Estudio funcional de los genes de un organismo dado es un paso esencial hacia la

caracterizacin biolgica. Esto es generalmente realizado por la alteracin gnica

utilizando procedimientos diseados a modificar o eliminar genes especficos o de
introducir mutaciones aleatorias en el genoma de la bacteria estudiada (8, 20 , 24 ,
30 ) . Muchas de estas estrategias se basan en la integracin de un fragmento
exgeno de ADN, tal como un marcador antibitico o un transposn ,
aprovechando los procesos implicados en transferencia horizontal de genes
natural, tales como la transformacin , fago transduccin, o conjugacin bacteriana
( 37 ) .
Una de las metodologas ms populares para realizar imparcial pantallas
genticos es el anlisis de las consecuencias fenotpicas de la insercin aleatoria
de elementos transposn. Mientras mutagnesis de transposn ahora se puede
lograr utilizando parcial o total de en los procedimientos in vitro, el mtodo de
eleccin por lo general implica transferencia por conjugacin eficaz de una cepa
donante a la meta cepa receptora de un vector suicida condicionalmente
replicativo maquinaria de entrega transposn de transporte ( 19-21). Una vez en el
clula receptora, el vector no puede replicarse, lo que permite la posterior
seleccin de un transposn insercin aleatoria en el bacteriana genoma.
Replicantes condicionalmente plsmidos de la familia R6K ( incx ) se utilizan muy
a menudo para entregar elementos de genes de inactivacin en bacterias
entricas ( 11 , 28 , 38 ). La replicacin de estos plsmidos requiere la protena pircodificado, que se proporciona generalmente en trans en la cepa donante. En
ausencia de en el receptor cepa, estos plsmidos no pueden replicar. Por lo tanto,
estos " suicidio " Los vectores se pierden rpidamente, pero permiten la
integracin de los pasajeros ADN exgeno llevar marcadores de seleccin a travs
la transposicin o la recombinacin homloga en los cromosomas de cepas
receptoras. Aunque la entrega de estos condicional plsmidos replicativos pueden
lograrse a travs de la transformacin, este es un procedimiento altamente
ineficaz, incluso en bacterias transformables. Los derivados comunes de estos
plsmidos que llevan el origen de transferencia oriT de la amplia gama de acogida
-por lo tanto, conjugativa plsmido RP4 (RIPC) se construyeron (45) . Estos
plsmidos se pueden movilizar y transferir entre Gram-negativos e incluso algunas
bacterias Gram- positivas, siempre que la maquinaria de entrega RP4 se expresa
en trans a partir de un plsmido o de genes cromosmicos insertada (17, 40 ) .
A principios de la dcada de 1980 , Phler y colaboradores disearon dos
Escherichia coli cepas donantes especializada , SM- 10 y S17-1 , que permiten la
movilizacin de oriT que contienen plsmidos a una amplia gama de cepas
destinatario a travs conjugativa RP4 dependiente de transferencia ( Fig. 1 ) ( 40
) . Ms tarde, se introdujo profago pir en ambas cepas para habilitar la replicacin

