Aspectos Bioqumicos da Biossntese de Pigmentos

Carotenides em Gonyaulax polyedra (DinophyceaeY'.

/f

HELOSA CANDIA HOLLNAGEL

Tese de Doutorado submetida ao Instituto de Qumica da
Universidade de So Paulo como parte dos requisitos necessrios obteno do grau
de Doutor em Cincias - rea: Bioqumica.

Aprovada por:

OLONETO

RIO JOSE POLITI

IQ - USP

Profa. Dra. MARIA TE ESA MACHINI DE MIRANDA

IQ- USP

Dr. ROLF ROLAND WEBER

10 - USP

Prof. Dr. EDISON Jos DE PAULA

IB - USP

SO PAULO
04 DE AGOSTO DE 2000.

"We see in nature not words,

but rather only the first letters of words,
and if we then wish to read, we discover
that the new so-called words
are again merely first letters of others".
GEORG CHRISTOPH UCHTENBERG

Dedico este trabalho Erika e ao Christian,

pois no fcil ter uma me cientista.

AGRADECIMENTOS

Ao Departamento de Bioqumica do Instituto de Qumica do Instituto de

Qumica da USP pelas excelentes condies de trabalho;
Ao Prof. Pio Colepicolo Neto pela orientao, amizade e apoio em todos
os momentos do meu doutorado;

Coordenadoria de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior

(CAPES) pelo suporte financeiro;
Ao Prof. Paolo Di Mascio pelas crticas e sugestes;
Ao Prof. Dr. David Morse, da Universidade de Montreal pela colaborao
cientfica;

A Prof.

Dra. Marie Anne Van Sluys, do Instituto de Biocincias pelo DNA

Total de Arabidopsis thaliana;
Aos amigos e colegas Alcely Strutz Barroso, Claudia Gadini Stingher,
Daniela Sankiewicz, Ednalson Pereira de Carvalho, Ernani Pinto Jr., Euclides
Matheucci Jr., Masa Pereira Lima Brigago, Marcelo Paes de Barros, Mariana
Cabral de Oliveira, Oswaldo Keith Okamoto, Patricia de Ftima Lopes, Sandra
Regina de Souza, Thereza Cristina Kutner, Valdemir Melechco Carvalho e
Wilton Jos Rocha Lima pela ajuda e companheirismo decisivos para
realizao deste trabalho;

Cristina Hernandez Ros, Cynthia Sayuri Bando e Viviane Ferreira

Campos Bando pelos momentos inesquecveis;

A amiga Cristina Sayuri Asano por uma dcada de amizade incondicional;

A Lindinalva Pereira de Carvalho, pelas horas extras;
minha famlia, especialmente meus pais Ennio e Susana, pela
dedicao;
Ao Mario, meu marido, por ser aquele que me completa.

ABREVIATURAS
AbPCP: anticorpo policlonal contra PCP
AbRull: anticorpo policlonal contra RuBisCo forma 11
AOP/ATP: adenosina bisfosfatol trifosfato
bp: pares de bases
BSA: albumina srica bovina
C: C Aten: claro constante atenuado em 30%
C: C: claro constante
C: E: claro:escuro
cab: "chlorophyllalb binding protein"
ccg: "clock-controlled genes"
CCTR: "circadian-controlled translational regulator"
cl: clulas
CRE; "clock responsive element"
CT: "circadian time" -tempo circadiano
CTAB: hexadecil trimetil brometo de amnio
OOT: ditiotreitol
OEPC: dietil pirocarbonato
EOTA: cido etilenodiaminotetraactico
EGTA: cido etilenoglicol bis (p- ter aminometlico) N,N,N',N'-tetractico
EROs: espcie reativa de oxignio
FRQ: "frequency" - protena ligada ao relgio biolgico caracterizada em Neurospora
GAPOH: enzima gliceraldedo-3-fosfato dehidrogenase
GIT: isotiocianato de guanidina
h: hora
HPLC: cromatografia lquida de alta performance
IgG: imunoglobulina G
Kb: Kilo bases
KOa: Kilo Oaltons
LB: meio de cultura Luria-Broth
LBP: "Iuciferin binding protein"
LHC: "Iight-harvesting complex protein"
LRE: "Iight responsive element"
min: minutos
MOPS: 3-(N-morfolino) cido propano-sulfnico
NR: enzima nitrato redutase
NSQ: ncleo supraquiasmtico
02Cdg): oxignio singlete
ORF: "Open Reading Frame"
PAGE: eletroforese em gel de poliacrilamida
PBS: tampo fosfato salino
PCP: complexo peridinina-clorofila a-protena
PCR: "polymerase chain reaction"
PER: "period"- protena ligada ao relgio biolgico caracterizada em Drosophila
PIPES: piperazina- N,N'bis(2 etano cido sulfnico)
PSI: fotossistema I
PSII: fotossistema 11
psy. (gene! enzima) fitoeno sintase
PVOF: difluoreto de polivinilidina
PVP: polivinil pirrolidona
RNAm: cido ribonuclico mensageiro
Ru 11: enzima ribulose- 1,5 -bifosfato carboxilaseloxigenase forma 11
RuBisCo: enzima ribulose- 1,5 -bifosfato carboxilase/oxigenase
RuBP: ribulose-1,5-bifosfato
SOS: dodecil sulfato de sodio
SOS-PAGE: eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
SOO: enzima superxido dismutase

