se fabrican tubos plsticos descartables segn las
especificaciones, los cuales son provistos limpios y secos por el fabricante. Algunos plsticos
resultan inadecuados pues unen GR siendo as ms susceptibles a los problemas de
taponamiento. Otros tubos plsticos se manufacturan recubiertos de agentes que eliminan
hongos o contienen componentes que interactuan con la sangre.
A.3 Gradillas
Las gradillas o dispositivos de sostn estn diseados para sostener los tubos en una posicin
vertical inmvil. Un dispositivo de burbuja niveladora debe formar parte integral de la gradilla
para asegurar que la posicin de los tubos sea vertical dentro de un lmite de 1. La misma debe
estar construida de modo tal que no existan prdidas de sangre cuando el tubo est colocado en
ella.
B. TCNICA
A) La sangre se obtiene por puncin venosa, evitando contaminacin con materiales utilizados
para la higiene de la piel. La sangre se agrega en proporcin de 4 Vol de sangre a 1 Vol
de solucin de citrato de sodio, por ejemplo 2 ml de sangre en 0,5 ml de
anticoagulante. El test debe ser realizado dentro de las 2 hs si la sangre es mantenida a
temperatura ambiente, o dentro de las 6 hs. si es mantenida a 4C.
B) Si la sangre citratada se equilibra a temperatura ambiente, se mezcla por inversin repetidas
veces, y se sumerge un tubo de Westergren en la muestra dejando que la sangre ascienda
por capilaridad. El nivel de la sangre se ajusta a cero.
C) El tubo es colocado en la gradilla en posicin estrictamente vertical a temperatura ambiente
(18-25C), sin exposicin a la luz del sol directa, libre de vibraciones y corrientes de aire,
mantenindolo exactamente 60 min.
D) Una vez transcurrido el tiempo, se lee la distancia entre la superficie del menisco de la
columna eritrocitaria y la parte superior de la columna de sangre situada a nivel de la marca
cero de la escala graduada. El valor de esta distancia, expresado en mm, corresponde al de
la VSG durante la primera hora (mm/hora).
C. VALORES DE REFERENCIA
EDAD (aos)
Nios mayores y 0-15
jvenes
Varones adultos
17-50
51-60
61-70
Mujeres adultas
17-50
51-60
61-70

Valores
de Lmite superior de
referencia (mm)
la normalidad
5 a 10
15
43
63
64
63
95
10 5

10
12
14
12
19
20

14

Factores tcnicos capaces de modificar la VSG

Causas de aumento
Desviacin de verticalidad de la pipeta
Incremento de la longitud y el dimetro de la pipeta
Elevacin de la temperatura ambiente
Dilucin de la sangre
Causas de disminucin:
Reduccin del dimetro de la pipeta
Utilizacin tarda de la sangre (especimen envejecido)
Cambio de anticoagulante
D. INTERPRETACION DE RESULTADOS
Los valores de referencia de la VSG se expresan exclusivamente en mm/h y varan
fundamentalmente con el sexo y en cierto grado tambin con la edad (ver valores de referencia),
el ciclo menstrual, y las medicaciones (corticosteroides, contraconceptivos orales, etc.) La VSG
no parece estar influenciada por las ingestas o por los ritmos circadianos.
Las determinaciones de la VSG a la segunda hora o a las 24 hs, muy utilizadas anteriormente,
han demostrado ser poco fiables y de escasa significacin clnica, por lo que no se recomienda
su empleo.
Existen numerosas patologas con alteraciones proteicas del plasma que cursan con
modificaciones del valor de VSG. Se observan aumentos de VSG en un amplio espectro de
enfermedades principalmente relacionadas a las protenas de fase aguda, y tambin en el
embarazo normal y el puerperio.
Un 10% de los nios normales tambin presentan VSG aumentadas.
La VSG es especialmente baja (0-1 mm) en la policitemia, vera anormalidades de GR
(hemoglobinopatas, esferocitosis hereditaria, anemia falciforme, etc.), hipofibrinogenemia,
defectos cardacos congestivos, y ocasionalmente sin causa aparente.
Adems de estas condiciones que pueden tender a ocultar una alta VSG, es inusual obtener
falsos negativos, por ende, un valor normal de VSG generalmente asegura que no existe
enfermedad orgnica.
Para muestras peditricas o cuando el volumen a obtener ser escaso se puede utilizar las
pipetas de Chattas, estas requieren un volumen de sangre mucho menor (40 L), la tcnica se
realiza de la misma manera pero los resultados deben ser corregidos utilizando un nomograma o
tabla para conversin.

15

NOMOGRAMA DE CHATTAS
Chattas
(mm)
1 a 10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20

Westergren
(mm)
1 a 10
12
13
14
16
18
20
22
24
26
28

Chattas
(mm)
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31

Westergren
(mm)
31
34
38
42
47
53
59
65
71
77
84

Chattas
(mm)
32
33
34
35
36
37
38
39
40

Westergren
(mm)
95
106
120
>120
>120
>120
>120
>120
>120

7-OBTENCIN DEL FROTIS DE SANGRE

Sobre un portaobjetos perfectamente limpio, se coloca en un extremo una gota pequea de
sangre (1-2 mm) recin obtenida, ya se trate de puncin digital, o del taln (en pediatra) o de la
ltima gota de sangre extrada con la jeringa y que se encuentra en la luz de la aguja. Evitar usar
sangre con anticoagulantes porque altera la morfologa de las clulas.
Por medio de otro portaobjetos de borde pulido y al cual se le ha quitado los ngulos (extensor),
se realiza la extensin de la gota de sangre: conservando un ngulo menor de 45 respecto al
portaobjetos horizontal, el extensor se apoya delante de la gota de sangre y retrocediendo hasta
tocarla, una vez que la misma se extiende a lo largo del borde de contacto por capilaridad, se
avanza con firmeza y no muy rpidamente. As se obtiene una fina pelcula de sangre que
representa integralmente a la gota de sangre que se extiende.

Secar rpidamente el extendido al aire para evitar el deterioro de las clulas.

Un extendido as obtenido poseer tres reas de diferente espesor y con distribucin tambin
distinta de leucocitos:
1. Zona excesivamente gruesa: Se encuentra en la regin inmediata al punto de partida de la
extensin (cabeza). En ella hay siempre un aumento del nmero de linfocitos.
2. Zona excesivamente fina: Corresponde al final de la extensin (cola) y en sta se observa un
exceso de granulocitos y monocitos.
3. Zona ideal: Regin central (cuerpo), en ella hay un reparto equilibrado de las clulas.

16

1
3

Para que un frotis sea valido:

1) No debe ser demasiado grueso (los elementos estarn retenidos y no sern identificados.
2) No debe ser demasiado delgado (ser muy pobre en elementos lo que impedira una
lectura conveniente).
3) No debe alcanzar los bordes ni las extremidades del porta (se perderan los elementos
mas voluminosos). La gota debe agotarse sobre el porta.
4) No debe presentar agujeros (utilizacin de portas mal desengrasados) ni estras o flecos
(provocados por un extensor de bordes no esmerilados, irregulares). Conviene elegir el
extensor observando sus bordes en el microscopio para asegurarse de que sean bien
lisos.
5) Debe ser regular (si no, el reparto de elementos es heterogneo y por tanto el recuento
variara segn los campos examinados).
6) Debe ser secado correctamente (un secado defectuoso produce artefactos: hemates
festoneados por ejemplo).
Existen algunas sutilezas que es necesario cuidar:
El tamao de la gota debe ser el adecuado y esto lo enseara la experiencia.
Si ha cado un exceso de gota limpiar el porta con gasa o algodn. Repetir el procedimiento
las veces que sea necesario hasta que la cantidad de sangre sea la adecuada.
Si tuvieran que elegir entre un extendido largo, y uno corto, es preferible el segundo, pero lo
ideal es que ocupe partes de la lamina.
Se prefieren en general los frotis delgados pero el excesivamente fino tiene muchos
inconvenientes: los hemates aparecen poligonales con su claridad central desaparecida, las
plaquetas se destruyen y los leucocitos resultan rotos o distorsionados.
Nunca debe llevarse la gota de sangre por delante del extensor porque producira erosin de
las clulas.
Un buen frotis debe constar de una zona inicial gruesa (cabeza), una zona central mediana
(espesor ideal para la lectura) y la cola delgada terminada suavemente en un borde convexo
sin estras prolongadas que hablan de un extensor defectuoso. Un buen extendido luce como
una pincelada sobre el vidrio.
Aun cuando el frotis sea ideal y el reparto homogneo no se puede evitar una cierta
segregacin de los elementos. Los linfocitos (mas pequeos) predominan en el centro de la
extensin. Los polimorfonucleares y los monocitos son atrados hacia los bordes y cola.
FROTIS ARRASTRADOS: todos los elementos estn en la cola. Deben rechazarse para la
formula.

Defectos observados en frotis con sangre anticoagulada:

1) Impide agrupacin de plaquetas.
2) Los ncleos de los monocitos aparecen como con lbulos, inclusive pueden estar
desintegrados o coloreados ms homogeneamente, ms compactos que con sangre
fresca, el citoplasma puede aparecer vacuolado.

17

Importante:
Lavar y secar bien el extensor entre una y otra extensin
Los portas nuevos deben ser desengrasados con agua jabonosa, enjuagados minuciosamente.
8-COLORACIN DEL FROTIS DE SANGRE
La coloracin se realiza por el mtodo de May Grnwald-Giemsa.
Fundamento
Prcticamente todos los mtodos empleados para teir las clulas de la sangre se basan en el
empleo de una mezcla de eosina y azul de metileno.
Estos colorantes son muy sensibles a las variaciones de pH de las diferentes estructuras
celulares, de modo que las que tienen carcter bsico fijan en mayor medida la eosina (colorante
cido), mientras que las que poseen propiedades cidas fijan principalmente el azul de metileno
(colorante bsico). Esto explica que ciertas estructuras basfilas presentes en el ncleo
(nuclolo) o en el citoplasma (ribosomas) se coloreen de azul, mientras que otros componentes
acidfilos como la hemoglobina adquieren color rosado.
De esta manera, la diferente afinidad de ciertas granulaciones citoplasmticas por dichos
colorantes permite clasificar los leucocitos polimorfonucleares en: neutrfilos, en los que la
granulacin especfica posee compuestos neutros que fijan ambos colorantes simultneamente,
resultando en un color pardo; eosinfilos, en los que la granulacin especfica contiene
sustancias de intenso carcter bsico que fijan fundamentalmente los colorantes cidos, dando
un color rojo-naranja; y los basfilos, cuya granulacin especfica posee sustancias de carcter
cido, que fijan colorantes bsicos dando un color azul oscuro.
Reactivos

Solucin May Grnwald : eosinato de azul de metileno en metanol.

Solucin Giemsa: azul de metileno (clorhidrato de tetrametiltionina), su derivado oxidado

en medio alcalino: el azur II, y eosina (tetrabromofluorescena).

Mtodo
Cubrir el frotis de sangre seco con solucin May Grnwald. Dejar 3 minutos. A continuacin,
agregar buffer fosfato pH 6.8 o una mezcla de agua de canilla con agua destilada en partes
iguales, en proporcin igual a la de colorante. Homogeneizar soplando suavemente con una
pipeta o moviendo el portaobjetos con un movimiento de vaivn. Dejar 3-5 minutos. Volcar,
enjuagar bajo chorro de canilla suave y cubrir el preparado con una solucin de Giemsa,
obtenida a razn de dos gotas del colorante por ml de agua (1/10). Dejar 10- 12 minutos. Lavar
con agua, limpiar la cara inferior del portaobjeto con un algodn y secar al aire.

18

TRABAJO PRCTICO N2
HEMOGRAMA 2 (FRMULA NORMAL, RECUENTO DE GB)
Objetivos generales
-Familiarizarse con el uso de la cmara de Neubauer
-Adquirir destreza en la preparacin de diluciones y manejo de muestras de sangre entera
-Adquirir destreza en el manejo del microscopio y la cmara de Neubauer para el recuento de
glbulos blancos
-Delinear los criterios para la identificacin de glbulos blancos en preparados coloreados con
MGG
-Realizar frmulas leucocitarias en muestras de pacientes sanos
-Interpretacin y validacin de resultados
1- RECUENTO DE LEUCOCITOS
Mtodo manual
1) Agregar 20 l de sangre anticoagulada a un tubo de Kahn conteniendo 0,38 ml de solucin
de Trk. Esta solucin contiene acido actico al 1 % en agua destilada y el agregado de una
punta de esptula de azul de metileno. DILUCION 1/20
2) Homogeneizar la mezcla.
3) Cargar la cmara de recuento
4) Ubicar el reticulado de la cmara con bajo aumento (10X), constatar la ausencia de burbujas
y que la distribucin sea regular.
5) Proceder al recuento de los elementos presentes en los cuadrados angulares grandes (4) de
la cmara. Las cuentas de los cuatro cuadrados no deben diferir entre s en ms del 20%. En
caso contrario debe cargarse nuevamente la cmara.

19

La lectura se realiza en los cuatro campos L. Adems de los leucocitos contados dentro de cada
uno de los cuadrantes, se deben contar todos los leucocitos adheridos en la lnea horizontal
superior y vertical exterior, o de lo contrario, todos los leucocitos adheridos a la lnea horizontal
inferior y vertical interior.
Si el valor obtenido (leucocitos/mm3 de sangre) es menor de 2500, se practica nuevamente el
recuento empleando una dilucin 1:10. Si por el contrario el nmero resulta notablemente
elevado se emplean diluciones 1:100 o 1:200.
6) Clculo:
m x 10 x d
n

= N de leucocitos/ mm3

Donde: m=nmero de leucocitos contados en n (4) cuadrados de 1 mm de superficie y

d=dilucin utilizada, n= nmero de cuadrantes contados.
Valores de referencia
Adultos
Recin nacidos
Nios de 1 ao
Nios de 4 a 7 aos
Nios de 8 a 12 aos

2- DETERMINACIN DE LA
DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS

4.000 - 11.000 / mm3

10.000 - 25.000 / mm3
6.000 - 18.000 / mm3
6.000 - 15.000 / mm3
4.500 - 13.000 / mm3

FRMULA

LEUCOCITARIA:

RECUENTO

En todo frotis coloreado con M.G.G. debe colocarse una delgada capa de aceite de inmersin,
aun para el pequeo aumento a seco. Si no se cumple este requisito la refringencia de los
elementos impide una buena observacin. Para esto es suficiente depositar una gota en un
extremo, aplicar de plano sobre ella otro portaobjetos que puede contener otro extendido en
cuyo caso se harn coincidir ambas caras que los contengan y desplazarlos suavemente unos
contra otros.
La observacin debe hacerse al principio de manera panormica con objetivo de 10X para ver la
dispersin de los elementos. Con este aumento se observaran la presencia de clulas grandes
como los linfocitos hiperbasofilos de la mononucleosis. Por ello debe evitarse la tendencia a
usar e comienzo la inmersin.
Luego se pasa a 40 X aumento que resulta til para evaluar alteraciones de tamao de los
glbulos rojos y finalmente se pasa a 100X para el recuento diferencial de los glbulos blancos
y para la observacin detallada de los elementos sanguneos.
Un extendido correctamente realizado poseer tres reas de diferente espesor y con distribucin
tambin distinta de leucocitos:
1. Zona excesivamente gruesa: Se encuentra en la regin inmediata al punto de partida de la
extensin (cabeza). En ella hay siempre un aumento del nmero de linfocitos.
2. Zona excesivamente fina: Corresponde al final de la extensin (cola) y en sta se observa un
exceso de granulocitos y monocitos.
3. Zona ideal: Regin central (cuerpo), en ella hay un reparto equilibrado de las clulas.

20

Formas de recorrer el preparado

Contar por lo menos 100 leucocitos anotando la cantidad de cada uno de ellos para establecer
los porcentajes. Refiriendo al valor de recuento de glbulos blancos se puede expresar cada tipo
de leucocitos en valores absolutos por mm3 de sangre.
Siempre que sea posible se deben contar 100 elementos, recordar que se est haciendo una
estimacin porcentual de las poblaciones, el recuento de 100 elementos resulta relativamente
sencillo en pacientes con valores absolutos de GB dentro de los valores de referencia. Distinto
es el caso de pacientes leucopnicos con recuento bajos por ej: 1500 GB / mm3 en estos casos
resultar muy tedioso llegar a encontrar 100 elementos para poder expresar en % , por ello es
aconsejable expresar literalmente lo que se vi al observar el preparado por ej: se realiza la
frmula leucocitaria en un paciente leucopnico y solo se logr contar 80 elementos ( pueden
ser 70, 90 dependiendo del tiempo utilizado y del grado de leucopenia del paciente) entonces lo
aconsejable es expresar los resultados de la siguiente manera: DE 80 ELEMENTOS
CONTADOS x son Neutrfilos, y son eosinfilos, z son linfocitos, etc, etc, es decir se
expresa cuantos elementos de cada serie se observ en el total de GB contados Y NO EN
PORCENTAJE!
FORMULA LEUCOCITARIA EN ADULTOS SANOS
LEUCOCITOS
(%)
ABSOLUTO (cel / mm3 )
CAYADOS
0 1%
100 - 250
NEUTROFILOS SEGMENTADOS 55 70 % 3000 - 5000
EOSINOFILOS
14%
20 - 350
BASOFILOS
01%
10 - 60
LINFOCITOS
20 40 % 1500 - 4000
MONOCITOS
48%
100 - 500
No hay variacin de la frmula segn el sexo, pero s segn la edad.
Nacimiento: 70% de neutrfilos.
Primera semana: 50% de neutrfilos y 50% de linfocitos.

21

Segunda semana: 65% de linfocitos y 25% de neutrfilos3-4 aos: 50% de linfocitos y 50%
de neutrfilos.
10-12 aos: valores de referencia del adulto.

Descripcin de cada uno de los elementos que componen una frmula normal

1. Neutrfilos: Ncleo lobulado (2-5 lbulos). Los lbulos estn unidos entre s por filamentos
cromatnicos muy delgados. La cromatina es condensada. Es una clula terminal. Mide
aproximadamente 12 m. El citoplasma es abundante y rosado, cubierto por una
granulacin fina especfica de color pardo rojiza.
2. Eosinfilos: Mide aproximadamente 13 m. El ncleo es segmentado, con predominio del
bisegmentado en forma de anteojo aunque pueden aparecer con ms lbulos. El citoplasma
es abundante y est cubierto de granulaciones esfricas de mayor tamao que las del
neutrfilo y que se colorean de anaranjado.
3. Basfilos: Mide aproximadamente 10 m. El ncleo est irregularmente lobulado. La
cromatina es densa. La masa nuclear es voluminosa con relacin al citoplasma. Las
granulaciones son groseras y muy irregulares en forma y tamao pudiendo quedar
superpuestas al ncleo, cubrindolo parcialmente.
4. Linfocitos: Es una clula generalmente pequea (7 m), pero puede llegar hasta 12 m. La
forma ms pequea posee slo un escaso anillo de citoplasma color celeste. Alrededor de un
10% de los linfocitos circulantes son clulas ms grandes y con citoplasma ms abundante.
El ncleo por lo general es redondo, pero puede tener una escotadura. La cromatina es
densa.
Monocito: Es el leucocito normal de mayor tamao (18-24 m). El ncleo presenta forma
irregular y variada, la cromatina se esponjosa. La proporcin ncleo-citoplasma es
aproximadamente semejante. El citoplasma se tie de celeste plomizo y no presenta
granulaciones.

22

TRABAJO PRCTICO N 3:
ELEMETOS SANGUNEOS NORMALES Y PATOLGICOS
ALTERACIONES DE LA SERIE BLANCA
Objetivos Generales
-Identificar los diferentes elementos sanguneos normales y patolgicos
-Desarrollar criterios para la clasificacin de elementos patolgicos
-Correlacionar los elementos encontrados con diferentes patologas y datos de contador
hematolgico.
GLOBULOS ROJOS:
PROERITROBLASTO (1):
Clula voluminosa (20-30 um. de dimetro)
Ncleo: ocupa la mayor parte de la clula.
Cromatina con aspecto de esponja uno o dos
nucleolos teidos de rosa por el giemsa.
Citoplasma: intensamente basfilo por el gran
contenido de ARN. Presenta sobre uno de los
costados del ncleo una formacin redondeada que
se destaca por su coloracin rosada: el arcoplasma
que corresponde al APARATO DE GOLGI y
CENTRO CELULAR.
Hay numerosos ribosomas. Escasos organoides
membranosos, excepto mitocondrias.

ERITROBLASTO BASOFILO (1):

Tamao: menor (15-18 um.)
Ncleo: menor tamao nuclear. Desaparicin de los
nucleolos. Cromatina condensada en grumos.
Citoplasma: intensamente basfilo. El halo
perinuclear es menos notorio. Contiene mitocondrias.
Ferritina en mayor cantidad formando acumulos.

23

ERITROBLASTO POLICROMATFILO (2):

Tamao: se sigue reduciendo 11-13 um.
Ncleo: menor tamao, se va condensando la cromatina.
Citoplasma: comienza a cargarse de un tinte lilaceo, debido a la superposicin de la basofilia
ribosmica con la acidofilia de la hemoglobina. A medida que los estadios progresan
predominan
los tintes rojizos sobre los azulados. Presentan mitocondrias donde se metaboliza el HEM.
Ferritina en acumulos groseros (siderosomas).
ERITROBLASTO ORTOCROMTICO (2):
Perdi la capacidad de divisin.
Tamao: alrededor de 10 um.
Ncleo: picnotico, retrado.
Citoplasma:
acidofilo
(rosado).Menos
mitocondrias y ribosomas.
Gran cantidad de siderosomas.

RETICULOCITO:
Es la clula anterior que ha perdido el ncleo por
expulsin o lisis (aunque se acepta ms lo
primero).
Contiene todava algunos ribosomas
y
mitocondrias. En un extendido coloreado con
Giemsa aparece de tamao algo mayor que el
glbulo rojo maduro y con una ligera
policromatofilia.
Pero con una coloracin supravital (colorea los
elementos
vivos, fuera del organismo) el
colorante precipita los ribosomas, formando una
sustancia retculo-filamentosa, que toma distintos
aspectos segn la cantidad de ARN que
contienen, siendo los mas maduros aquellos que contienen menos ARN.

GLOBULO ROJO MADURO, ERITROCITO O HEMATIE:

Es un residuo celular desprovisto de ncleo en todos
los mamferos.
Forma: disco bicncavo.
Dimetro: 7,5 um.
Esta recubierto por una membrana cuya estructura
responde al modelo de mosaico fluido, al igual que
todas las unidades de membrana biolgicas.
Tiene forma de disco bicncavo

24

GRANULOPOYESIS:
Durante la maduracin de la serie granuloctica se suceden una serie de cambios morfolgicos
que consisten en la desaparicin de los nuclolos, la reduccin de la relacin ncleo/citoplasma,
la condensacin de la cromatina, la desaparicin de la basofilia citoplasmtica, la aparicin de
las granulaciones primarias o azurfilas en el estadio de promielocito y de las secundarias o
especficas a partir del estadio de mielocito. Por ltimo en esta serie de cambios morfolgicos se
va a comenzar a producir la segmentacin nuclear que se puede apreciar en el metamielocito,
para dar origen al polimorfonuclear en banda o cayado y por ltimo a la clula ms madura de
esta serie, el polimorfonuclear segmentado.
MIELOBLASTO:
Elemento iniciador de la
progenie.
Tamao: aproxim. 20 um.
Ncleo: de gran tamao,
ocupa casi toda la clula, con
una fina membrana nuclear
lisa y delgada y una cromatina
muy fina, muy delicada que
no hace condensacin cerca de
la membrana nuclear. Suele
tomar el aspecto de una red o tamiz. Contiene uno o
dos NUCLEOLOS.
Citoplasma: se colorea de celeste claro, es apenas un
halo alrededor del ncleo tan voluminoso. Con el
microscopio comn no se observan granulaciones. Sin
embargo el microscopio electrnico detecta la presencia
de lisosomas que en otras etapas van a constituir las
granulaciones inespecficas.
PROMIELOCITO:
Tamao: mayor que el
anterior (25-30 um.)
Ncleo: grande, pero la
relacin ncleo citoplasma
es menor. Puede ser
redondo
u
ovalada,
generalmente es excntrico.
La cromatina todava es
laxa, aunque algo menos
que en el anterior. Presenta
NUCLEOLOS.
Citoplasma: presenta una zona clara perinuclear llamada arcoplasma (corresponde a la zona del
complejo de golgi y centro celular). Sigue siendo basfilo y ya son visibles con el microscopio
ptico numerosas granulaciones inespecficas (se llaman as porque no permite identificar a la
clula como precursora de neutrofilo-eosinofilo-basfilo). Tambien son llamadas primarias.
Contienen enzimas y la ms caractersticas es a mieloperoxidasa. Los grnulos primarios son
lisosomas rodeados por lo tanto de unidades de membrana.

25

MIELOCITO (1):
Tamao: 20-25 um.
Ncleo: ya no muestra NUCLEOLOS. La
cromatina
comienza
a
mostrar
condensaciones.
Citoplasma: es todava basfilo, pero
adems de las granulaciones primarias
presenta en la zona del arcoplasma,
granulaciones especficas que permiten
hablar de mielocito neutrofilo-eosinofilobasfilo segn el contenido de sus grnulos
especficos o secundarios. El mielocito es el
ltimo elemento en el cual se presenta
divisin.

METAMIELOCITO:
Tamao: algo menor que el mielocito.
Ncleo: de forma arrionada con cromatina en forma
parcelada, mostrando zonas condensadas. No presenta
nucleolos.
Citoplasma: policromatofilo (intermedio entre azul y
rosado). Predominan las granulaciones especficas. Las
granulaciones primarias son escasas y van poco a poco
perdiendo su coloracion.

GRANULOCITO EN BANDA O CAYADO:

Tamao: menor que el metamielocito.
Ncleo: en forma de C (bastn o cayado)
S o en una banda. Con cromatina condensada,
disposicin parcelada.
Citoplasma:
acidofilo
(rosado)
con
granulaciones especficas o secundarias. Las
granulaciones primarias ya no son visibles al
microscopio comn.
De acuerdo a los grnulos que presenta
ser neutrofilo, eosinofilo o basfilo.

GRANULOCITO MADURO: granulocito con ncleo segmentado.

26

GRANULOCITO NEUTRFILO:
Es el elemento ms abundante del frotis normal
de un adulto
Ncleo: lobulado o segmentado. Presenta de 2
a 5 lbulos que se van formando a partir de
estrangulaciones en el ncleo del granulocito en
cayado, que se van profundizando de manera
que van quedando los segmentos o lbulos
unidos por filamentos de cromatina.
La cromatina tiene una disposicin en mosaico,
con zonas de cromatina muy condensada y otras
de cromatina extendida. La mayor cantidad de
lbulos indica mayor madurez de la clula.
Tamao: de 12 a 14 um.
Citoplasma: rosado con granulaciones
especficas muy finas, que toman tanto los
colorantes cidos como los bsicos (de all el
nombre de neutrfilos) y aparecen de color
violeta. Contienen enzimas como la fosfatasa
alcalina y sustancias de accin bactericida.

GRANULOCITOS EOSINFILOS:
Tamao: 12-15 um.
Ncleo:
predomina
el
ncleo
bilobulado, semejante a un anteojo.
Disposicin de la cromatina en
mosaico.
Citoplasma: cubierto de granulaciones
esfricas de mayor tamao que las
neutrfilos, coloreadas de color naranja
(o pardo rojizo) por la eosina.
Prcticamente
cubren
todo
el
citoplasma y se consideran lisosomas.

GRANULOCITO BASFILO:
Tamao: 10-12 um.
Ncleo: irregularmente lobulado.
Cromatina muy densa, masa nuclear
voluminosa en relacin al citoplasma.
Citoplasma:
rosado.
Contiene
granulaciones grandes, irregulares en
forma y tamao, de color azul oscuro,
casi negro, que a veces, por el aspecto
esfrico de la clula viva, cuando se
transforma en disco por la desecacin
(al realizar el frotis) quedan
superpuestas al ncleo cubrindolo
parcialmente. Son solubles en agua,
por eso muchas se disuelven durante

27

la coloracin. Contiene heparina e histamina.

ORIGEN DE LOS MONOCITOS:

Se acepta como nico lugar productor de monocitos en el organismo, la mdula sea.

MONOBLASTO:
Tamao: aproximadamente 20
um.
Es muy parecido al mieloblasto,
se diferencia de el en que el
ncleo presenta una ligera
indentacion (que hace recordar al
monocito
maduro)
presenta
tambien varios nucleolos. La otra
diferencia es que el citoplasma es ligeramente grisceo y a veces marca pliegues.

PROMONOCITO:
Tamao: algo mayor que el monoblasto.
Cromatina nuclear: con aspecto de fina red. Queda
restos de nucleolos. Ncleo de contorno irregular
con indentaciones.
Citoplasma: de un color grisceo mas basfilo que
su predecesor.

MONOCITO:
Clula de mayor tamao en el extendido (18-24 um)
Forma: irregular.
Ncleo: con lobulaciones incompletas como si se
replegara sobre si mismo, de modo que recuerda las
circunvoluciones del cerebro. A veces forma arrionada.
Con forma abigarrada en herradura, indentado o
doblado.
Cromatina laxa, delicada, condensada en grumos, dando
un aspecto como de pinceladas desparejas. No presenta
nucleolos.
Citoplasma: grisceo. No presenta grnulos pero si un
polvillo muy fino, en el limite de visibilidad del microscopio y pequeas vacuolas. Ese polvillo
esta constituido por acumulos de lisosomas.

LINFOPOYESIS: Se originan en mdula sea y luego sufren procesos de maduracin y

diferenciacin en rganos linfticos secundarios.

28

LINFOBLASTO:
Tamao: aproxim. 20 um.
Ncleo: grande, con membrana nuclear
gruesa debido a que la cromatina se condensa
cerca de la membrana. Esto permite
diferenciarlo de un mieloblasto y monoblasto.
Citoplasma: basfilo. Sin grnulos. Es
escaso porque el ncleo ocupa gran parte de
la clula.

PROLINFOCITO:
Tamao: 15-18 um.
Ncleo: algo ms pequeo, cromatina ms condensada.
Generalmente es excntrico. Todava se identifican
nucleolos.
Citoplasma: mas abundante que en el linfoblasto. Sin
grnulos.

LINFOCITO MADURO:
Podemos encontrarlo como linfocito pequeo
o linfocito mediano y grande.
LINFOCITO PEQUEO:
Tamao: aprox. 9 a 14 um.
Ncleo: color prpura, cromatina muy
condensada. A veces puede atisbarse algn
nucleolo. Ocupa casi toda la clula.
Generalmente es redondo. A veces presenta
una escotadura.
Citoplasma: azul celeste muy escaso.

29

LINFOCITO GRANDE:
Tamao: mayor 12-15 um. (A veces tamao de un
monocito).
Ncleo: cromatina densa. Se ubica oralmente en forma
excntrica.
Citoplasma: ms abundante que en el pequeo y
mediano. Color celeste. Suele contener algunas
granulaciones muy pequeas de color prpura.

CELULA PLASMATICA:
Representa el 1-4% de las clulas nucleadas
de MO en un sujeto normal y es el estadio
final de la maduracin y transformacin del
linfocito B maduro. Es una clula redonda u
ovalada que mide entre 11 y 15 um. de
dimetro. Se caracteriza por el ncleo
redondo, denso y excntrico con la
heterocromatina dispuesta en masas groseras
de disposicin radial (en rueda de carro).
Por lo general no presentan nuclolo. El
citoplasma puede tener frecuentemente bordes
de apariencia irregular y se tie de azul
violceo muy intenso, indicio de su riqueza en
RNA con una zona clara cercana al ncleo
denominada "arcoplasma". Normalmente no
contienen granulaciones, pero pueden mostrar
vacuolas o cuerpos de inclusin plida o rosa,
que
corresponden
a
acumulos
de
inmunoglobulinas (cuerpos de Russell).
Cuando estas inclusiones son muy numerosas,
el aspecto de la clula es el de una mrula (clula de Mott). En algunos procesos reactivos que
cursan con estimulacin antignica crnica (por ej. artritis reumatoidea activa) pueden aparecer
en SP en un pequeo nmero. Se pueden observar tambin plasmocitos con inclusiones que
representan acumulos de inmunoglobulinas en la cisterna perinuclear con la subsecuente
invaginacin dentro del ncleo, que da la apariencia de ser intranucleares. Estas estructuras se
conocen como cuerpos de Dutcher.
En algunos pacientes con mielomas IgA se pueden observar clulas plasmticas flameadas
caracterizadas por una coloracin eosinofilica en la periferia o a veces en el citoplasma
completo. En raras ocasiones se pueden observar plasmocitos multinucleados o clulas
plasmticas inmaduras (plasmoblastos) en aspirados de MO normal.

SERIE MEGACARIOCITICA-PLAQUETARIA
En la serie megacarioctica las divisiones nucleares no son seguidas de divisiones
citoplasmticas, lo que da lugar a la existencia de clulas poliploides de gran tamao. Se

30

distinguen cuatro estadios evolutivos: el megacarioblasto, el promegacariocito, el megacariocito

granular y el megacariocito formador de plaquetas o maduro.
MEGACARIOBLASTO:
Es la clula descendiente de la SC, con
orientacin plaquetognica. Su tamao
oscila entre 10 - 25 micras. El ncleo
generalmente tetraploide u octaploide es
nico, grande, ovalado o bilobulado con
cromatina laxa y numerosos nuclolos. El
citoplasma, es intensamente basfilo,
agranular y puede presentar algunas
prolongaciones a modo de seudpodos
muy caractersticos.

PROMEGACARIOCITO:
Mide 30 a 50 micras y se identifica
fcilmente en MO por su gran tamao y por el
aspecto caracterstico de su citoplasma que
posee bordes mal limitados y emite
numerosas prolongaciones. El ncleo es
multilobulado, su cromatina es densa y no
posee nuclolos. En el citoplasma persiste su
tonalidad
basfila,
con
numerosas
granulaciones azurfilas que cubren distintas
zonas.

MEGACARIOCITO GRANULAR:
Es caracterstico su gran tamao (80
micras o ms) y su elevada ploida. Su
citoplasma amplio no posee basofilia y
est totalmente cubierto por granulacin
azurfila rojo rosada. El ncleo es
multilobulado o segmentado con
cromatina condensada sin nuclolo.

31

MEGACARIOCITO MADURO ACTIVO:

En este estadio el ncleo sigue siendo
lobulado pero ms compacto. Finalizada
la sntesis de ADN se inicia en el
citoplasma la granulognesis que dar
origen a las plaquetas. Los grnulos
azurfilos se distribuyen especialmente
en la periferia, en pequeos agregados
rodeados por una
zona
hialina
citoplasmtica correspondiente a las
membranas de demarcacin que irn
delimitando las futuras plaquetas. Las
plaquetas son finalmente liberadas como
fragmentos citoplasmticos por fusin de
las membranas de demarcacin.