dependiente de vectores de suicidio (14, 28 ) . Estas dos cepas llevan, en

procedimientos genticos differen llevado a la creacin de SM10 pir , que es
resistente a la kanamicina , y S17-1 pir , que es sensible a la kanamicina y
resistente a la estreptomicina / trimetoprim (Fig. 1 ) . Estas cepas han sido ya
ampliamente utilizado para los anlisis genticos realizados por mutagnesis
aleatoria o intercambio allico en E. coli ( 4 ,23 , 29 , 38 ) , y muchas otras
bacterias: Salmonella enterica serovar Typhimurium ( 25 , 27 ) , Sinorhizobium
meliloti ( 33 ) , Pseudomonas fluorescens ( 52 ) , Erwinia carotovora ( 32 ) , Vibrio
cholerae ( 28 ) , y muchos ms .
Aunque generalmente ignorado , se ha informado de que la oriT situado dentro de
la regin RP4-2 - Tc :: Mu puede promover transferencia conjugativo hfr de genes
cromosmicos , incluyendo transponible elementos nativos de la cepa donante de
E. coli ( 3 , 40 , 41 ). Mientras que las mutaciones de la regin nic oriT de RP4-2 Tc :: Mu prevenir la movilizacin de la RP4 integrado ( 3 ), hay se informa tambin
mencionar que muestran fenotipos por transconjugantes obtenidos utilizando pir
S17-1 o SM10 pir eran ya sea inestable o no vinculados al evento de insercin , lo
que sugiere que tambin podran haber ocurrido eventos mutacionales
secundarias (referencias 3 , 26, y 38 y nuestras propias observaciones ).
Aqu, mostramos que el bacterifago Mu procedente de la RP4-2-Tc :: Mu
presente derivado en S17-1? Pir y SM10? Pir los cromosomas pueden transferirse
a cepas receptoras de E. coli a muy alta frecuencia de forma concomitante con
bona fide transposn mutagnesis.
Esta insercin en silencio Mu Mu en las cepas sensibles, por lo tanto, conduce a
un procedimiento de doble mutagnesis y podra estar en el origen de algunas
inconsistencias reportado en gentica pantallas realizan a travs de RP4 mediada
por transposn mutagnesis utilizando pir S17-1? o cepas SM10? pir. Para sortear
este problema, se construy una nueva cepa donante Mu-libre de E. coli, FDPIR
(por donante Mu-libre), que simplificar el anlisis de futuras caceras mutantes
realizados en E. coli y otros Mu-sensible Bacteria husped RP4.
Figura. 1. Historia de la construccin de S17-1? Pir (pSC189) y SM10? pir
(pSC189) cepas de donantes para la mutagnesis aleatoria basado en transposn
utilizando el plsmido suicida R6K pSC189. El plsmido RP4-2-Tc :: Mu lleva
codificacin loci para maquinaria Conjugacin RP4 (Tra1, Tra2, y TRA3), un
marcador de resistencia a tetraciclina interrumpido por Mu (Tc :: Mu), y los
elementos genticos que codifican para resistencia a la kanamicina (Kmr).
Integracin RP4-2-Tc :: Mu en el cromosoma de E. coli fue aislado despus de la
cotransformacin con el plsmido mini-RP4 incompatible pSR120 y seleccin de
clones que muestran tanto la kanamicina y tetraciclina resistencia (paso 1). Los

clones obtenidos se curaron de pSR120, lo que lleva a SM10 (cepa parental, S4920 Kmr) o S17-1 (los padres cepa, E. coli 294 SMR Tpr, tras la inactivacin de la
RP4- gen asociado a la kanamicina resistencia mediante la insercin Tn7), que
contienen la RP4-2-Tc integrado :: plsmido Mu (ChRP4), como se describe
anteriormente (paso 2) (40). Por simplicidad, slo una nica representacin se
presenta para las cepas SM10 y S17-1. Por ltimo, el? -encoding Pir gen era
introducido en el? El sitio (paso 3), y las cepas se transformaron con el vector
pSC189 suicidio, que lleva un transposn basado en mariner (Tn) y su
transposasa C9 (transposasa) y alberga la RP4-dependiente origen de la
conjugacin, oriT, para la movilizacin y la? dependiente origen de replicacin,
oriR6K (paso 4) (11, 14, 28).

