UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

(Universidad del Per, DECANA DE AMRICA)

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

Carreras Profesionales Acreditadas Internacionalmente

CROMATOGRAFIA DE FILTRACION

El procedimiento fsico-qumico que permite la separacin de macromolculas

a travs de un tamiz molecular se denomina Cromatografa de filtracin. Para
ello es necesario considerar la forma de la molcula que se est purificando, la
cual en la mayora de las protenas es una esfera estadstica. Esto significa que
se pueden separar protenas relacionando su forma tridimensional con su peso
molecular. La malla cromatogrfica o tamiz molecular tiene poros a travs de
los que pueden pasar aquellas protenas que tengan el tamao apropiado,
otras no podrn ingresar y su elucin ser ms rpida que las que ingresaron a
la malla. El uso de solventes acuosos que ejercen presin sobre los
componentes que se estn filtrando determinar que la salida de ellas ocurra
en el siguiente orden:
En primer lugar las protenas ms grandes, luego las de tamao intermedio y
finalmente las de pequeo tamao o tambin llamadas de bajo peso molecular.
Un requisito indispensable para el empleo de esta tcnica es contar con geles
de dextrano comercialmente preparados, los cuales son insolubles pero
hidratables y que colocados en una columna de vidrio dan lugar a esta
separacin al aplicarse mezclas de dos o ms protenas.

OBJETIVOS:
1. Conocer el procedimiento para preparar una columna de filtracin.
2. Separar dos componentes utilizando el sistema.

MATERIALES:
-

Columna de vidrio ( 20 x 1,1 cm ).

Sephadex G-100
Veneno de Bothrops atrox (20 mg/ml)
Acetato de amonio 0,05M pH 6,0
30 tubos de ensayo 13 x 100 mm
Gradilla
Pipeta de vidrio 1 ml
Una pipeta descartables de 10 ml

Dos pipetas descartables tipo gotero

Papel milimetrado
Regla milimetrada
Tapones de jebe, mangueras finas y agujas descartables No. 19 y 20.
Plumn para escribir sobre vidrio.
Algodn
Organza
Calculadora

PROCEDIMIENTO:
1. Colocar en la columna de vidrio el gel de Sephadex G-100, previamente
hidratado y equilibrado con el eluente.
2. Una vez empacada la columna, colocar 0,8 ml de la muestra e iniciar la
coleccin de las fracciones en los tubos en volmenes de 1 ml.
3. Observar la coloracin de la mezcla inicial y su separacin durante la
corrida cromatogrfica.
4. Cada vez que se tenga 1 ml en el tubo cambiarlo por otro, tomando el
tiempo en que se obtuvo ese volumen. El contenido de cada tubo ser
denominado fraccin.
5. Luego de colectadas las 30 fracciones se medir la absorbancia a 280
nm.
6. Hacer los clculos cromatogrficos para cada componente separado.
7. Graficar en papel milimetrado No. Fraccin vs absorbancia a 280 nm.

PROBLEMAS:
1. Por una columna de filtracin capaz de atrapar protenas de hasta 80
000 Daltons. Se pasa una mezcla de cinco protenas: A (100 000
Daltons), B ( 50 000 Daltons), C (120 000 Daltons), D ( 10 000
Daltons) y E (35 000 Daltons). Sabiendo que las dimensiones de la
columna son 30 x 1 cm). Determine:
a) Cul es el volumen mximo de muestra que se puede aplicar?
b) Determine el nmero de picos que se obtendr y la composicin de
cada uno?
2. Una mezcla de dos protenas de 120 y 40 kDa, se pasan por una
columna de filtracin, que atrapa protenas de hasta 100 000 Daltons. En
otro experimento la misma protena se pasa por otra columna de
filtracin, que atrapa protenas de hasta 50 000 Daltons. Analice y
explique En cul de las columnas la separacin tendr mayor
resolucin?
3. Una mezcla de cuatro protenas: A (80 000), B (200 000 Daltons), C (220
000 Daltons) y D (40 000 Daltons), se pasan por una columna de

Sephadex G-75 (este gel atrapa protenas de hasta 75 000 Daltons).

Sabiendo que la columna tiene un volumen interno de 60 ml. Determine:
a) El nmero de picos y la composicin de cada uno
b) El volumen de elucin del primer pico.
4. Tres protenas de 40, 80 y 120 kDa se pasan por una columna de
filtracin, capaz de atrapar protenas de hasta 200 kDa. Sabiendo que el
Vt= 120 ml. Determine:
a) El nmero de picos y composicin de cada uno
b) El Ve del primer pico.