FORMULA LEUCOCITARIA NORMAL

Valores de referencia para adultos sanos

Cayados
Neutrfilos Segmentados
Eosinfilos
Basfilos
Linfocitos
Monocitos

Valor relativo (%)

02
50 70
15
01
25 40
38

Valor absoluto (x109/L)

0 0,2
2,3 6,5
0,05 0,5
0 0,1
1,5 4,0
0,1 0,8

ALTERACIONES CUANTITATIVAS
Se refiere a una variacin en la cantidad de los diferentes tipos leucocitos o bien a variaciones
en el recuento total.
Se evalan mediante un conteo total de leucocitos y conteo diferencial de cada uno de ellos.
Pueden ser trastornos malignos o benignos.
Los trastornos malignos pueden ser ocasionados por transformacin neoplsica de clulas
progenitoras
Los trastornos benignos pueden ser adquiridos o hereditarios.
1-ALTERACIONES FISIOLGICAS
Son todas aquellas alteraciones desencadenadas por causas diferentes a la enfermedad
subyacente del paciente, son transitorias y no necesitan tratamiento ya que NO constituyen un
parmetro de enfermedad.
Edad
Embarazo
Stress emocional
Ejercicio
Raza (algunas personas de raza negra tienen tendencia a leucopenia)
2-ALTERACIONES PATOLGICAS

32

2.1-LEUCOCITOSIS: >11.0 x 109/L (Neutrofilia, eosinofilia, basofilia, linfocitosis,

monocitosis)
2.2-LEUCOPENIA: < 4.0 x 109/L (Neutropenia, eosinopenia, monocitopenia, linfopenia)
2.3-REACCIONES LEUCEMOIDES entre 20.0 50.0 x 109/L
2.1 LEUCOCITOSIS
Neutrofilia: > 6.5 x 109 /L
Aumento absoluto de los neutrfilos
La causa ms comn es la infeccin bacteriana. Mecanismo: La invasin bacteriana estimula los
precursores en la M.O, esto intensifica la proliferacin, el pool marginal se desplaza hacia el
pool circulante; reflejndose en la sangre como leucocitosis y neutrofilia.
Tambin es causada por quemaduras, medicamentos, lesiones, y leucemia mieloide crnica.
(LMC).
Los corticoides, actividad fsica intensa, situaciones de stress pueden manifestarse con
neutrofilias sin desviacin a la izquierda.
Eosinofilia: > 0.5 x 109 /L
Puede verse en infecciones con parsitos metazoarios, trastornos alrgicos, cncer y estados
inflamatorios crnicos.
Se observa tambin en el sndrome de Loeffler, el cual parece ser producido por una reaccin
alrgica. Una causa comn es la migracin del parsito Ascaris lumbricoides a travs del tracto
respiratorio. Otros parsitos de la familia Ascaris tambin pueden producir el sndrome. Entre
las posibles causas adicionales se puede incluir la alergia a medicamentos, por ejemplo
antibiticos sulfonamida. Tambin se puede presentar en coexistencia con tumores slidos.
Basofilia: > 0.1 x 109 /L
Aumento absoluto de los basfilos. Est vinculada con reacciones de hipersensibilidad
inmediata y afecciones mieloproliferativas crnicas (LMC). Se observa tambin en
enfermedades inflamatorias del intestino, el mixedema y despus de la exposicin a la radiacin
Linfocitosis: > 4 x 109/ L
Incremento absoluto en el nmero de linfocitos.
Generalmente responde a una infeccin viral.
Un marcado incremento en el nmero de linfocitos puede estar asociado a una leucemia linftica
crnica.
Monocitosis: > 0.8 x 109/ L
Incremento absoluto del nmero de monocitos.
Este estado se encuentra asociado a perodos largos y crnicos de infeccin bacteriana
(brucelosis, tuberculosis, fiebre tifoidea)
Se presenta en la etapa de recuperacin de las infecciones agudas.
Otras causas son leucemia monoctica y enfermedades del colgeno
2.2 LEUCOPENIAS
Neutropenias: < 2.3 x 109 /L
Disminucin en la produccin medular: aplasia medular, agentes citotxicos que deprimen la
divisin celular (sulfamidas, cloranfenicol), hematopoyesis ineficaz.
Exceso de destruccin por Ac antineutrfilos, por medicamentos como la fenotiazina.
Se observa en enfermedades virales, bacterianas y protozoarias (paludismo, tifo, etc)
Fase inicial de la infeccin: la salida de los PNN a los tejidos es mayor que la salida medular
(gran demanda tisular).
Eosinopenia: < 0.05 x 109 /L

33

Disminucin en la cantidad de eosinfilos. Difcil de establecer debido a su bajo recuento.

La ACTH aumenta los PMN circulantes pero disminuye los eosinfilos circulantes.
Se presenta en situaciones estresantes agudas, reacciones inflamatorias y con la administracin
de glucocorticoides.
La infeccin bacteriana puede causar disminucin debido a una marginacin creciente y a la
migracin de estas clulas a los tejidos, pero la recuperacin se puede acompaar de eosinofilia
leve
Monocitopenias: < 0.1 x 109/L
Se encuentra en trastornos de las clulas progenitoras como en la anemia aplsica, en las
leucemias, y despus de la terapia con glucocorticoides.
En la fase inicial de procesos infecciosos.
Linfopenias: < 1.5 x 109/L
Disminucin en el nmero de linfocitos
Puede originarse por: falla en la produccin, exceso en su destruccin, o prdidas celulares a
travs de los conductos linfticos del intestino.
Las linfopenias por defectos en la produccin son caracterstica de algunas IDP, tales como:
inmunodeficiencia severa combinada, sndrome de DiGeorge completo, hipoplasia cartlagopelo, inmunodeficiencia comn variable, SIDA
2.3 - REACCION LEUCEMOIDE
Reaccin benigna de leucocitos caracterizada por leucocitosis con muchos precursores
inmaduros de leucocitos circulantes.
Esta respuesta puede ser linfoctica, eosinoflica, as como neutroflica.
Puede producir un cuadro sanguneo indistinguible de la leucemia mieloctica crnica.
Es transitoria y desaparece cuando el estmulo desencadenante se elimina, por ejemplo
extirpacin del tumor y control de la infeccin.
Como sucede con la leucemia, la persona que presenta una reaccin leucemoide presenta una
proliferacin desorganizada de glbulos blancos inmaduros en la sangre y en la mdula sea.
REACCION LEUCEMOIDE NEUTROFILICA
Se encuentra aumento de los PNN, acompaados de mielocitos y metamielocitos.
Causas:
Neoplasias Broncopulmonares y gstricas
Tumores malignos de mama y prstata
Algunas infecciones bacterianas: Osteomielitis, tuberculosis.

ALTERACIONES CUALITATIVAS
1-ALTERACIONES NUCLEARES
Anomala de Pelger Het
Es un trastorno nuclear hereditario autosmico dominante o adquirido debido a quimioterapia,
sndromes mieloproliferativos agudos o crnicos, quemaduras, reacciones a frmacos e
infecciones. Hay una falla en el desarrollo del ncleo durante la diferenciacin terminal, el
ncleo es en forma de nuez o man. Hay hipercondensacin de la cromatina. Se observa
hiposegmentacin nuclear .No hay prdida de la funcin celular.

34

Hipersegmentacin Nuclear
Trastorno hereditario (autosmico dominante) o adquirido. Se debe a una anormalidad en la
maduracin del ncleo (sntesis de DNA). Presentacin de PMN con 6 o ms lbulos. Clulas
de mayor tamao que las normales. Se observa asociada a la eritropoyesis megaloblstica.
Tambin puede estar asociado a infecciones crnicas o a dficit de vitamina B12, folatos, etc.
2-ALTERACIONES CITOPLASMATICAS
Sndrome de Chediak Higashi.
Esta rara enfermedad autosmica recesiva se caracteriza por albinismo parcial, grnulos
lisosmicos gigantes en la mayora de las clulas granulosas (aunque tambin se observan en
linfocitos y monocitos), y mayor susceptibilidad a las infecciones. Es fcil observar las clulas
sanguneas anormales en los frotis sanguneos de rutina. La enfermedad se diagnostica por lo
general en nios. Hay diversas anomalas en los neutrfilos incluyendo neutropenia moderada,
reduccin en la quimiotaxis de neutrfilos. Adems, en estudios microbicidas, se observa que
los grnulos primarios gigantes se degranulan con lentitud, y por lo tanto, se retarda la muerte
de las bacterias fagocitadas.
Anomala de Alder Reilly.
Trastorno de tipo autosmico. Presencia de grnulos azurfilos agrupados en racimos en el
citoplasma de granulocitos, monocitos y linfocitos. Se diferencian de las granulaciones txicas
ya que se presentan en otras clulas diferentes a los neutrfilos y la ausencia de vacuolas
txicas. Esta asociada a mucopolisacaridosis.
Anomala de May Hegglin.
Trastorno autosmico dominante. Asociado con hemorragias leves, macroplaquetas con
escasos grnulos y trombocitopenia. Se caracteriza por aparicin en los neutrfilos segmentados
de unos cuerpos de inclusin muy similares a los cuerpos de Dhle; se observan coloreados azul
plido,
con
la
diferencia
que
por
lo
general
no
estn
hacia la periferia de la clula sino distribuidos indistintamente en el citoplasma.
Cuerpos de Dhle.
No son exclusivos de los neutrfilos, igualmente se pueden encontrar en
monocitos, se observan como inclusiones redondeadas basfilas nicas
depositan en la periferia de las clulas y son poco ntidos. La presencia
indica hiperactividad celular. Se encuentran en condiciones txicas
escarlatina, sepsis, quemaduras, embarazo y tuberculosis

el citoplasma de los
o mltiples que se
de estas inclusiones
tales como Fiebre

Granulaciones Txicas.
Las granulaciones txicas de los segmentados neutrfilos son grnulos hipertrofiados que le
dan un aspecto hipergranular al citoplasma de los neutrfilos que junto con las vacuolas y los
cuerpos de Dhle se encuentran en condiciones txicas como infecciones, septicemia,
quemaduras. Son grnulos primarios que debido a algn desbalance en la maduracin del
neutrfilo no lograron ser eliminados eficazmente.
Cuerpos o bastones de Auer.
Inclusiones intracitoplasmticas en forma de varilla o de bastn que se observa en los
mieloblastos, promielocitos y monoblastos. Se cree que son grnulos azurfilos que se fusionan,

35

tienen afinidad por la eosina. Se encuentran en la leucemia mieloide aguda y durante la crisis
blstica de la leucemia mieloide crnica.
Linfocitos atpicos
Llamados tambin clulas linfomonocitoides, linfocitos activados, inmuncitos, etc. Miden de
15m a 30m, ncleo irregular, indentado, excntrico y puede observarse nucleolos. El
citoplasma es amplio, color azul tenue o intenso, y puede presentar grnulos azurfilos y
vacuolas. Estas clulas pueden observarse en mononucleosis infecciosa, hepatitis viral, herpes
zoster, enfermedades autoinmunes y normalmente pueden hallarse hasta en 5%.
Vacuolas
Se pueden presentar en el citoplasma de neutrfilos txicos, monocitos, eosinfilos y menos
frecuentemente linfocitos.
Al MO se observan como puntos blancos en sacabocado.
En frotis realizados del frasco de hemograma estas vacuolas se pueden presentar en muestras
envejecidas por fagocitosis de las sales del anticoagulante, por lo tanto para su confirmacin
resulta imprescindible el extendido de punta de aguja.
Degranulacin
Neutrfilo sin granulaciones, citoplasma limpio, indicativo de hemopatas severas, SMD y
SMP. Sepsis de mala evolucin, etc.

36

TRABAJO PRCTICO 4 Y 5
ALTERACIONES SERIE ROJA - ANEMIAS
HEMATIES NORMOCTICOS - NORMOCRMICOS
Discos cuya biconcavidad hace que aparezcan con cierta palidez central. Miden
aproximadamente de 7,2 m a 7,4 m.
Las alteraciones eritrocitarias se dividen en:
Alteraciones en tamao (Anisocitosis)
Alteraciones en su forma (Poiquilocitosis)
Alteraciones de color (Anisocroma)
Inclusiones anormales.

Alteraciones en el tamao.
Pueden ser de dos tipos:
Macrocitos: Hemates que presentan un tamao superior al normal (ms de 9 m) y su
expresin mxima es el megalocito. Suelen aparecer en la anemia megaloblstica debida a
dficit de vitamina B12 o cido flico. Se suele observar cuando hay un aumento de la actividad
eritropoytica, como un mecanismo de compensacin a la prdida de los hemates, sea por
anemia severa o hemorragias. En la sangre perifrica se pueden observar como hemates
grandes policromatfilos o reticulocitos.
Microcitos: Hemates que presentan un tamao inferior al normal (menos de 6 m) y se
encuentran en pacientes con anemia ferropnica y talasemias.

Alteraciones en la forma
Esferocitos: Son hemates esfricos, no son bicncavos, presentan un dimetro inferior al
normal pero ms grueso. Su vida media es de 14 das, producen taponamiento de los vasos
sanguneos. Se encuentran en la esferocitosis hereditaria o enfermedad de MihkowskiChauffard (defecto congnito de la membrana eritrocitaria). Tambin pueden ser adquiridos por
factores extraeritrocitarios (autoanticuerpos, quemaduras extensas, etc.)
Codocitos o Target cells: Llamados tambin dianocitos. En la regin central presentan
un rea con mayor contenido hemoglobnico (zona densa). La interfase entre la membrana
celular y el centro es transparente. Se encuentran en hemoglobinopatas (Hb C), talasemias,
anemia ferropnica y en algunas hepatopatas crnicas con aumento de colesterol y fosfolpidos.
Drepanocitos: Son hemates con HbS precipitada. Su apariencia es propia del estado
homocigoto de la hemoglobina S, aunque tambin se puede presentar en estados de
heterocigozis.
Eliptocitos: Los hemates son alargados (ovalocitos). Se encuentran en la eliptocitosis
hereditaria. Su presencia se debe a una alteracin congnita de la membrana del hemate,
aunque puede ser adquirida en caso de una anemia megaloblstica, ferropnica o arregenerativa.
Equinocitos: Son aquellos que presentan membrana ondulante e irregular. Se encuentran en
algunas anemias hemolticas. Este fenmeno puede ser inducido in vitro exponiendo los

37

hemates a una solucin hipertnica. Tambin se pueden encontrar en pacientes con IRC,
hepatopatas, dficit de PK, etc.
Acantocitos: Las prominencias de la membrana eritrocitaria son ms aguzadas (alargadas) y
distribuidas irregularmente. Se encuentran en la acantocitosis que se caracterizan por la ausencia
de lipoprotenas plasmticas. Tambin pueden encontrase en pacientes con hepatopatas,
dislipidemias, hipotiroidismo, etc.
Dacriocitos: Son hemates en forma de lgrima. Se encuentran en la anemia ferropnica,
anemia megaloblstica y talasemia. Tambin se encuentran en situaciones en las que la MO
padece alguna patologa severa (SMD, MFI, etc) y en esplenomegalia.
Esquistocitos: Son fragmentos hemticos. Se encuentran
microangiopticas (SUH, PTT, etc.), quemaduras, etc.

en

anemias

hemolticas

Estomatocitos: Son hemates que en lugar de una deplecin central clara tienen una banda
plida central que les da un aspecto de boca. Se hereda como carcter autosmico dominante.
Esta enfermedad es causada por anormalidad hereditaria de la membrana eritrocitaria. Tambin
se pueden encontrar en pacientes con hepatopatas y dislipidemias.
Excentrocitos: Son hemates con distribucin irregular de la hemoglobina. Su tamao es
inferior al normal y se caracteriza por poseer contornos parcialmente arrugados, pero adems se
observa una distribucin irregular de la hemoglobina que aparece desplegada de la parte interna
hacia uno de los extremos.
Knocitos: Son hemates que presentan un estoma o boca en la regin central completamente
coloreada y lo dems incoloro. Morfolgicamente es todo lo contrario a las caractersticas del
estomatocito. Se encuentran en algunas anemias como las ferropnicas.

Alteraciones de color
Aqu observamos las diferentes tonalidades de color de los hemates dependiendo del contenido
hemoglobnico u otros. Tenemos:
Hipocroma: Son hemates con disminucin del contenido de la hemoglobina y dependiendo de
la cantidad de este pigmento es que observamos a los hemates con diferentes caracteres de
color. Aqu estn incluidos los anulocitos, que son hemates en forma de anillo en que solo la
membrana eritrocitaria est coloreada y que se traduce en una hipocroma de grado severo
(+++).
Pseudo - Hipercroma: Son hemates vidos de hemoglobina. Pueden encontrarse en caso de
enfermedades como la policitemia vera o la policitemia fisiolgica y esferocitosis hereditaria
Policromatofilia: Presencia de hemates con tonalidad (azul y rojo) morada. Se le relaciona con
inmadurez celular, clulas nucleadas, presencia de reticulocitos, macrocitos, etc. Esto debido a
su elevada cantidad de ARN.
Anisocroma: Diferentes tonalidades de color como hemates hipocrmicos, hipercrmicos,
normocrmicos y policromatfilos. Se encuentran en ciertas anemias refractarias.

Inclusiones anormales
Punteado basfilo: Son grnulos basfilos presentes en el citoplasma de los hemates. Indica
una alteracin de la eritropoyesis ms que un aumento de la misma. Se produce en muchas
enfermedades sanguneas: talasemia, anemias megaloblasticas, infecciones, hepatopatas,

38

intoxicacin por plomo y otros metales pesados, hemoglobinas inestables y deficiencia de

pirimidina-5-nucleotidasa. Actualmente el consumo de ciertos frmacos tambin puede
producir este fenmeno.
Cuerpos de Heinz: Son formaciones redondeadas de hasta 3 m de dimetro localizadas
habitualmente en la periferia de la clula. Se observan con colorantes para reticulocitos. Estos
cuerpos son abundantes en sujetos esplenectomizados.
Anillos de Cabot: Se cree que sean restos de membrana nuclear eritroblstica o restos despus
de una mitosis anormal. Se observan en forma de anillo u ocho invertido. Pueden ser
precipitados de ARN o protena carente de importancia diagnstica. Su presencia indica severas
signos de diseritropoyesis.
Cuerpos de Howel-Jolly: Son restos de cromatina nuclear, resultados de la prdida del ncleo
por parte del eritroblasto ortocromtico hasta la conversin del hemate. Se les considera signos
de regeneracin celular. Pueden observarse (habitualmente aislados) en un pequeo porcentaje
de hemates en la anemia perniciosa. Las clulas que los contienen aparecen habitualmente tras
la esplenectoma y cuando se ha producido una atrofia esplnica. En general, solo se encuentran
unas cuantas clulas de este tipo, pero pueden ser muy numerosas en los casos de enfermedad
celiaca, en la que hay una atrofia esplnica y una deficiencia de folato concomitante.
Cuerpos de Pappenheimer: Los cuerpos de Pappenheimer son pequeas inclusiones
eritrocitarias basfilas (casi negras) dispuestas perifricamente. Habitualmente, solo hay una
pequea cantidad en el interior de la clula. Estn formados por hemosiderina y su presencia se
relaciona con una sobrecarga de hierro y con hipoesplenismo. A veces, se encuentran en la
mayora de los hemates circulantes. Su naturaleza puede confirmarse por medio de una tincin
de Perls. Corresponden a los grnulos sideroticos de los siderocitos y nunca se encuentran en
grandes cantidades en el interior de las clulas, como el clsico punteado basofilo. Sin embargo,
en una sola clula se pueden encontrar ambos elementos, es decir, el punteado basofilo y los
cuerpos de Pappenheimer. Con la tincin de Perls, los primeros de estos grnulos se tien de
rosa mientras que los ltimos lo hacen de azul.
Siderocitos: Son hemates con contenido de hierro libre no hemoglobnico de color verde
azulado.
Grnulos de Shuffner: Son grnulos que presentan algunos hemates en caso de parasitismo
por plasmodium vivax.
Grnulos de Maurer: Son grnulos de color violeta oscuro que se encuentran en pacientes con
parasitismo por plasmodium falciparum.

ANEMIA:
Se define anemia como la incapacidad de la sangre para transportar oxgeno.
Segn la definicin de la OMS se acepta que existe Anemia cuando la concentracin de
HEMOGLOBINA se halla por debajo de los lmites establecidos en funcin de la edad y el
sexo; independientemente de que la concentracin de eritrocitos se encuentre normal o incluso
elevada.
EDAD

CONCENTRACION DE HEMOGLOBINA (g/dL) MENOR A .

Recin nacidos (a termino)

Nios de 3 meses
Nios de 2 aos
Mujeres (no embarazadas)
Varones
Mujeres embarazadas

14,0
9,0
11,0
11,5
12,0
11,0

39

CLASIFICACION MORFOLGICA:
Se debe recordar que el VCM se correlaciona con la HCM (que informa el contenido medio
hemoglobnico de los eritrocitos circulantes) de forma que disminuir la HCM al hacerlo el
VCM (anemia microctica hipocrmica) y aumenta cuando aumente el VCM (anemia
macroctica hipercrmica).
Siempre se debe recordar que en determinadas situaciones el VCM puede estar afectado por
factores no debidos al tamao de los eritrocitos, como alteraciones en la forma o la
deformabilidad celular, lo que obedece a los mtodos automatizados para medir el VCM por lo
tanto, siempre que analicemos un histograma, debemos tener en cuenta que el VCM es un valor
medio y no informa sobre la homogeneidad celular y es necesario correlacionarlo con el ndice
ADE y hacer una inspeccin al microscopio del frotis para que una posible anisocitosis no pase
desapercibida.
a) ANEMIAS MICROCITICAS (VCM< 82 fl)

Anemia Ferropnica. Deficiencia de Hierro.

Talasemias. Defectos en la sntesis de Hemoglobina.
Anemia secundaria a enfermedades crnicas. Mala disponibilidad del hierro
orgnico.
Anemia Sideroblstica. Defectos en la sntesis del grupo HEM.

b) ANEMIAS NORMOCITICAS (VCM: 82 98 fl)

Anemias hemolticas.
Aplasia Medular.
Invasin Medular.
Anemia secundaria a enfermedades crnicas.
Anemia secundaria a procesos hemorrgicos agudos.
Anemias tempranas de otras anemias.

c) ANEMIAS MACROCITICAS (VCM> 98 fl)

i.
HEMATOLOGICAS. (VCM > 115 fl)

ii.

Anemias megaloblsticas. Deficiencia de folato o vit B12

Anemias aplsicas.
Anemias hemolticas con crisis reticulocitaria.
Sndromes mielodisplsicos.
NO HEMATOLOGICAS. (VCM < 115 fl)

Anemia secundaria a abuso de alcohol

Anemia secundaria a Hepatopata crnica
Anemia secundaria a Hipotiroidismo
Anemia secundaria a Hipoxia.

40

CLASIFICACIN FISIOPATOLOGICA DE LAS ANEMIAS

ANEMIAS ARREGENERATIVAS:
En este tipo de Anemias tambin llamadas Arregenerativas, la medula sea no presenta una
capacidad regenerativa normal y no se cumple una relacin inversa entre la disminucin de la
concentracin de la hemoglobina y el aumento de Reticulocitos. Esto es, la Medula sea no
puede responder adecuadamente al grado de anemia.
Defecto de proliferacin y diferenciacin de stem cells: aplasia medular,
leucemia, mielodisplasias.
Defecto de proliferacin y diferenciacin de progenitores de los GR: aplasia
roja pura, insuficiencia renal, enfermedades endocrinas, etc.
Defecto en sntesis de DNA: deficiencia de vitamina B12 y folatos.
Defecto en sntesis de Hemoglobina: deficiencia de fierro, talasemias.
Mecanismos mltiples o desconocidos: anemia de enfermedades crnicas,
infiltracin medular (metstasis), anemias sideroblsticas.

ANEMIAS REGENERATIVAS:
En general, obedecen a una perdida perifrica de eritrocitos por hemorragias o hemlisis. Son
anemias regenerativas, es decir que la medula presenta una capacidad de respuesta normal y
existe una relacin inversa entre el grado de anemia y el aumento de Reticulocitos.
DEFECTOS INTRNSECOS:
- De membrana: esferocitosis, acantocitosis, etc.
- De enzimas: deficiencias de G-6-PD, piruvato kinasa, etc.
- De globinas: enfermedad de las clulas falciformes (HbS), Hemoglobinas
inestables, etc.
DEFECTOS EXTRNSECOS:
- Mecnicos: microangiopata, prtesis, etc.
- Qumicos o fsicos: hemlisis por drogas, venenos.
- Infecciones: clostridium, malaria, otras septicemias...
- Anticuerpos: autoinmune, aloinmune, drogas.
- Hiperactividad monocito-macrfago: hiperesplenia.
- Prdida de sangre: hemorragia aguda.

RECUENTO DE RETICULOCITOS
Los Reticulocitos son eritrocitos no nucleados, inmaduros, que contienen ARN y que continan
sintetizando hemoglobina despus de la prdida del ncleo.

El carcter regenerativo o arregenerativo de una anemia puede conocerse a travs del recuento
de Reticulocitos. Adems, el recuento de Reticulocitos sirve para el seguimiento en el
tratamiento de ciertas anemias. Por ejemplo, la respuesta de los reticulocitos en el da 6 despus

41

de la terapia confirma la respuesta a la terapia con folato o con B12 siempre que slo se hayan
dado dosis bajas, en una anemia por dficit de folato o cabalamina. Podemos observar los
reticulocitos al microscopio ptico mediante la tincin con colorantes vital, azul de metileno o
azul brillante de cresilo. Estos colorantes dan lugar a la precipitacin de los restos de ARN, y se
observan como filamentos de color azul intenso en el interior de la clula.
El nmero de reticulocitos en sangre circulante es, probablemente el mejor y ms sencillo
indicador de la eritropoyesis. Un aumento puede interpretarse como indicacin de una elevada
demanda de nuevos eritrocitos y un correcto funcionamiento de la mdula sea. Por el contrario
cuando la demanda disminuye o la mdula sea falla en sus funciones, la cifra de reticulocitos
baja.
Segn el grado de maduracin que posea el reticulocito presentar un modelo de reticulocito
distinto, de ovillo denso en el caso de los ms inmaduros o de grnulos escasos para los ms
maduros

PROCEDIMIENTO:
1) Se prepara un tubo que ya contenga el colorante (azul brillante de cresilo).
2) La sangre debe ser anticoagulada con EDTA-Na2. (Debido a que los Reticulocitos
tambin maduran in vitro, es aconsejable que la sangre utilizada se haya extrado
recientemente, como mximo 6 horas antes de su anlisis). Aadir 2 gotas de sangre a
uno de los tubos ya preparados que contienen 100 ul de colorante.
3) Mezclar e incubar durante 10-15 minutos a 37C.
4) Volver a mezclar la suspensin
5) Realizar un extendido
6) Dejar secar al aire
7) Una vez realizado todo esto observar al microscopio con el objetivo de 100x con aceite
de inmersin. En la coloracin, los hemates se tien de color verde amarillento y los
Reticulocitos se diferencian porque presentan en su interior unos hilos finos de color
azul.

50 hemates

X= 5 campos

Luego se procede a contar los Reticulocitos en 5 campos, por ejemplo:

Tambin se pueden contar 10 campos homogneos y luego sacar un promedio y se obtiene as

el porcentaje. Si se utiliza esta tcnica conviene moverse aleatoriamente por el preparado
buscando zonas de distribucin homognea realizando el recuento cada 2 o 3 campos. Recordar
que los campos en los que no se encuentran reticulocitos deben considerarse en el clculo final.
As por ejemplo para un paciente sano podramos tener:

42

2 + 1 + 0 + 1 + 2 + 1 + 0 + 1 + 2 + 2 = 1,1 %
10
Los Reticulocitos pueden expresarse de diferentes maneras:
PORCENTAJE DE RETICULOCITOS:
El porcentaje de Reticulocitos se determina en al menos 1,000 hemates. El recuento de
Reticulocitos se determina multiplicando el porcentaje de Reticulocitos por el recuento de
hemates.
Los adultos normales muestran un recuento de Reticulocitos de 0.5 a 2 %.
En los recin nacidos, el porcentaje oscila entre 2 a 6%.

VALOR ABSOLUTO:
Se expresa como N de Reticulocitos/mm3. Para adultos, el valor de referencia se sita entre
40.000 60.000.
VALOR CORREGIDO I:
Si se expresan los Reticulocitos en porcentaje van referidos a la concentracin normal de
eritrocitos y no tiene en cuenta la salida prematura de Reticulocitos desde la medula sea, por
ello siempre debe corregirse en funcin de la intensidad de la anemia:

% Ret x Hto paciente (%)

Hto normal (%)
VALOR CORREGIDO II:
En condiciones normales los Reticulocitos permanecen 4 das en la medula sea y tardan de 1-2
das en sangre perifrica en madurar; pero si hay anemia, el estimulo eritropoytico
compensador disminuye el periodo de maduracin intramedular y se alarga en sangre perifrica,
haciendo que el recuento de Reticulocitos sea falsamente elevado. Esto se conoce como
"desviacin reticulocitaria" y se observa en el frotis por la aparicin de hemates grandes con un
color azulado. Este es el motivo por el cual suele corregirse por el periodo en das que tardan los
Reticulocitos en madurar a eritrocitos, y a esto se le llama ndice de produccin reticulocitaria
(IPR).

IPR = Valor corregido I

Factor
El factor en condiciones normales es de 1 y aumenta en 0,5 por cada 10% de disminucin del
Hto.

43

Reticulocitos 100 x Azul Brillante de Cresilo

TRABAJO PRCTICO N 6

Grupos sanguneos ABO y Rh: pruebas de Coombs

FUENTE: UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATAFACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS
CATEDRA DE ANALISIS CLINICOS I (HEMATOLOGIA)

A. TIPIFICACION DE ANTIGENOS ABO EN HEMATIES: METODO EN TUBO POR

SEDIMENTACION
a) Preparar una suspensin de hemates de grupo sanguneo desconocido, al 2 % en salina
fresca (vase ms abajo el apartado C. Preparacin de la suspensin globular al 2%).
b) Agregar una gota de la suspensin globular, a igual volumen de suero anti-A, anti-B, antiAB y plasma AB normal (poli o monoclonales) en tubos de Kahn.
c) Simultneamente controlar cada antisuero contra hemates A1, B y O al 2%
d) Incubar 1 hora a temperatura ambiente o centrifugar 1 minuto a 1000 rpm.
e) Leer primero los controles y luego los problemas microscpicamente en visor y
macroscpicamente.
f) Scores de lectura:
+++ un gran aglutinato
++ varios aglutinatos grandes
+ muchos aglutinatos pequeos
pequeos aglutinatos, muy escasos, visibles a ojo desnudo
- negativo no se observan aglutinatos
B. TIPIFICACION DE ANTICUERPOS ABO EN SUERO
a) Tomar una muestra de suero libre de hemates.
b) En tubos de Kahn, agregar una gota de suero a igual volumen de suspensin al 2%, de los
siguientes hemates:
1) hemates A conocidos
2) hemates B conocidos
3) hemates del propio individuo
4) hemates O conocidos
c) Incubar 1 hora a temperatura ambiente o centrifugar 1 minuto a 1000 rpm.
d) Leer primero los controles y luego los problemas, microscpicamente en visor y
macroscpicamente.
C. PREPARACIN DE LA SUSPENSIN GLOBULAR AL 2%
a) Separar los hemates del plasma y trasvasar una porcin de los mismos a un tubo de Kahn.
b) Llenar el tubo con solucin fisiolgica al 0.85% y centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto.
c) Eliminar el sobrenadante y repetir los lavados dos veces ms, teniendo la precaucin de
resuspender perfectamente el culot globular antes de completar el agregado de solucin
fisiolgica.
d) Tomar una gota de culot (50 l) y agregarle 0,5 ml de solucin fisiolgica. Se tendr as la
suspensin al 2%.
D. SUBAGRUPACION DEL GRUPO A: METODO EN PLACA
a) Colocar una cantidad de sangre total igual a de gota.
b) Agregar una gota de anti-A absorbido y mezclar bien con una varilla de punta fina.
c) Al terminar de mezclar, disparar el cronmetro.

44

d) Rotar la placa en forma circular y observar la aparicin de aglutinacin dentro del minuto.
Los siguientes cuadros resumen los posibles resultados:

Glbulos
problema

Suero problema

Anti A
rojos +
+
GR A
+
+
-

Anti B
+
+

Anti AB
+
+
+

Grupo ABO
A
B
O
AB

GR B
+
+
-

GR AB
+
+
+
-

Grupo ABO
A
B
O
AB

E. TIPIFICACION DEL FACTOR D DEL SISTEMA Rh

a) Coloque 2 gotas de suero anti-D en un tubo de Kahn.
b) Adicione una gota pequea de suspensin de glbulos o en su defecto de sangre entera de la
muestra.
c) Agite para mezclar los reactivos y centrifugue durante 1 minuto a 1500 rpm.
d) Desprenda suavemente el culot globular y lea. La lectura se har microscpicamente con un
visor y macroscpicamente.
e) Proceda de la misma manera con los tubos controles.
E.1 Controles
a) Prueba sobre la bondad del suero: sangre D positiva + anti-D
b) Prueba sobre la inespecificidad respecto de anti-D: sangre D negativa + anti-D
c) Control de seudoaglutinacin: muestras de sangre + plasma de persona AB.
E.2 Reacciones

Positiva: los hemates D (Rho) positivos permanecern aglutinados al querer desprender el

culot globular.

Negativa: los hemates (Rh-rh) se suspendern nuevamente sin evidenciar aglutinacin.

F. PRUEBA PARA DETECTAR Du

Nunca puede ser diagnosticada como negativa la sangre de un dador por ofrecer reacciones
negativas frente a sueros anti D. Siempre debe descartarse la posibilidad de estar en presencia
de un individuo Du. Para ello es necesario aplicar la prueba de Coombs.
1)
2)
3)
4)

Coloque dos gotas de suero anti D (Rho) en un tubo de Kahn.

Agregue 1 gota de una suspensin sangunea al 2% en salina.
Agite para mezclar los reactivos e incube durante 30 minutos a 37C.
Lave los hemates 3 veces con abundante cantidad de SF (ocupando casi todo el volumen
del tubo). Centrifugue y elimine el sobrenadante.
5) Agregue 2 gotas del suero antiglobulina humana.

45

6) Agite para mezclar los reactivos y centrifugue inmediatamente durante 1 minuto a 1500
rpm, desprenda suavemente el culot globular y lea. La lectura se har macro y
microscpicamente.
F.1 Reacciones

Positiva: los hemates Du (Rhou) positivos permanecern aglutinados luego de intentar

desprender el culot globular.

