ADN en Medicina Legal: Problemas

Traduccon hecha en la Universidad de Alcal de Henares, Espaa

El Proyecto Biolgico > Biologia Humana > ADN en Medicina Legal

ADN en Medicina Legal:

Grupo de Problemas no 1
Problema 1: Tcnica de hibridacin de Southern
El anlisis de la "huella dactilar de ADN" se basa en la tcnica de transferencia e
hibridacin de Southern. En sta:

Gua
La huella dactilar de ADN, tambin conocida como anlisis del perfil de ADN, se basa en
el uso de la tcnica de transferencia e hibridacin de Southern para analizar regiones
polimrficas del ADN humano. Los polimorfismos se explican con mayor detalle en el
problema n 5. Las etapas experimentales empleadas en un laboratorio de medicina legal o
forense para el anlisis del perfil de ADN son las siguientes:
1. Extraccin del ADN
Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las
posibles fuentes de ADN en la escena de un delito incluyen
sangre, semen, tejido de una vctima muerta, clulas del folculo
capilar y saliva. El ADN extrado de las pruebas del delito
("indicios" o "vestigios" biolgicos) se compara con el extrado de
muestras de referencia, obtenidas de personas conocidas,
habitualmente de la sangre.
2. Digestin del ADN con una endonucleasa de restriccin
El ADN extrado de la muestra se trata con una endonucleasa de
restriccin, que es una enzima que corta el ADN dicatenario en
donde tenga una seuencia caracterstica. La enzima que se usa
ms frecuentemente para el anlisis legal es HaeIII, que corta el
ADN en la secuencia 5'-GGCC-3'.
3. Electroforesis en gel de agarosa
Tras la digestin del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se
separan segn su tamao mediante electroforesis en geles de
agarosa. Durante la electroforesis, las molculas de ADN, que
poseen carga negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al
avanzar las molculas de ADN, su velocidad de migracin se ve
reducida por la matriz del gel de agarosa. Las molculas menores
se mueven ms deprisa a travs de los poros del gel que las de
mayor tamao. Como resultado, se produce una separacin
continua de los fragmentos de ADN de acuerdo con su tamao, de
modo que los fragmentos ms pequeos avanzan la mayor
distancia con referencia al origen o punto de aplicain de la
muestra.
4. Preparacin de un ensayo de Southern ("Southern blot")
Tras la electroforesis, las molculas de ADN separadas se
desnaturalizan mientras permanecen en el gel de agarosa,
impregnando ste con una disolucin alcalina. Tras la
neutralizacin de sta, el DNA monocatenario resultante se
transfiere a la superficie de una membrana de nailon, realizando
as una copia o "calco" (la traduccin ms literal del ingls blot,
conservando este sentido, es "secante"). Este proceso de
file:///C|/Documents%20and%20Settings/MMMaaaTTTuuuSSS/Escritorio/ADN%20en%20Medicina%20Legal%20Problemas.htm[28/05/2010 4:19:04]

ADN en Medicina Legal: Problemas

desnaturalizacin y transferencia se conoce como mtodo de

Southern en recuerdo de quien lo invent, Edward Southern. Al
igual que la aplicacin de un secante a un papel con la tinta
hmeda transfiere una rplica de la imagen del papel al secante, el
"calco" del ADN en el gel a la membrana de nailon conserva la
distribucin espacial de los fragmentos de ADN conseguida en el
gel como resultado de la electroforesis.
5. Hibridacin con sonda radiactiva
Una sonda de locus nico es una molcula pequea de ADN o
ARN capaz de hibridar (es decir, de formar un dplex ADN-ADN
o ADN-ARN) con el ADN de un fragmento de restriccin
concreto en el ensayo de Southern. La formacin de la molcula
dicatenaria (dplex) depende del emparejamiento de bases
complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN
presente en el "calco". Las sondas de locus nico se marcan
habitualmente con un istopo radiactivo para facilitar su
deteccin, y se eligen para que detecten un locus gentico
polimrfico en un solo cromosoma humano. El ensayo de
Southern resultante de la etapa 4 se incuba en una disolucin que
contiene una sonda radiactiva de locus nico, bajo condiciones de
temeratura y concentracin de sales que favorezcan la hibridacin.
Tras producirse sta, se lava el exceso de sonda no unido, de
modo que la nica radiactividad que quede en la membrana de
nailon sea la asociada al ADN del locus diana.
6. Deteccin de los RFLPs mediante autorradiografa
Las posiciones de hibridacin de la sonda radiactiva sobre la
membrana del ensayo de Southern se detectan mediante
autorradiografa. En esta tcnica, la membrana de nailon se coloca,
una vez lavada, junto a una pelcula de rayos X dentro de una caja
que las asle de la luz. La pelcula registra las posiciones donde
hay desintegracin radiactiva. Tras su exposicin y el revelado
fotogrfico, el registro resultante de la hibridacin de Southern se
conoce como autorradiografa ( abreviado coloquialmente en
ingls a "autorad").
7. Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales
En un anlisis legal de DNA se suelen caracterizar polimorfismos
de ADN en varios cromosomas diferentes. Tras el revelado de una
autorradiografa para la primera sonda, se puede lavar la
radiactividad con una disolucin a elevada temperatura, que deja
el ADN en su sitio, e hibridarlo con una segunda sonda radiactiva
que se una a un locus diferente. Se repiten as las etapas 5-7,
detectando cada vez un locus diferente. El grupo de
autorradiografas de una misma transferencia de Southern se
conoce como un "perfil de ADN".
Problema 1 | Respuesta | Problema 2
El Proyecto Biolgico > Biologia Humana > ADN en Medicina Legal
El Proyecto Biolgico
University of Arizona
Tuesday, August 20, 1996
Traducido en Marzo 2004

file:///C|/Documents%20and%20Settings/MMMaaaTTTuuuSSS/Escritorio/ADN%20en%20Medicina%20Legal%20Problemas.htm[28/05/2010 4:19:04]

ADN en Medicina Legal: Problemas

Contact the Development Team

http://www.biologia.arizona.edu
All contents copyright 1996-2002. All rights reserved.

file:///C|/Documents%20and%20Settings/MMMaaaTTTuuuSSS/Escritorio/ADN%20en%20Medicina%20Legal%20Problemas.htm[28/05/2010 4:19:04]