RESULTADOS
La evidencia de bacterifago Mu transferencia entre el donante y cepas
receptoras durante la mutagnesis de transposn usando E. coli S17-1? Pir o
SM10? Pir. Pantallas genticas bacterianas a menudo implican
La movilizacin de RP4 mediada por vectores suicidas pir-dependiente que
entregan los transposones en los genomas de receptor-pir menos cepas, en el que
no se pueden replicar. durante el curso de un anlisis gentico, que utiliza el bien
conocido cepa donante E. coli S17-1? pir (pSC189) para entregar una TNSC 189
resistente a la kanamicina transposn mariner a base de en E. coli MG1655? Lac
(11). Curiosamente, caracterizamos un transconjugante con un transposn
insertado en una regin correspondiente de ADN del bacterifago Mu.
Considerando la ausencia de Mu en la cepa receptora original y la presencia, por
construccin, de un derivado de Mu integrado en E. coli S17-1? pir (RP4-2-Tc ::
Mu) (vase la introduccin) (Fig. 1), se investig el potencial de transferencia
silenciosa de Mu de E. coli S17-1? pir en las clulas receptoras. Hemos
examinado ms de 100 transconjugantes por PCR utilizando cebadores
especficos para el gen de transposasa Mu A, y que de hecho encontr que,
adems de TnSC189 transposn insercin, el 63%? 13% de ellos tambin llev
bacterifago Mu ADN en sus cromosomas (Tabla 3). Por otra parte, un alto
frecuencia de Mu (61%? 17%) tambin se observ en destinatario clulas cuando
se llev a cabo la conjugacin utilizando un plsmido libre-S17-1? Pir, lo que
sugiere que la transferencia de Mu es independiente de la entrega bona fide
transposn (Tabla 3). El uso de la cepa alternativa? pir SM10 tambin condujo a la
transferencia frecuente de Mu en E. coli destinatarios, lo que demuestra que el
populares donante cepas? pir de E. coli S17-1 y SM10? pir son las fuentes de
contaminacin muy significativo por bacterifago Mu (Tabla 3).

La liberacin de partculas de fago Mu en E. coli? Pir S17-1 y SM10?

Sobrenadantes de cultivo pir. La presencia de una Insercin RP4-2-Tc :: Mu en el
genoma de E. coli S17-1? Pir o SM10? pir califica estas dos cepas como Mu
lisgenos que debe liberan espontneamente Mu a una frecuencia de 10? 4
bacterias (47). Con el fin de comprobar la presencia de la libre fago Mu partculas
en E. coli? pir S17-1 y SM10? sobrenadantes de cultivo pir, vimos una gota de
sobrenadante esterilizada por filtracin en un...csped de Mu-sensible MG1655?
lac o Mu-resistente MG1655? lac ya que lleva un bacterifago Mu. La incubacin a
37 C placas de lisis confluentes reveladas en el caso de la Mu-sensible
MG1655? Cepa lac slo, lo que confirma que la lisis era Mu dependiente y que las
partculas de Mu fueron puestos en libertad por el donante las cepas en el medio
(Fig. 2 y datos no mostrados). Consistentemente, la adicin de filtro esterilizado
S17-1? sobrenadante pir en un cultivo lquido en fase exponencial de MG1655?
lac llev a la lisis celular, tal como se comprueba por una disminucin en la cultura
turbidez (datos no se muestra). Anlisis de PCR de las bacterias supervivientes
despus de que se sembraron en placas de agar LB que mostr que el 22% de
ellos tena adquirido un profago Mu.
Figura. 2. Mu partculas se liberan en el sobrenadante de S17-1 y S17-1? Pir
culturas. Se observ lisis confluente cuando una gota de sobrenadante esterilizada
por filtracin de S17-1 o S17-1? cultura pir fue vista en un csped de crecimiento
MG1655? clulas lac (Mu?). En contraste, no hay (S17-1 sobrenadante) o muy
pocos (? Sobrenadante pir S17-1) aparecieron placas cuando los mismos
sobrenadantes fueron vistos en un csped de un Mu derivado lisognico (Mu?), lo
que confirma que la lisis es Mu dependiente y que las partculas Mu estn
presentes en el sobrenadante. Mu-independiente lisis observ utilizando S17-1?
sobrenadante pir probablemente resulta de la liberacin de? partculas de fago en
el medio.
Asignacin de inserciones RP4-2-Tc :: Mu en? Pir de E. coli S17-1 y SM10? Pir. Se
construyeron pir E. coli S17-1? Pir y SM10? a principios de 1980, pero la ubicacin
y el mecanismo de RP4-2-Tc :: Mu insercin en el cromosoma de E. coli han sido
mal descrito (40). Por lo tanto, mapeado la ubicacin de la insercin de Mu en E.
coli? pir S17-1 por PCR cebada aleatoriamente usando cebadores especficos
para las extremidades izquierda y derecha de la Secuencia de Mu, y se determin
que dos potencialmente funcional copias de Mu flanqueadas el replicn RP4
integrado insertado en MHPC en la posicin 371203 del cromosoma de E. coli,
cerca del gen lacZ (posicin 365.529) (Fig. 3A). Los dos copias de Mu estn en la
misma orientacin, lo que indica que la integracin de RP4-2-Tc :: Mu en el E. coli
original de 294 fondo surge de un mecanismo de fusin replicn impulsado-Mu
(47). A medida que la integracin de RP4-2-Tc :: Mu se produjo de forma