Negativa: los hemates Rh-(rh) y Du (Rhou) negativos se resuspendern y no aglutinarn.

F.2 Controles utilizados

Se utilizan tres controles para
1. Probar la bondad del suero
2. Comprobar su especificidad
3. Para seudoaglutinacin
Para el primer control positivo deben emplearse hemates Rh positivos de dador conocido OR1r
(Cde/cde). Es aconsejable usar esos hemates y evitar emplear eritrocitos D(Rho) positivos con
el antgeno E(rh) presente ,dado que, en tales hemates el factor D(Rho) es mas reactivo.
El control negativo consiste en eliminar la posibilidad de estar utilizando un suero que contenga
aglutininas inespecficas para el antgeno en cuestin (por ejemplo: anti-A y/o anti-B no
absorbidos durante la preparacin del suero). Estos dos primeros controles sirven para
demostrar que el suero a emplear es especfico y no posee ningn contaminante que pueda
falsear los resultados.
El tercer control, es de seudoaglutinacin y para ello se reemplaza el suero anti D por suero de
persona de grupo sanguneo AB, se lo enfrenta con los hemates que estn siendo tipificados.

G. COMPROBACIN DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS INMUNES MEDIANTE

LA PRUEBA DE COOMBS.

G.1 Prueba de Coombs indirecta

1) Colocar en un tubo de Kahn 2 gotas de suero problema y 2 gotas de suspensin de hemates
de grupo O Rh+ al 2%. Agitar suavemente 2 o 3 veces durante el perodo de incubacin de
1 hora a 37 C. Proceder de la misma manera con un tubo control que contiene 2 gotas de
solucin fisiolgica y 2 gotas de suspensin de hemates O Rh+ al 2%.
2) Centrifugar, quitar el sobrenadante y lavar 3 veces con solucin fisiolgica, eliminando
completamente el sobrenadante en el ltimo lavado.
3) Preparar otros controles siguiendo las indicaciones del apartado F.2
4) Leer al microscopio antes del agregado del suero antiglobulina humana.
5) Agregar una gota de suero antiglobulina humana. Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. Leer
microscpicamente con visor y microscpicamente.

46

G.2 Prueba de Coombs directa

6) Colocar en un tubo de Kahn 2 gotas de suspensin al 2% de hemates problema. Preparar un
tubo control que contenga 2 gotas de suspensin de hemates O Rh+ sensibilizados al 2%.
7) Preparar otros controles siguiendo las indicaciones del apartado F.2
8) Leer al microscopio antes del agregado del suero antiglobulina humana.
9) Agregar una gota de suero antiglobulina humana. Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. Leer
microscpicamente con visor y microscpicamente.
RECOMENDACIONES:
*es importante realizar con cuidado los sucesivos lavados, la temperatura que sea 37C, la
ultima centrifugacin no debe ser enrgica ni ms de un minuto.
*siempre que una prueba de Coombs directa de negativa de debe dejarla 15-20 minutos a 37C
y luego volver a realizar un corta centrifugacin

Anti-A, Anti-B o Anti A,B

Monoclonal
Reactivos para la determinacin de grupos sanguneos ABO

SIGNIFICACION CLINICA
En el ao 1900 Landsteiner descubri que los glbulos rojos humanos podan ser clasificados en
A, B, AB u O de acuerdo a la presencia (grupos A, B, o AB) o ausencia (grupo O) de antgenos
altamente reactivos en su superficie. Tambin demostr que existen anticuerpos (aglutininas)
para los anfgenos A y B y que el suero de un individuo no contiene anticuerpos para el
antgeno presente en sus propios glbulos rojos pero s contra los que no posee. Actualmente se
han identificado subgrupos de los grupos A y B con distinta especificidad. Todas estas
observaciones revelaron la importancia de la compatibilidad ABO en la prctica transfusional.
Por este motivo, la tipificacin de los grupos sanguneos ABO es la prueba fundamental sobre la
que se basan los dems ensayos pretransfusionales.
FUNDAMENTOS DEL METODO
Los glbulos rojos del paciente se ponen en contacto con Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B
monoclonal. Si existen en la superficie de los eritrocitos los antgenos correspondientes, se
producir una aglutinacin visible macroscpicamente. La ausencia de aglutinacin en todos los
casos, implica grupo O.
REACTIVOS PROVISTOS
Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal: reactivos preparados a partir de anticuerpos
monoclonales secretados por lneas celulares de hibridomas de ratn.
REACTIVOS NO PROVISTOS
De acuerdo a la tcnica que se emplee pueden requerirse adicionalmente:
- Solucin fisiolgica
- Solucin fisiolgica tamponada con buffer fosfatos (PBS)
- Solucin fisiolgica de baja fuerza inica (LISS)
- Albmina Bovina 30% de Wiener lab.
INSTRUCCIONES PARA SU USO
Los Reactivos se proveen listos para usar.

47

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO

Los Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento
indicada en la caja.
INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS
Desechar el reactivo cuando se observe contaminacin del mismo.
MUESTRA
Glbulos rojos o sangre entera
a) Recoleccin: la sangre debe ser obtenida aspticamente, con o sin anticoagulante.
b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA, heparina, ACD (cido ctrico,
citrato, dextrosa) CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina).
Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab.
c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en
refrigerador (2-10oC). Si se utiliz heparina o EDTA, la tipificacin debe llevarse a cabo en 48
horas. Las muestras recogidas con ACD, CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35
das. Si se emplean cogulos, deber efectuarse la tipificacin dentro de los 7 das de obtenida la
muestra.
MATERIAL REQUERIDO (no provisto)
- Centrfuga
- Tubos de hemlisis
- Placas
- Palillos mezcladores descartables
PRECAUCIONES
Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro".
PROCEDIMIENTO
En las siguientes tcnicas la suspensin de glbulos rojos a ensayar debe ser preparada con
solucin fisiolgica, PBS o LISS.
I- TECNICA EN PLACA
Preparar una suspensin de glbulos rojos al 10%. Como alternativa puede emplearse una
suspensin al 35-45% en plasma del mismo paciente o sangre entera.0
1) A una gota de Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal colocada en una placa
limpia, agregar 1 gota de suspensin de glbulos rojos.
2) Mezclar el Reactivo y los glbulos con un palillo descartable cubriendo un rea circular de
2 cm de dimetro y balancear la placa continuamente durante 2 minutos. Observar
aglutinacin visible microscpicamente hasta los 2 minutos. No debe emplearse
microscopio.
II- TECNICA EN TUBO (por centrifugacin)
1) A una gota de Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal colocada en un tubo de
hemlisis, agregar 1 gota de suspensin de glbulos rojos al 3-5%.
III- TECNICA EN TUBO (por sedimentacin)
1) A una gota de Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal colocada en un tubo de
hemlisis, agregar 1 gota de suspensin de glbulos rojos al 3-5%.
2) Mezclar e incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente.
3) Agitar el tubo para despegar las clulas y examinar macroscpicamente la aglutinacin.
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

48

La observacin de aglutinacin (con cualquiera de las tcnicas utilizadas) indica una reaccin
positiva.
Antisuero
Grupo sanguneo Anti-A Anti-B
A
B
0
AB
Variants dbiles
del grupo A
como Ax

+
+
+/-

+
+
-

AntiA,B
+
+
+
+

METODO DE CONTROL DE CALIDAD

El control de calidad puede efectuarse ensayando glbulos rojos tipificados.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
Reacciones dbiles pueden observarse en las siguientes situaciones:
- Neonatos: los antgenos A y B no se encuentran totalmente expresados en el recin nacido.
Por esta razn deben extremarse los cuidados, sobre todo en los prematuros.
- Leucemias u otros desrdenes malignos.
- Pacientes recientemente transfundidos con cantidades sustanciales de sangre de grupo no
idntico.
- Reacciones falsas positivas: se han observado problemas ocasionados en la tipificacin de los
grupos sanguneos ABO debido a anticuerpos que reaccionan con drogas, colorantes,
compuestos qumicos o con partculas de slica coloidal liberadas de vidrios de mala calidad.
- Aglutininas fras: en presencia de aglutininas fras, el lavado de los glbulos rojos 4-6 veces
con solucin fisiolgica, resulta generalmente suficiente para obtener clulas aptas para la
tipificacin. En muy raras ocasiones se requiere un calentamiento a 37oC durante 10 minutos
antes de los lavados mencionados. Como control, se coloca una gota de estas clulas con 2
gotas de solucin
fisiolgica. No debe producirse aglutinacin.
PRESENTACION
Anti-A: frasco x 10 ml (Cd. 1443152).
Anti-B: frasco x 10 ml (Cd. 1443154).
Anti-AB: frasco x 10 ml (Cd. 1443153).
BIBLIOGRAFIA
- Moore, S. et al. Int. Symp. on Monoclonal Antibodies: Standardization of their
Characterization and use. Pars, France, 1983. Develop. Biol. Standard 57:49-59.
- Widman, F.K. Technical Manual. 9th Edition, Washington, D.C. American Association of
Blood Banks 1985. Chapter 8.
2) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3.500 rpm. 3) Agitar el tubo para despegar las clulas y
examinar macroscpicamente la presencia o ausencia de aglutinacin.
Wiener lab.
2000 Rosario - Argentina
Elaborado por:
Wiener Laboratorios S.A.I.C.
Riobamba 2944
2000 - Rosario - Argentina
http://www.wiener-lab.com.ar
Dir. Tc.: Viviana E. Ctola

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Bioqumica
Producto Inscripto M.S.
Disp. N: 1076/89 (Anti-A)
Disp. N: 1073/89 (Anti-B)
Disp. N: 1071/89 (Anti-A,B)

Anti-D (Rho)
monoclonal
Reactivo para la deteccin de antgeno D (Rho)

SIGNIFICACION CLINICA
Las observaciones de Levine y Stetson en 1939 y de Landsteiner y Wiener en 1940
establecieron las bases para el conocimiento actual de la importancia clnica de la deteccin en
el laboratorio de los anticuerpos anti-D.
Aproximadamente el 15% de los individuos de raza blanca y el 8% de los individuos de raza
negra carecen del antgeno D y son fcilmente estimulados cuando reciben este antgeno, ya sea
por transfusin o durante el parto, produciendo anti-D. Este anticuerpo es responsable de
severas reacciones postransfusionales y de la enfermedad hemoltica del recin nacido.
Existen muchos otros antgenos identificados dentro del sistema Rh. Sin embargo, es el antgeno
D el que posee mayor importancia en la clnica despus del sistema ABO.
FUNDAMENTOS DEL METODO
Los glbulos rojos del paciente se ponen en contacto con suero anti-D (anti-Rho). Si existe en la
superficie del eritrocito el antgeno correspondiente, se producir una aglutinacin visible
macroscpicamente.
REACTIVO PROVISTO
Anti-D (Rho): solucin de anticuerpos monoclonales humanos.
REACTIVOS NO PROVISTOS
De acuerdo a la tcnica empleada puede requerirse adicionalmente:
- Solucin fisiolgica.
- Suero Anti-humano (poliespecfico) provisto separadamente por Wiener lab.
INSTRUCCIONES PARA SU USO
Anti-D (Rho): listo para usar.
PRECAUCIONES
El reactivo es para uso diagnstico "in vitro".
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO
El Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada
en la caja.
INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS
Desechar el reactivo cuando se observe contaminacin del mismo.
MUESTRA
Glbulos rojos o sangre entera
a) Recoleccin: obtener la sangre en forma asptica con o sin anticoagulantes.
b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: heparina, EDTA, ACD (cido ctrico,
citrato, dextrosa), CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa,
adenina).

50

c) Sustancias interferentes conocidas: los glbulos rojos recubiertos con inmunoglobulinas o

fracciones del complemento pueden dar reacciones falsamente positivas. Cuando se sospecha
esta situacin deber realizarse una Prueba de Antiglobulina Directa.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en
refrigerador (2-10oC).
Si se utiliz heparina o EDTA, la tipificacin debe llevarse a cabo en 48 horas. Las muestras
recogidas con ACD, CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 das. Si se emplean
cogulos, deber efectuarse la tipificacin dentro de los 7 das de obtenida la muestra.
MATERIAL REQUERIDO (no provisto)
Dependiendo de la tcnica que se emplee, podrn ser necesarios:
- Centrfuga
- Tubos de hemlisis
- Placa de vidrio
- Palillos mezcladores descartables
PROCEDIMIENTO
I- TECNICA EN PLACA
Preparar una suspensin de glbulos rojos al 40-50% en plasma o suero autlogos, o solucin
fisiolgica. Tambin puede emplearse sangre entera.
1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) sobre una placa de vidrio limpia.
2) Agregar una gota de la suspensin de glbulos rojos a probar.
3) Mezclar el antisuero y los glbulos rojos con un palillo descartable en un rea de 2 cm de
dimetro y balancear constantemente la placa durante 2 minutos. Observar
macroscpicamente la presencia o ausencia de aglutinacin.

II- TECNICA EN TUBO

Preparar una suspensin de glbulos rojos al 3-5% en plasma o suero autlogos, o en solucin
fisiolgica.
1)
Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemlisis.
2)
Agregar una gota de la suspensin de glbulos rojos a probar.
3)
Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3.500 rpm.
4)
Agitar el tubo para despegar las clulas y examinar macroscpicamente la presencia o
ausencia de aglutinacin.
Las reacciones aparentemente negativas deben incubarse a 37oC durante 15-30 minutos, luego
centrifugar y volver a leer como se describi en 4). Las muestras que an en estas condiciones
resulten negativas deben ser investigadas respecto al antgeno Du.
III- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA PARA Du
Preparar una suspensin al 3-5% de glbulos rojos en plasma o suero autlogos, o solucin
fisiolgica.
1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemlisis.
2) Agregar una gota de la suspensin de glbulos rojos a probar.
3) Mezclar e incubar a 37oC durante 15-30 minutos.
4) Lavar las clulas 3-4 veces con solucin fisiolgica, descartando perfectamente el
sobrenadante y resuspender las clulas luego de cada lavado.
5) Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecfico), mezclar, centrifugar 20 segundos
a 3500 rpm.
6) Agitar el tubo para despegar las clulas y examinar macroscpicamente.
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
La observacin de aglutinacin (con cualquiera de las tcnicas empleadas) indica una reaccin
positiva.

51

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.
La prueba para tipificacin de antgeno D (Rho) de glbulos rojos sensibilizados debe realizarse
solamente en medio salino. La determinacin del Du no puede efectuarse sobre glbulos rojos
sensibilizados.
Pueden obtenerse resultados ms rpidos y mejor visualizacin precalentando la placa a 4550oC.
PRESENTACION
Frasco x 10 ml (Cd. 1443155).
BIBLIOGRAFIA
- Landsteiner, K.; Wiener, A.S. - Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 43: 223, 1940.
- Wiener, A.S.; Unger, L.J. - JAMA 169:696, 1959.
- Widman, F.K. - Technical Manual - 9 th. Ed. Washington D.C., American Association of
Blood Banks, Chapter 9, 1985.
- Race , R.R. and Sanger, R. - Blood Groups in Man - 6 th Ed. Oxford Blackwell Scientific
Publications, pg. 178, 1975.
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2000 Rosario - Argentina
Elaborado por:
Wiener Laboratorios S.A.I.C.
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Bioqumica
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Suero Anti-humano
(poliespecfico)
Para realizar Pruebas Antiglobulina (Coombs) Directa o Indirecta

SIGNIFICACION CLINICA
Las experiencias descriptas por Coombs, Mourant y Race en 1945 establecieron que las Pruebas
Antiglobulina Humana resultaban los mejores mtodos para detectar anticuerpos sensibilizantes
pero no directamente aglutinantes. El ejemplo descripto originalmente haca referencia a
antgenos del sistema Rh.
Experiencias posteriores probaron el valor de estas pruebas en la deteccin de anticuerpos en
casi todos los grupos sanguneos de importancia clnica, siendo empleadas actualmente en los
siguientes casos:
Prueba Antiglobulina Indirecta
- Screening de suero de donantes y pacientes para anticuerpos.
- Pruebas de compatibilidad previas a la transfusin.
- Fenotipo de glbulos rojos.
- Identificacin y titulacin de anticuerpos encontrados en
suero o eluatos.

52

Prueba Antiglobulina Directa

- Diagnstico de laboratorio de anemia hemoltica y enfermedad hemoltica del recin nacido.
- Investigacin de reacciones dudosas en una transfusin.
- Investigacin de enfermedades autoinmunes que involucran la unin de inmunoglobulinas y/o
fracciones del complemento a los glbulos rojos.
FUNDAMENTOS DEL METODO
El agregado de Suero Anti-humano (poliespecfico) a glbulos rojos que estn cubiertos de
inmunoglobulinas y/o
Fragmentos de complemento (C3b, C3bi, C3dg o C3d), produce una aglutinacin de los
glbulos rojos visible macroscpicamente.
REACTIVO PROVISTO
Suero Anti-humano (poliespecfico): suero obtenido de conejos inmunizados con
inmunoglobulina G purificada y C3.
REACTIVOS NO PROVISTOS
- Reactivos para la determinacin de grupos sanguneos.
De acuerdo a la tcnica a emplear puede requerirse adicionalmente:
- Solucin fisiolgica.
- Solucin fisiolgica tamponada con buffer fosfato (PBS).
- Solucin fisiolgica de baja fuerza inica (LISS).
INSTRUCCIONES PARA SU USO
Suero Anti-humano (poliespecfico): listo para usar.
PRECAUCIONES
El Reactivo Provisto es para uso diagnstico "in vitro".
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO
El Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada
en la caja.

INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS

Desechar el reactivo si se observa contaminacin del mismo.
MUESTRA
Glbulos rojos
a) Recoleccin: la sangre debe ser obtenida aspticamente, con o sin anticoagulante.
b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA, heparina, ACD (cido ctrico,
citrato, dextrosa) CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina).
Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab.
c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en
refrigerador (2-10oC). Si se utiliz heparina o EDTA, la tipificacin debe llevarse a cabo en 48
horas. Las muestras recogidas con ACD, CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35
das. Si se emplean cogulos, deber efectuarse la tipificacin dentro de los 7 das de obtenida la
muestra.
Cuando se efectan pruebas antiglobulina directas, la sangre debe ser preferentemente fresca
(menos de 24 horas de la extraccin).
Si los glbulos provienen de cogulos, no deben ser refrigerados antes de las pruebas directas.

53

MATERIAL REQUERIDO (no provisto)

- Centrfuga
- Bao de agua a 37oC
- Tubos de hemlisis
PROCEDIMIENTO
I- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solucin salina de fuerza inica normal).
1) En un tubo de hemlisis colocar 2 gotas del suero a probar.
2) Agregar 1 gota de suspensin de glbulos rojos a probar al 3% lavados 3 veces y
resuspendidos en PBS.
3) Mezclar e incubar a 37oC durante 30-60 minutos.
4) Lavar los glbulos 3 veces con PBS teniendo la precaucin de descartar completamente el
sobrenadante y resuspender el precipitado luego de cada lavado. Descartar completamente
el sobrenadante luego del ltimo lavado.
5) Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecfico) al botn de clulas. Mezclar
perfectamente y centrifugar durante 15 segundos a 3.500 rpm.
6) Resuspender las clulas por agitacin y observar macroscpicamente. Tener en cuenta que
agitaciones demasiado vigorosas pueden desligar aglutinaciones dbiles.
7) Los resultados negativos deben confirmarse por adicin de glbulos rojos sensibilizados
con IgG dbiles.
II- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solucin fisiolgica de baja fuerza inica).
El empleo de esta solucin permite reducir el tiempo de incubacin a 15 minutos.
Los glbulos rojos deben lavarse 2 veces con PBS y una vez con LISS. Finalmente preparar con
esta solucin una suspensin de glbulos rojos al 3%.
1) Colocar en un tubo de hemlisis 1 gota de suero a probar.
2) Agregar 1 gota de glbulos rojos a probar al 3% en LISS.
3) Mezclar e incubar a 37C durante 15 minutos en bao de agua.
Continuar como se indica en los pasos 4) a 7) de la tcnica I).
III- PRUEBA ANTIGLOBULINA DIRECTA
Se emplea para demostrar la absorcin in vivo de IgG y/o fracciones del complemento en la
superficie de los glbulos rojos.
1) Preparar una suspensin de glbulos rojos a probar en PBS al 3%.
2) En un tubo de hemlisis colocar 1 gota de esta suspensin y continuar con los pasos 4) a 7)
de la tcnica I).
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
La observacin de aglutinacin (con cualquiera de las tcnicas empleadas) indica una reaccin
positiva.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
Reacciones falsas positivas y falsas negativas pueden ocurrir por las siguientes causas:
- Contaminacin qumica o bacteriana de la muestra u otros materiales empleados para la
prueba.
- Lavado inadecuado de las clulas.
- Tiempo o temperatura de incubacin inadecuados.
- Tiempo o velocidad de centrifugacin inadecuados.
- Concentracin inadecuada de glbulos rojos.
- Agitacin excesiva para despegar los glbulos rojos aglutinados.
Recordar que los reactivos han sido estandarizados para detectar inmunoglobulinas humanas y
fragmentos C3 unidos a los glbulos rojos. No son aptos para detectar anticuerpos de otro
origen.
PRESENTACION

54

Frasco x 10 ml (Cd. 1443156).

BIBLIOGRAFIA
- Coombs, R.R.A.; Mourant., A.E. and Race, R.R. - Lancet, ii:15, 1945.
- Coombs, R.R.A.; Mourant, A.E. and Race, R.R. - Brit. J. Exp. Path. 26:225, 1945.
- Widman, F.K. - Technical Manual. 9th ed. Washington D.C. American Association of
Blood Banks, pg. 376, 1985.
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Determinacin de anticuerpos inmunes

A. TITULACIN DE ANTICUERPOS
A.1 Tcnica bsica de titulacin
A.1.1. Preparacin de diluciones madres.
a) Colocar en una gradilla 10 tubos de Kahn numerados del 1 al 10 (el nmero de tubos puede
aumentarse o disminuirse si fuera necesario).
b) En los tubos 2 al 10, colocar 0,100 ml de solucin fisiolgica (SF). Colocar 0,300 ml de
suero a titular en el tubo N1.
c) Tomar 0,100 ml de suero del tubo 1 y transvasarlo al tubo N2.
d) Homogeneizar la mezcla de suero y SF con la misma pipeta. Luego se toman 0,100 ml de la
misma y se trasvasan al tubo de Kahn N3. Homogeneizar y repetir la operacin hasta
completar las diluciones.
A.1.2 Titulacin
a) Se toman 10 tubos de Kahn, numerados del 1 al 10 y se disponen en una gradilla. Con una
pipeta Pasteur para cada dilucin, colocar 2 gotas de las mismas en los correspondientes
tubos.
b) Adicionar con pipeta Pasteur 2 gotas de suspensin de hemates al 2%. Agitar la mezcla.
c) Incubar a la temperatura apropiada, el tiempo requerido.
d) Simultneamente se llevan a cabo controles de autoaglutinacin y de especificidad del
suero.
e) Leer los resultados macro y microscpicamente comenzando por los controles y luego por
el tubo de mayor dilucin. El grado de aglutinacin se considerar segn los scores
anteriormente indicados.
El ttulo es la recproca de la dilucin ms alta donde se observa aglutinacin . Si en la ltima
dilucin, con aglutinacin, el tipo de aglutinato es tr, el ttulo se determinar promediando dicha

55

dilucin con la precedente. Por ejemplo, si en el tubo N 5 cuya dilucin es 1/16, el tipo de
aglutinato es tr, el ttulo ser (16+8)/2=12.
a) Control de autoaglutinacin: consiste en enfrentar dos gotas de suspensin de hemates a
usarse con dos gotas del suero del dador de hemates.
b) Control de especificidad del suero: consiste en enfrentar dos gotas de hemates O con dos
gotas del suero a titular.

56

TRABAJO PRCTICO N 7
SEPARACION ELECTROFORETICA DE HEMOGLOBINAS
Fundamentos
La electroforesis consiste en la separacin de partculas aprovechando su traslado mediante la
aplicacin de campos elctricos. La capacidad de movimiento de las diferentes molculas
depende de la intensidad del campo aplicado, su carga y su peso molecular.
La hemoglobina, protena presente en los glbulos rojos, tiene varias formas moleculares,
algunas normales y otras anormales. El proceso de electroforesis aprovecha el hecho de que las
diferentes hemoglobinas migran a diferentes velocidades, permitiendo as su separacin. En
acetato de celulosa, a pH alcalino, la HbA migra hacia el nodo, mientras que la HbF (que en
condiciones normales se encuentra en pequeas cantidades) queda cercana a esta. La HbA2 tiene
una velocidad menor por lo que queda cerca del ctodo.
Durante la electroforesis, una corriente elctrica pasa a travs de la muestra de sangre de una
persona, lo cual hace que los tipos de hemoglobina se separen en diferentes momentos y formen
bandas. Al comparar la forma en la que se separan con la de una muestra de sangre normal, se
pueden ver los tipos y las cantidades de hemoglobina existentes en la muestra de sangre.
Entre sus ventajas estn, que constituye una microtcnica y el costo en reactivos y tiempo
laboral es muy bajo; adems mediante esta tcnica pueden diferenciarse con precisin la
presencia de las hemoglobinas A, S y C.
Soporte: Acetato de celulosa gelatinizado, en medio alcalino (pH= 8,5).

Las tiras deben conservarse en posicin vertical y en un recipiente tapado conteniendo

metanol al 40%.
Las tiras secas pierden las dimensiones y las caractersticas del gel.
La superficie de las tiras que es penetrable a las protenas se reconoce porque es ms
opaca luego de secarse entre dos tiras de papel de filtro.

Reactivos

Solucin buffer:
Tris-(hidroximetil)-amino etano..........................10,2 g
EDTA di sdico.......................0,6 g
cido Brico.3, 2 g
Agua Destilada.1000ml

Solucin colorante:
Amido Schwartz (0,5 g Amido Schwartz / 45 ml alcohol metlico / 10
ml cido actico / 45 ml agua destilada)

Solucin decolorante:
cido actico 5%.
cido actico: metanol (1+9).

Solucin deshidratante:
Metanol puro.

Solucin de transparentizacin (preparar en el momento) :

Metanol..........................85 ml
cido actico..................14 ml

57

Glicerol...........................1 ml

Solucin disolvente: cido actico 80%

Preparacin de solucin de hemoglobina

Puede utilizarse sangre fresca con cualquier anticoagulante (EDTA di sdico).

Centrifugar la sangre a 3000rpm durante 10 min en tubo de centrifuga cnico.
Separar por aspiracin el plasma sobrenadante y la capa de blancos y plaquetas.
Lavar los glbulos rojos 3 veces con solucin fisiolgica 5 min.
Centrifugar cada vez a 3000 rpm.
El ltimo centrifugado dejarlo 15 min.
Separar el sobrenadante.
Agregar a los GR igual volumen de agua destilada.
Mezclar bien por inversin con tapn.
Dejar reposar 10 min.
Agregar un volumen de tetracloruro de carbono igual a la mitad del volumen de GR.
Agitar enrgicamente 5 a 10 min.
Dejar reposar 30 min.
Centrifugar a 3000 rpm durante 15 min.
Aspirar la solucin lmpida de Hb q queda en la parte superior del tubo.
Se determina la concentracin de hemoglobina en el hemolizado obtenido, mediante el
mtodo de la cianometahemoglobina, se lleva la concentracin hasta los valores 7-8 g/dl
de hemoglobina con agua destilada.
Esta solucin de Hb debe procesarse inmediatamente si se sospecha de hemoglobina H.
de no ser as puede conservase una semana a -20 C.

Tcnica
1. Sumergir las tiras en el buffer por lo menos 10 minutos.
2. Eliminar el exceso de lquido secando entre 2 papeles de filtro (suavemente).
3. Extender las tiras sobre el puente de la cmara electrofortica. La superficie penetrable
tiene que ir dirigida hacia arriba. La tira debe estar bien tiesa y plana. Operar
rpidamente para evitar evaporaciones.
4. Sembrar las muestras: hemolizado obtenido siguiendo la tcnica expuesta en el presente
trabajo.
5. Conectar la fuente de poder, realizar la corrida a un voltaje constante de 200 volts,
durante 60 minutos.
6. Desconectar la corriente y retirar las tiras.
7. Colorear durante 5 minutos.
8. Decolorar de la siguiente manera:
- 5 minutos en AcH al 5%.
- 5 minutos en AcH al 5%.
- 5 minutos en AcH: metanol (1+9).
9. Determinacin cuantitativa: Cortar las fracciones coloreadas e introducirlas en tubos de
ensayo conteniendo la solucin disolvente y agitar. Leer a 630 nm. si se us colorante
Amido Schwartz.
10. Transparentizacin: Luego de decolorar las tiras se sumergen en metanol puro anhidro
durante 30 segundos, a continuacin se las coloca en la solucin transparentizadora
durante 1 minuto como mnimo. Se colocan luego en una placa de vidrio, eliminando
cuidadosamente las burbujas de aire y se calienta a la llama de un mechero durante unos
minutos, hasta la transparencia completa. As se conserva para leer en densitometra.
El siguiente cuadro muestra los resultados obtenidos en diferentes Hemoglobinopatas

58

TIPO
Normal

Polo negativo

Anhidrasas
Carbnicas

Polo positivo

HbA2

HbA

Recin nacido

ACLARACIONES
HbA 98%
HbA2 2%
HbF Aprox 90%

Anhidrasas HbA2
Carbnicas

HbF HbA

Drepanocitosis
homocigota
Anhidrasas HbA2 Hb S
Carbnicas

HbS 98%

Drepanocitosis
heterocigota
Anhidrasas HbA2 Hb S
Carbnicas

HbA 10%
HbA2 1%
HbA2 2%

HbA

Hemoglobinopata C
homocigota

HbA < 50%

HbS > 50%
HbA2 2%
HbC 98%

Anhidrasas
carbnicas

HbC

HbA2 2%

Hemoglobinopata C
heterocigota

HbC > 50%

Anhidrasas
Carbnicas

HbC

HbA

Anhidrasas HbA2
Carbnicas

HbA

-talasemia
heterocigota

HbA < 50%

HbA2 entre 4-8%

-talasemia
homocigota
Anhidrasas HbA2
Carbnicas
Doble Heterocigota
S/C
Anhidrasas HbC HbS
Carbnicas

HbF HbA

HbA2 normal
% de HbF y HbA,
variable segn tipo de
Th homocigota
HbS 50%
HbC 50%

59

TRABAJO PRCTICO N 8:
CITOQUMICA -MEDULOGRAMA
En el laboratorio de hematologa, la citoqumica constituye un elemento de capital importancia
y un complemento indispensable al la observacin morfolgica convencional para la
identificacin de las estirpes celulares. La citoqumica estudia la composicin qumica de la
clula y permite detectar la localizacin topogrfica de algunos principios inmediatos, enzimas,
metales pesados y otras sustancias. Se considera como un nexo de unin entre la morfologa y la
bioqumica
En este trabajo se describirn las tcnicas citoqumicas aplicadas con mayor frecuencia en la
Hematologa tradicional.
TECNICAS CITOQUIMICAS:
RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS NO ENZIMATICOS
Tincin histoqumica de hierro: coloracin de Perls
La coloracin de Perls pone de manifiesto la presencia de hemosiderina en el citoplasma tipo de
clula pudiendo ser aplicada a las clulas presentes en un frotis o extensin de sangre o mdula
sea. La hemosiderina es un derivado insoluble de la ferritina, que se considera el resultado de
la precipitacin de varias molculas desnaturalizadas de apoferritina. Normalmente, constituye
el hierro no hemnico de los eritroblastos y puede hallarse abundantemente en las clulas del
sistema mononuclear fagoctico.
CONSIDERACIONES
1. Frotis de la mdula sea bien extendidos en portaobjetos totalmente libres de hierro. Se
debe tener cuidado de evitar toda contaminacin por exceso de hierro que pueda contener el
portaobjeto a utilizar en la coloracin; para ello debern ser sumergidos en una solucin de
HCl 3 mol/L como mnimo dos minutos o ms para poder eliminar todo exceso de hierro.
2. Solucin clorhdrica de ferricianuro potsico. Debe prepararse extemporneamente
mezclando dos volmenes iguales de una solucin acuosa de ferricianuro potsico al 2% en
agua destilada (20g/L) y otra en HCl 0.2 N durante 10 minutos a temperatura ambiente
(24C).
METODO
1. Fijar los frotis en metanol o etanol al 80% durante 10-20 minutos.
2. Dejarlos secar a temperatura ambiente.
3. Preparar en el momento la solucin compuesta por partes iguales de ferrocianuro
de potasio (20gr/L) y HCl 0,2M.
4. Dejar actuar dicha solucin durante 10 minutos.
5. Lavar con agua de canilla durante 20 minutos.
6. Enjuagar con agua destilada.
7. Contracolorear con Hematoxilina durante 1-2 minutos.
8. Dejar secar y luego observar en microscopio ptico.

60

Tincin de Perls en Anemia Sideroblstica Refractaria

Deteccin histoqumica de hemoglobina fetal: reaccin de Kleihauer-Betke

FUNDAMENTO
La hemoglobina fetal (HbF o 22) es cido y alcalirresistente. Por consiguiente, sometido un
preparado fresco de sangre a una elucin cida ser arrastrada la hemoglobina A y retenida la
fetal dentro de los eritrocitos, lo cual se reconoce por la coloracin de estos ltimos.
REACTIVOS
1. Alcohol etlico al 80%
2. Buffer de cido ctrico, pH 3,4 constituido por dos soluciones:
Solucin A:
cido ctrico............................ 4,2 g
Agua destilada......................... 100 ml
Solucin B:
Citrato de sodio........................ 5,9 g
Agua destilada......................... 100 ml
Solucin Buffer pH 3,4:
Solucin A ................ 84 ml
Solucin B................. 16 ml
3. Eosina al 0,1 % en agua.
DESARROLLO
1. Extendidos de sangre secos de no ms de una hora de obtencin, se fijan durante 5 minutos
en el alcohol etlico al 80%
2. Lavado rpido con agua y secado.
3. Inmersin en una cpsula de Petri que contenga el buffer de citrato. Llevarlos a estufa a
37C un mnimo de 5 minutos, agitando cada dos minutos. Lavar rpidamente en agua
comn y secar en posicin vertical.
4. Colorear en 3 a 5 minutos con la solucin de eosina. Lavar con agua y secar.
RESULTADOS
Los hemates con hemoglobina fetal se colorean por la eritrosina o eosina. Los que contienen
hemoglobina A han sido reducidos a sus membranas vacas y aparecen como sombras.
El anlisis cuantitativo puede hacerse estableciendo el porcentaje de hemates coloreados e
incoloros.