TBE: tampo Tris-borato-EDTA

TBS-T: tampo salino Tris-Tween
TE: tampo Tris-EDTA
TEMED: N, N, N',N'-tetrametil-etilenodiamina
TIM; "timeless"- protena ligada ao relgio biolgico caracterizada em Drosophila
Tris: tris(hidroxi metil) amino metano
TWEEN: monolaurato polioxietilenosorbitan
UV: luz ultravioleta
wc-: "white collar"- mutante incolor de Neurospora crassa

NDICE
1. INTRODUO
1.1 Ritmos Biolgicos

12

1.2 A Alga Marinha Unicelular Gonyaulax polyedra

20

1.3 Espcies Reativas de Oxignio e os Antioxidantes

31

1.4 Biossntese de Carotenides

39

1.5 Influncia da Luz e o Papel dos Fotorreceptores

45

1.6 Fotossntese

46

2. OBJETIVOS ESPECFICOS DA TESE

51

3. MATERIAL E MTODOS
Reagentes

52

3.1 Cultivo de Gonyaulax polyedra

54

3.1.1 Variao Circadiana de Pigmentos, RuBisCo II e PCP

55

3.1.2 Diferentes Irradiaes

56

3.1.3 Induo da Sintese de Pigmentos em Clulas do Escuro

58

3.1.4 Induo formao de Cistos

59

3.2 Anlise por HPLC

3.2.1 Extrao de Pigmentos Totais

59

3.2.2 Condies Cromatogrficas

60

3.3 Supresso de O2(1g) por Carotenides de G. polyedra in vitro

3.3.1 Extrao de Pigmentos Carotenides

61

3.3.2 Teste da Oxidao do Rubreno

61

3.4 Southern Blots

3.4.1 Extrao de DNA genmico
63
3.4.2 Obteno da sonda psyAra17

64

3.4.3 Slot-Blots

67

3.4.4 Gel de Agarose/Transferncia/ Hibridao

67

3.4.5 Anlise das Sequncias de Fitoeno Sintase

69

3.4.6 Sntese de primers degenerados-PCR

72

3.5 Northern Blots

3.5.1 Extrao de RNA total

74

3.5.2 Obteno da sonda RullI

75

3.5.3 Gel de Formaldedo/ Transferncia/ Hibridao

77

3.6 Western Blots

3.6.1 Obteno de Extrato Bruto Protico

78

3.6.2 SDS-PAGE/ Transferncia para Membrana PVDF

78

3.6.3 Utilizao de Anticorpos Policlonais

79

4. RESULTADOS
4.1 Anlises por HPLC

81

4.1.1 Variao Circadiana nas diferentes Irradiaes

83

4.1.2 Induo da Sntese de Pigmentos em Clulas do Escuro

88

4.1.3 Quantificao dos Pigmentos em Cistos

93

4.2 Supresso de O2(1g) por Carotenides de G. polyedra in vitro

96

4.3 Slot-Blots

98

4.4 Southern Blots

100

4.5 Northern Blots

102

4.6 Western Blots

104

5. DISCUSSO
5.1 Variao Circadiana nas diferentes Irradiaes

109

5.2 Induo da Sntese de Pigmentos em Clulas do Escuro

113

5.3 Quantificao dos Pigmentos em Cistos

116

5.4 Supresso de O2(1g) por Carotenides de G. polyedra in vitro

119

5.5 Slot-Blots, Southern Blots e PCR Aspectos moleculares

120

5.6 Northern Blots

121

5.7 Western Blots

123

6. CONCLUSES

127

7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

129

RESUMO
O dinoflagelado unicelular marinho fotossintetizante Gonyaulax polyedra
tem sido utilizado como modelo para o estudo de relgios biolgicos. Neste
organismo j foram descritos os ritmos de: migrao vertical, diviso celular,
atividade de superxido dismutase e nitrato redutase, bioli.iminescncia e
capacidade fotossinttica. Investigamos a variao circadiana dos pigmentos
carotenides e de RuBisCo II e PCP, as quais esto intimamente ligadas ao
processo fotossinttico.
Experimentos de silpresso de espcies reativas de oxignio (EROs)
por carotenides foram preparados e mostraram que extratos de carotenides
de G. polyedra sao capazes de suprimir o o*('A~)(oxignio singlete) n vitm