independiente en las dos cepas donantes (vase la introduccin), tambin

determinaron que las dos copias de Mu que flanquean la regin RP4 en SM10? pir
estaban en la posicin 3859682 en el cromosoma en el gen glvB (83 minutos).
Esta ubicacin es consistente con evidencia gentica proporcionada en 1983 por
Simon et al., que asigna el sitio de integracin RP4-2-Tc :: Mu en SM10? pir al lado
de la marcador de metionina en la regin arg ilv reunido (89 minutos) (40).
Figura. 3. Mapa gentico de inserciones Mu en E. coli S17-1? Pir. (A) Estructura
de la regin de insercin RP4-2-Tc :: Mu en E. coli S17-1? Mostrando pir la regin
lacZ y el plsmido RP4 oriT ncleo portador flanqueado por las dos copias del
bacterifago Mu, Mu1 y MU2, en la misma orientacin. (B) Anlisis PCR de la
unin entre Mu y lacZ en S17-1? Pir, MG1655? Lac, y una Lac azar?
transconjugantes obtenido por conjugacin entre estas cepas, utilizando
cebadores ATG lacZ? 100-3 y MuL.100-3. La regin amplificada usando estos
cebadores se muestra en el panel A.
Tambin se determin que una copia adicional del profago Mu estaba situado
fuera de la regin RP4-2-Tc :: Mu en SM10 ? pir, en la posicin 2450790 (minuto
53) en el gen yfcU. Evidencia para la transferencia de Mu HFR en las clulas
receptoras. Tomamos ventaja de la insercin de RP4-2-Tc :: Mu en la vecindad de
lacZ en el cromosoma de S17-1? pir para evaluar la posibilidad de transferencia
de RP4-2-Tc :: Mu flanqueando las regiones en MG1655? Lac (a? Cepa Lac) por
transferencia HFR (35, 40, 50).
Como se muestra en la Tabla 3, una gran proporcin de MG1655 ?
transconjugados lac obtuvieron con S17-1? pir o S17-1 ? pir (pSC189) como
cepas donantes y chapada en-Gal-X que contiene placas de agar muestran una
Lac? fenotipo (colonias azules). Uso cebadores que se hibridan en la regin lacIZ
inicialmente ausente de MG1655? Lac, se amplific un producto correspondiente a
la regin lacIZ de tipo salvaje en todos los transconjugantes azules probados, lo
que indica que este Lac? fenotipo resultante de la insercin de una regin lacIZ
funcional (datos no mostrados). Adems, el uso de cebadores que se hibridan en
la extremidad izquierda de Mu mostr que esta regin lacIZ funcional estaba
genticamente vinculado a Mu (Fig. 3B). Finalmente, conjugaciones realizaron en
MG1655-s? Lac usando una cepa donante que lleva una mutacin en un sitio nic
RP4 oriT que deteriora la transferencia de ADN cromosmico,? 7249 (pSC189CM), no produjo ningn transconjugantes con una Lac? fenotipo (3). Estos
resultados confirmaron que cotransfer HFR-mediada de Mu y la regin lac
adyacente es un evento frecuente cuando S17-1 ? se utiliza pir. En contraste, los
transconjugantes que muestra una Lac? fenotipo nunca se observaron cuando E.
coli? pir SM10 era utilizado como cepa donante, que es coherente con la RP4-2-Tc
:: Mu posicin de insercin en la cepa (minuto 83), distante del gen lacZ (8