61

Hematies con Hemoglobina Fetal

RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS ENZIMATICOS
PEROXIDASAS (MIELOPEROXIDASA)
Fundamento
Mtodo de Washburn: frente al agregado de agua oxigenada, aquellas organelas que poseen la
enzima desprenden oxgeno naciente del agua oxigenada y este oxida la bencidina a un xido
intermedio color azul oscuro al principio que luego vira al negro.
Reactivos
1. Colorante (conservar en heladera y oscuridad)
Bencidina
300 mg
Solucin saturada de nitroprusiato de Na
1 ml
Alcohol etlico absoluto
99 ml
2. Solucin H2O2-AcH
H2O2 (10 vol.)
2 gotas
H2O destilada
50 ml
AcH puro
1 gota
Preparar en el momento.
Procedimiento
1. Fijar el extendido con metanol o etanol 80% durante 5 minutos.
2. Impregnar el extendido con la solucin 1 durante 3 minutos.
3. Volcar sobre la misma solucin anterior la solucin 2, dejar actuar durante 2 minutos.
4. Pasado el tiempo tomar el extendido con alguna pinza, lavarlo y dejarlo verticalmente hasta
que se seque.
5. Contracolorear con una solucin de Giemsa diluido 1/10 durante 20 minutos.
6. Observar al microscopio ptico con aceite de inmersin.

Resultados
Positivo: citoplasma cubierto de color negro en aquellas clulas que poseen la enzima.

62

Reaccin de Peroxidasa (+) en precursor mieloide

BIOPSIA Y ASPIRADO DE MEDULA SEA - MEDULOGRAMA

La biopsia de mdula sea (BMO) se ha convertido en una herramienta til en el diagnstico de
enfermedades hematolgicas, de neoplasias primarias o metastsicas y estadificacin de las
mismas, de infecciones, y de enfermedades metablicas. Para optimizar la valoracin de la
BMO, es necesario conocer los datos clnicos y de laboratorio, incluyendo los resultados de la
sangre perifrica y del aspirado de la mdula sea (MO), as como las posibilidades diagnsticas
del mdico tratante. Se debe contar con un procedimiento tcnico adecuado para obtener y
procesar la BMO. La mdula sea (MO) comprende entre 3.5 y 6% del peso corporal; es el
principal rgano de hemopoyesis; es un rgano linfoide primario y secundario que proporciona
un medio para la maduracin celular y la interaccin inmunolgica; est influida por factores
reguladores para la produccin normal de clulas sanguneas.
La hemopoyesis es el proceso de produccin de elementos formes de la sangre, y est localizada
en el compartimento extravascular de la MO. La hemopoyesis en la MO se inicia desde la
mitad de la gestacin, y es el mayor sitio de hemopoyesis al nacimiento. Durante el primer ao
de la vida la hemopoyesis tiene lugar en la MO de huesos axiales y radiales del esqueleto, y a
partir de la mitad de la adolescencia los huesos planos centrales se convierten en los principales
sitios de hemopoyesis.
Importa sealar que uno de los factores que modifican la hemopoyesis es la edad; los recin
nacidos pueden tener una celularidad entre el 80 y 100% en la MO, mientras que en los ancianos
de ms de 70 aos, la celularidad normal puede ser de menos del 50%. Conforme los nios
crecen, la celularidad de la MO va decreciendo; en menores de 9 aos la celularidad es del 78%
13, y de 10 a 19 aos es de 72% 11. Las clulas progenitoras o clulas madre circulan en la
sangre perifrica y se alojan en la MO; de esta manera hay un suplemento continuo de clulas
pluripotenciales, capaces de autorenovarse y diferenciarse en clulas destinadas hacia
eritropoyesis, granulopoyesis, monocitopoyesis y megacariocitopoyesis.
Las clulas progenitoras pluripotenciales, adems de dar orgen a los eritrocitos, granulocitos,
megacariocitos y plaquetas, tambin generan linfocitos (linfopoyesis), clulas cebadas y
macrfagos.
INDICACIONES
La BMO est indicada en todas las enfermedades que puedan afectarla, ya sea en forma
primaria o secundaria. La indicacin hematolgica ms frecuente corresponde a la disminucin
de elementos formes de la sangre perifrica, las citopenias, leucopenia, anemia y
trombocitopenia, ya sea en forma aislada o de las tres series (pancitopenia). Las citopenias
perifricas pueden deberse a: 1) produccin insuficiente de clulas en la MO; 2) incremento en

63

su utilizacin perifrica, por destruccin o por prdida, sin una adecuada produccin
compensadora en la MO; 3) una combinacin de estas causas.
El aspirdo de MO se utiliza frecuentemente para el diagnstico de procesos proliferetivos ya sea
para la observacin microscpica como para la inmunomarcacin y posterior identificacin por
citometra de flujo.
Las especialidades mdicas que con mayor frecuencia solicitan la BMO corresponden a
hematologa, oncologa, infectologa y medicina interna.
Las indicaciones de la BMO se agrupan en Cuadro 1.
Cuadro 1: Indicaciones de BMO
- En pacientes con citopenias no explicadas previamente por los estudios
hematolgicos (incluye la evaluacin de procesos mielodisplsicos)
- En la sospecha de infiltracin de neoplasia con diagnstico previo desconocido
- Para la estadificacin oncolgica de tumores con diagnstico previo confirmado:
linfomas, otros tumores slidos como neuroblastoma, rabdomiosarcoma, etc.
- Para conocer la respuesta al tratamiento de algunas neoplasias: remisin, recada,
etc.
- Evaluacin de la mdula sea antes del trasplante de clulas progenitoras
- En el estudio de pacientes con fiebre de origen desconocido: sospecha de agentes
infecciosos com o histoplasmosis, tuberculosis.
- En la evaluacin de pacientes con enfermedad metablica por depsito de
material anormal

CONTRAINDICACIONES
No existe una contraindicacin absoluta para la BMO. Se debe tener controlado al paciente con
tendencia a sangrar y conocer el tipo de tratamiento que puede ocasionar hemorragias: aspirina
o anticoagulantes.
COMPLICACIONES
En general la BMO es un procedimiento relativamente bien tolerado y con bajo riesgo de
morbilidad. Las complicaciones de la toma de BMO son raras; corresponden a 0.08%,
generalmente debido a sangrados que pueden ocasionar hematomas. Otras complicaciones ms
serias son an menos frecuentes, como la neuropata transitoria, una infeccin de la herida y
osteomielitis, reaccin a medicamentos, as como dolor persistente. El riesgo de sangrado puede
ser mayor en pacientes con trombocitopenia y alteraciones de la funcin plaquetaria; ellos deben
tenerse en observacin en el hospital por 24 horas despus del procedimiento. La siembra de
clulas malignas puede ocurrir excepcionalmente en pacientes con metstasis diseminadas.
TECNICA
La BMO se debe realizar exclusivamente por personal capacitado y con experiencia en la
tcnica. La BMO se puede tomar en forma uni o bilateral, generalmente de la cresta ilaca
posterosuperior. Para el estudio de enfermedades hematolgicas, un fragmento es suficiente.
Para el estudio de las neoplasias malignas, frecuentemente se toman biopsias de dos sitios
diferentes: una de cada cresta ilaca.
El sitio de donde se obtiene la biopsia debe ser de fcil acceso, con mnimo trauma y sin peligro
para el paciente. En nios muy pequeos o en pacientes no cooperadores, la biopsia se toma
bajo anestesia general. En lesiones seas precisas es importante la gua con estudios de imagen.
La aguja para biopsia que ms se usa, especialmente por los hematlogos, es la de 11 a 8 gauge,
que obtiene una biopsia de 2 mm de dimetro, con una longitud de 1 a 2 cm, de acuerdo con la
profundidad a la que se introduce la aguja.
El aspirado de MO debe efectuarse despus de haber tomado la biopsia del tejido, colocando la
aguja a 1 cm de esa zona; se hacen los frotis, y el material restante se puede colocar en tubos
con anticoagulante para estudio con citometra de flujo, para estudios citogenticos, etc.
MANEJO DEL TEJIDO
La biopsia de MO se debe fijar de inmediato en formaldehido con amortiguador (buffer) de
fosfatos al 10%, cuando menos durante seis horas; posteriormente se coloca en solucin
descalcificadora, generalmente suficiente por 24 h.

64

Los cortes histolgicos no deben exceder 4 micras de espesor. Las tinciones iniciales ms
usadas son hematoxilina y eosina, cido peridico de Schiff (PAS), Giemsa, tincin para fibras
reticulares (Sweet) y para hierro (Perls).
Se realizarn estudios adicionales con imunohistoqumica, si son necesarios, sobre todo para el
diagnstico diferencial de neoplasias.
INTERPRETACIN
Histologa normal
En condiciones normales el tejido hematopoytico en los espacios medulares tiene una
distribucin y topografa especiales: los grupos de clulas eritropoyticas, los megacariocitos y
las formas maduras de la serie granuloctica, se localizan en sinusoides del centro del espacio
medular, mientras que los precursores mieloides tempranos se localizan con relacin a la
superficie endosteal de las trabculas seas y en la vecindad de las arteriolas. Por lo tanto, las
variaciones espaciales de las diferentes series son importantes en la interpretacin. Las clulas
madre no se identifican por la morfologa tradicional en los aspirados de MO, aunque recuerdan
a las clulas linfoides pequeas. Las clulas madre se identifican por su funcin y por el
inmunofenotipo que incluye la expresin de CD34, c-kit y Thy1, y estn localizadas en la regin
endosteal de la MO.
Celularidad. La celularidad en la MO corresponde a la proporcin entre las clulas
hemopoyticas y el tejido adiposo, que vara segn la edad del paciente, es casi del 100% en
recin nacidos y disminuye aproximadamente 10% conforme avanza cada dcada de la vida
(Cuadro 2).
En los recin nacidos a trmino hay predominio de los precursores mieloides, que ocupan dos
terceras partes de la celularidad, y disminuyen a un tercio al mes de edad. Los linfocitos en
recin nacidos ocupan un 15%, y aumentan hasta 50% al mes de edad, lo que se prolonga hasta
los 18 meses.
Relacin mieloide:eritroide (RM:E). Se refiere a la proporcin relativa entre el componente
granuloctico y el eritroide; el resto de los componentes de la mdula sea (megacariocitos,
linfocitos, clulas plasmticas) no se toman en cuenta en esta relacin.
En la primera semana de vida hasta el 70% de las clulas corresponde a la serie eritroide,
principalmente proeritroblastos y eritroblastos basfilos, por lo que la RM:E en esta etapa de la
vida est invertida, y es de 1:2.

Posteriormente el componente granuloctico aumenta y la relacin se estabiliza entre 2.5:1 y 4:1

en adultos. La tincin de PAS acenta la diferencia entre los dos componentes, ya que la serie

65

granuloctica tiene citoplasma PAS positivo difuso. La IHQ con anticuerpos antimieloperoxidasa y anti-glucoforina, identifica con mayor precisin los dos componentes.

MDULA SEA NORMAL

Eritropoyesis. En condiciones normales la maduracin de eritroblasto a normoblasto se lleva a
cabo en cinco das, y estos precursores nucleados de los eritrocitos se encuentran en grupos (seis
o ms clulas) con grados variables de maduracin. Frecuentemente se localiza un macrfago
(clula reticular) en el centro o en la vecindad de los grupos eritropoyticos y aparentemente
tiene un papel importante en la produccin normal de clulas rojas. La RM:E normalmente es de
1.5:1 a 3:1. Una disminucin en esta relacin, encontrada en una MO normo a hipocelular,
indica una hiperplasia eritroide, mientras no haya disminucin en los otros elementos.
Las clulas eritroides tienen ncleo redondo, hipercromtico con un halo perinuclear,
caractersticas que las distinguen de los linfocitos maduros. La tincin de Giemsa identifica a la
serie eritroide por la basofilia intensa de su citoplasma. Una de las alteraciones ms frecuentes
es la modificacin en la maduracin con cambios megaloblsticos, en la que se observan
precursores rojos con ncleos ms grandes e irregulares.

ISLOTE ERITROBLSTICO
Granulopoyesis. En condiciones normales todas las clulas de la serie granuloctica se
identifican en la BMO: mieloblastos, promielocitos, mielocito, metamielocito, bandas y
segmentados (neutrfilos, eosinfilos y basfilos). Un incremento en la RM:E, en MO normal o
hipocelular, sin disminucin de las otras series, indica hiperplasia granuloctica. Normalmente
los precursores granulocticos como los promielocitos y los mielocitos, no exceden el 3% y se
encuentran distribudos junto a la superficie del endocito de las trabculas seas. Los
metamielocitos, bandas y segmentados se localizan hacia el centro de la regin intrertrabecular,
y las clulas maduras llegan a la circulacin, migrando a traves del endotelio de sinusoides. Las
tinciones de IHQ con mieloperoxidasa, CD-117, CD-13, CD-15, CD-33 las identifican; las
clulas progenitoras se identifican con CD-34 y QBEND10.

66

Clulas cebadas. Generalmente se encuentran adyacentes a las clulas endoteliales de

sinusoides, bordeando la superficie endosteal de las trabculas seas, en el periostio y
adyacentes a la pared de pequeas arterias; aparentemente se originan del mismo precursor de
los granulocitos basfilos. Se caracterizan por tener ncleo redondo u oval con grnulos
citoplsmicos basfilos, que son rojos con la tincin de Giemsa y positivos con CD117 por
IHQ. Puede aumentar su nmero en algunos procesos infecciosos y por efecto de
medicamentos.
Megacariocitos y trombopoyesis. Los megacariocitos son las clulas ms grandes de la MO,
con dimetros que van de 12 a 150 m; varan en tamao y en la configuracin nuclear, son
positivos con la tincin de PAS. Se reconocen tres etapas de maduracin: 1) megacarioblasto
que mide 15 a 20 m, con ncleo oval o arrionado y citoplasma basfilo; 2) promegacariocito
que mide de 20 a 80 m, cuyo citoplasma es menos basfilo y tiene una zona perinuclear de
grnulos en desarrollo; 3) megacariocito maduro con ncleo cerebriforme o multilobulado,
citoplasma eosinfilo con granularidad variable; en esta etapa se liberan las plaquetas. Los
megacariocitos maduros se hallan en relacin a las sinusoides y liberan directamente las
plaquetas hacia la luz. Todo el megacariocito o parte de su citoplasma entra al sinusoide, y se
fragmenta directamente en el sistema vascular. En nios menores de nueve aos normalmente
hay 20+/-8 megacariocitos por mm2; en adolescentes, 16+/-4, y disminuyen conforme avanza la
edad hasta 10+/-6 en los ancianos. Otra forma de cuantificarlos es de 1 a 3 por campo a 40x.
Puede haber agrupamiento de megacariocitos cuando hay regeneracin de la MO, sin que esto
sugiera neoplasia. Las tinciones auxiliares de IHQ para facilitar su identificacin son:
relacionado al Factor VIII, CD-41, CD-61 y CD-79a.
Monocitos/macrfagos y clulas dendrticas. Estas clulas tienen una progenitora comn que
comparten con los granulocitos, y en condiciones normales generalmente son invisibles. Los
monocitos llegan de la circulacin a la MO, son menos del 5% del total de las clulas, y
maduran hacia macrfagos/histiocitos. Los macrfagos tisulares tienen ncleo redondo con
nuclolo de tamao variable y citoplasma abundante que frecuentemente muestra elementos
celulares fagocitados (eritrocitos, fragmentos nucleares, hemosiderina), y son responsables de la
fragmentacin de eritrocitos viejos y del almacenamiento de hierro. Son positivas con CD68 y
para CD163 con IHQ. En estas clulas se encuentra el material de depsito anormal de las
enfermedades metablicas por almacenamiento.
Las clulas dendrticas son escasas en la MO; se pueden identificar con IHQ porque son
positivas con protena S-100 y CD1a.
Linfocitos y linfopoyesis. La funcin linfopoytica de la MO, existe desde las etapas
embrionarias y persiste hasta la vida adulta, aunque en menor proporcin. Las clulas linfoides
se encuentran dispersas en la MO, independientemente de que se hayan originado en este sitio;
comprenden entre 15 y 20% de la celularidad, y conservan la misma proporcin, que en la
sangre perifrica: 65-75% son linfocitos T (CD-3+); 10-15% son linfocitos B (CD-20+), y 1020% son NK (CD-56+ y CD-16+). La proporcin de cmulos linfoides aumenta con la edad. En
los procesos benignos los cmulos linfoides se localizan en la regin intertrabecular y
perivascular; cuando son paratrabeculares sugieren malignidad.
Hematogonias. Son precursores de linfocitos B benignos, que generalmente no se identifican
en los aspirados de MO. En la BMO tienen ncleo denso, sin nuclolo prominente y escaso
citoplasma; presentan una mezcla de positividad para CD-45, CD-34, tdt, CD-20 y CD-10.
Importa sealar que slo una pequea proporcin de ellas son positivas para tdt y CD-34. Su
presencia vara de 3 hasta 25% en recin nacidos y prematuros sanos. En condiciones normales
disminuyen las hematogonias a 9% en nios menores de dos aos; hasta 3-4% a los 5 aos de
edad. Pueden aumentar a ms de 5% en MO con cambios regenerativos, sobre todo relacionados
con citopenias. La poblacin de hematogonias siempre exhibe un espectro variable en la
expresin de antgenos que identifica una maduracin normal, continua y completa de los

67

precursores B. Esto las distingue de las clulas de la LAL-pre-B, ya que stas carecen de
maduracin, y adems pueden presentar expresiones aberrantes de antgenos asociados con
diferenciacin mieloide. El conocimiento de este hallazgo es pertinente para la interpretacin
adecuada de la BMO en los diferentes grupos de edad. Hay que destacar que las hematogonias
no se encuentran en sangre perifrica.
Clulas plasmticas. Representan la etapa final de la maduracin de un grupo de linfocitos B;
corresponden al 1% de la celularidad de la BMO; son positivas con IHQ para kappa, lambda y
CD-138. En nios y adolescentes hay de 20 a 30 clulas por mm2. Cuando la IHQ muestra
restriccin para una de las cadenas ligeras (kappa o lambda), es un dato til para sospechar
monoclonalidad. Hay dos tipos de clulas plasmticas normalmente presentes en la MO: uno
corresponde a las habituales previamente mencionadas y fcilmente identificables, denominadas
reticulares (Marschalko); el otro tipo es la clula plasmtica linfoplasmocitoide, que deriva
de linfocitos B positivos para IgM; es ms pequea, con escaso citoplasma, ncleo menos
excntrico, y zona de Golgi poco definida; frecuentemente aparece en infecciones virales.
Estroma. Proporciona el sostn del tejido hematopoytico, constitudo por clulas adiposas,
fibroblastos y sus prolongaciones; por la extensa red de vasos sanguneos, incluyendo
sinusoides y por los nervios acompaantes. Las fibras reticulares normalmente slo se localizan
alrededor de los vasos con muy ocasionales fibras en las celdillas, que se visualizan con
tinciones de Gomori o de Gordon-Sweet..
Todo esto constituye el microambiente de la MO, con una estrecha relacin entre todos los
elementos mesenquimatosos y la hemopoyesis. Las molculas de adhesin son las responsables
de que las clulas madre permanezcan en el estroma. Las clulas adiposas ocupan una tercera
parte del volumen de la MO.
RESUMIENDO:
PROGENIE
ERITROIDE
Proeritroblastos
Eritroblastos basfilos
Eritroblastos policromatfilos
y ortocromticos
MIELOIDE
Mieloblastos
Promielocitos
Mielocitos
Metamielocitos
Cayados
Segmentados
Eosinfilos
Basfilos
LINFOIDE
Linfoblastos
Linfocitos
Clulas plasmticas
MONOCITOS
y
su
progenie
MEGACARIOCITOS

% RELATIVOS
0,5 7,5 %
7 40 %

0,5 5 %
0 7,5%
5 25 %
5 20 %
5 25 %
0,5 15 %
17%
01%
0,5 4 %
2,5 15 %
0,5 3%
0,5 3%
0,5 2 % (AUMENTO 40 X)

Artificios en mdula sea. Pueden ocurrir debido a una tcnica inadecuada, a un error en la
toma de la muestra, o por artificios en la preparacin histopatolgica. La deplecin de la
celularidad acompaada de hemorragia se puede presentar cuando se realiza primero el aspirado
y posteriormente se efecta en el mismo sitio la biopsia de MO.

68

CITOPENIAS
Citopenia de serie roja
La aplasia pura de la serie roja puede ser congnita como en el sndrome de Blackfan-Diamond,
o adquirida, por inhibicin selectiva de la eritropoyesis como en la insuficiencia renal crnica.
Hay formas transitorias como ocurre en el curso de procesos virales, en lupus eritematoso
sistmico y en estados preleucmicos En la BMO la vista panormica puede no mostrar
alteraciones en la celularidad, pero a mayor aumento llama la atencin que no se observan las
islas eritropoyticas normales, y slo en forma ocasional uno o dos precursores eritroides; puede
haber depsito de hierro en las clulas estromales y escasos agregados linfoides, que
frecuentemente corresponden a hematogonias
Citopenia de serie blanca
La causa ms frecuente de neutropenia adquirida son los procesos infecciosos, en los que
aumenta la destruccin de neutrfilos. La BMO puede mostrar necrosis, edema y fibrina. Una
alteracin semejante se puede observar en la citotoxicidad inducida por medicamentos.
El sndrome de Shwachman-Diamond es una enfermedad congnita con herencia autosmica
recesiva, caracterizado por insuficiencia pancretica excrina y neutropenia severa. La BMO
muestra disminucin acentuada de clulas precursoras y de granulocitos maduros
La neutropenia con una BMO hipercelular se puede ver en pacientes con enfermedades
autoinmunes: artritis reumatoide, sndrome de Felty, lupus eritematoso sistmico, y en ciertos
tipos de linfomas. Hay que recordar que las inmunodeficiencas primarias tambin pueden cursar
con neutropenia
Citopenia de megacariocitos
Los mecanismos de trombocitopenia pueden corresponder a: 1) defecto en la produccin, donde
la BMO muestra disminucin de megacariocitos; 2) prdida o utilizacin acelerada como en la
coagulacin intravascular diseminada, el sndrome urmico hemoltico, la septicemia, o los
procesos autoinmunes; 3) distribucin anormal, particularmente en esplenomegalia. Al igual
que otras citopenias, tambin se divide en trombocitopenia primaria y adquirida.
Las trombocitopenias primarias incluyen las congnitas, como el sndrome de Tar en el que se
reduce el nmero de megacariocitos, y las constitucionales, donde la MO es celular con
ausencia virtual de megacariocitos; algo semejante se ve en trombocitopenias, en el sndrome de
Wiskott-Aldrich y sus variantes.
Las trombocitopenias adquiridas frecuentemente se deben a procesos infecciosos o txicos, a
infiltracin neoplsica, en sndrome urmico hemoltico, en procesos autoinmunes como la
prpura trombocitopnica idioptica donde hay anticuerpos con IgG contra los antgenos de las
plaquetas. Sin embargo, en estos casos la MO muestra megacariocitos normales en la fase
aguda, y elevada en nmero en la fase crnica.
Anemia Aplsica. Es la disminucin acentuada de elementos maduros en la sangre perifrica
(pancitopenia), debido a la produccin insuficiente en la MO; puede ser familiar, congnita o
secundaria. La ms frecuente es la secundaria, generalmente por exposicin a agentes txicos.
Se requiere la BMO para excluir otras causas de pancitopenia, as como para conocer la
gravedad de la hipoplasia/ aplasia y la reaccin del estroma. Para una adecuada valoracin en
estos pacientes, se necesita de una biopsia de 20 a 30 mm de longitud, excluyendo la cortical
sea
La BMO muestra acentuada hipocelularidad, de 5 a 10% o menos; escasas clulas maduras,
prcticamente sin mieloblastos, y entonces debido a la hipoplasia medular, otros elementos
como los linfocitos y las clulas plasmticas pueden ser evidentes. Generalmente no hay fibrosis
reticulnica en los casos de anemia aplsica secundaria idioptica.

69

MO
HIPOCELULAR

MO NORMAL

HIPERPLASIA DE MO
La hiperplasia de la MO es frecuente en procesos no neoplsicos, como las infecciones
bacterianas y virales (virus de Epstein-Barr); las reacciones alrgicas y los medicamentos. En
ocasiones estos procesos elevan el nmero de clulas mieloides maduras, principalmente
granulocitos neutrfilos y ocasionan las llamadas reacciones leucemoides.
La diferenciacin histolgica entre una reaccin leucemoide y una leucemia mieloide crnica,
exclusivamente con la BMO es prcticamente imposible; sin embargo, en los procesos reactivos
generalmente hay un incremento proporcionado de los tres elementos de la MO.
La eosinofilia perifrica se refleja en la BMO con incremento en el nmero de eosinfilos
maduros que puede deberse a infecciones parasitarias, enfermedades alrgicas y dermatolgicas,
a mastocitosis sistmica y a reaccin a los medicamentos. La eosinofilia acentuada se puede
observar en el sndrome hipereosinoflico como precursor de leucemias/linfomas de tipo
linfoblstico, y en el linfoma de Hodgkin
El incremento en la megacariopoyesis puede verse en la prpura trombocitopnica idioptica, en
la hemlisis, el hiperesplenismo, enfermedades linfoproliferativas, linfoma de Hodgkin y otras
neoplasias malignas. En estos casos el incremento de megacariocitos se presenta sin
pleomorfismo ni atipia.

MO HIPERBLSICA

MO HIPERPLSICA

ALTERACIONES DE LA MADURACIN

70

Sndromes mielodisplsicos. La MO muestra un aumento en la proliferacin de las clulas

germinales con alteracin en la maduracin (displasia), hemopoyesis defectuosa de una o ms
lneas celulares con incremento en la apoptosis, lo que causa discrepancia entre la
hipercelularidad de la MO y las citopenias perifricas. En algunos casos la proliferacin
sobrepasa a la apoptosis y entonces la hipercelularidad de la MO puede coexistir con elevacin
de la cuenta de las clulas perifricas. Estos casos se pueden confundir fcilmente con
desrdenes mieloproliferativos y se designan como sndrome mielodisplsico/mieloproliferativo
mixto.
Los SMP son muy raros en nios: 4 por 1000000. Aproximadamente una tercera parte de los
nios con SMD tienen un trastorno gentico predisponerte, como alteraciones cromosmicas,
inmunodeficiencias primarias o deficiencia en la reparacin del ADN.
Es importante mencionar que la BMO puede mostrar cambios de tipo
mielodispoyticos/mielodisplsicos (MD), que morfolgicamente pueden ser indistinguibles del
SMD, pero clnicamente pueden corresponder a causas exgenas como deficiencias vitamnicas
o de hierro, neoplasias malignas (tumores slidos), infecciones, reaccin txica a
medicamentos, alteraciones autoinmunes, cambios regenerativos transitorios secundarios a
quimioterapia, a radioterapia o ambas, as como en hemopoyesis residual en las etapas
intermedias entre desordenes linfoproliferativos y linfomas.
La morfologa que muestra la BMO en el SMD generalmente es de hipercelularidad con
maduracin inadecuada cuando menos en dos de las tres series: frecuentemente cambios
megaloblsticos en la serie roja, hiperplasia de los precursores de la serie blanca con ausencia de
maduracin a polimorfonucleares e hiperplasia de megacariocitos, que pueden estar
hipolobulados o ser pequeos, generalmente agrupados; se acompaa de localizacin anormal
de los precursores inmaduros. Se ha relacionado el incremento de clulas de fenotipo blstico a
mal pronstico en pacientes con SMD. Frecuentemente se encuentran grados variables de
fibrosis reticulnica y puede haber hemosiderina. En algunos casos las BMO repetidas pueden
mostrar incremento de blastos o bien leucemia mieloide aguda. fibrosis no es comn en EMPT,
pero muy frecuente en LAM M7. Aparentemente esta mielopoyesis anormal no predispone a
otro tipo de leucemia linfoide (Cuadro 8).
Lesiones infiltrativas mieloides: Es poco frecuente que se tome BMO para el diagnstico de
LAM, ya que generalmente bastan los estudios hematolgicos. En ocasiones se realiza porque
los aspirados no son suficientes en celularidad, o porque la cuenta de blastos no rebasa 30%,
sobre todo en el diagnstico diferencial con sndrome mielodisplsico. El diagnstico
morfolgico de LAM se sospecha en una MO con celularidad del 100% con clulas montonas
de citoplasma eosinfilo y ncleo con cromatina irregular y nuclolo prominente. La IHQ es
importante para corroborar la inmadurez homognea de las clulas mieloides con
mieloperoxidasa, CD34 y CD117 positivos, acompaados de fibrosis reticulnica Grado II a III.
Lesiones infiltrativas no mieloides: La neoplasia linfoide ms frecuente en nios es la
leucemia linfoblstica, ya sea pre-B o pre-T. Cuando se presenta el cuadro clnico tpico de
leucemia con ms de 30% de blastos en sangre perifrica o en los aspirados, generalmente el
diagnstico es hematolgico y no es necesaria la BMO.
Solamente cuando los aspirados de MO son insuficientes para el diagnstico hematolgico
inicial o cuando se sospecha una recada la BMO puede mostrar sustitucin del tejido
hemopoytico por una neoplasia de morfologa homognea con clulas de ncleo de cromatina
fina, muy escaso citoplasma y frecuentemente fibrosis reticulnica en grado variable. La IHQ
con positividad para antgeno comn leucocitario (CD45), tdt, CD10 y CD-34 corrobora que se
trata de blastos; si adems es positiva para CD79a y PAX5, corresponde a LAL pre-B; si es
positiva para CD3 el diagnstico es LAL pre-T.
El diagnstico de linfoma en la BMO, generalmente se hace como parte del estudio de
estadificacin, una vez que el diagnstico se ha hecho en otro tejido, frecuentemente ganglio
linftico.
Histiocitosis: Las histiocitosis que pueden infiltrar la mdula sea son de dos tipos:

71

1) Histiocitosis de clulas de Langerhans (HCL). Es una enfermedad clonal de clulas

dendrticas epiteliales. La ms frecuente es en nios, usualmente se observa en las dos primeras
dcadas de la vida y puede ser una enfermedad generalizada o localizada (hueso). La forma
diseminada se caracteriza por lesiones en MO, huesos, hgado, bazo, ganglios linfticos y otras
vsceras; frecuentemente tiene curso clnico agresivo.
La BMO muestra grupos intersticiales o lminas de histiocitos con citoplasma eosinfilo y
ncleo con hendiduras, pueden formar clulas gigantes multinucleadas y estn mezclados con
un nmero variable de eosinfilos y linfocitos. Tambin se puede encontrar fibrosis y
hematopoyesis displsica, acompaada de hemofagocitosis que puede ser muy notable. Algunos
casos de HCL pueden presentarse como sndromes hemofagocticos. La IHQ corrobora la
presencia de clulas de Langerhans con positividad para S-100 y CD1a.
2) Histiocitosis hemofagoctica. Es frecuente en nios. Se caracteriza por incremento de
histiocitos que contienen elementos hemopoyticos fagocitados. El sndrome hemofagoctico es
una enfermedad grave en el que la proliferacin de histiocitos ocurre en respuesta a una
estimulacin variada de citoquinas. Los pacientes presentan fiebre, hepatoesplenomegalia,
citopenias (anemia 80%; neutropenia, trombocitopenia o las dos 50%), incremento de
triglicridos e hipofibrinogenemia
Procesos infecciosos
Son mltiples los microorganismos que pueden alterar la MO; sin embargo, la BMO slo est
indicada en pacientes con fiebre en estudio en quienes mltiples estudios con cultivos,
serolgicos y de imagen, no han identificado la etiologa. Algunos de estos pacientes pueden
tener inmunodeficiencia primaria o secundaria (post-tratamiento de neoplasias o de
enfermedades autoinmunes, SIDA), causante de una pobre respuesta inmune. Los grmenes que
frecuentemente se buscan en la MO son micobacterias y micosis, principalmente
histoplasmosis.
El parvovirus 19 puede ocasionar cuadros de anemia con reticulocitopenia por infeccin de los
precursores eritroides y la MO muestra hipoplasia de la serie eritroide con pronormoblastos
gigantes e inclusiones intranucleares que le dan aspecto de vidrio esmerilado con halo
perinuclear.

Enfermedades metablicas Son susceptibles de biopsia de MO cuando se sospecha

clnicamente una enfermedad por depsito de material que se pueda reconocer, frecuentemente
en macrfagos: material eosinfilo fibrilar citoplsmico, PAS positivo en enfermedad de
Gaucher, o bien macrfagos vaculados por lpidos en enfermedad de Niemann-Pick.
Algunas enfermedades metablicas con depsito sistmico de cristales, incluso en la MO, como
la cistinosis y la oxalosis, muestran adems de los cristales, alteraciones en el estroma. En la
oxalosis los cristales son grandes y existen en el estroma y en la matriz sea; son causa de
fibrosis acentuada, as como reaccin a cuerpo extrao. Los cristales de la cistinosis son menos
visibles: son pequeos, rectangulares; estn en el citoplasma de los macrfagos. Ambas
enfermedades son autosmicas recesivas y ocasionan insuficiencia renal crnica, adems de
otras alteraciones multiorgnicas.

72

TRABAJO PRCTICO N 9:
LEUCEMIAS MIELOIDES AGUDAS
La leucemia mieloide aguda (LMA) es un desorden caracterizado por presencia de clulas
progenitoras mieloides en medula sea (MO), infiltracin de la sangre perifrica (SP) y otros
tejidos, as como tambin la interrupcin de la hematopoyesis normal, ocasionando la
disminucin de los componentes mieloides de la sangre
La LMA representa un grupo heterogneo de enfermedades hematolgicas que derivan de los
precursores mieloides, monocticos, eritroides y megacariocticos de la MO.
Las LMA se clasifican en primer lugar por su morfologa (caractersticas del ncleo, citoplasma
y grnulos) y tambin segn las caractersticas citoqumicas, inmunofenotpicas (expresin de
determinadas molculas en la membrana o en el citoplasma de las clulas leucmicas, que son
reconocidas por anticuerpos monoclonales mediante tcnicas como la citometra de flujo),
citogenticas (alteraciones en el cariotipo) y moleculares (alteraciones que se detectan por
Southern blott, PCR).
Los mieloblastos difieren de los linfoblastos en que los primeros tienen una menor relacin
ncleocitoplasma, una cromatina nuclear ms fina, y un nucleolo claramente en sacabocado.
Los grnulos citoplasmticos estn frecuentemente presentes en los mieloblastos y la deteccin
de cuerpos o bastones de Auer es patognomnica.

BLASTOS MIELOIDES
Aproximadamente un tercio de las LMA presentan bastones de Auer: inclusiones
citoplasmticas, que representan aglomeraciones de grnulos azurfilos.
Los cuerpos de Auer contienen peroxidasa, enzimas lisosomales e inclusiones cristalinas.
Cuando estn presentes, son encontradas tpicamente en solo 1 a 10% de los blastos.
Se ven predominantemente en granulocitos inmaduros y solo raramente en monocitos
inmaduros. Los promieloctos malignos pueden contener mltiples bastones de Auer agrupados
en paquete, recibiendo estas clulas el nombre de clulas de faggot y las inclusiones del mismo
Sultan bodies.

BASTON DE AUER
Dos clasificaciones han sido usadas en la LMA.

73

La primera, creada en 1976 por el Grupo Franco-Amrico-Britnico (FAB) se basa en la

descripcin morfolgica de las clulas neoplsicas comparndolas con los precursores
hematopoyticos normales.
Esta clasificacin (si bien ha sido superada por la clasificacin de la OMS que incluye
citogentica, inmunofenotipo, etc.) ser la mas importante en la prctica de rutina, ya que, como
bioqumicos, en un laboratorio clnico o de urgencias, jugamos un rol relevante en la deteccin
del paciente con leucemia, para lo cual la morfologa y algn signo clnico que aporte el mdico
en la solicitud de anlisis, sern la nica herramienta con que contamos en ese momento.
La clasificacin French-American-British (FAB) usada desde 1976 utiliza un umbral de
30% de blastos en MO para diagnstico y divide a la LMA en subgrupos que van de M0 a
M7.
El diagnstico de LMA segn la WHO, y a diferencia de FAB, se confirma al encontrar
ms de 20% de mieloblastos en SP o en MO.
Clasificacin FAB. Criterios para los diferentes subtipos
Segn el grupo FAB, la LMA se clasifica en:
M0=Mieloide con mnima diferenciacin
M1= Mieloide inmadura
M2= Mieloide con maduracin
M3= Promieloctica
M4= Mielomonoctica
M5= Monoctica,
M6= Eritroleucemia,
M7= Megacarioblstica
Criterio para LMA M0 (indiferenciada):
Con mnima diferenciacin mieloide. No estaba incluida en la primera versin de la
clasificacin FAB. No puede ser diagnosticada sobre una base morfolgica solamente, dado que
los blastos son grandes y agranulares, a veces semejando linfoblastos L2 o raramente L1 y
deberan ser identificados por una reaccin de mieloperoxidasa (MPO) y sudan black (SB)
negativas (o positivas en menos de 3% de los blastos), marcadores de linaje B y T negativos y
expresin de antgenos mieloides reconocidos por al menos uno de los anticuerpos
monoclonales CD13 o CD33.
Frecuentemente, otros marcadores mieloides son positivos, e incluyen CD11b y la enzima MPO
demostrada por inmunocitoqumica y/o anlisis por microscopa electrnica.
Criterio para LMA M1 (sin maduracin):
La suma de clulas blsticas tipo I y II en MO debe ser 90% o mas de las clulas no eritroides y
por lo menos 3% de estas clulas blsticas sern peroxidasa o sudan black positivo. Las
restantes (10%) clulas sern granulocitos desde promielocitos en adelante, o monocitos.
Criterio para LMA M2 (con maduracin):
La suma de los blastos tipo I y II en MO es de 30% a 89% de las clulas no eritroides; las
clulas monocticas son menores al 20%; y los granulocitos de promielocitos a neutrfilo
maduro son mas del 10%.
Criterio LMA para M3 (promieloctica) (LPM):
Es la leucemia hipergranular promieloctica.
A) La gran mayora de las clulas son promielocitos anormales, con un modelo caracterstico de
granulacin densa; B) el ncleo vara ampliamente en tamao y forma y es frecuentemente
reniforme o bilobulado; C) el citoplasma de la mayora de las clulas esta ocupado
completamente por granulacin roja, rosa o prpura.
D) En algunas clulas el citoplasma esta cubierto de finos grnulos como polvo.

74

Las clulas caractersticas conteniendo manojos de cuerpos de Auer ("faggots"), azarosamente

esparcidos por el citoplasma, estn invariablemente presentes en MO y a veces en SP. El
citoplasma de las clulas que contienen faggots es frecuentemente claro o est plidamente
teido, pero puede tambin contener grnulos azurfilos.
La mayora de los casos de M3 cumple esta descripcin, pero existe una forma atpica
caracterizada por una minima granulacin denominada "M3 Variante". Su caracterstica
citomorfolgica ms saliente se relaciona a la configuracin nuclear y a la aparicin escasa de
clulas con densa granulacin y de clulas conteniendo mltiples bastones de Auer. El ncleo
de casi todas las clulas en SP es bilobulado, multilobulado o reniforme, pero la mayora de las
clulas estn desprovistas de grnulos o contienen unos pocos finos grnulos azurfilos. Sin
embargo, estn presentes algunas clulas con caracterstica de la tpica M3. La morfologa
atpica es propia de clulas en SP. En MO la morfologa es semejante a la de M3 tpica.
Criterio para LMA M4 (mielomonoctica):
En MO las clulas blsticas son mas del 30% de las clulas no eritroides. La suma de
mieloblastos, promielocito, mielocito y granulocitos en sus ltimos estadios de maduracin es
>30%, pero < de 80% de clulas no eritroides. Mas del 20% de clulas no eritroides son de
estirpe monoctica en diferentes estadios de maduracin; generalmente son promonocitos y
monocitos. Cuando las clulas monocticas exceden 80%, se diagnostica LMA M5. Cuando los
hallazgos en MO son como se ha indicado y el recuento de monocitos perifrico (monoblastos,
promonoblasto y monocito) es 5. 109/l, el diagnostico es LMA M4.
Si el recuento de monocitos es < 5.109/l, aun persiste el diagnostico de M4 si los hallazgos en
MO son como se describi y se demuestra la presencia de un componente monoctico, como la
estimacin de lisozima o mtodos histoqumicos que incorporan una doble reaccin de
esterasas, cloroacetato esterasa especifica, alfa naftil acetato esterasa no especifica, u otras
esterasas que identifican monocitos como naftol ASD acetato con o sin incubacin con fluoruro
de sodio.
El diagnostico de M4 se establece si mas de 20% de precursores de MO son monocitos,
evidenciados por reaccin citoqumica, o si la concentracin de lisozima excede 3 veces el valor
normal de suero u orina. Si la medula parece la de los casos de LMA M2, el diagnostico de M4
es aun posible si el recuento de monocitos perifrico es de 5. 109/l y uno de los tests
mencionados seala un aumento de componente monoctico en MO.
M4 con eosinofilia: Estos eosinfilos son anormales y algunos tienen adems de los grnulos
eosinfilos especficos, amplios grnulos basfilos (inmaduros) y puede tener un nico ncleo
no segmentado. Tie con cloroacetato esterasa y PAS.
Criterio para M5 o monoctica
Se basa en el aspecto de la MO. El 80% o ms de todas las clulas no eritroides en MO son
monoblastos, promonocitos o monocitos.
Se describen dos variedades.
-M5a: 80% o ms de todas las clulas monocticas son monoblastos.
-M5b: menos del 80% de todas las clulas monocticas son monoblastos, las restantes son
predominantemente promonocitos y monocitos.
Criterio para LMA M6 (eritroleucemia):
El criterio de diagnostico para M6 es diferente del utilizado para los otros subtipos de LMA
(M1-M5).
El criterio revisado para el diagnostico de M6 requiere que 30% o mas de las clulas no
eritroides en MO sean blastos tipo I o II.
Criterio para LMA M7 (megacarioctica):
Estas clulas son altamente polimrficas y van desde pequeas clulas redondas con escasa
cantidad de citoplasma y densa cromatina, a veces semejando linfoblastos (L1), a clulas que
semejan los blastos vistos en L2, con o sin grnulos y con 1 a 3 nucleolos prominentes. El
ncleo es redondo con cromatina finamente reticulada. Hay cierta heterogeneidad en el tamao

75

debido a que aproximadamente 20 % al 30 % de los blastos presentan 3 veces o mas el tamao

de un linfocito normal.
A veces, las clulas en MO o SP pueden tener mamelones, o se ve un ncleo desnudo con
grupos de plaquetas alrededor.
Los blastos son Sudan Black o MPO negativos. Puede ocurrir confusin con monocitos dado
que la alfa naftil acetato esterasa o la naftil AS-D acetato esterasa da reaccin positiva y la
reaccin puede ser inhibida significativamente con fluoruro.
Sin embargo los megacariocitos son casi siempre negativos a la alfa naftol butirato esterasa (lo
que los diferencia de los monocitos). Adems, los megacarioblastos frecuentemente tienen una
positividad localizada y distintiva con la alfa naftil acetato esterasa en contraste con una tincin
citoplasmtica ms difusa en los monocitos.
La reaccin de PAS o fosfatasa acida son tambin frecuentemente positivas con un modelo
caracterstico.
La incidencia de los distintos tipos FAB es, aproximadamente: M1:18%, M2:28%,
M3:8%, M4:27%, M5:10%, M6:4%, M7:5%.
En 2002, la OMS propuso un sistema de clasificacin que incorporaba informacin citogentica
diagnstica que se correlacionaba de forma ms confiable con los resultados.
En esta clasificacin, los pacientes con t (8;21), inv (16), t(15;17) y aquellos con
desplazamientos MLL, los cuales de manera colectiva constituan casi la mitad de los casos de
LMA infantil, fueron clasificados como "LMA con anomalas citogenticas recidivantes".
Esta clasificacin tambin disminuy los requisitos en cuanto al porcentaje de blastos en la MO
para el diagnostico de LMA (de 30 a 20%). Se hizo una aclaracin de que los pacientes con
anomalas citogenticas recidivantes no necesitaban cumplir con los requisitos mnimos de
blastos para considerrseles con LMA.
El anlisis citogentico, identifica la presencia de ciertas anomalas genticas asociadas con un
pronostico favorable (denominado de bajo riesgo) como lo son: inv(16)(p13q22),
t(8;21)(q22;q22) y t(15;17) (q22;q12).
Mientras que alteraciones en el 11q23, t(6;9), t(9;22), -7, del(5q), inv(3) o t(3), estn asociadas a
un pobre pronostico (es decir de alto riesgo).
Dada su importancia, este aspecto fue reconocido por la OMS, creando as, los grupos:
- Grupo I: LMA con Anormalidades Genticas Recurrentes que incluye,
como se menciono anteriormente, subgrupos genticos especficos.
- Grupo II: La LMA que comparte anormalidades citogenticas y otras caractersticas clnicas
y biolgicas con el SMD fue clasificada como LMA con Displasia Multilinaje (DML). La
OMS sugiere que el principal determinante para el diagnstico de este tipo LMA sea la
evidencia o historia de SMD o de neoplasia mielodisplsica/mieloproliferativa (SMD/NMP) de
seis meses de evolucin.
En la nueva clasificacin, el diagnostico de LMA con DML sin antecedentes de SMD o
SMD/NMP se hace cuando los blastos alcanzan el 20% en el aspirado de MO y cuando el 50%
o mas de las clulas en dos o mas lneas mieloides son displsicas en una muestra previa al
tratamiento.
- Grupo III: Los casos inducidos por la exposicin a terapias antineoplsicas (agentes
alquilantes, radiaciones e inhibidores de la Topoisomerasa II) son incluidos en LMA Y SMD
relacionados con terapias previas. Los alquilantes y la radiacin inducen aberraciones
citogenticas cuatro a siete anos despus de la exposicin mientras que para el tratamiento con
inhibidores de la Topoisomerasa II el periodo es entre uno a tres aos.
- Grupo IV: Las LMA que no cumplen los criterios de los anteriores grupos conforman el
LMA no clasificable de otra forma cuyos subtipos no difieren mucho de su correspondiente
en la clasificacin FAB incluyendo adems la leucemia basoflica aguda, panmielosis aguda con
mielofibrosis y sarcoma mieloide.

76

Clasificacin de la OMS para la LMA

LMA con anomalas genticas recidivantes
LMA con t(8;21)(q22;q22), RUNX1-RUNX1T1(CBFA/ETO).
LMA con inv(16)(p13q22) o t(16;16)(p13;q22), CBFB-MYH11.
Leucemia promieloctica aguda con t(15;17)(q22;q11-12), PML-RARA.
LMA con t(9;11)(p22;q23), MLLT3-MLL.
LMA con t(6;9)(p23;q34); DEK-NUP214.
LMA con inv(3)(q21q26.2) o t(3;3)(q21;q26.2), RPN1-EVI1.
LMA (megacarioblstica) con t(1;22)(p13;q13), RBM15-MKL1.
LMA con NPM1 mutado.
LMA con CEBPA mutado.
LMA con caractersticas relacionadas con la mielodisplasia
Neoplasia mieloide relacionado a terapia
LMA no especificada de otra manera
LMA con diferenciacin minima.
LMA sin maduracin.
LMA con maduracin.
Leucemia aguda mielomonoctica.
Leucemia monoblstica y monocticas aguda.
Leucemia eritroide aguda.
Leucemia megacarioblstica aguda.
Leucemia basoflica aguda.
Panmielosis aguda con mielofibrosis.
Sarcoma mieloide.
Proliferaciones mieloides relacionadas con el sndrome de Down:
Mielopoyesis anormal transitoria.
Leucemia mieloide relacionada con el sndrome de Down.
Neoplasma celular dendrtico plasmocitoide blstico
CITOQUMICA DE LAS LMA
MPO
ENE
CAE
ANAE
SUDAN
PAS

M0
-

M1-M2-M3
+

M4
+

M5
-

M6
-

M7
-

+
+
-

+
+*
+
+/-

+/+*
+/-

+/- *
-

* Inhibidas por fluoruro

INMUNOFENOTIPO MS RELEVANTE
M0
M1
M2
M3
M4
CD13 CD
13 CD 13 CD 13
CD 13
CD 33 CD33
CD 33 CD 33
CD 33
CD
CD 11 b
CD 11 HLA DR CD 14
14CD
65 b
CD 14
CD 15
+/CD 15
HLA
+++

M5
CD 13
CD 33
CD 14
HLA DR +
DR CD 65

M6
Gly A
CD
71
CD
36

M7
CD 61
CD 41
CD 13 y
33 +/-

77

LMA M0

LMA M1

LMA M2

LMA M3

LMA M3 V

LMA M5

LMA M4

LMA M6

78

LMA M7

79

TRABAJO PRCTICO N 10
LEUCEMIA LINFOBLASTICA AGUDA
Leucemia Linfoblstica Aguda
Es tambin conocida como leucemia linfoide aguda o leucemia linfoblstica aguda (LLA). Es el
cncer mas frecuente en pediatra.
La LLA puede ser de estirpe B o T. Aproximadamente 85% de los casos de LLA son de clulas
linfocticas de linaje B (LLA-B), la LLA-T es diagnosticada en el 15% de los nios y adultos
con LLA.
1- Generalidades
5200 casos/ao en US (National Cancer Institute),
Pico de incidencia a la edad de 4 aos, generalmente menores de 15 aos
80% de las leucemias en nios son LLA
- 85% son de clula B,
-15% son T, pero ambas frecuentemente presentan expresin aberrante de antgenos mieloides o
linfoides asociados.
Factores de riesgo: radiacin in tero, sndrome de Down, ataxia telangiectasia, sin embargo la
mayora de los casos no presentan causa conocida.
Sntomas: de abrupto establecimiento, relacionados a depresin de la MO, (fatiga, fiebre,
sangrado), dolor seo,
dolor de articulaciones, linfadenopata generalizada,
hepatoesplenomegalia, compromiso testicular, manifestaciones de sistema nervioso central.
Presentacin atpica: hipercalcemia, lesiones seas, ausencia de blastos circulantes.
Laboratorio: la anemia es comn, el recuento de plaquetas es <100x109/l en el 75% de los
casos y <10x109 /l en el 15%; la leucopenia se presenta en el 25% de los afectados, en un 10 %
de los pacientes se observa leucocitosis (WBC>100x109/l)
Pronstico favorable: edad entre 2-10 aos, sexo femenino, raza blanca; fenotipo preB,
hiperdiploida >50, t(12,21), recuento de blancos normal a la presentacin, respuesta rpida a la
quimioterapia, CD10+.
Pronstico intermedio: hiperploida 47-50, diploida, 6q-, rerelos del 8q24
Pronstico desfavorable: < de 2 aos (pues generalmente presentan translocaciones 11q23) o
>de 10 aos; t (9;22) (pero no si es >de 59 aos); hipoploida, casi tetraploide, 17p-, t(11q23);
LLA preB CD10 negativa; expresin de MDR1 en nios y adultos. Hiperleucocitosis y
plaquetopenia.
2- Epidemiologa
La LLA es la enfermedad maligna mas frecuente en la edad peditrica. Constituye un 25% de
los tumores peditricos y el 75% de todas las leucemias peditricas.
El pico de incidencia se sita entre los 2 y 5 aos. En pases con poblaciones heterogneas se ha
observado un aumento de frecuencia en la raza blanca.
Es algo mas frecuente en los varones, sobre todo en la edad puberal.
Desde el punto de vista geogrfico, la LLA es mas frecuente en los pases ms industrializados.
Se cree que esto es debido a la mayor exposicin a agentes leucemognicos en dichos pases.
3- Etiopatogenia
La LLA es la consecuencia de la transformacin maligna de una clula progenitora linfoide
inmadura que tiene la capacidad de expandirse y formar un clon de clulas progenitoras
idnticas bloqueadas en un punto de su diferenciacin. La secuencia de eventos que llevan a la
transformacin maligna es multifactorial. Estos eventos se producen durante el desarrollo

80

linfoide, momento en el que los precursores linfoides tienen mayor riesgo de presentar
mutaciones espontneas debido a la alta tasa de proliferacin de estas clulas y al
reordenamiento gentico que se lleva a cabo en ese proceso.
La acumulacin de estos linfoblastos en la MO y en diversos rganos provoca las
manifestaciones clnicas de las LLA.
Se han identificado pocos factores que estn relacionados con un aumento en el riesgo de LLA.
Los factores de riesgo no genticos primarios aceptados son la exposicin prenatal a los rayos X
y la exposicin postnatal a dosis altas de radiacin.
Se han identificado mltiples translocaciones cromosmicas en las LLA. Existe un mayor riesgo
de desarrollar leucemia aguda en pacientes con sndrome de Down (hasta 15 veces ms que en
la poblacin normal), de Schwachman, Klinefelter, neurofibromatosis y en sndromes
caracterizados por fragilidad cromosmica como la ataxia-telangiectasia, sndrome de Bloom o
la anemia de Fanconi. La frecuencia de LLA es mayor entre familiares de pacientes afectados.
Estos pacientes representan una minora de casos de LLA.
Sndrome de Down. Los nios con sndrome de Down muestran un aumento en el riesgo de
presentar LLA y leucemia mieloide aguda, con un riesgo acumulativo de presentar leucemia de
aproximadamente 2,1% a la edad de 5 aos y 2,7% a la edad de 30 aos.
Aproximadamente de la mitad a dos tercios de los casos de LA en nios con sndrome de Down
son LLA.
Los pacientes con LLA y sndrome de Down tienen una incidencia ms baja de hallazgos
citogenticos, tanto de pronstico favorable como desfavorable, y una incidencia menor de
fenotipo de clulas T. Aproximadamente un 20% de los casos de LLA que surgen en los nios
con sndrome de Down presentan mutaciones JAK2 somticamente adquiridas. Mientras que la
vasta mayora de casos de LMA en los nios con sndrome de Down se presentan antes de los
cuatro aos de edad (mediana de edad, un ao), la LLA tiene una distribucin de edad similar a
la de los nios con LLA sin sndrome de Down, con una mediana de edad de 3 a 4 aos.
Los factores que se han asociado claramente a un mayor riesgo de presentar LLA son el sexo
masculino, la edad entre 2 y 5 aos, la raza caucsica, la exposicin intratero a radiaciones
ionizantes y la exposicin posnatal a la radiacin causada por bombas atmicas o tratamientos
con radioterapia. No se ha comprobado asociacin clara entre el riesgo de desarrollar LLA y los
campos electromagnticos de baja frecuencia o la exposicin al radn. En los ltimos aos se ha
dado mucha importancia a la posible etiologa viral en las LLA. La nica asociacin clara
descripta en pacientes peditricos hasta ahora ha sido el virus de Epstein-Barr en el linfoma tipo
Burkitt y algunos tipos de linfoma de Hodgkin.
4- Clasificacin Morfolgica
Los criterios morfolgicos se basan en la definicin del Grupo FAB (de French- American
British).
El grupo FAB reconoce tres variedades morfolgicas de LLA: L1, L2 y L3.
El subtipo morfolgico L1 es el ms comn (85%), le sigue el subtipo L2 (14%), y el L3 (1%).
En la actualidad solo tiene un valor relativo debido a que los subtipos L1 y 2 no definen a un
subtipo biolgicamente relevante, y su valor pronstico es muy limitado.

Rasgos citolgicos L1

L2

L3

Tamao celular

Clulas pequeas

Clulas grandes

Clulas grandes

Cromatina

Homognea

Variable,
Heterognea

Homognea
mitosis >5%

Forma del ncleo Regular, Ocasionalmente Irregular,

hendido
indentado

hendido

o Regular
redondo

,oval

81

Nucleolos

No visibles o pequeos

Uno o mas

Vacuolizacin

Habitualmente ausente

Habitualmente ausente Prominente

Basofilia
citoplasmtica

Ligera

Variable

1-LINFOBLASTOS
2-LINFOCITOS

Uno o mas

Muy intensa

LINFOBLASTOS

Los linfoblastos L1 son clulas pequeas caracterizadas por una elevada relacin
ncleo/citoplasma (N:C). El citoplasma es azul plido y escaso, y esta limitado a una pequea
porcin del borde celular. Las clulas tienen nucleolo indistinto y la membrana nuclear varia de
redonda a clivada.
Los linfoblastos L2 son mayores, frecuentemente son una poblacin ms heterognea, con
menor relacin N:C. El nucleolo prominente (frecuentemente con condensacin de cromatina
perinuclear). La membrana nuclear puede ser irregular o reniforme.
Los linfoblastos L3 son un grupo heterogneo de clulas, caracterizado por una profunda
basofilia citoplasmtica y prominente vacuolizacin citoplasmtica.
La LLA no esta tpicamente asociada con la presencia de grnulos azurfilos, que son una figura
mucho mas comn de las LMA. Sin embargo, la LLA granular es un fenmeno morfolgico
que debe ser reconocido y no debe ser confundido con LMA. Este error puede ocurrir
particularmente si existe una granulacin densa en conjuncin con la morfologa FAB L2. Los
estudios inmunolgicos y citoqumicos corroborarn el diagnstico correcto. La variante
granular ocurre en aproximadamente 7% de nios con LLA.
La vacuolizacin citoplasmtica es una caracterstica de la categora FAB L3 donde est
asociada con un gran tamao celular e intensa basofilia citoplasmtica. Sin embargo, tales
vacuolas no son exclusivas de la variante L3. Generalmente menores y mas escasas, se las
puede encontrar en clulas de una minora de nios con LLA L1 y L2. Los blastos vacuolados
de la LLA peditrica suelen ser PAS positivos y son mas comnmente encontrados en pacientes
de 3 a 7 aos de edad con bajos recuentos leucocitarios y positividad al CD 10.
El sistema de escarificacin propuesto enfatiza la importancia de la elevada relacin N:C y
ausencia de nucleolo para L1 y la baja relacin N:C, nucleolo prominente, irregularidades
de membrana groseras y gran tamao del blasto para la L2
Por otra parte el subtipo L3, que se reconoce inmunofenotpicamente como LLA B, se considera
como la fase leucmica del linfoma de Burkitt.

82

5- Citoqumica
Acido peridico de Schiff (PAS): Aproximadamente en el 80 % de los casos de LLA los
linfoblastos son PAS reactivos . La reaccin es positiva en un 40- 70% de los blastos de las
LLA. Estas clulas caractersticamente presentan un patrn granular o en mazacote (rosado
fuerte) con un fondo negativo. Los blastos mieloides o monocticos son dbilmente positivos o
negativos. Los blastos en la LLA son negativos a la reaccin de MPO, Sudan Black B y naftol
ASD cloroacetato esterasa, sin embargo hay casos descriptos de positividad al Sudan Black en
estas leucemias. En la LLA L3 las vacuolas se tien con la coloracin aceite rojo O (oil red O).
CITOQUMICA

LLA - B

LLA - T

MPO
SUDAN BLACK

PAS
FAC

+
-

+ dbil
+ focal

NASDA
NASDA F-

+ dbil/No se inhibe

+
No se inhibe

ANABE
ANAE

+
+

6- Clasificacin Inmunolgica
Se basa en la expresin de antgenos especficos presentes durante las diferentes fases de la
diferenciacin de la clula.
La co expresin en clulas blsticas de HLA-DR y antgenos asociados a la clula B como el
CD19, CD22 o CD10 es consistente con el diagnostico de LLA de clula B.
Dentro de las LLA, el grupo EGIL (European group for the immunological
characterization of leukaemia) ha establecido una clasificacin inmunolgica tanto de las LLA
de lnea B como de las de lnea T basada en la expresin de diferentes antgenos.
Dentro de las de lnea B, uno de los aspectos mas importantes es identificar correctamente las
LLA B maduras. Estas se caracterizan por la expresin de cadenas livianas de Ig en la superficie
celular (ocasionalmente en el citoplasma).
Aunque se relacionan con el tipo morfolgico L3, se han identificado casos sin esta morfologa.
Su identificacin es de gran importancia, ya que su tratamiento y pronstico es diferente al del
resto de las LLA.
Clasificacin inmunolgica de las LLA
LLA de estirpe B
CD19+ y/o CD79+ y/o CD20+ (al menos 2 +). La mayora Tdt+ y HLA-DR+
ProB : sin expresin de otros antgenos de diferenciacin
Comn : CD10+
PreB : IgM citoplasmtica +
B madura : Ig superficie +
LLA estirpe T
CD3 citoplasmtico +. La mayora Tdt +, HLA-DR + y CD34 ProT : CD7 +
PreT : CD2 + y/o CD5 + y/o CD8 +
T intermedia : CD1a +
T madura: CD3 + en membrana.
Aproximadamente tres cuartos de los pacientes con LLA de clulas precursoras B, tienen

83

inmunofenotipo de la clula precursora B comn y cuentan con el mejor pronostico.

Aproximadamente 5% de los pacientes tienen el inmunofenotipo de precursor pro-B. Este
fenotipo es el ms frecuente en nios jvenes y con frecuencia se relaciona con un t(4;11).
Las clulas leucmicas de pacientes con LLA PRE-B, contienen Igc y el 25% de los pacientes
con LLA PRE-B, tienen t(1;19).
Aproximadamente el 2% de los pacientes presentan leucemia de clulas B (expresin Ig de
superficie, generalmente con morfologa FAB L3 y desplazamiento del gen C-MYC) tambin se
llama leucemia de Burkitt. Su tratamiento es completamente diferente del de otras formas de
LLA infantil.

7- Citogentica Convencional y Gentica Molecular

La citogentica convencional detecta solo clulas neoplsicas en metafase. Actualmente, el
desarrollo de tcnicas que incluyen nuevos mtodos de bandeo cromosmico e hibridizacin de
fluorescencia in situ (FISH), tcnicas de gentica molecular de cariotipo espectral (SKY) e
hibridizacin genmica comparativa (CGH), permiten reconocer anormalidades cromosmicas
en las clulas leucmicas en la mayora de los casos de LLA peditrica.
Las anormalidades genticas reportadas en LLA incluyen nmero cromosmico (ploida) y
rearreglos estructurales.
Desplazamientos cromosmicos
De todas las anomalas cromosmicas estructurales, las translocaciones son las ms frecuentes.
- La anormalidad cromosmica mas frecuente en pacientes peditricos con cncer es la t(12;21)
que se encuentra en 25% de los nios con LLA de linaje B. Estas alteraciones son el resultado
de la fusin del gen TEL (del cromosoma 12) con el AML (del cromosoma 21) y se asocia a
pronstico favorable.
- La t(9;22) es comn en adultos y en nios se presenta en aproximadamente el 5% de los casos,
asociada con mal pronostico.
- Los reordenamientos con el gen MLL(11q23) se presentan en alrededor del 8% de los nios
con LLA y se asocia generalmente a un aumento del riesgo de fracaso al tratamiento. La t(4;11)
es el desplazamiento mas frecuente relacionado con el gen MLL y se presenta en 2% de los
casos, estos pacientes son generalmente lactantes con recuentos elevados de leucocitos y
respuesta pobre al tratamiento. La t(11;19) se presenta en el 1%.
- La t(1;19) se presenta con una frecuencia del 5-6%, asociada con fenotipo PRE-B y resulta en
la formacin del gen de fusin E2A en el cromosoma 19 al gen PBX1 en el cromosoma 1. Los
pacientes presentan hiperleucocitosis, y el pronstico es pobre.
- La t(8;14)(q24;p32) afecta al 1-2% de los casos. Los genes afectados son MYC-IgH
- La desregulacin TAL-1 es la anormalidad gentica ms comn en LLA-T. Puede ocurrir
como resultado de t(1;14) o mas comnmente debido a deleciones en el cromosoma 1p32
La LLA puede ser clasificada en 4 subgrupos en base al n modal de cromosomas:
- hiperdiploide con mas de 47 cromosomas (35-45% de los casos)
-pseudodiploide 46 cromosomas con anormalidades numricas o
estructurales (40%)
- hipodiploide < 46 cromosomas (aproximadamente 8% de los casos)
La hiperdiploida es comn y se ha comprobado que en los linfoblastos es un factor de buen
pronstico. En la actualidad se sabe que esto probablemente se deba a que las clulas
leucmicas hiperdiploides tienen una mayor predisposicin a la apoptosis porque son capaces de
acumular mayor concentracin de metabolitos activos del metotrexato (poliglutamatos) y por
ello son ms sensibles a este frmaco.
8- Presentacin clnica
La LLA puede presentarse en forma insidiosa o aguda, como un hallazgo
incidental en un recuento de rutina en un nio asintomtico o como una
hemorragia con riesgo de vida, infeccin, o episodio de distress respiratorio.

84

La duracin de los sntomas en nios con LLA puede variar de das a meses. Los primeros
sntomas son generalmente no-especficos e incluyen, anorexia, irritabilidad y letargia. La fiebre
es el hallazgo ms comn, y ocurre en aproximadamente 60% de los pacientes. Progresivamente
el fallo medular conduce a palidez (anemia), sangrado (trombocitopenia) y susceptibilidad a las
infecciones (neutropenia).
La linfadenopata (generalmente indolora, localizada o generalizada) debido a infiltracin
leucmica es tambin un signo frecuente.
Los pacientes con LLA de estirpe T, generalmente de mayor edad, presentan manifestaciones
clnicas caractersticas, como mayor frecuencia de masa mediastinal y mayor porcentaje de
afectacin del sistema nervioso central.
La exploracin fsica debe ser exhaustiva y minuciosa, sin olvidar nunca la exploracin de los
testculos en el varn.
9- Diagnstico
La prueba complementaria que mas frecuentemente confirma la sospecha clnica inicial de una
LLA es el hemograma.
En el se puede encontrar leucocitosis en el 50% de los casos, anemia en el 80% y
trombocitopenia menor de 100x109/l en el 75% de los pacientes.
En el examen de la extensin perifrica pueden observarse linfoblastos, aunque en algunas
ocasiones no aparecen.
El diagnstico de una leucemia aguda siempre debe realizarse con el aspirado de MO.
La presencia de al menos un 20% de blastos en la MO confirma el diagnstico de
leucemia.
El diagnostico de LLA se establecer con los estudios de inmunofenotipo, biologa molecular y
citogentica de dicho aspirado.
Se deber realizar exmen del lquido cefalorraqudeo en toda leucemia al diagnstico, para
descartar la afectacin del sistema nervioso central.
Una radiografa de trax inicial permitir conocer la existencia de una masa mediastnica (mas
frecuente en LLA de estirpe T).
10- Laboratorio
Al momento del diagnostico estn generalmente presentes: anemia, recuento de leucocitos y
diferencial anormales, y trombocitopenia, reflejando el grado en el cual ha sido reemplazada la
medula sea por linfoblastos leucmicos.
El recuento de leucocitos varia desde 0.1 a 150 x109/L (mediana 15x109/L) y se encuentra
elevado (>10x109/L) en casi mas de la mitad de los pacientes.
Hiperleucocitosis (> 100x109/L) ocurre en 10% a 15% de los pacientes.
El grado de elevacin del recuento de leucocitos al diagnostico es un predictor muy importante
del pronostico en LLA.
Neutropenia (< de 500 granulocitos por mm3) es comn y esta asociada con un aumento de
riesgo de infecciones serias.
Hipereosinofilia, generalmente reactiva, puede estar presente al diagnostico
Los recuentos disminuidos de plaquetas (mediana 50x109/L) estn frecuentemente presentes al
diagnostico y pueden ser rpidamente diferenciados de una trombocitopenia inmune, dado que
la trombocitopenia aislada es rara en la leucemia.
Coagulopata generalmente leve, puede ocurrir en LLA-T y esta solo raramente asociada con
sangrado severo. Mas del 75% de los pacientes presentan anemia, la cual es generalmente
normoctica y normocrmica y asociada con recuento de reticulocitos normales a bajos.
La anemia o trombocitopenia es frecuentemente leve (o aun ausente) en LLA T.
En raros casos una pancitopenia seguida por un periodo de recuperacin hematopoytica
espontnea puede preceder al diagnostico de LLA y debe ser diferenciada de la anemia aplsica.

85

11 LLA ACTUALIZACIN
1- Cambios en el diagnstico y clasificacin de neoplasias de clula precursora B y T.
A continuacin se detallan cambios en la clasificacin WHO de neoplasias de clulas B y T
precursoras:
1. La nomenclatura ha cambiado de leucemia/linfoma linfoblstico precursor B y
leucemia/linfoma linfoblstico precursor T a leucemia/linfoma linfoblstico B y
leucemia/linfoma linfoblstico T
2. Leucemia/linfoma linfoblstico B ha sido posteriormente dividido en 7 entidades distintivas
definidas por anormalidades cromosmicas recurrentes especificas; los casos de LLA-B que
carecen de estas anormalidades son consideradas como sin otra especificacin.
Si bien la distincin entre leucemia linfoblstica y linfoma linfoblstico es obvia cuando el
paciente presenta una masa compuesta por linfoblastos B o T y sin blastos en SP o MO, es ms
arbitraria cuando hay masa y compromiso medular limitado.
Se sugiere que cuando hay masa presente y 25% o mas de las clulas nucleadas en MO son
linfoblastos, el diagnstico sea leucemia linfoblstica antes que linfoma linfoblstico.
Leucemia/linfoma linfoblstico B
Leucemia/linfoma linfoblstico B, sin otra especificacin
Leucemia/linfoma linfoblstico B con anormalidades genticas recurrentes
Leucemia/linfoma linfoblstico B con t(9;22)(q34;q11.2);BCR-ABL 1
Leucemia/linfoma linfoblstico B con t(v;11q23);reordenamientos MLL
Leucemia/linfoma linfoblstico B con t(12;21)(p13;q22) TEL-AML1
(ETV6-RUNX1)
Leucemia/linfoma linfoblstico B con hiperdiploida
Leucemia/linfoma linfoblstico B con hipodiploida
Leucemia/linfoma linfoblstico B con t(5;14)(q31;q32) IL3-IGH
Leucemia/linfoma linfoblstico B con t(1;19)(q23;p13.3);TCF3-PBX1
Leucemia/linfoma linfoblstico T
12 TRATAMIENTO
Aunque el tratamiento de la LLA debe ser dirigido y especfico para los distintos grupos de
riesgo, el tratamiento en todos ellos comprende las siguientes fases: induccin de la remisin,
tratamiento del sistema nervioso central, intensificacin (consolidacin) y mantenimiento.
- Tratamiento de induccin.
El objetivo inicial de todo tratamiento de una LLA es inducir una remisin completa con una
recuperacin de la hematopoyesis normal. Obtener la remisin completa es la base del
tratamiento de la LLA y un requisito imprescindible para obtener una supervivencia prolongada.
Se define la remisin completa cuando no existe evidencia de leucemia en la exploracin
fsica, en el examen de sangre perifrica ni de MO. La remisin completa incluye tambin la
ausencia de afectacin del sistema nervioso central o de afectacin extramedular.
El tratamiento de induccin incluye necesariamente un glucocorticoide, un alcaloide de la vinca
(vincristina) y por lo menos otro frmaco (antraciclina o asparraginasa). Algunos protocolos que
incluyen un cuarto frmaco como la daunorrubicina han demostrado prolongar la duracin de la
remisin completa incluso en grupos de riesgo alto.
El fracaso de la induccin es un acontecimiento raro que tan solo ocurre en un porcentaje
inferior al 5% de los pacientes peditricos con LLA y determina un pronstico muy
desfavorable.
- Tratamiento de intensificacin (consolidacin).