minutos). Curiosamente, Conjugacin utilizando la cepa de hfr defectuoso? 7249

(pSC189-Cm) todava producido una alta frecuencia de Mu-llevar trans
conjugantes (93%? 3%). Por tanto, estos datos sugieren que de novo la infeccin
a travs de las partculas de fago Mu liberados por las cepas donantes S17-1? Pir
y SM10? Pir puede ocurrir de forma concomitante con conjugativo transferencia de
plsmidos de entrega transposn y no exclusivamente por transferencia HFR (Fig.
4).
Figura. 4. De novo infeccin por Mu durante los resultados de conjugacin en un
segundo evento de mutacin en la cepa receptora. (Paso 1) Durante la
conjugacin, pSC189 se transfiere a la clula receptora utilizando las funciones de
movilizacin y la conjugacin del plsmido RP4 integrado en los cromosomas de
cepas donantes S17-1? pir y SM10? pir (RP4). (Paso 2) Una vez en la celda, el
transposn llevado-pSC189 (caja gris) se integra en el cromosoma, alterando la
expresin de un gen y su funcin asociada. (Paso 3) Paralelamente, el profago Mu
asociada a ChRP4 (tringulo) es inducida espontneamente en una subpoblacin
de clulas del donante. Partculas Mu (hexgonos de cola) se liberan en el medio
ambiente e infectan el clulas receptoras, lo que lleva, en algunos casos, a un
segundo evento mutagnico por lisogenizacin (2).
La eliminacin dirigida al sitio de Mu de RP4-2-Tc :: Mu-que contiene cepas
donantes conduce a la entrega Mu-libre de transposones a receptor cepas. La
presencia de Mu prophages en las cepas donantes resultados en los eventos de
insercin markerless indeseables en destinatario cepas que interfieren con el
anlisis de los resultados de mutagnesis. Para tratar de inhibir la infeccin de
bacterias Mu receptores, se realiz apareamiento en presencia de citrato de sodio
10 mM, pero todava observamos altas frecuencias de transferencias Mu en este
caso (alrededor del 30% de los transconjugantes) (Tabla 3). Por lo tanto, a eludir el
problema, decidimos construir un nuevo Mufree cepa. Elegimos el derivado
SM10? 7249 como plantilla para tomar ventaja de la mutacin? nic35 introducido
en el RP4-2-Tc :: locus Mu oriT, lo que impide la transferencia de cromosmica
ADN por HFR (3). El anlisis de la regin de RP4 ? Pir SM10 revel que la
integracin de RP4-2-Tc :: Mu en el cromosoma condujo a la duplicacin de Mu,
con cada copia (denominan Mu1 y MU2, respectivamente) que flanquean el ncleo
RP4 plsmido (Fig. 5). Con el fin de eliminar Mu partir de esta cepa, se
reemplazado Mu1 y MU2 con elementos genticos que confiere apramicina y la
resistencia a zeocina, respectivamente (Fig. 5, paso 1). este procedimiento
tambin nos permiti eliminar los restos de la TETRA regin que originalmente
haba sido interrumpida por Mu en RP4-2-Tc :: Mu (Fig. 5, el paso 1). A
continuacin, la transduced RP4 ? Mu regin de? 7249? Mu1 :: apra? MU2 :: Zeo
en MG1655, y se verific que la cepa resultante no contena ninguna otra copia de