86

En la fase de consolidacin se administra un tratamiento intensivo inmediatamente despus de

finalizar el tratamiento de induccin, que se ha mostrado muy efectivo sobre todo en los
pacientes de alto riesgo.
La intensificacin retardada o la reinduccin promulgada por el grupo BFM (Berln-FrankfurtMunich) es probablemente el rgimen mas utilizado. Consiste en una repeticin del tratamiento
de induccin a los 3 meses de la remisin completa y su beneficio es claro en los pacientes de
riesgo estndar
- Tratamiento de mantenimiento.
Los pacientes con LLA requieren un tratamiento prolongado de mantenimiento.
Con las nuevas y sofisticadas tcnicas de laboratorio los investigadores han comprobado que en
pacientes que estn en aparente remisin completa puede existir enfermedad minima residual
(EMR).
La combinacin de metotrexato administrado semanalmente y 6-mercaptopurina a diario
constituye el tratamiento estndar de mantenimiento en las LLA.
En la actualidad, la norma general es prolongar el tratamiento un total de 2 aos o 2 aos y
medio. Muchos investigadores prefieren ampliarlo a 3 aos en el caso de los varones, por su
peor pronstico comparado con el sexo femenino.
-Tratamiento del sistema nervioso central.
La importancia de la afectacin del SNC en el tratamiento de la LLA estriba en que dicho
sistema acta como un refugio para las clulas leucmicas que residen en el, al quedar
protegidas por la barrera hematoenceflica de las dosis teraputicas sistmicas de los distintos
quimioterpicos.
Actualmente, la mayora de los protocolos en Europa y EE.UU. han prescindido de la
irradiacin intracraneal como profilaxis del SNC y se utiliza mayoritariamente la profilaxis
intratecal con metotrexato en monoterapia, junto con la quimioterapia intensiva sistmica.
Trasplante hematopoytico.
En las ultimas 2 dcadas los avances en el campo de los trasplantes de
progenitores hematopoyticos han sido notables. Destacan la mejora en la prevencin de la
enfermedad del injerto contra husped, el desarrollo de los bancos de donantes no
emparentados, la disminucin del tiempo de injerto hematopoytico y las mejoras en el
tratamiento de soporte.
Sin embargo, el desarrollo paralelo de la quimioterapia hace que en la actualidad las
indicaciones de trasplante hematopoytico en pacientes en primera remisin sean difciles de
establecer y tan solo se aceptan como claras en los pacientes con cromosoma Ph positivo y en
pacientes que no alcanzan la remisin completa al finalizar el tratamiento de induccin.
Enfermedad mnima residual (EMR)
La resistencia a agentes teraputicos es el factor principal en el fracaso del tratamiento del
cncer.
En la leucemia, las clulas resistentes remanentes en MO y/o SP constituyen la EMR y son
detectables por ensayos de alta sensibilidad cuando el paciente aparenta estar en remisin
completa.
La deteccin temprana de la expansin de clulas residuales permite intervencin clnica con el
objetivo de revertir la proliferacin de clulas leucmicas resistentes. De esta forma, la
medicin exacta y precisa de EMR puede mejorar la optimizacin del manejo clnico del
paciente oncolgico.
Varios estudios han demostrado el valor pronostico de la EMR durante. El anlisis de EMR en
el final del tratamiento de induccin y comienzo del de consolidacin ha mostrado tener la
significacin ms relevante en la identificacin de pacientes con diferentes riesgos de recada,
independientemente de otros parmetros biolgicos y clnicos desde entonces utilizados como
criterio de estratificacin.

87

LLA L1

LLA L2

LLA L3

88

TRABAJO PRCTIVO N 11:

SLPC Y SMPC
SINDROMES LINFOPROLIFERATIVOS CRNICOS
El trmino sndrome linfoproliferativos crnicos (SLC) incluye una variedad de entidades
clnico-biolgicas que resultan de la proliferacin clonal de un linfocito B o T maduro e
inmunocompetente. El diagnstico preciso de los SLC debe basarse en una constelacin de
datos clnicos y de laboratorio. Estos ltimos deben incluir: citologa, histologa, marcadores
inmunolgicos y, en determinados casos, estudios citogenticos y moleculares. Desde un punto
de vista prctico, la citologa, histologa e inmunofenotipo constituyen los pilares diagnsticos
fundamentales.
En trminos generales, la morfologa de las clulas linfoides se
aprecia mejor en extensiones de sangre perifrica y por consiguiente, sta es la muestra que
deber examinarse con preferencia en entidades que cursan con un cuadro leucmico. Si bien, es
recomendable la observacin de otros tejidos como la mdula sea y/o improntas de ganglio
linftico, bazo u otros rganos ya que pueden existir discrepancias en cuanto a morfologa en los
diferentes rganos que tal vez indiquen progresin o transformacin del proceso. Por ejemplo,
en procesos de bajo grado, Ej. leucemia linftica crnica o linfoma folicular, el hallazgo de
clulas grandes en mdula sea es un signo que sugiere transformacin. Otros puntos
importantes a tener en consideracin para apreciar bien el detalle morfolgico del linfocito son
los siguientes: 1 - las extensiones deben realizarse de sangre fresca y con una tincin adecuada
de May-Grunwald-Giemsa y, 2- la observacin debe realizarse en una zona de la preparacin en
la que los glbulos rojos estn bien extendidos; por ejemplo un caso de leucemia prolinfoctica
B puede remedar una leucemia linftica crnica si se observa en una parte gruesa de la
extensin o por el contrario, asemejarse a una leucemia aguda si se observa en una zona
demasiado fina. Finalmente, la citomorfologa tiene sus limitaciones y por tanto es esencial
disponer de la informacin del inmunofenotipo del linfocito neoplsico, es decir tener
conocimiento de si nos hallamos ante un SLC de naturaleza B o T. As, la variante de clulas
pequeas de Szary puede asemejar morfolgicamente un linfoma centrofolicular o bien, una
variante de clulas pequeas de leucemia prolinfoctica T parecerse a una leucemia linftica
crnica atpica.
SINDROMES LINFOPROLIFERATIVOS B
PRIMARIAMENTE LEUCMICOS
Leucemia linftica crnica (LLC)
Las clulas de la LLC poseen unos rasgos morfolgicos caractersticos. Son de tamao pequeo
o mediano, el ncleo tiene un contorno regular, la cromatina es cuarteada, el nuclolo no es
visible o es muy pequeo y el citoplasma es escaso. En las formas tpicas de LLC, esta
poblacin es la predominante y constituye ms del 80% de linfocitos circulantes; la presencia de
sombras de Grumpecht es comn, especialmente en casos con recuentos linfocitarios elevados.
Existen dos variantes morfolgicas de LLC cuya identificacin tiene importancia desde un
punto de vista clnico y biolgico: la LLC con cifras superiores al 10% de prolinfocitos o
LLC/PL y la LLC atpica en la que una cifra superior al 15% de clulas circulantes posee un
ncleo hendido o rasgos linfoplasmocticos. El reconocimiento de estas dos formas es
importante ya que suelen asociarse a estadios ms avanzados y a enfermedad progresiva con un
mayor ndice de proliferacin. Es probable que esta asociacin clnico-morfolgica tenga su
base en la elevada frecuencia en estas variantes de LLC de trisoma 12 as como de mutaciones
o deleciones del gen supresor de tumores p53, hechos ambos que son infrecuentes en las formas
de LLC tpicas. Tan slo la citologa permite el diagnstico de LLC/PL o LLC atpica ya que el
inmunofenotipo en estas dos variedades suele ser el caracterstico de la LLC. La LLC, como
todo proceso de bajo grado, puede sufrir transformacin a un linfoma de clulas grandes, cuadro
que se reconoce como sndrome de Richter. Aunque ello es ms comn que acontezca en
ganglios linfticos perifricos o se manifieste con masas abdominales y durante el curso

89

evolutivo de la LLC, en algunos pacientes, el sndrome de Richter puede ser la manifestacin

inicial de la enfermedad e incluso manifestarse en forma de leucemia con franca afectacin de
sangre perifrica y mdula sea. En estos pacientes, la observacin de extensiones de sangre
perifrica demuestra la presencia de dos poblaciones celulares, una de clulas pequeas con una
morfologa tpica de LLC y una segunda poblacin de clulas de tamao grande con dimetro
superior a tres glbulos rojos, cromatina reticular, nuclolo prominente y citoplasma basfilo.
Debido a que el perfil inmunolgico de las clulas en el sndrome de Richter es similar al de la
LLC en la mayora de los casos, si slo se considera el inmunofenotipo y se prescinde de la
morfologa, se realizar el diagnstico errneo de "LLC". Por tanto, la citologa en esta
situacin es esencial para el diagnstico. El inmunofenotipo, por otro lado, es de ayuda
especialmente en pacientes en los que el sndrome de Richter se manifiesta en la fase
diagnstica ya que, al ser caracterstico de LLC, nos est indicando que se trata de la
transformacin de una LLC. Existen casos en los que el linfoma de clulas grandes representa
una neoplasia "de novo" que resulta de la expansin clonal de una nueva clona independiente de
la LLC. La citologa no distingue entre estas dos situaciones mientras que los datos
citogenticos y moleculares permiten su distincin.
Leucemia prolinfoctica B (LP-B)
La LP-B fue inicialmente descrita por Galton y cols. (1974) como una variante de LLC. Si bien,
la LP-B representa una entidad clnico-biolgica definida diferente a la LLC. El examen
morfolgico de las clulas circulantes es esencial para establecer el diagnstico. El prolinfocito
B posee un tamao superior al del linfocito de la LLC; el ncleo es de contorno regular,
cromatina densa pero no cuarteada y posee un nuclolo nico, prominente, vesicular y
generalmente en posicin central. Estas clulas se hallan en sangre perifrica en una proporcin
superior al 55% del total de linfocitos circulantes. En algunos casos, pueden apreciarse formas
bilobuladas que sugieren cierto grado de transformacin. El diagnstico diferencial de la LP-B
se plantea con la LLC/PL, el linfoma de manto y la variante de tricoleucemia. El anlisis
citolgico es el test bsico para el diagnstico de la LP-B ya que el inmunofenotipo, si bien
difiere de la LLC, puede ser similar al de los linfomas B leucemizados incluyendo el del manto,
y al de la variante de tricoleucemia. En un 20% de LP-B se demuestra la presencia de la t (11;
14) (q23; q32) con expresin de ciclina Dl idntica a la documentada en linfomas del manto, de
ah los problemas de diagnstico diferencial entre la LP-B y dicho linfoma en fase leucmica.
La citologa y la histologa del bazo, cuando se dispone de la misma, constituyen tests
diferenciales esenciales.
Tricoleucemia y variante de tricoleucemia
La tricoleucemia es un SLC que cursa habitualmente con citopenias, en particular
monocitopenia y una proporcin variable de clulas atpicas circulantes con unos rasgos
citolgicos muy caractersticos. El tricoleucocito es una clula de tamao mediano que posee un
ncleo redondeado o ms frecuentemente arrionado o hendido y una cromatina algodonosa; el
nuclolo no es visible generalmente al microscopio ptico. Aunque la franca transformacin de
la tricoleucemia a un proceso de alto grado no ha sido descrita, en una minora de pacientes,
junto a los tricoleucocitos tpicos se puede apreciar la presencia de clulas de tamao superior
con una relacin ncleo/citoplasmtica ms elevada, un ncleo de cromatina reticular y la
presencia o no de uno a tres nuclolos. Ello ha sido documentado en el curso evolutivo de la
tricoleucemia en aproximadamente el 5% de los pacientes y se halla asociado a masas
adenopticas abdominales y cierto grado de resistencia a los anlogos de las purinas,
deoxicoformicina y clorodeoxiadenosina. Todos estos datos sugieren un cierto de grado de
transformacin de la tricoleucemia si bien, la agresividad clnica es menor si se compara a la de
un linfoma de clulas grandes que se desarrolla en uno de bajo grado. Adems de la
tricoleucemia tpica, existe una forma especial denominada variante de tricoleucemia. En sta
y, a diferencia de la forma tpica, los recuentos leucocitarios son elevados y no se constata

90

monocitopenia. La morfologa del linfocito circulante podra considerarse intermedia entre el

tricoleucocito y el prolinfocito. El ncleo es redondeado y posee una cromatina ms densa que
la del tricoleucocito y un nuclolo prominente similar al del prolinfocito; por el contrario, el
citoplasma es abundante con vellosidades similares al del tricoleucocito si bien con un grado
mayor de basofilia. El diagnstico diferencial de la variante de tricoleucemia se plantea con la
forma tpica, la leucemia prolinfoctica y el linfoma esplnico de clulas vellosas. La morfologa
y marcadores inmunolgicos son esenciales para distinguir entre la tricoleucemia y su variante
ya que la histologa del bazo y mdula sea son similares en ambos procesos. La morfologa e
histologa del bazo y mdula sea permiten el diagnstico diferencial entre la variante de
tricoleucemia y el linfoma esplnico de clulas vellosas o la leucemia prolinfoctica. La
distincin de estos tres procesos es importante por la diferente conducta teraputica a adoptar.
Leucemia de clulas Plasmticas
Este es un proceso muy infrecuente y que se define de forma arbitraria por la presencia de una
cifra superior a 2x109/l de clulas plasmticas en sangre perifrica. Este cuadro debe
diferenciarse de la leucemizacin de un mieloma mltiple, el cual en fases terminales puede
asociarse a la presencia de plasmocitos circulantes. Las manifestaciones clnicas de la leucemia
de clulas plasmticas con alta frecuencia de organomegalia, hipercalcemia y su forma de
presentacin
aguda
difieren
asimismo
del
mieloma
mltiple.
En la leucemia de clulas plasmticas, los elementos circulantes muestran grados variables de
diferenciacin. As pues, los rasgos morfolgicos pueden ser similares a los de clulas
plasmticas maduras aunque en general con un cierto grado de asincronismo o atipa. El ncleo
suele ser excntrico y poseer una cromatina densa aunque formas con cromatina reticular no son
raras; el citoplasma suele ser marcadamente basfilo. En general, la leucemia de clulas
plasmticas no plantea problemas diagnsticos cuando la clula circulante que predomina es la
descrita, si bien hay formas indiferenciadas puramente blsticas en las que los marcadores
inmunolgicos son esenciales para establecer el diagnstico ya que demuestran la presencia de
inmunoglobulina en el citoplasma de los blastos con restriccin clonal y expresin marcada de
cadena ligera y negatividad para muchos de los marcadores pan-B.
LINFOMAS NO HODGKIN B LEUCEMIZADOS
La leucemizacin de los linfomas no Hodgkin es altamente frecuente, en especial en aquellos de
bajo grado, aunque tambin puede acontecer en los linfomas de alto grado de clulas grandes.
La linfocitosis puede documentarse en la fase diagnstica y no es infrecuente que estos
pacientes se diagnostiquen errneamente de LLC si uno no tiene en consideracin la morfologa
de las clulas circulantes as como los marcadores inmunolgicos. El significado pronstico de
la manifestacin leucmica de un linfoma vara de acuerdo al tipo histolgico, grado de
linfocitosis y a la presencia o no de clulas grandes circulantes que sugieran transformacin del
proceso. Describiremos a continuacin los rasgos morfolgicos que caracterizan los linfomas B
que con mayor frecuencia se leucemizan.
Linfoma centrofolicular
Los linfocitos son de tamao muy pequeo, similar al de un glbulo rojo, la cromatina es densa
pero uniforme, no cuarteada y en algunas clulas puede apreciarse una hendidura nuclear muy
estrecha; el citoplasma es apenas visible. En algunos pacientes, junto a estas clulas pequeas,
pueden observarse clulas de tamao superior con citoplasma abundante y un nuclolo
perifrico, es decir, mostrando rasgos morfolgicos de centroblastos. El diagnstico diferencial
del linfoma centrofolicular se plantea con la LLC y ms raramente con el linfoma del manto. Si
bien, la morfologa de los linfocitos es diferente en estos tres procesos, la histologa y/o
citogentica/estudios moleculares son pruebas esenciales para la confirmacin del diagnstico

91

de uno u otro tipo de linfoma mientras que el inmunofenotipo permite distinguir la LLC del
linfoma centrofolicular.
Linfoma esplnico de clulas vellosas
Como su nombre indica, este linfoma se caracteriza por la presencia en sangre perifrica de una
cifra variable de linfocitos con un citoplasma irregular que muestra mltiples vellosidades finas.
La cromatina nuclear es densa e incluso en algunos casos cuarteada como la de los linfocitos de
la LLC y el nuclolo raramente puede observarse al microscopio ptico. A diferencia de la
tricoleucemia o su variante, el citoplasma de las clulas en este linfoma es menos abundante as
como el tamao celular es menor. En algunos pacientes, junto a los linfocitos vellosos, pueden
apreciarse clulas con rasgos de linfoplasmocitos y de hecho, en aproximadamente el 20% de
casos, se documenta una pequea banda monoclonal, generalmente lgG. El diagnstico
diferencial se plantea con la LLC o con los otros procesos que cursan con clulas vellosas,
tricoleucemia y su variante, y ello es importante por cuanto pacientes con un linfoma de clulas
vellosas responden bien a la esplenectoma o bien a la fludarabina mientras que suelen mostrar
resistencia a los agentes alquilantes. Adems de la morfologa, los marcadores inmunolgicos
son importantes para distinguir este linfoma de la LLC y, la histologa del bazo y de la mdula
sea para diferenciarlo de la tricoleucemia y su variante. En un 5% de los casos el linfoma de
clulas vellosas puede sufrir transformacin a un linfoma de clulas grandes, bien a nivel
ganglionar o incluso en sangre perifrica. En tal situacin, se observan clulas pequeas de
citoplasma velloso junto a clulas grandes con ncleo de cromatina reticular y nuclolo
prominente.
Linfoma linfoplasmoctico
La manifestacin leucmica de un linfoma linfoplasmactico es relativamente frecuente. En las
extensiones de sangre perifrica se puede apreciar "rouleaux" debido a la presencia de una
banda monoclonal. Los linfocitos circulantes poseen un aspecto maduro, cromatina densa y
citoplasma escaso o de mediano tamao con diferentes grados de basofilia. El diagnstico
diferencial de este linfoma se plantea con la LLC atpica y con el linfoma esplnico de clulas
vellosas, bsicamente en aquellos pacientes en los que se detecta una pequea banda
monoclonal. Adems de la citologa, los marcadores inmunolgicos son de gran valor para
diferenciar la LLC atpica del linfoma linfoplasmoctico.
Linfoma de clulas del manto
Es sta una entidad clnico-biolgica cuya definicin ha sido establecida durante la ltima
dcada. La frecuencia de un cuadro leucmico en este tipo de linfoma, bien al diagnstico o
durante su evolucin, se desconoce, ya que una proporcin substancial de casos se diagnostican
de LLC atpicas. El cuadro morfolgico en sangre perifrica en el linfoma del manto se
caracteriza por su marcado pleomorfismo en lo que se refiere a tamao celular e irregularidad
del contorno nuclear. La clula ms tpica es un linfocito de tamao medio con un ncleo de
cromatina punteada, una o dos hendiduras de corta longitud y visibles al microscopio ptico y
un citoplasma escaso o mediano; el nuclolo no es visible o en caso de visualizarse es pequeo
y no prominente. Actualmente se considera que el linfoma de clulas del manto puede
transformarse a formas blsticas y/o anaplsicas lo que le confiere un peor pronstico a un
linfoma que, de por s, es de difcil manejo clnico por su resistencia a tratamiento o respuesta
corta al mismo. El diagnstico diferencial del linfoma del manto leucemizado se plantea con la
LLC/PL ya que sta suele manifestar un cierto pleomorfismo, la LP-B, especialmente en casos
asociados a la t(11;14) y con otros linfomas leucemizados, en particular el folicular y el
esplnico de clulas vellosas. Adems de la citologa, la histologa es un pilar esencial para el
diagnstico diferencial entre estas entidades y, los marcadores inmunolgicos y la citogentica

92

son asimismo de gran valor siempre que se tenga presente que la t(11;1 4) no es estrictamente
especfica de linfoma de manto.
Linfoma de clulas grandes
La manifestacin leucmica de un linfoma de clulas grandes es infrecuente pero puede
acontecer ya como cuadro de presentacin en la fase diagnstica o durante el curso clnico. Las
clulas linfoides circulantes poseen gran tamao y rasgos citolgicos de inmunoblastos tales
como un ncleo con cromatina laxa, uno o varios nuclolos y un citoplasma marcadamente
basfilo; en algunos casos, las clulas asemejan centroblastos o bien muestran rasgos
anaplsicos. Raramente las clulas corresponden a un linfoma multilobulado. El diagnstico
diferencial se plantea esencialmente con la leucemia aguda, en particular la monoblstica, y
muy en especial en aquellos pacientes en los que el cuadro se manifiesta "d'amblee" en forma de
leucemia y sin organomegalia. El inmunofenotipo es esencial para distinguir entre un linfoma
de clulas grandes y la leucemia aguda monoblstica ya que la morfologa en la mayora de los
casos no permite distinguirlos.
Linfocitosis B policlonal
Si bien este cuadro no puede considerarse como un SLO, lo describiremos aqu por los
problemas de diagnstico que ofrece con linfomas leucemizados. El grado de linfocitosis en
estos pacientes, que suelen ser mujeres de mediana edad y con una historia marcada de
tabaquismo, no suele ser muy marcado, alrededor de 5 a 10x109/l. Los linfocitos muestran una
morfologa muy peculiar. Estos poseen un tamao grande y citoplasma abundante, un ncleo
hendido o bien bilobulado y algunas clulas poseen nuclolo. Formas con ciertos rasgos
linfoplasmocitoides pueden tambin hallarse presentes. Aunque esta morfologa e incluso la
histologa de mdula sea con presencia de agregados linfoides sugieren un linfoma, el
inmunofenotipo es esencial ya que si bien muestra la naturaleza B de la clula, no evidencia
restriccin clonal. Ello se confirma mediante anlisis de ADN de las cadenas pesada y ligeras de
la inmunoglobulina.

SINDROMES LINFOPROLIFERATIVOS T
PRIMARIAMENTE LEUCMICOS
Leucemia prolinfoctica T (LP-T)
Es sta una entidad bien definida en cuanto a sus caractersticas clnicas y de laboratorio. Desde
un punto de vista morfolgico, las clulas circulantes corresponden a prolinfocitos. Es decir son
clulas de tamao mediano con un ncleo de cromatina densa y contorno regular o irregular
con un nuclolo nico; el citoplasma muestra irregularidades o protusiones y suele ser
intensamente basfilo. No existen diferencias marcadas entre el prolinfocito B y el T en las
formas de leucemia prolinfoctica T tpica excepto por el hecho de que los prolinfocitos T
poseen un tamao inferior, el ncleo puede mostrar irregularidades en su contorno y el
citoplasma es ms basfilo que el del prolinfocito B. Junto a la forma tpica, existe una variante
de LP-T, designada de clulas pequeas, la cual se caracteriza porque las clulas tienen un
tamao inferior a la forma tpica y el nuclolo solo es visible por microscopa ptica en una
proporcin de clulas si bien se identifica mediante estudios ultraestructurales. Esta variante de
clulas pequeas representa el 20% de casos de LP-T y se ha descrito en la literatura bajo el
trmino de LLC-T, designacin que da lugar a confusin ya que la enfermedad no suele
comportarse como una leucemia crnica sino que tiene un curso agresivo y, por el hecho de que
la designacin LLC-T se haba empleado en las dcadas de los 70 y 80 para describir la
leucemia de linfocitos granulares. Debido a que no existen diferencias entre la forma de LP-T
tpica y la variante de clulas pequeas en cuanto a clnica, marcadores inmunolgicos y

93

citogentica es justificado que se incluya como variante de LP-T ya que ambas, la LP-T tpica y
la variante, representan una nica entidad clnico biolgica. El diagnstico diferencial de la LPT se plantea con la LP-B en aquellos casos con morfologa tpica mientras que la variante de
clulas pequeas de LP-T puede errneamente diagnosticarse de LLC. Los marcadores
inmunolgicos permiten la distincin entre la LP-T y LP-B as como de la LP-T con la LLC.
Leucemia de linfocitos granulares (LLG)
sta representa una entidad definida y tal vez una de las primeras en las que se demostr el
origen T de los linfocitos circulantes. La sangre perifrica se halla afectada en la mayora de los
casos, aunque en unos pocos, la enfermedad se manifiesta en forma tumoral, ej. esplenomegalia,
y la sangre perifrica solo se halla involucrada durante la evolucin clnica y, en especial,
despus de una esplenectoma que, en estos pacientes, suele realizarse con fines diagnsticos.
Las citopenias, particularmente neutropenia y anemia, son comunes. El grado de linfocitosis es
muy variable y generalmente no suele ser muy marcado e inferior a 20x109 /l. El cuadro
morfolgico es homogneo y la clula predominante es un linfocito de tamao mediano o
grande con un ncleo de cromatina madura, generalmente excntrico, de cromatina densa y
nuclolo no visible; el citoplasma es abundante, claro y posee varios grnulos azurfilos, de ah
la denominacin de leucemia de linfocitos granulares. Dicha granulacin contiene enzimas tales
como la fosfatasa cida as como otras citocinas (por ejemplo granzimas) que desarrollan un
papel importante en la funcin citotxica/killer o "natural killer" de estos linfocitos. Estudios
ultraestructurales demuestran que algunos de estos grnulos poseen en su interior una estructura
peculiar integrada por haces de microtbulos dispuestos en posicin paralela y que por ello se
designan: haces de tbulos paralelos o PTA. De acuerdo al fenotipo, existen dos variantes de
leucemias de linfocitos granulares: la variante T-citotxica y la de clulas "natural killer". No
existen grandes diferencias entre ambas excepto por: 1- su incidencia, la variante de clulas
natural killer es mas frecuente en pases orientales, 2- curso clnico, que suele ser ms agresivo
en la leucemia de clulas natural killer y 3- la morfologa, ya que la granulacin citoplasmtica
es ms marcada en la variante de clulas T. Los rasgos morfolgicos de los linfocitos en la
leucemia de linfocitos granulares son idnticos o muy similares a los que muestran la pequea
proporcin (5-10%) de linfocitos granulares presentes en sangre perifrica de individuos
normales. Raramente la leucemia de linfocitos granulares sufre transformacin a un linfoma de
alto grado T; en algunos casos descritos, las clulas blsticas poseen unas caractersticas
citoplasmticas similares a las de los linfocitos granulares incluyendo granulacin
citoplasmtica. El diagnstico diferencial de la leucemia de linfocitos granulares se plantea
esencialmente con cuadros de linfocitosis reactivos a procesos virales o post-esplenectoma y
con la tricoleucemia. La leucemia de linfocitos granulares se diferencia de linfocitosis reactivas,
no clonales, mediante estudios citogenticos o de anlisis molecular investigando la
configuracin de los genes que codifican las cadenas del receptor de clulas T (RCT) que
demuestra la presencia de una clona solamente en procesos leucmicos. Si bien, cuando no se
dispone de estas tcnicas, datos que apoyan el diagnstico de un cuadro leucmico no reactivo
son: una morfologa y fenotipo uniformes (por ejemplo >90% de linfocitos CD8+>,
inmunofenotipos atpicos o muy infrecuentes en linfocitos normales (por ejemplo
CD4+CD16+CD56+) y una linfocitosis superior a 5x109/I que persista durante o ms de 6
meses. El diagnstico diferencial con la tricoleucemia se presenta en aquellos casos en los que
la enfermedad se manifiesta con marcada esplenomegalia y la linfocitosis no es obvia. La
histologa del bazo en estos pacientes puede remedar la de la tricoleucemia ya que como sta, la
leucemia de linfocitos granulares afecta primordialmente la pulpa roja del bazo. El
inmunofenotipo, particularmente en cortes del bazo permite distinguir entre ambos procesos.
Leucemia de linfocitos "Szary-like"
sta es una entidad muy infrecuente que se caracteriza por la presencia de linfocitos circulantes
con una morfologa similar o idntica a la de las clulas de Szary pero que, a diferencia del

94

sndrome de Szary, la afectacin cutnea es inexistente. La enfermedad tiene un curso

agresivo, similar al de la LP-T. Desde un punto de vista morfolgico, las clulas circulantes son
idnticas a las de la variante pequea o de clulas grandes del sndrome de Szary; el ncleo es
cerebriforme y el nuclolo no puede visualizarse por microscopa ptica o ultraestructural,
mientras que el ltimo anlisis permite confirmar la configuracin cerebriforme del ncleo de
estas clulas. Recientes estudios citogenticos en una minora de casos han demostrado la
presencia de anomalas caractersticas de la LP-T, tales como inv(14)(qll;q32) as como
anomalas que se observan con una frecuencia relativa en el sndrome de Szary, como aquellas
que afectan a 17q. Por consiguiente, es incierto s este tipo de leucemia puede clasificarse como
una entidad definida, con rasgos intermedios entre la LP-T y el sndrome de Szary, o bien
encuadrarse como una variante cerebriforme de la LP-T.
LINFOMAS T LEUCEMIZADOS
Leucemia linfoma T del adulto (LLTA)
ste es un sndrome linfoproliferativo T con una distribucin racial y geogrfica y etiologa
caractersticas y que con una gran frecuencia (>75%) afecta sangre perifrica. El cuadro
citolgico se caracteriza por un marcado pleomorfismo en relacin al tamao celular, grado de
condensacin cromatnica e irregularidades nucleares. La clula ms caracterstica es un
linfocito de mediano tamao con citoplasma escaso y agranular y un ncleo polilobulado o con
mltiples hendiduras visibles al microscopio ptico. Por dicha configuracin nuclear que
asemeja los ptalos de flores, esta clula se ha designado "clula en flor". Una proporcin muy
pequea de linfocitos en flor puede ser identificada en la sangre perifrica de portadores del
retrovirus HTLV-l, agente causal de la LLTA. Asimismo en la LLTA, pueden observarse en
sangre perifrica clulas linfoides de tamao grande y con caractersticas de inmunoblastos,
especialmente en la forma aguda de presentacin, aunque su proporcin es pequea. El
diagnstico diferencial de la LLTA se plantea con otros linfomas T leucemizados, el sndrome
de Szary y linfomas cutneos con expresin perifrica. La morfologa es de gran ayuda en el
diagnstico diferencial ya que existe un marcado "overlapping" en cuanto a datos histolgicos e
inmunofenotipo que no permiten diferenciar entre la LLTA y los otros linfomas cutneos T. El
test definitivo es la demostracin del retrovirus HTLV-l bien mediante serologa o anlisis del
ADN ya que slo se halla presente en la LLTA.
Sndrome de Szary
El sndrome de Szary es un linfoma cutneo T que por definicin afecta la sangre perifrica.
Los recuentos linfocitarios en estos pacientes no suelen ser muy elevados, generalmente
inferiores a 50x109 /l pero en la extensin de sangre perifrica destacan siempre linfocitos
atpicos. En base al tamao celular se distinguen dos variantes de sndrome de Szary: la de
clulas pequeas y la de clulas grandes, si bien no es infrecuente hallar los dos tipos celulares
en un mismo paciente. La clula de Szary posee unos rasgos nucleares muy caractersticos. En
las clulas de mayor tamao, el ncleo es altamente convoluto con irregularidades que asemejan
las circunvoluciones del cerebro y por ello se designa ncleo cerebriforme. Este aspecto no
siempre se objetiva en las clulas de Szary pequeas, las cuales suelen exhibir un ncleo
hipercromtico. El citoplasma en estas ltimas es escaso, mientras que puede ser algo ms
abundante en las de tamao grande y contener o no vacuolas. El estudio ultraestructural permite
documentar de forma ms precisa las irregularidades nucleares y demostrar un ncleo
serpentino con dos o ms indentaciones de escasa amplitud. En general, no existen problemas
de diagnstico diferencial entre el sndrome de Szary y otros procesos T cuando se dispone de
los datos clnicos y de inmunofenotipo, excepto con la LLTA, en especial en pases endmicos
para el HTLV-l. Como hemos mencionado antes, estudios serolgicos o moleculares de este
retrovirus son esenciales junto con los otros datos clnicos y de laboratorio para distinguir el
sndrome de Szary u otros linfomas cutneos leucemizados de la LLTA.

95

Otros linfomas T con expresin leucmica

Los linfomas de clulas grandes T pueden manifestarse o evolucionar con un cuadro leucmico
como ocurre con los de origen B, si bien con una frecuencia menor. Desde un punto de vista
morfolgico las clulas circulantes son de tamao grande y no poseen rasgos que permitan
diferenciarlas de aquellas que se observan en los linfomas B de clulas grandes. El
inmunofenotipo, por consiguiente, es necesario para tal diferenciacin. Los linfomas
pleomrficos T, anaplsicos y linfomas / raramente se leucemizan y el cuadro morfolgico
es altamente variable.

LLC

LPL B

TL

LEUCEMIA DE CELULAS PLASMATICAS

LINFOMA CENTROFOLICULAR

LINFOMA DE MANTO

96

LEUCEMIA PROLINFOCITICA T

LEUCEMIA LGG

SINDROME DE SEZARY

SINDROMES MIELOPROLIFERATIVOS CRNICOS

Son alteraciones clonales de la clula madre hematopoytica, caracterizados por la proliferacin
en la mdula sea, de una o ms lneas celulares mieloides (granuloctica, eritroide y
megacarioctica). Pueden cursar con un grado variable de mielofibrosis. En su evolucin tienen
el potencial de sufrir progresin de la enfermedad y fallo medular debido a mielofibrosis,
hematopoyesis inefectiva o transformacin en una fase blstica aguda. Son enfermedades de
adultos, con edad de presentacin comprendida entre 50 y 70 aos. El tratamiento de los SMPC
no est encaminado a la curacin de la enfermedad, sino a la supervivencia y mantenimiento de
una situacin clnica ptima. La excepcin la constituye la leucemia mieloide crnica (LMC)
que requiere un tratamiento ms agresivo.
Son desordenes clonales de las clulas sanguneas caracterizados por proliferacin en MO
de uno o mas de los linajes mieloides (eritroide, granuloctico, megacarioctico)
Cambios en las Denominaciones
La clasificacin WHO 2001 utilizaba la denominacin de enfermedades mieloproliferativas
crnicas. La clasificacion WHO 2008, con el objeto de reflejar exactamente la naturaleza
neoplsica de estas entidades, paso a denominarlas neoplasias mieloproliferativas (NMP).
Se ha incorporado adems, un nuevo subgrupo, el de las neoplasias mieloides y linfoides con
eosinofilia y anormalidades del PDGFRA, PDGFRB, y FGFR1.
Razones que justificaron los cambios
En los primeros esquemas de la clasificacion WHO, para confirmar el diagnostico
de Leucemia Mieloide Crnica (LMC) se consideraba la deteccin del cromosoma

97

Philadelphia (Ph) y/o el gen de fusin BCR-ABL1 mientras que los subtipos de NMP BCRABL1 negativos eran diagnosticados de acuerdo a caractersticas clnicas y de laboratorio y
sustentado en mnimas contribuciones histopatolgicas.
Hoy se reconoce que en las NMP la proliferacin anormal es debida a rearreglos
clonales o mutaciones de genes que codifican protenas tirosinquinasa.
Dos factores han influido para generar los cambios producidos en la revisin de
los criterios WHO para NMP:
1) el descubrimiento de anormalidades genticas que pueden ser utilizadas como
marcadores diagnsticos en las NMP con transcripto gentico BCR-ABL1 negativas y
2) y una mejor caracterizacin de figuras histolgicas en estas neoplasias. El descubrimiento en
2005 de la mutacin JAK2 V617F (gen Janus cinasa 2) fue un hecho relevante para la
comprensin de la fisiopatogenia en las NMP y ha generado una revolucin en el diagnostico y
clasificacion de este grupo de enfermedades, y especialmente de la Policitemia Vera (PV).
Anormalidades, como el JAK2 o KIT mutado, no son especficas de un NMP especfica, pero
proveen una prueba de que la proliferacin es clonal permitiendo as eliminar la posibilidad de
un proceso reactivo. Hasta el presente la mutacin ms comn reconocida en las NMP BCRABL1 negativas es JAK2 V617F. Esta mutacin se detecta en mas del 90% de pacientes con PV
y en casi la mitad de aquellos con mielofibrosis primaria (MFP) o trombocitemia esencial (TE).
De esta manera, JAK2 V617F no es especfica de una NMP exclusiva, ni su ausencia excluye
una NMP.
Clasificacion WHO
-Neoplasias Mieloproliferativas (NMP)
Leucemia mieloide crnica, BCR-ABL1positiva
Leucemia neutroflica crnica
Policitemia vera
Mielofibrosis Primaria
Trombocitemia Esencial
Leucemia eosinoflica crnica, sin otra especificacin
Mastocitosis
Neoplasias mieloproliferativas, inclasificables
-Neoplasias Mieloides y Linfoides con Eosinofilia asociada con anormalidades del
PDGFRA, PDGFRB, o FGFR1
Todos estos trastornos implican desregulacin en la clula madre hematopoytica
multipotente (CD34), y comparten una o ms de las siguientes caractersticas:
Sobreproduccin de uno o varios elementos sanguneos con predominio de un clon
transformado.
Medula hipercelular o fibrosis medular.
Anomalas citogenticas.
Ditesis trombtica o hemorrgica.
Hematopoyesis extramedular (hgado o bazo).
Transformacin a leucemia aguda.
Superposicin de caractersticas clnicas

LEUCEMIA MIELOIDE CRNICA (LMC)

La LMC es una expansin clonal de celulas progenitoras hematopoyticas
caracterizada clnicamente por hiperplasia mieloide, leucocitosis con
basofilia y esplenomegalia.
La LMC tiene una huella gentica (el cromosoma Ph formado por la translocacin entre los
cromosomas 9 y 22) y un correlato molecular (el gen de fusin BCR/ABL).
Caractersticas de la LMC

98

Examen clnico
Al momento del diagnostico, >80% de los pacientes estn en fase crnica, que en muchos
pacientes se presenta asintomtica.
El hallazgo mas comn del examen fsico en el momento del diagnostico es la esplenomegalia.
El bazo puede ocupar gran parte del abdomen, o puede presentarse solo un aumento mnimo. En
alrededor del 10% de los pacientes, el bazo no se palpa durante una exploracin esplnica.
En aquellos pacientes que experimentan sntomas, estos son generalmente secundarios a
esplenomegalia, e incluyen dolor, plenitud abdominal, y perdida de peso.
Fases de la Enfermedad
La enfermedad suele presentar un curso evolutivo bifsico, con un periodo inicial o fase
crnica, fcil de controlar con distintas teraputicas, y otro final o crisis blstica, muy similar
desde el punto de vista clnico y hematolgico a una leucemia aguda, aunque de peor
pronstico.
En algunos pacientes se intercala entre ambos un tercer periodo, la denominada fase de
aceleracin.
1. Fase crnica (FC):
Durante esta fase la LMC es una enfermedad poco agresiva y fcil de controlar, y permite a los
pacientes una vida prcticamente normal. Al cabo de un periodo variable, cuyo promedio es de
unos 3,5 aos, la enfermedad entra en una fase terminal muy agresiva y resistente al tratamiento.
2. Fase de aceleracin (FA):
Se observa en alrededor de un tercio de los pacientes. En ella cambian las caractersticas de la
enfermedad y puede aparecer: fiebre y/o sudoracin nocturna, esplenomegalia progresiva y
resistente al tratamiento.
Las celulas diferenciadas persisten, aunque a menudo muestran mayores anomalas
morfolgicas.
Pueden presentar anemia o trombocitopenia no atribuibles a la quimioterapia, leucocitosis
resistente al tratamiento, trombocitosis (superior a 1.000 109/l), blastos del 10-15% en SP o
MO. Aparicin de anomalas citogenticas adicionales al cromosoma Ph. Algunos enfermos
fallecen en esta fase por infeccin o hemorragia, pero la mayora acaban por presentar en pocos
meses los criterios de crisis blstica.
3. Crisis blstica (FB):
Consiste en el paso sin solucin de continuidad de la FC a un cuadro superponible al de LA, con
la invasin mas o menos rpida de la MO, la SP y a veces otros rganos por blastos. Este patrn
evolutivo (sin fase de aceleracin previa) es el ms frecuente, ya que se da en el 60% de los
pacientes.
Fase crnica
- Alteraciones citogenticas (ver mas adelante)
- < 10% de blastos y promielocitos en SP y MO
Fase acelerada (FA)
- Blastos 10-19% en SP o MO,
- Basfilos en SP 20%,
- Trombocitopenia o trombocitosis persistente que no responde a la Terapia (<100.109/l o
>1000.109/l respectivamente)
-Aumento del tamao del bazo y aumento del recuento de leucocitos que no responde a la
terapia
-Evidencia citogentica de evolucin clonal
-Una proliferacin megacarioctica importante en clusters , asociada con marcada fibrosis
de reticulina o colgeno, y/o severa displasia granuloctica, debera ser considerada como
sugestiva de FA.
Estos hallazgos aun no han sido analizados en grandes estudios clnicos, as que no esta claro si
son criterios independientes para la FA. Ellos frecuentemente ocurren simultneamente con una
o ms de las caractersticas enumeradas.
Fase blstica (FB)

99

- Blastos >20% en SP o MO,

- Proliferacin extramedular de blastos,
- Grandes focos o clusters de blastos en biopsia de MO
Algunos estudios han indicado que ciertas caractersticas a la presentacin tienen importancia
pronostica.
La transicin de FC a FA y posteriormente a FB puede ocurrir gradualmente durante un periodo
de un ano o mas, o aparecer bruscamente (crisis blstica). La tasa de evolucin anual de FC a
crisis blstica es de 5% a 10% los primeros dos anos y de 20% en los anos subsiguientes.
Los factores que predicen una FC de menor duracin son:
Padecer esplenomegalia o hepatomegalia creciente y dolorosa
Ser de edad avanzada.
Ser de sexo masculino.
Tener una concentracin elevada de lactato deshidrogenasa perica.
Anomalas citogenticas adicionales al cromosoma Ph1.
Una proporcin en el lmite de blastos de MO o SP.
Leucocitosis evolutiva.
Basofilia.
Eosinofilia.
Trombocitosis o trombocitopenia.
Anemia.
Fiebre.
Dolores seos.
Desarrollo de lesiones seas destructivas.
Complicaciones trombticas o hemorrgicas
Exmen de MO y SP
La MO es hipercelular, y los recuentos diferenciales tanto de MO como SP muestran un
espectro de granulocitos maduros e inmaduros similares a los que se encuentran en una MO
normal.
A menudo se observan cantidades mayores de eosinfilos o basfilos, y a veces se observa
monocitosis. Con frecuencia se encuentra un aumento de megacariocitos en la MO, y en
ocasiones se observa en SP fragmentos de ncleos megacariocticos, especialmente cuando el
recuento de plaquetas es muy alto.
El porcentaje de linfocitos es menor, tanto en MO como en SP, en comparacin con sujetos
normales, y la proporcin mieloide/eritroide en la MO es generalmente muy elevada.
El examen histopatolgico del aspirado de MO demuestra un cambio en las series mieloides a
formas inmaduras que aumentan en numero a medida que el paciente progresa a la FB de la
enfermedad.
SP:
_ presenta recuento de leucocitos >10 x 109/l
_ con neutrfilos, metamielocitos y mielocitos,
_ generalmente < 5% mieloblastos en SP y MO;
_ se observa eosinofilia y basofilia;
_ 50% de los casos trombocitosis.
MO:
_ hipercelular (hasta 100% celular)
_ con precursores granulociticos aumentados, basfilos, eosinfilos y
ocasionalmente monocitos;
_ serie eritroide normal,
_ megacariocitos con disposicin en clusters en nmero normal o aumentado,
_ presencia variable sea-blue histiocitos;
_ aumento de fibras de reticulina,

100

_ sin embargo la fibrosis medular es rara a la presentacin y esta asociada con el n de

megacariocitos CD61+.
Score de fosfatasa alcalina:
La fosfatasa alcalina leucocitaria (LAP) esta ausente o marcadamente reducida en
los neutrfilos de pacientes con LMC.
La LAP es un marcador de diferenciacin terminal de neutrfilos. Para su cuantificacin se
realiza un score (en 100 neutrfilos) de 0 a 4+ sobre la base de la intensidad del precipitado azul
en su citoplasma; se suman los valores de 100 celulas y se reporta la puntuacin total.
Un score bajo: indica desarrollo de neutrfilos anormales, asociado con LMC, PNH.
Citogentica y Alteraciones Moleculares
Como se menciono en la introduccin, la LMC es un trastorno clonal que generalmente se
diagnostica con facilidad porque las celulas leucmicas de ms del 95% de los pacientes
presentan una anomala citogentica distintiva, el cromosoma Ph.
Este cromosoma resulta de un desplazamiento reciproco entre los brazos largos
del cromosoma 9 y el 22 en todos los precursores hematopoyticos. El desplazamiento o
translocacin produce la transferencia de la regin ABL (Abelson) en el oncogn del cromosoma
9 a un rea en el cromosoma 22 denominada BCR (regin de rotura de conglomerados). Esto a
su vez resulta en un gen fusionado BCR/ABL y en la produccin de una protena anormal con
actividad tirosinquinasa que puede estar relacionada con la mielopoyesis desordenada que se
encuentra en la LMC.
El seguimiento molecular de la enfermedad se realiza a travs de la cuantificacin de la
expresin del transcripto de fusin BCR/ABL, por tcnicas de PCR cuantitativa.
La cuantificacin de BCR/ABL tiene adems importancia pronostica y ayuda a tomar decisiones
teraputicas en el manejo de los pacientes con LMC.
Aunque las tcnicas citogenticas continan siendo el gold standard para monitorear la
respuesta al tratamiento de los pacientes con LMC Ph positiva, una vez alcanzada la respuesta
citogentica completa (RCC), el nico mtodo que permite monitorear los niveles de
enfermedad del paciente es el estudio molecular.
En la actualidad, con el tratamiento con inhibidores de tirosinquinasa, mas de un
80% de los pacientes alcanzan RCC, por lo tanto es necesario introducir estas
tcnicas de anlisis ms sensibles, que permiten medir respuesta al tratamiento.
En los enfermos que alcanzan RCC, el nivel del transcrito BCR/ABL sigue disminuyendo con el
tiempo, incluso en algunos casos hasta pasados tres anos de la obtencin de la respuesta
citogentica.
La respuesta molecular completa se define como la desaparicin de la deteccin de BCR/ABL
mediante PCR convencional o la disminucin de 4,5 logaritmos mediante PCR cuantitativa.
La recada molecular se define como el aumento del nivel de expresin del transcrito BCR/ABL
de un logaritmo, comprobado en dos determinaciones consecutivas. Cuando esto ocurre, la
probabilidad de recada de la enfermedad es alta, y por ello deben considerarse seales de
alarma sobre las posibles causas y, si es necesario, modificar el tratamiento del enfermo.
LMC en edad peditrica
La LMC comprende menos de 5% de todas las leucemias de la niez, y en el rango de edad
peditrica, se presenta principalmente en los adolescentes mayores.
El imatinib ha mostrado un ndice alto de actividad en nios con LMC, que es comparable con
el que se observa entre adultos.
El nico tratamiento curativo que se conoce actualmente para la LMC es el trasplante de celulas
madre hematopoyticas autlogo. Informes publicados describen tasas de respuesta de 70 a 80%
cuando se utiliza un donante familiar HLA compatible en el tratamiento de nios en la fase
crnica temprana, con tasas de supervivencia mas bajas cuando se utilizan donantes HLA
compatible no emparentados con.

101

LEUCEMIA NEUTROFLICA CRNICA (LNC)

El interrogante que surge respecto de la LNC es si realmente es una enfermedad.
La clasificacion WHO la incluye en los desordenes mieloproliferativos, con la recomendacin
de que sea cuidadosamente excluida una enfermedad subyacente.
Si esta presente otra neoplasia, tal como un mieloma, el diagnostico de LNC solo
debera ser considerado, si se demuestra evidencia gentica de neoplasia mieloide.
La LNC es un trastorno mieloproliferativo crnico poco comn de etiologa desconocida, que se
caracteriza por una neutrofilia en SP (>25 109 /L) y hepatoesplenomegalia. La MO es
hipercelular. No hay displasia significativa en ningn linaje celular y la fibrosis de MO es poco
comn. Los estudios citogenticos son normales en casi el 90% de los pacientes. En el 10%
restante, las anomalas cariotpicas clonales, podran incluir +8, +9, del(20q) y del(11q). No hay
cromosoma Ph o gen de fusin BCR/ABL.
Leucocitosis en SP 25 x 109/L
Neutrfilos y cayados >80%
Granulocitos inmaduros <10%
Mieloblastos <1%
Biopsia de MO hipercelular
Aumento de granulocitos neutrfilos
Mieloblastos <5%
Maduracin neutroflica normal
La LNC es un trastorno que evoluciona lentamente y la supervivencia de los pacientes es
variable, oscilando entre seis meses y ms de 20 anos.

POLICITEMIA VERA (PV)

Un poco de historia
La PV, TE y MFI son tres condiciones que comparten varias caractersticas, incluyendo
hipercelularidad de MO, predisposicin a la trombosis y hemorragia, y riesgo de transformacin
leucmica en el largo plazo.
La PV es una condicin de hipercelularidad persistente y excesiva acompaada por cianosis
que fue reconocida por primera vez por Vazquez en 1892. La MFP fue descripta casi al mismo
tiempo y la TE reconocida en los 1930s.
Dameshek, en 1951, fue el primero en observar la considerable superposicin de
caractersticas clnicas y de laboratorio en estas condiciones y propuso que, junto con la LMC y
otros desordenes constituan un espectro de desordenes relacionados. Uso el trmino de
desordenes mieloproliferativos.
En 1974, un experimento critico mostr que los progenitores eritroides de MO de
pacientes con PV eran capaces de crecer in vitro en ausencia de eritropoyetina (EPO).
Se determino que estas enfermedades se originan en un clon de stem cells
hematopoyticas. Con el tiempo, se fueron encontrando otras claves del mecanismo responsable
de los desordenes mieloproliferativos. Estas incluyen la asociacin de varias neoplasias
mieloides crnicas con tirosinquinasas activadas y el reconocimiento de pasos de sealizacin
aumentada a travs de Janus cinasas y traductores de seales y activadores de transcripcin
(JAKSTAT) y fosfatidil inositol 3-cinasa (PI3K) en celulas mieloides y eritroides.
El descubrimiento de la mutacin JAK2V617F en PV, TE y MFP y de las mutaciones en el
exn 12 en PV y de MPLW515L/K en MFP y TE, ha ocasionado tal impacto en el diagnostico
de estas entidades que no solo se ha impuesto como prueba diagnostica esencial en la clnica
cotidiana, sino que ha obligado a efectuar la revisin de los criterios diagnsticos de la WHO
vigentes desde 2001 y ha llevado, en 2007, al grupo de expertos en estas enfermedades, a
publicar una nueva propuesta para las tres NMP Ph negativas clsicas.
.
Criterios para PV
Requiere la presencia de los 2 criterios mayores y uno de los criterios menores, o la

102

presencia del primer criterio mayor junto con 2 criterios menores.

Criterio Mayor
1- Hb >18.5g/dl en varones, > 16.5 g/dl en mujeres u otra evidencia de aumento de
la masa de celulas rojas*
2- Presencia de JAK2 V617F u otra mutacin tal como la mutacin del exn 12 de
JAK2
Criterio Menor
1- Biopsia de MO mostrando hipercelularidad para la edad con crecimiento de los 3
linajes (panmielosis) con prominente proliferacin eritroide, granuloctica y
megacarioctica
2- Nivel de eritropoyetina srica inferior al rango de referencia
3- Formacin de colonias eritroides endgenas in Vitro
*Hb o hematocrito en el percentil 99 del rango de referencia o Hb 17 g/dL en varones, 15 g/dl
en mujeres si esta asociado con un aumento sostenido de al menos 2 g/dL del valor basal de una
persona que no pueda ser atribuido a correccin por deficiencia de Fe o masa de GR 25% sobre
el valor normal.
El estudio de la mutacin JAK2 V617F ha tenido un gran impacto en la aproximacin
diagnostica a las NMP, en especial a la PV. JAK2 2V617F se ha convertido en el primer
marcador biolgico pronstico
independiente, junto a los factores pronsticos convencionales, para PV, TE y MFP.
Los siguientes hallazgos confirmatorios ya no se requieren para emitir un diagnostico:
Saturacin de oxigeno con gasometra arterial venosa >92%.
Esplenomegalia.
Trombocitosis (>400.000 plaquetas/mm3).
Leucocitosis (>12.000/mm3).
Fosfatasa alcalina leucocitaria (>100 unidades en ausencia de fiebre o infeccin).
Algunos signos y sntomas de la PV:
Dolor de cabeza, sudoracin exagerada, zumbido en los odos, trastornos visuales, como visin
borrosa o reas ciegas, mareos o vrtigo.
En algunos pacientes aparece picazn en la piel, especialmente despus de
baos o duchas tibias.
Puede aparecer un aspecto rojizo o violceo de la piel, especialmente en las
palmas, los lbulos de la oreja, la nariz y las mejillas. Algunos pacientes tal vez experimenten
una sensacin de ardor en los pies.
Las ulceras ppticas se pueden asociar con la PV y pueden tener como resultado hemorragias
gastrointestinales
Esplenomegalia.
La angina de pecho o insuficiencia cardiaca congestiva pueden ser efectos
nocivos de la sangre viscosa y la elevacin de plaquetas puede causar trombos.
La gota puede aparecer o empeorar.
Hemorragias o hematomas, generalmente leves, ocurren en aproximadamente
el 25% de los pacientes con PV.

MIELOFIBROSIS IDIOPTICA PRIMARIA (MFP)

Sinnimos: metaplasia mieloide agnognica, mieloesclerosis con metaplasma mieloide, mielosis
crnica granuloctica-megacarioctica)
La MFP es una proliferacin clonal de una clula madre hematopoytica pluripotencial, en la
que la fibrosis y la reaccin del estroma constituyen fenmenos reactivos a la liberacin de
citoquinas, fundamentalmente por los megacariocitos, los monocitos y las celulas endoteliales.
Esta enfermedad afecta fundamentalmente a personas de edad avanzada, si bien

103

tambin hay pacientes jvenes.

Esta caracterizada por panmielopatia con maduracin intacta, fibrosis medular progresiva,
hematopoyesis extramedular en bazo, hgado y ndulos linfticos, y marcada esplenomegalia
(hasta 4 Kg.). Tambin anemia, otras citopenias, sntomas B (fiebre, perdida de peso >10%,
sudoracin nocturna), gota, infecciones, episodios tromboticos, sangrado.
La MFP se caracteriza por fibrosis de la MO, hemopoyesis extramedular con
esplenomegalia, anemia con dacriocitosis y sndrome leucoeritroblstico.
La MFP es heterognea en su presentacin y evolucin, oscilando su espectro clnico desde
pacientes asintomticos al diagnostico hasta otros con sintomatologa constitucional o sntomas
derivados de la esplenomegalia y la anemia.
Cambios en MO
Presencia de proliferacin megacarioctica con atipa (megacariocitos pequeos a
grandes con relacin ncleo/citoplasma aberrante y ncleos hipercromticos, con
mameln, o irregularmente plegados y agrupamiento denso), generalmente esta
acompaada de fibrosis de colgeno o reticulina o, en ausencia de fibrosis
significativa, los cambios en megacariocitos deben estar acompaados por
aumento en la celularidad medular caracterizada por proliferacin granuloctica y
frecuentemente disminucin de la eritropoyesis.
EN SANGRE PERIFRICA DACRICITOS!!!

TROMBOCITEMIA ESENCIAL (ET)

Algunos investigadores argumentan que los pacientes con figuras clnicas y
morfolgicas de TE pueden tener recuentos de plaquetas que exceden el rango normal, pero que
no alcanzan el umbral diagnostico requerido. En la ultima revisin de criterios para el
diagnostico de TE ha sido, por esto, bajado de 600 109/l a 450 109/l.
Cabe destacar, adems de lo referido previamente, que en presencia de marcador
clonal JAK2V617F, MPLW515L/K, u otros, la presencia de trombocitosis reactiva asociada
no excluyen el diagnostico de TE si se cumplen los tres criterios mayores que se describen en la
tabla 5.

104

Cuando se mencionan cambios en MO compatibles con TE refieren a una biopsia de MO que

muestra proliferacin principalmente del linaje megacarioctico con numero aumentado de
megacariocitos grandes, maduros; sin aumento significativo o desviacin a la izquierda en la
granulopoyesis neutrfila o de la eritropoyesis.
Es importante destacar que la mutacin JAK2V617F, aunque muy caracterstica, no es
especifica de las NMP Ph negativas clsicas, ya que se puede detectar tambin en otras
patologas mieloides: en el 50% de las anemias refractarias con sideroblastos en anillo y
trombocitosis (ARSA-T), en el 20% de los SMD atpicos y en el 3% de los SMD o LMA de
novo. De modo que, ante la sospecha de TE, la deteccin de la mutacin JAK2V617F no
descartara un SMD o MFP si bien conviene resaltar que no se detecta en patologa tumoral no
mieloide ni en LMC. plaquetaria disminuida.

Leucemia Eosinoflica Crnica (LEC) y Sndrome Hipereosinoflico (SHE)

La decisin de incluir LEC y SHE juntos no significa que la WHO considere que todos los
casos de SHE sean enfermedades mieloproliferativas clonales. Mas bien seala el problema de
que en la prctica es virtualmente imposible distinguir entre eosinofilia clonal y eosinofilia
secundaria a produccin anormal de citosina para la cual no se reconocen bases etiolgicas.
El diagnostico de LEC o SHE puede ser hecho solo tras la exclusin de un nmero
de enfermedades infecciosas, inflamatorias y neoplsicas con asociacin conocida a eosinofilia
(incluyendo LMC, LMA con inv(16), otros desordenes mieloproliferativos crnicos, linfoma de
clula T, linfoma Hodgkin, y otros).
Entonces, si no hay evidencia de clonalidad, se prefiere establecer el diagnstico
de SHE, mientras que el hallazgo de una anormalidad clonal mieloide soportara el diagnostico
de LEC.
Caractersticas
exclusin de causas reactivas, infecciosas y neoplsicas
Eosinofilia persistente >1.5 x 109/L en SP
Aumento de eosinfilos en MO
Mieloblastos <20% en SP o MO
Los casos de Neoplasia Mieloide con Eosinofilia que carecen de reordenamientos
del PDGFRA, PDGFRB, o FGFR1 deberan ser clasificados como LEC sin otras
especificaciones, si se cumplen los siguientes criterios:
_ recuento de eosinfilos 1.5 109/l,
_ blastos < 20% en SP y MO,
_ ausencia de BCR-ABL1, inv(16)(p13.1q22) o t(16;16)(p13.1;q22), y
_ ausencia de evidencia de otra NMP o SMD/NMP,
pero hay:
_ una anormalidad clonal, citogentica relacionada mieloide
_ anormalidad gentica molecular,
_ blastos >2 % en SP o 5% en MO.
Los casos con eosinofilia que carecen de evidencia de clonalidad pueden ser diagnosticados
como SHE idioptico tras descartar todas las causas de eosinofilia reactiva.

105

LMC SP FASE CRNICA

LMC MO FASE CRNICA

LMC MO FASE ACELERADA

LMC MO CRISIS BLSTICA

106

TRABAJO PRCTICO N 12:

HEMOSTASIA PRIMARIA
UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS
CATEDRA DE ANALISIS CLINICOS I (HEMATOLOGIA)

1. RECUENTO DE PLAQUETAS (METODO MANUAL)

Fundamento
El recuento de plaquetas se efecta en sangre obtenida de puncin venosa anticoagulada con
EDTA-Na2, y sometida a hemlisis por accin de una solucin hipotnica de oxalato de amonio
en agua destilada.
Materiales y reactivos

Tubos plsticos.
Cpsula de Petri.
Algodn.
Anticoagulante EDTA (0,342 mol/L).
Diluyente: Oxalato de amonio 1% en agua destilada.

Procedimiento
1. Se obtiene sangre por puncin venosa en anticoagulante EDTA (0,342 mol/L), en tubos
plsticos.
2. Se homogeiniza bien la muestra y se toman 100 l que se colocan en otro tubo plstico que
contenga 1,9 ml de oxalato de amonio 1%.
3. Incubar 10-15 min , para provocar la hemlisis.
4. Cargar la cmara de Neubauer con el hemolizado y dejar que sedimenten las plaquetas en
ambiente hmedo: se recomienda colocar la cmara dentro de una cpsula de Petri
conteniendo un trozo de algodn humedecido.
5. Dejar 10-15 min en atmsfera hmeda.
6. Efectuar el recuento en microscopio (40 X) en el reticulado central de la cmara (dividido
en 400 cuadrados pequeos comprendidos en 1 mm2). El recuento de plaquetas se realiza en
el cuadrado central (al igual que el recuento de hemates), se eligen 5 de los cuadrados que
se encuentran subdivididos en 16 cuadraditos, como se muestra a continuacin .

Recuadro central
La superficie de este cuadrado central es de 1 mm2 y la cmara tiene una profundidad de 0,1
mm.

107

7. Contar los 4 cuadrados de los extremos y el cuadrado central (por ende, sern 5 cuadrados
con 16 cuadraditos c/u, o sea 80 cuadraditos).
8. Clculo: sumar las plaquetas contadas en los 5 cuadrados y multiplicar por 1000 para
obtener el nmero de plaquetas por mm3. El factor 1000 surge del producto:
20 x 400
80 x 0,1 mm3

= 1000/mm3

Donde 20 es el factor de dilucin, 400 son los cuadraditos totales y 80 los cuadraditos
contados. El volumen total del cuadrante es de 0,1 mm3 .
Valores de referencia (pacientes adultos) 150.000 400.000 plaquetas / mm3
Observaciones
Actualmente, en muchos laboratorios, los recuentos de plaquetas se realizan en forma
automatizada en contadores hematolgicos o en contadores especficos, habindose logrado un
alto nivel de precisin (incluso en trombocitopenias). El recuento manual suele efectuarse para
la comprobacin de la cifra de plaquetas en trombocitopenias muy graves y en el caso de
plaquetas gigantes en las que el recuento automtico no es fiable. O lo que es ms frecuente en
la rutina, inspeccionar frotis de punta de aguja coloreados con MGG para corroborar el
recuento automatizado, esta ltima prctica es de vital importancia realizarla para
comprobar los recuentos automatizados.
2. TIEMPO DE SANGRIA
2.1 METODO DE IVY
Fundamento
Esta prueba valora la capacidad hemosttica global in vivo y consiste en medir el tiempo
transcurrido desde la realizacin de una pequea incisin cutnea hasta que cesa la hemorragia.
La prueba mide el tiempo necesario para obtener un tapn hemosttico eficaz y, por ende,
representa una valoracin global y simultnea de la funcin plaquetaria (nmero, adhesin,
agregacin y degranulacin plaquetaria) y de la funcin vascular. Respecto al factor vascular, la
prueba depende de la integridad de la pared vascular y de su capacidad constrictora.
El mtodo original del corte en el lbulo de la oreja, introducido por Duke en 1910, es poco
sensible y menos reproducible, por lo que no es aconsejable continuar utilizndolo hoy en da.
En 1935, Ivy introdujo la aplicacin de un manguito de presin en el brazo y la prctica de la
incisin en la cara anterior del antebrazo. Este mtodo, con la modificacin introducida por
Borchgrevink, que sustituye la puncin con lanceta por un corte realizado con hoja de bistur, ha
demostrado una alta sensibilidad. Por ltimo, la introduccin de plantillas o dispositivos
automticos para la realizacin de la incisin ha venido a uniformar y aumentar la
reproducibilidad.
Materiales y reactivos

Dispositivos automticos para la realizacin de la incisin: Simplate y Simplate II (Organon

Teknika) y Surgicutt (Ortho Diagnostics).
Lancetas (en el trabajo prctico se utilizarn estas ltimas)
Esfingomanmetro
Cronmetro.

108

Procedimiento
1. Es aconsejable colocar un esfigmomanmetro en el brazo del paciente y se regula a 40 mm
de Hg, mantenindolo a esta presin a lo largo de toda la prueba.
2. Se extrae el dispositivo automtico de su reservorio estril y se sita en la parte superior de
la cara anterior del antebrazo (previamente desinfectada), en una zona sin vello y alejada de
las venas superficiales, a unos 3 cm por debajo del pliegue del codo y paralelo al mismo.
3. Se presiona el disparador del dispositivo y al mismo tiempo se pone en marcha el
cronmetro (el corte tendr un largo y profundidad predeterminados: 1 cm x 1 mm).
4. La sangre que brota espontneamente se va secando cada 30 segundos, sin tocar la incisin,
anotndose el tiempo que tarda en cesar la hemorragia, que ser el resultado de la prueba.
Cuando el tiempo se alarga ms de 20 minutos puede detenerse la prueba aplicando una
compresa con material hemosttico.
Valores de referencia
Hasta 6-8 minutos. Los tiempos superiores a 10 minutos son claramente patolgicos.
2.2 METODO DE DUKE
Fundamento
El mtodo original de Duke es, como dijimos antes, poco sensible y menos reproducible, pero
se contina aplicando.
Procedimiento
1. Se practica una incisin de 2 mm de longitud en el lbulo de la oreja utilizando una lanceta
con tope, descartable.
2. La sangre que brota espontneamente se va secando cada 30 segundos, sin tocar la incisin,
anotndose el tiempo que tarda en cesar la hemorragia, que ser el resultado de la prueba.
Valores de referencia: Inferior a 5 minutos.
Interpretacin de resultados
La prueba se prolonga por reduccin del nmero de plaquetas o por alteraciones funcionales
plaquetarias o plasmticas (enfermedad de von Willebrand) relacionadas con los procesos de
adhesin, agregacin o degranulacin plaquetarias.
Est alterado en trombocitopenias, trombopatas, tromboastenias y dficit de fibringeno. Se
observan tiempos prolongados en uremias, mielomas, macroglobulinemias y despus de la
ingesta de cido acetilsaliclico.
En la enfermedad de von Willebrand generalmente es alargado, pero si es normal no invalida el
diagnstico de dicha enfermedad.
3. TIEMPO DE COAGULACION
Fundamento
El tiempo de coagulacin de sangre total es una de las pruebas llamadas globales y abarca la
activacin intrnseca de la protrombina y el fibringeno.