Mu (Fig. 5, paso 2). Para reducir el nmero de marcadores de resistencia a

antibiticos y para hacer compatible la cepa con la mayora de vectores de
suministro disponibles, la resistencia a la kanamicina
Figura. 5. Construccin de una nueva cepa donante, FDPIR (vase el texto para
ms detalles). La introduccin de RP4-2-Tc :: Mu en el cromosoma de SM10 y la
de su derivado,? 7249, se produjeron en glvB. Esto dio lugar a la duplicacin de
Mu, con cada copia (Mu1 y MU2) flanqueando el ncleo y RP4 presentan la misma
orientacin. Las dos copias Mu1 y MU2, junto con los restos de la regin de
resistencia a la tetraciclina interrumpida (tetA-R y tetA ), Fueron retirados y
reemplazados por casetes que proporcionan resistencia a apramicina (APRA) y
zeocina (zeo), respectivamente. Despus de la transduccin de la regin RP4-Mu
libre en MG1655, el gen de resistencia a kanamicina aphA fue reemplazado por un
casete cat-FRT; la resistencia a cloranfenicol gen, gato, se escindi posteriormente
usando la recombinasa Flp. Entonces, el? -encoding Datos :: pir locus 116-erm se
introdujo en la cepa. La reca gen fue finalmente sustituido por un casete de kanFRT, y el gen de resistencia a la kanamicina, kan, se elimin con Flp, dando a la
nueva cepa donante, FDPIR.
Se suprimi el gen llevado por el RP4? regin de Mu y reemplazado por un gato
de resistencia a cloranfenicol-FRT escindible casete que se elimin posteriormente
mediante Flp recombinasa (Fig. 5, los pasos 3 y 4) (10). A continuacin,
presentamos el locus pir dapA :: pir-erm de? 7249 y una mutacin recA :: kanFRT? para reducir la eficiencia de una recombinacin homloga interna (Fig. 5, los
pasos 5 y 6). Por ltimo, la resistencia a la kanamicina marcador se elimin
usando la recombinasa Flp para producir la nueva cepa donante Mu-libre, MFDpir
(Fig. 5, el paso 7).
Con el fin de demostrar que la regin de RP4 MFDpir era todava funcional,
introdujimos la? -dependiente pSC189-Cm plsmido conjugativo y realiz el
apareamiento con el destinatario cepa, MG1655-s? lac. La frecuencia de los
transconjugantes que lleva el transposn TnSC189-Cm (CMR) fue similar a la el
observado utilizando la cepa parental,? 7.249, lo que sugiere que las alteraciones
que hicimos en la regin RP4 no afectaron la proceso de conjugacin (Tabla 3).
Mientras que la frecuencia transconjugante usando MFDpir es ligeramente menor
que la observada con SM10 ? pir o S17-1? pir, es similar a la frecuencia
transconjugante obtenida con la cepa parental nic?,? 7249 (3).
Los transconjugantes ensayados eran todos Lac? y desprovisto de cualquier
Secuencia de Mu, como se muestra por PCR, confirmando la ausencia de Mu o
transferencia lac cuando se utiliz la nueva cepa donante Mu-libre (Tabla 3).

En conjunto, estos resultados indican que el nuevo donante MFDpir cepa es una
alternativa eficaz a la utilizacin de S17-1? pir y SM10? Pir donantes y se puede
utilizar para introducir exgeno ADN en una cepa diana, evitando as los efectos
secundarios indeseables resultante de la presencia de Mu en donantes
disponibles actualmente derivado de la pir originales S17-1? y cepas SM10? pir.