109

La sangre, al ser extrada sin mayor contaminacin con tromboplastina tisular, es capaz de
coagular cuando se la deposita en un tubo de vidrio. El tiempo que tarda este proceso est en
relacin con el sistema de procoagulantes e inhibidores fisiolgicos o adquiridos, que influyen
en la formacin de dicho cogulo.
Este tiempo de coagulacin in vitro reflejar mejor la eficacia del sistema in vivo, cuanto menos
se modifique esta sangre (contacto con el vidrio, burbujas de aire, detergentes, etc.).
Materiales y reactivos
Tubos de vidrio, perfectamente limpios.
Bao a 37C.
Cronmetro.
Procedimiento
1. Obtener 3 ml de sangre por puncin venosa, de primera intencin y con jeringa plstica.
2. Disparar el cronmetro en el instante en que la sangre venosa se introduce en la jeringa.
3. Desconectar la aguja y vaciar ordenadamente 1 ml de sangre en el primero de los tres tubos
de vidrio perfectamente limpios, previamente colocados en gradilla de bao a 37C.
4. Inclinar el primer tubo cada 30 seg. por la misma cara hasta que la sangre se coagule (deja
de escurrirse por las paredes del tubo).
5. De inmediato, inclinar el segundo tubo hasta que se coagule; luego, proceder de la misma
forma con el tercer tubo.
6. Se toma como tiempo de coagulacin el valor obtenido en el tercer tubo.
Interpretacin de resultados
Valores de referencia a 37C: 7-15 min.
El rango normal debe establecerse en cada laboratorio, con un grupo suficiente de controles (20
como mnimo). Conviene repetir un paciente normal semanalmente, para determinar cualquier
variabilidad de los valores previamente obtenidos.
Se considera alargado un tiempo de coagulacin que difiere en ms de 2 min del lmite superior
del rango normal, establecido en cada laboratorio (media + 2 SD).
Se trata de un mtodo poco sensible, pues se prolonga slo en aquellos casos de dficit graves.
Un tiempo de coagulacin normal no descarta la existencia de un trastorno de la coagulacin,
pero un tiempo prolongado es siempre ndice de un defecto severo de la misma, que puede
deberse a una deficiencia de cualquiera de los factores que intervienen en la formacin del
cogulo de fibrina, con excepcin de una deficiencia pura de los factores VII y XIII; pero el
mtodo es mucho ms sensible a los defectos de los factores que intervienen en la activacin por
contacto y en la formacin del activador intrnseco de la protrombina.
4. RETRACCION DEL COAGULO
Fundamento
La retraccin del cogulo depende de la actividad trombodinmica de las plaquetas, por lo que
se requiere un nmero mnimo de plaquetas normales y adecuados niveles de Ca++.
Procedimiento

110

1. Los tres tubos utilizados para determinar el tiempo de coagulacin deben dejarse en bao a
37C durante por lo menos 3 Hs. Al cabo de este tiempo, observaremos la mejor retraccin
de los tres tubos, graduando de acuerdo a la magnitud de la retraccin por apreciacin visual
del tamao del cogulo retrado y el suero libre en:
a)
b)
c)
d)

Normal o completa
Incompleta
No retrae
Hiperretrctil

Interpretacin de resultados
Esta prueba depende del nmero de plaquetas, su actividad funcional y de la concentracin de
fibringeno, aunque no se relacione muy bien con el nmero de plaquetas (en ciertas
condiciones da normal an con 30.000/mm3). Un aumento importante de fibringeno reducir la
retraccin por efecto de volumen, mientras que lo opuesto ocurre en casos de
hipofibrinogenemia.
En la tromboastenia de Glazman (alteracin funcional) se observan retracciones incompletas o
nulas.

a-Retraccin normal o buena b- Retraccin deficiente c- Ausencia de retraccin

d- Hiperretraccin

111

TRABAJO PRCTICO N 13
HEMOSTASIA SECUNDARIA
OBTENCIN DE MUESTRAS
INDICACIONES PARA EL PACIENTE: para realizar los estudios de coagulacin no es
necesario un ayuno prolongado, pero es conveniente no ingerir alimentos grasos desde 4h antes
de la extraccin .Debe tratar de evitarse situaciones de estrs o esfuerzo fsico durante horas
previas a la toma de muestra ya que se producen variaciones importantes
La extraccin de sangre debe realizarse por la maana (entre las 8 y las 10) y con el mnimo
stasis venoso posible (idealmente menos de 1 minuto y sin lazo, esto ltimo raramente se
efecta).
La noche anterior del estudio el paciente no debe realizar actividad fsica ni comer en forma
abundante debe recurrir al laboratorio realizando la menor actividad posible y en conocimiento
que al llegar debe permanecer en reposo por lo menos 30min antes de la extraccin.
ANTICOAGULANTE: El anticoagulante mas ampliamente utilizado es el citrato trisdico en
cc. 0,109 o 0,129 M (3.2 o 3.8%) el comit de expertos de la Sociedad internacional de
Hemostasia y Trombosis (ISHT) recomienda el citrato al 3.2% .Los plasmas patrones
liofilizados con los cuales se calcula el ndice de sensibilidad internacional (ISI) se obtienen con
citrato trisdico 3.2%.
Se debe mantener la relacin anticoagulante /sangre 1:9 hay que tener presente que se deber
ajustar la relacin de acuerdo al hematocrito sobre todo los por debajo de 25% y por arriba de
55%.
EXTRACCIN: Para realizar la extraccin sangunea se debe utilizar jeringas plsticas de
buena calidad. Las agujas descartarles de calibre entre 21 y 19 para adultos y 23 G para
pediatra. Los tubos para recoger la sangre deben ser de material no reactivo como polipropileno
o vidrio siliconado.
No se aconseja utilizar sangre capilar para pruebas de coagulacin, si no es posible obtener una
muestra de sangre venosa, la muestra puede ser obtenida del pulpejo del dedo en los adultos o
del taln del pie en los neonatos. Es esencial que la puncin realizada permita que la sangre
fluya espontneamente y forme una gota de volumen importante, la cual se deber recoger en
tubos con la proporcin de anticoagulante ajustada.
La puncin venosa debe ser rpida y precisa, sin dificultades, evitando la formacin de espuma,
el stasis venoso y la contaminacin con tromboplastina tisular
Cuando la extraccin es dificultosa se recomienda el cambio de jeringa luego de extraer 2 a 3 ml
de sangre. La muestra extrada en la segunda jeringa ser utilizada para los estudios de
coagulacin.
En los pacientes canalizados se recomienda evitar la extraccin por catter, de ser ello
indispensable, realizar la doble extraccin con jeringa y descartar los primeros 5 mL. Los
pacientes canalizados, en ocasiones puede recibir heparina, para mantener la permeabilidad del
catter y en el laboratorio de hemostasia la heparina es mala palabra prolonga todas las
pruebas.
Una vez realizada la extraccin se vierte suavemente la sangre por la pared de los tubos, hasta la
marca prevista, evitando la formacin de espuma
Todo el material utilizado en hemostasia es de plstico, para evitar que el vidrio active la
cascada de la coagulacin.
Es conveniente recoger la sangre en dos tubos, pues al tener la posibilidad de procesar en un
segundo tubo se reducirn las posibilidades de error.
Descartar los plasmas con signos de hemlisis visibles.

112

PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
Plasma citratado rico en plaquetas (prp): la sangre obtenida de acuerdo a las condiciones ya
sealadas es centrifugada a 1000 r.p.m durante 5 minutos. Trasvasar el plasma rico a un tubo de
plstico con pipeta plstica. Mantener a T ambiente hasta su uso (no mas de 2h). El plasma as
obtenido es el plasma rico en plaquetas.
Se utiliza fundamentalmente para el estudio de la funcin plaquetaria y para el tiempo de
plasma recalcificado (Tiempo de Howell)
Plasma citratado: Se obtiene centrifugando la sangre durante al menos 10 min. a 3000 r.p.m.
El plasma as obtenido es relativamente pobre en plaquetas (menor de 10000/mm3 ). Se utiliza
dentro de las 4 h de extraccin para los estudios pre- quirrgicos, control de anticoagulacin en
los pacientes sin antecedentes de sangrado o trombosis.
Plasma pobre en plaquetas: Se obtiene por doble centrifugacin (primero de sangre entera y
luego el plasma citratado y separado) de 15 minutos a 4000 rpm (idealmente en centrfuga
refrigerada a 4C). El plasma as obtenido es pobre en plaquetas (menor de 5000/mm3) rene
las condiciones para realizar todos los estudios. Puede ser fraccionado y congelado para estudios
posteriores. En este caso se aconseja procesar de igual forma muestras normales.
Pool de plasmas normales: Se debe extraer sangre de sujetos normales, sin historia previa de
manifestaciones hemorrgicas, ni trombticas, ni hepticas, que no estn recibiendo ninguna
medicacin. Se prepara plasma pobre en plaquetas de por lo menos 10 sujetos que tengan las
pruebas bsicas de coagulacin normal. Se puede fraccionar y congelar a-70C mximo 6 meses
y 1 mes si se conserva a -20C

Activacin intrnseca de la protrombina

TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADO (APTT)
Fundamento
El APTT, es la prueba ms sensible para evaluar la va intrnseca de la coagulacin. Consiste en
activar el plasma por contacto con superficies cargadas negativamente (caoln, slica, etc.). En
esta prueba se fija la concentracin de fosfolpidos presentes en la reaccin, mediante el
agregado de cefalina (tromboplastina parcial). La activacin por contacto se ve favorecida por el
agregado de caoln (sustancia inerte, con cargas negativas) que aumenta la superficie de
contacto.
Expresin de resultados
Los resultados se expresan en segundos.
Interpretacin de resultados
Valor normal: segn el reactivo utilizado y el mtodo de deteccin: 37-48 seg.
Valores menores a 37 seg indican concentracin aumentada de factores o muestra activada.
Valores prolongados revelan un defecto en la va intrnseca.
El APTT es ms sensible al defecto de los factores VIII, IX, XI, XII o fase de contacto como
precalicrena (PK), quiningenos de alto peso molecular (HMWK). Es menos sensible al
defecto de factores de la va comn (X, V o II). En casos de deficiencias de fibringeno, el
APTT se prolonga a partir de concentraciones menores a 100 mg/dL.
Presencia de inhibidores, ya sean especficos contra un factor (neutralizantes) o inespecficos
(interferencia) afectan la prueba del APTT (dependiendo de la sensibilidad del reactivo), que no
corrige por el agregado de plasma normal. La heparina no fraccionada (UFH), que potencia la
accin inhibitoria de la antitrombina frente a la trombina, puede afectar el resultado del APTT.

113

FACTORES DE VIA INTRINSECA (VIII, IX, XI, XII, PK, HMWK)

Fundamento
Este mtodo mide la formacin de fibrina por accin de la trombina generada en un sistema
coagulante que aporta todos los factores excepto el factor en estudio. El tiempo de coagulacin
del sistema es dependiente de la concentracin del factor presente en la muestra problema.
Expresin de resultados
Los resultados se expresan en por ciento de actividad.
Para la construccin de la curva de calibracin, en papel doble logartmico, se transportan las
concentraciones de factor (%) sobre la abscisa y los tiempos de coagulacin (seg) sobre la
ordenada. Se interpola la concentracin del factor en el plasma problema en la curva obtenida.
Interpretacin de resultados
Valores normales: 50-150 %
El descenso de los niveles plasmticos de cualquiera de estos factores puede deberse a un dficit
congnito (cuali o cuantitativo), adquirido, o a la presencia de inhibidores.

Activacin extrnseca de la protrombina

TIEMPO DE QUICK O TIEMPO DE PROTROMBINA
Fundamento
Se utiliza como reactivo tromboplastina clcica (comercial) que, en contacto con el plasma
citratado, genera la activacin del mecanismo extrnseco y la produccin de fibrina. El tiempo
de coagulacin de la prueba depende de la concentracin de los factores plasmticos que
participan en el mecanismo extrnseco de la coagulacin.
Expresin de resultados
Los resultados se expresan en por ciento de actividad y/o tiempo en segundos. Se realiza el
tiempo de protrombina y se interpola el tiempo en la curva de Quick o curva de tasa de
protrombina (VER INSERTO).
Interpretacin de resultados
Valor normal: 70-100%
Resultados de tiempo de protrombina menores a 70% evidencian una anormalidad del
mecanismo extrnseco debida a un defecto o a la inhibicin de uno o ms de los factores
intervinientes en la va extrnseca. Se deber corregir la prueba con plasma normal para
descartar un efecto inhibitorio y realizar la determinacin individual de cada uno de los factores
para identificar el o los factores deficientes.
El general, tiempo de Quick es ms sensible al defecto de los factores VII, X y V que a la
deficiencia de protrombina. No detecta disminuciones moderadas de fibringeno, pero se ve
afectado por concentraciones menores a 100 mg/dL.
FACTORES DE VIA EXTRINSECA (II, V, VII y X). METODO EN UNA ETAPA
Fundamento
El mtodo mide la formacin de fibrina por accin de la trombina generada en un sistema
coagulante que aporta todos los factores excepto el factor en estudio. El tiempo de coagulacin
del sistema es dependiente de la concentracin del factor presente en la muestra problema.
Expresin de resultados
Los resultados se expresan en por ciento de actividad.

114

Curva de calibracin: graficar en papel doble logartmico la concentracin del factor sobre la
abscisa y los tiempos de coagulacin (seg) sobre la ordenada. De la recta resultante, se interpola
la concentracin del factor presente en el plasma problema.
Interpretacin de resultados
Valores normales: 70-120 %
El descenso de los niveles plasmticos de los factores puede deberse a un dficit congnito
(cuali o cuantitativo), adquirido, o a la presencia de inhibidores. Las deficiencias adquiridas
pueden ser causadas por consumo, alteraciones en la funcin heptica, aumento en la actividad
fibrinoltica o presencia de inhibidores.

Transformacin fibringeno-fibrina
TIEMPO DE TROMBINA (TT)
Fundamento
Esta prueba mide el tiempo de coagulacin del plasma citratado en presencia de trombina.
Permite evaluar la transformacin de fibringeno a fibrina.
Expresin de resultados
Se informa el tiempo de coagulacin de la muestra (TT) expresado en segundos, junto con el
tiempo de trombina del plasma normal.
Interpretacin de resultados
Valores prolongados del TT pueden deberse a:
-Baja concentracin de fibringeno (menor 200 mg/dL.), o ausencia del mismo (hipo o
afibrinogenemia). Puede ser de origen congnito o adquirido. Los niveles de fibringeno
plasmtico pueden disminuir en hepatopatas severas, CID, por efecto del tratamiento con
estreptoquinasa, r-tPA o L-asparaginasa, o tambin en respuesta a la actividad fsica.
-Presencia de un fibringeno anmalo (disfibrinogenemias congnitas o adquiridas)
-Inhibidores de la polimerizacin de los monmeros de fibrina, productos de degradacin del
fibringeno/fibrina o protenas plasmticas anormales.
-Tratamiento o contaminacin con heparina
-Prolongaciones inespecficas (hiperbilirrubinemia, hipoalbuminemia, hemlisis)
-Aumento muy marcado de fibringeno (>800-1000mg/dl)*
Valores acortados de TT: es muy controvertida su interpretacin; algunas disfibrinogenemias
trombticas cursan con TT acortados.
*Los valores aumentados de fibringeno no suelen afectar el TT, excepto en situaciones
particulares, como por ejemplo pacientes con sndrome nefrtico. Dado que el fibringeno es
una protena reactante de fase aguda, su concentracin plasmtica est aumentada en procesos
infecciosos e inflamatorios, ciruga, sepsis, cncer o ateroesclerosis y constituye un marcador de
riesgo para eventos vasculares oclusivos. Los niveles de fibringeno aumentan con la edad,
masa corporal, embarazo, tabaquismo, estrs y con el uso de anticonceptivos orales.
FACTOR
XIII (FACTOR ESTABILIZADOR DE LA FIBRINA) PRUEBA DE
SOLUBILIDAD DEL COAGULO
Introduccin
Las pruebas de laboratorio fundadas en la medida del tiempo de coagulacin no detectan los
defectos o alteraciones del FXIII, dado que no participa en las reacciones que llevan a la
formacin de fibrina soluble. El FXIIIa acta en una fase posterior, estableciendo uniones

115

covalentes entre las molculas de fibrina, transformndola en insoluble. La deficiencia severa

de FXIII puede ser detectada por la disolucin temprana del cogulo de fibrina en medio
hidrofbico (urea, cido monocloroactico) (prueba de solubilidad del cogulo).

Fundamento
La prueba consiste en evaluar la presencia de un cogulo de fibrina insoluble (estable); el
plasma del paciente, en presencia de iones calcio coagula, dicho cogulo de coloca en un medio
hidrofbico y se observa si se disuelve o no el cogulo. En pacientes con deficiencias severas
del FXIII (1-5 U/dl) se produce un cogulo, que se disuelve tempranamente, comparado con
los controles normales.
Expresin de resultados
Los resultados se expresan como normal (cogulo insoluble) o anormal (cogulo soluble).
Interpretacin de resultados
En ausencia de FXIII o en presencia de concentraciones menores a 1-5U/dl (depende del
mtodo), el cogulo de fibrina se disuelve en el trmino de pocos minutos u horas. A pesar de su
escasa sensibilidad, la tcnica es til para detectar defectos clnicamente importantes. Se
requiere muy baja concentracin de FXIII para obtener una hemostasia adecuada (valor
hemosttico: 1-5 U/dl).
Las alteraciones del FXIII pueden deberse a defectos cualitativos o cuantitativos, ya sean
congnitos o adquiridos. La prueba de solubilidad puede dar anormal por la presencia de
inhibidores especficos del FXIII.

COAGULMETRO AUTOMATIZADO
Son equipos utilizados para determinar cualquiera de las pruebas de hemostasia que utilicen
mtodo coagulomtrico (TP, APTT, TT, Fibringeno, factores, etc.). Desde el punto de vista
prctico ahorran tiempo para procesar muchas muestras (ms de 30 en una maana por Ej.) pero
fundamentalmente logran altos grados de reproducibilidad.
Bsicamente su funcionamiento se basa en dos mtodos de deteccin: ptico
(turbodensitometra) y/o magntico. Los que utilizan el mtodo magntico toman el tiempo que
tarda en formarse el cogulo desde el momento de mezcla hasta que una varillita de metal deja
de girar. Los basados en mtodos pticos utilizan medidas de transmitancia para dar el tiempo
de formacin del cogulo.
Dentro de las funciones que pueden brindar estos equipos est la incubacin de muestras por
medio de fuentes secas, sta se realiza por el tiempo estipulado para cada prueba que debe ser
determinado por el operador o bien ya viene estandarizado en el equipo.
Cabe aclarar que en estos equipos se trabaja de modo muy similar al mtodo manual en lo que
se refiere a preparacin de diluciones y curvas de actividad, la ventaja de estos equipos radica
en agilizar el trabajo en caso de elevado nmero de muestras y la de permitir mayor
reproducibilidad.

116

APTTest
Reactivos para la determinacin del Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada

SIGNIFICACION CLINICA
El tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT), es una prueba sensible a la deficiencia de
factores procoagulantes del plasma as como a la presencia de ciertos inhibidotes de la
coagulacin.
Sirve para detectar anormalidades en la va intrnseca de la coagulacin, como son los factores
necesarios para la formacin del activador intrnseco de la protrombina, o sea los factores VIII,
IX, XI y XII.
Tambin detecta deficiencias severas de los factores II, V, X y fibringeno, no siendo as con
los trastornos plaquetarios, las deficiencias de los factores VII y XIII ni los problemas
vasculares.
La rapidez, sencillez y reproducibilidad de la prueba la hacen muy adecuada para el control de
la teraputica anticoagulante por heparina. Tambin permite la identificacin rpida de
hemoflicos en potencia, a fin de poder someterlos a tratamientos preventivos prequirrgicos y
evitar problemas hemorrgicos.
FUNDAMENTOS DEL METODO
El ensayo se basa en la medida del tiempo que tarda en coagular un plasma descalcificado,
colocado en un bao a 37oC y en presencia de un exceso de cefalina, activador y calcio.
REACTIVOS PROVISTOS
Reactivo APTT: viales conteniendo cefalina con tierra de diatomeas como activador
particulado.
Cloruro de Calcio: solucin de cloruro de calcio 0,025 mol/l.
REACTIVOS NO PROVISTOS
Agua bidestilada o desionizada.
INSTRUCCIONES PARA SU USO
Cloruro de Calcio: listo para usar.
Reactivo APTT, preparacin:
- Abrir un vial quitando el precinto metlico y retirando lentamente el tapn de goma para evitar
prdidas del material.
- Agregar el volumen de agua bidestilada o desionizada indicado en el envase.
- Verificar que la temperatura del agua empleada no sea mayor a 37C
- Tapar y agitar suavemente hasta obtener una suspensin homognea. Volver a homogeneizar
cada vez que se emplee.
PRECAUCIONES
Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro".
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO
Reactivos Provistos: estables en refrigerador (2-10 C) hasta la fecha de vencimiento indicada
en la caja.
Reactivo APTT: una vez reconstituido es estable durante 14 das en refrigerador o 30 das
congelado (-20 C). El congelado y descongelado slo puede realizarse una vez. Por esto se
recomienda dividirlo en porciones, de acuerdo a las necesidades de trabajo.
MUESTRA
Plasma
a) Recoleccin: obtener sangre cuidadosamente (evitando estasis o trauma) y colocar en un
tubo con anticoagulante en proporcin 9 + 1 exacta (ejemplo: 4,5 ml de sangre + 0,5 ml de

117

Anticoagulante TP de Wiener lab.). Mezclar suavemente. Centrifugar y separar el plasma antes

de los 30 minutos. Es recomendable efectuar la extraccin con jeringas plsticas.
b) Aditivos: para obtener el plasma debe emplearse Anticoagulante TP de Wiener lab. o citrato
de sodio 0,130 mol/l.
c) Sustancias interferentes conocidas:
- Las contaminaciones, visibles o no, son causa de tiempos falsamente prolongados.
- No debe emplearse EDTA o heparina para obtener plasma. Referirse a la bibliografa de
Young para los efectos de las drogas en el presente mtodo.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el plasma debe mantenerse en refrigerador
(2-10C) hasta el momento de efectuar la prueba. Este perodo no debe prolongarse ms de 4
horas. En caso de no poder procesarse en este lapso, el plasma debe congelarse a -20C. Este
procedimiento al igual que el descongelado debe realizarse con rapidez (sumergiendo en bao a
37C) previo a la determinacin. La muestra debe conservarse hasta el momento de su anlisis
en tubos plsticos para minimizar los efectos de activacin por contacto que pueden ocurrir con
los tubos de vidrio.
MATERIAL REQUERIDO (no provisto)
- Tubos de hemlisis.
- Pipetas y micropipetas capaces de medir los volmenes indicados.
- Bao de agua a 37C.
- Cronmetro.
- Fuente luminosa, para la observacin del cogulo.
PROCEDIMIENTO
Precalentar el Cloruro de Calcio antes de realizar la prueba en bao de agua a 37C.
En un tubo de hemlisis colocar:
Muestra (plasma desconocido o control) 100 ul
Reactivo APTT (homogeneizado) 100 ul
Mezclar e incubar de 3 a 5 minutos a 37C, luego agregar: Cloruro de Calcio (a 37C) 100 ul
Disparar simultneamente un cronmetro. Agitar brevemente para homogeneizar el contenido,
mantener en el bao unos 25 segundos. Luego sacar el tubo del bao, inclinar suavemente una
vez por segundo y detener el cronmetro en el momento de la formacin del cogulo. Tomar
nota del tiempo de coagulacin.
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
Los resultados pueden expresarse de distinta forma:
1) Como tiempo de tromboplastina parcial activada en segundos.
2) Como relacin entre el tiempo obtenido con el desconocido y el de un plasma control.
METODO DE CONTROL DE CALIDAD
Plasma Control normal - patolgico.
VALORES DE REFERENCIA
El intervalo de valores observados en individuos normales
oscila entre 33-48 segundos.
Se considera fuera de lo normal valores que difieran en ms de 6 segundos de un plasma
control.
Es recomendable que cada laboratorio procese un plasma control con cada lote de reactivos
empleado y que correlacione los valores obtenidos para los pacientes con el de dicho plasma,
haciendo constar estos resultados en el informe.
CURVA DE CALIBRACION
Este mtodo es til como control de la respuesta a la heparina en pacientes tratados con este
anticoagulante.
La tcnica empleada es la siguiente:

118

1) Preparar una Solucin de Trabajo de heparina en solucin fisiolgica cuya concentracin sea
10 Unidades/ml. Debe emplearse la misma heparina que se suministra al paciente.
2) Preparar diluciones de esta Solucin de Trabajo utilizando un pool de plasmas frescos
normales o Plasma Control normal como diluyente. Se debern obtener diluciones de 0,8; 0,6;
0,4; 0,2; y 0,1 Unidades/ml.
3) Determinar el tiempo de tromboplastina parcial para cada una de estas soluciones as como
para el pool de plasmas y graficar en papel semilogartmico APTT vs. Concentracin de
heparina.
El valor obtenido para el paciente debe correlacionarse con los valores de la grfica, para
obtener la concentracin actual de heparina circulante.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
Ver Sustancias interferentes conocidas y Estabilidad e instrucciones de almacenamiento en
MUESTRA.
El mecanismo de la coagulacin involucra una serie de reacciones enzimticas que pueden ser
influenciadas por toda condicin que afecte a los sistemas enzimticos en general, razn por la
cual se deben observar las mismas precauciones metodolgicas.
Debe tenerse en cuenta que variaciones en la relacin anticoagulante/muestra o en la
concentracin de citrato utilizada afectan los tiempos de tromboplastina parcial activada, por lo
que se recomienda controlar la dosis de anticoagulante empleada al tomar la muestra.
PERFORMANCE
Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo da se
obtuvieron los siguientes resultados:
Nivel
45 seg
62 seg

D.S.
+1,1 seg
+1,8 seg

C.V.
2,5%
3,0%

PRESENTACION
Equipo para 150 determinaciones (6 x 2,5 ml) (Cd. 1705002).
BIBLIOGRAFIA
- Bell, W.N.; Alton, H.G. - Nature 174:880 (1954).
- Dacie, J.B.; Lewis, S.M. - Hematologa Prctica Ediciones Toray, 2 Edicin (1970).
- Wintrobe, M.M. - Hematologa Clnica 3 Edicin Intermdica (1969).
- Bragos, I; Rodrguez Pcora, S; Lorenzo, L; Capriotti, G. Evaluacin de un nuevo Reactivo de Tiempo Parcial de
Tromboplastina Activada - 53 Triduo Bioqumico Cientfico Anual; Baha Blanca (1988).
- Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.

Soluplastin
Tromboplastina clcica para la determinacin del Tiempo
de Protrombina o Tiempo de Quick en una etapa

SIGNIFICACION CLINICA
El fenmeno de la coagulacin puede desencadenarse por una va extrnseca (lesin tisular) o
por una va intrnseca contacto de la sangre con epitelios distintos del vascular normal).
La determinacin del Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick es una prueba global para
evaluar la coagulacin extrnseca, siendo sensible a: factor II o protrombina, factor V o
proacelerina, factor VII o proconvertina y factor X o Stuart-Prower.
Por lo tanto la determinacin se aplica a:

119

- estudios de rutina en los anlisis prequirrgicos;

- deteccin de alteraciones en los niveles de uno o ms factores involucrados en la va
extrnseca;
- control de la teraputica con anticoagulantes orales.
FUNDAMENTOS DEL METODO
Este ensayo se basa en la medida del tiempo que tarda en coagular un plasma descalcificado,
colocado a 37C y en presencia de un exceso de tromboplastina tisular y calcio. El mtodo no
detecta deficiencias de factores de la va intrnseca (VIII, IX, XI y XII).
REACTIVO PROVISTO
Soluplastin: viales conteniendo tromboplastina de cerebro de conejo, cloruro de calcio para una
concentracin final de 0,0125 mol/l y cloruro de sodio para una concentracin final de 0,1 mol/l.
REACTIVO NO PROVISTO
Agua bidestilada o deionizada.
INSTRUCCIONES PARA SU USO
- Abrir un vial quitando el precinto metlico y retirando lentamente el tapn de goma para evitar
prdidas del material.
- Agregar el volumen de agua bidestilada o desionizada indicado en el envase. Verificar que la
temperatura del agua empleada no sea mayor de 37C.
- Tapar y agitar suavemente hasta obtener una suspensin homognea. Volver a homogeneizar
cada vez que se emplee.
PRECAUCIONES
El reactivo es para uso diagnstico "in vitro".
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO
Soluplastin provisto: estable en refrigerador (2-10C) hasta la fecha de vencimiento indicada
en la caja.
Soluplastin reconstituido: en refrigerador (2-10C), es estable 5 das a partir del momento de
su reconstitucin.
MUESTRA
Plasma
a) Recoleccin: obtener sangre cuidadosamente (evitando estasis o trauma) y colocar en un
tubo con anticoagulante en proporcin 9 + 1 exacta (ejemplo: 4,5 ml de sangre + 0,5 ml de
anticoagulante). Si se emplea Anticoagulante TP de Wiener lab., se requerirn 7 gotas para 4,5
ml de sangre). Mezclar suavemente. Centrifugar y separar el plasma antes de los 30 minutos.
b) Aditivos: para obtener el plasma se debe emplear Anticoagulante TP de Wiener lab. o citrato
de sodio 0,130 mol/l.
c) Sustancias interferentes conocidas:
- las contaminaciones, visibles o no, son causa de tiempos falsamente prolongados;
- la presencia de heparina o EDTA invalida los resultados;
- hemlisis visibles dificultan la medicin foto-ptica de los resultados.
Referirse a la bibliografa de Young para los efectos de las drogas en el presente mtodo.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento:
el plasma debe mantenerse en el refrigerador (2-10C) hasta el momento de efectuar el ensayo.
En caso de no procesarse dentro de las 4 horas contadas desde la obtencin, la muestra se debe
congelar (a -20C); de tal forma, puede conservarse durante un mes. Este ltimo procedimiento
debe ser realizado con rapidez, al igual que el descongelamiento (sumergiendo en bao a 37C)
previo a la determinacin.
MATERIAL REQUERIDO (no provisto)

120

- Tubos de hemlisis.
- Pipetas y micropipetas para medir los volmenes indicados.
- Bao de agua a 37C.
- Cronmetro.
- Fuente luminosa para la observacin del cogulo.

PROCEDIMIENTO
1- Colocar el plasma (desconocido o control) en bao de agua a 37C durante 2-3 minutos (no
ms de 10 minutos).
2- En un tubo de hemlisis, colocar 0,2 ml de Soluplastin reconstituido y preincubar a 37 C
durante 2-3 minutos (no ms de 10 minutos).
3- Pipetear 100 ul del plasma preincubado y agregar rpidamente al tubo conteniendo 0,2 ml de
Soluplastin, disparando simultneamente el cronmetro.
4- Mantener el tubo dentro del bao y cerca de una fuente de luz. Previo al tiempo estimado de
coagulacin, sacar el tubo del bao, inclinar suavemente una o dos veces por segundo y detener
el cronmetro en el momento de la aparicin del cogulo.
5- Calcular el tiempo promedio de coagulacin de la determinacin por duplicado para cada
plasma (desconocido o control). Si la diferencia entre los replicados de una misma muestra es
mayor del 5%, se aconseja repetir el procedimiento desechando los valores anteriores. En caso
de emplear un instrumento de medicin, deben seguirse las instrucciones del fabricante del
mismo.
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
Los resultados pueden expresarse de distintas formas:
1- Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick en segundos.
2- Porcentaje de Actividad Protrombnica respecto de un plasma normal (100% de
actividad): para ello se debe trazar la curva de actividad protrombnica de un pool de plasmas
frescos normales.
Curva de calibracin
En tubos de hemlisis, preparar 5 diluciones (cada una por duplicado) de un pool de por lo
menos 3 plasmas normales o Plasma Control normal, segn:
Diluciones
Porcentaje de actividad
(%)
Pool plasmas normales
(ml)
Solucin fisiolgica

1:1
100

1:2
50

1:3
33,3

1:4
25

1:8
12,5

0,5

0,3

0,3

0,2

0,2

0,3

0,6

0,6

1,4

Determinar el Tiempo de Protrombina para cada dilucin, empleando el PROCEDIMIENTO

descripto. En un papel milimetrado, graficar los resultados en un sistema de coordenadas.
Colocar los Tiempos de Protrombina en segundos sobre el eje de las ordenadas y los Porcentajes
de Actividad Protrombnica en el eje de las abscisas. Cada laboratorio debe trazar su propia
curva de calibracin, correspondiente al lote de reactivos en uso. Repetir con cada nuevo lote de
reactivos.
3- Razn Internacional Normatizada (R.I.N.)
Para su clculo, deber emplearse la tabla de valores adjunta al equipo.
METODO DE CONTROL DE CALIDAD

121

Plasma Control normal - patolgico.

VALORES DE REFERENCIA
El rango de valores obtenidos en pacientes normales oscila entre:
- Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick: 10 - 14 seg
- Porcentaje de Actividad Protrombnica: 70 - 100%
Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios intervalos o valores de referencia.
Para pacientes bajo tratamiento con antivitaminas K se ha establecido un rango teraputico que
se puede expresar como:
- Porcentaje de Actividad Protrombnica: 25 - 35%
- R.I.N.: 2,4 - 2,5
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.
Otras causas de resultados errneos son:
- Extraccin defectuosa de sangre venosa.
- Las variaciones en la relacin anticoagulante/muestra o en la concentracin de citrato utilizada
afectan los Tiempos de Quick por lo que se recomienda controlar la dosis de anticoagulante
empleada al tomar la muestra.
- La preincubacin en el 2o paso del PROCEDIMIENTO no debe exceder los 10 minutos
indicados como lmite mximo. Por otra parte, es conveniente que el reactivo reconstituido se
retire del refrigerador inmediatamente antes de iniciar la prueba y vuelva a guardarse al
finalizarla, ya que la exposicin por varias horas a temperatura ambiente en forma reiterada,
deteriora el reactivo produciendo el alargamiento de los tiempos de protrombina.
PERFORMANCE
a) Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo da, se
obtuvieron los siguientes datos:
X (n=20
11,5 seg
21,2 seg

D.S.
+0,4 seg
+0,6 seg

C.V.
3,5%
2,8%

b) Comparacin con mtodo de referencia: procesando distintas muestras con Soluplastin y

con otro mtodo tomado como referencia, se observa:

Reactivo
Soluplastin
Referencia

X (n=60)
13,2 seg
12,8 seg

D.S.
+0,3 seg
+0,3 seg

C.V.
2,3%
2,3%

PRESENTACION
- Equipo para 100 determinaciones (10 x 2 ml) (Cd. 1705001).
- Equipo para 10 x 20 determinaciones (10 x 4 ml) (Cd. 1705005).
- Equipo para 320 determinaciones (8 x 8 ml) (Cd. 1705003).
BIBLIOGRAFIA
- Quick, A.J. - Fisiologa y Patologa de la Hemostasis - Ed. El Ateneo, Buenos Aires (1952).
- Araldi, H.T., et al. - Primer Reactivo Nacional Argentino de Referencia de Tromboplastina de
Cerebro Humano Acta Bioqum. Cln. Latinoam. XVI/1:131 (1982).
- Comit de Expertos de la O.M.S. en Patrones Biolgicos - Inf. N 28: Normalizacin de la
Vigilancia del Tratamiento Anticoagulante (oral) - Serv. Inf. Tec. N 610:49-56 (1977).

122

- Comit de Expertos de la O.M.S. en Patrones Biolgicos - Inf. N 31: Requerimientos para

Tromboplastinas y Plasmas usados en la terapia anticoagulante oral - Serv. Inf. Tc. N
658:202-223 (1981).
- Suer Casadevall, F. - Nuevas Normas Internacionales para la Expresin del Tiempo de
Quick - Anlisis Clnicos X/40:240-245 (1985).
- Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.
Wiener lab.
2000 Rosario - Argentina
Elaborado por:
Wiener Laboratorios S.A.I.C.
Riobamba 2944
2000 - Rosario - Argentina
http://www.wiener-lab.com.ar
Dir. Tc.: Viviana E. Ctola
Bioqumica
Producto Inscripto M.S.
Disp. N: 1589/89 - 255/99

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