DISCUSIN

A pesar de, o debido a-la abundancia de la informacin proporcionada por la

secuenciacin del genoma y posterior gen microarray anlisis de expresin, las
funciones de una gran fraccin de identificado genes bacterianos se desconocen o
no han sido experimentalmente validado, incluso en organismos modelo bien
estudiados tales como E. coli (22). La mayora de los estudios de la funcin gnica
se basan en la investigacin directa bacteriana-gen de funcin a travs de la
creacin de mutantes.
Mientras diferente mutagnesis dirigida al sitio basada en PCR estrategias fueron
desarrolladas en la ltima dcada para facilitar dicha anlisis pantallas genticos
aleatorios, dirigidos a la identificacin de la gentica base de fenotipos expresa
bajo crecimiento diferente condiciones o ambientes siguen siendo un enfoque muy
fructfero (4, 23, 26, 32, 38, 39). En muchas bacterias, mutagnesis aleatoria es
realizado a travs de la introduccin de transposones que llevan antibitico
marcadores de resistencia en el cromosoma de la meta cepa (20). La introduccin
del elemento de inactivacin por Conjugacin de un vector suicida, por lo tanto
sigue siendo el mtodo de eleccin para realizar barato, amplio y relativamente
imparcial pantallas genmicas.
La integracin de las funciones de movilizacin de RP4 en E. coli cepas S17-1 y
SM10 por Pulher y colaboradores fue originalmente diseado para permitir la
transferencia por conjugacin de extranjera genes en no-E. bacterias coli Gramnegativos incluidos en el RP4 gama de acogida, tales como Rhizobiaceae (40).
Aunque estado de la tcnica en el momento, sino que tambin permiti la
introduccin accidental de un profago funcional Mu en estas cepas y su
respectiva ? pir derivados, que desde entonces han sido ampliamente utilizados
para transferencia de conjugacin de ADN exgeno, incluyendo el suicidio
vectores de transposn que lleva, a un gran nmero de bacterias especies (E. coli
[4, 23, 29], Klebsiella pneumoniae [7], Edwardsiella ictaluri [46], Rhizobium meliloti
[33], Vibrio cholerae [28], y Erwinia carotovora [32]). En algunos casos, se inform
que los mutantes de transposn transconjugante obtuvieron utilizando S17-1 y

cepas donantes SM10 no mostraron la espera gentica vinculacin entre el

fenotipo seleccionados y eventos de insercin o inestabilidad en transconjugantes
fenotipo, pero las razones de estas inconsistencias no fueron investigados (26,
38). en este estudio, mostramos que tanto E. coli? pir S17-1 y SM10? pir cepas
donantes transfieren bacterifago Mu a altas frecuencias en receptor clulas de E.
coli por tanto HFR y la infeccin de novo.
Nuestros datos demuestran que, en particular, Mu traslado al clula receptora
puede ser independiente del proceso conjugativo y principalmente el resultado de
la infeccin por partculas de fago Mu liberados en el medio de cultivo por E. coli?
pir S17-1 y SM10 ? cepas donantes pir. Desde que se observ transferencia Mu
usando S17-1 ? pir, SM10? pir, y? 7249 que viene de muchos independientes
(fuentes diferentes colecciones de laboratorio), esto sugiere que los Mu la
contaminacin no es especfico de nuestra propia coleccin de cepas, pero ms
bien es una caracterstica intrnseca de la? pir originales y S17-1 SM10? Pir. Por
otra parte, adems de las condiciones usadas para realizar la conjugacin, se
seleccionaron al azar otros dos de apareamiento procedimientos en la literatura
(38, 40). A pesar de las diferencias fuertes entre estos procedimientos con
respecto a la duracin de apareamiento (2 h o 24 h), medios (LB o RMGC), y las
condiciones de crecimiento (en las placas o en caldo), se observ una alta
frecuencia de transferencia de Mu los transconjugantes en cada caso (datos no
presentados), lo que sugiere que? pir mediada por la contaminacin Mu S17-1?
PIR- y SM10 se produce de manera eficiente cuando se utilizan protocolos de
conjugacin clsicos.
Por lo tanto, especular que muchas inconsistencias observadas durante S17-1?
PIR- y SM10? pantallas basadas pir-realizan en Mu-bacterias sensibles podran
resultar de infecciosas y silencioso transferencia de Mu desde el donante hasta
cepas receptoras, adems de la insercin del transposn se esperaba. Este
segundo mutagnico evento es de hecho que pueda afectar el resultado de
muchos sitedirected experimentos de mutagnesis y para complicar correcta
asignacin de la funcin de genes. Por otra parte, Mu se conoce para replicar por
transposicin, que induce reordenamientos de ADN posteriores y por lo tanto
contribuye a la inestabilidad gentica y altamente fenotipos variables (47). Sin
embargo, a pesar de estas deficiencias y a lo mejor de nuestro conocimiento,
infeccin de otros cepas receptoras por bacterifago Mu en la mutagnesis de
transposn
No se ha reportado experimentos. Esto puede ser debido a el hecho de que no
todas las cepas potenciales receptores muestran igual sensibilidad a la infeccin
Mu. Partculas de fago Mu de hecho infectan sus clulas diana mediante la unin a
la terminal Glc? 1-2Glc? 1 o MGlcNAc? 1-2Glc? 1 residuos de oligosacridos en

el lipopolisacrido (LPS) de extremo exterior (36). Como consecuencia, Muresistente

Se espera que las cepas a ser menos afectado o no afectado por la evento de
doble mutagnesis se producen durante la conjugacin. en efecto, no se observ
ninguna transferencia de Mu de la S17-1 ? donante pir a uropatgena E. coli cepa
CFT073, que lleva el tipo de ncleo de LPS y R1 no es reconocido por Mu, cuando
la realizacin de apareamiento entre estas dos cepas (datos no presentados).
El rea de distribucin natural de acogida Mu es bastante limitado, pero incluye
muchos bacterias patgenas, tales como Salmonella enterica subsp. arizonae,
Shigella dysenteriae (43), Citrobacter freundii (13), y Erwinia chrysanthemi (49), y
cepas clnicas de E. coli que albergar el tipo de ncleo de LPS Mu-sensible R2 (1,
18, 36). mientras transferencia de Mu durante la conjugacin mutagnico puede
revelar algunos fenotipos que slo pueden observarse con dos independientes
mutaciones, sigue siendo una barrera importante para el correcto gentica
caracterizacin de estos organismos, algunos de los cuales son siendo utilizado
como modelo bacterias. Adems, mientras que las inserciones de Mu se limitan a
bacterias Mu-sensibles, esto an representa un nmero significativo de cepas,
teniendo en cuenta todo natural aislados de cada especie ahora estudiados para
explorar la biodiversidad bacteriana (34, 44, 48). Finalmente, cepas receptoras
Mu-resistentes son no es absolutamente protegido de la contaminacin Mu, ya
que Mu
Tambin puede entrar en la clula a travs de HFR. Esto puede perjudicar
seriamente el desarrollo resultado de mutagnesis realiz en cepas resistentes, ya
Mu ha sido reportado para desarrollar en muchas bacterias, adems de E. coli
(Enterobacteriaceae, Rhizobiaceae, Pseudomonas, y otras especies Gramnegativa), donde se puede generar progenie y reordenamientos cromosmicos
(51).
Mientras que los mtodos alternativos han sido desarrollados sobre la base de
triparental de apareamiento en vivo o en vitro de insercin de la transposicin
complejos en la cepa diana mediante electroporacin (19, 21, 41), estos mtodos
son costosos o requieren combinaciones adecuadas de los marcadores de
deformacin y el plsmido para permitir la seleccin de la adecuada eventos de
insercin. Para evitar los problemas causados por la secundaria
Insercin de Mu, se construy una nueva cepa donante, MFDpir, que combina
tanto las mejoras introducidas recientemente por Babic y compaeros de trabajo
en la prevencin de la transferencia de cromosmica ADN por un mecanismo y el
HFR RP4 mediada ausencia de cualquier profago Mu que podra contaminar el

destinatario las clulas (3). Esta nueva cepa de donantes sigue siendo tan activo
como el anterior pir S17-1? y SM10? cepas pir en la promocin mutagnico
Conjugacin y deja abierta la posibilidad de utilizar transposones que llevan
muchos marcadores de resistencia diferentes. Adicionalmente, su incapacidad
para crecer en ausencia de DAP facilita de contra de la cepa donante despus de
la conjugacin. el uso de esta nueva cepa MFDpir debera permitir ms sencillo
anlisis de transconjugantes producidos por el futuro transposn mutagnesis en
E. coli y otras bacterias husped RP4.