confirmando o importante papel destes no controle das EROs nestas algas.
Os extratos metanlicos apresentaram vrios pigmentos, tais como
clorofila a, p-caroteno e peridinina em diferentes concentraes. A peridinina
representa 80 % do total de carotenides enquanto que o p-caroteno somente
4%. As anlises dos cromatogramas de HPLC mostraram que a razo

peridininalclorofila a nAo varia ao longo de 24 h porm, por outro lado, o

P-

caroteno apresenta uma variao significativa na sua quantidade, com nveis

duas vezes maiores no meio do dia em comparao com os nveis no meio da
noite. Esta variao conservada mesmo quando as clulas so mantidas em
condies de luz constante.
A curva de dose-resposta para a sntese de waroteno induzida pela

luz mostra uma resposta linear com 45 minutos de exposio a luz branca. A
induo mxima quando utilizamos as clulas do meio perodo da noite (CT
18) que aps esta exposio apresentam nveis de Waroteno semelhantes as

clulas do meio do dia. Esta alterao de fase no CT 18 sugere que este

pigmento pode ser um dos compostos-captadores de luz envolvidos no
mecanismo de ajuste de fase por luz em G. polyedra.
Culturas de G. polyedra do meio da noite foram expostas diferentes
irradiaes (azul, vermelha e verde) e os seus pigmentos extrados e

analisados. Em outra srie de experimentos, as clulas foram mantidas

durante o perodo de claro (12: 12 h) sob diferentes irradiaes (vermelha,
verde e azul) por 36 horas e os seus pigmentos analisados. Os resultados
sugerem que a sntese foto-induzida e a oscilao circadiana do p-caroteno
esto ligadas a um fotorreceptor de luz azul1 verde. Nas condies utilizadas
no foram observadas variaes significativas no contedo protbico da
RuBisCo II e da PCP ao longo do dia. As anlises de RNA total da RuBisCo II
mostram que no h variao nos seus nveis quando as clulas sao coletadas
no meio do dia e no meio da noite.
Quando expostas a condies adversas, G. polyedra apresenta a
capacidade de encistar. Embora se conhea bem este mecanismo de defesa,
existem poucas informabes sobre o estado fisiolgico destas clulas. Clulas
encistadas induzidas por dias curtos apresentam uma alterao na
composio de pigmentos com diminuiao nas quantidades de p-caroteno e
de clorofila a e aumento da quantidade de peridinina, indicando um rearranjo
do aparato fotossinttico nesta situaao, com a peridinina desempenhando um
papel mais estrutural. Em consequencia, embora o contedo protico de
RuBisCo permanea inalterado, os nveis proticos de PCP se encontram
diminudos nas clulas encistadas.

Gonyaulax polyedra, a marine dinoflagellate which has been used as a

model to study the biological clock, displays numerous circadian processes,
such as bioluminescence, cell aggregation, cell division, superoxide dismutase
and nitrate reductase activities and photosynthesis. In this alga, the
photosynthesis is maximal in the middle of the day and minimal in the middle of
the night. We investigated the pigments content and the amounts of two
proteins

related to

the

photosynthesis:

ribulose-

1,5-

bisphosphate

carboxylase/ oxygenase form II (RuBisCo II) and peridinin: chlorophyll a:

protein (PCP) in a 24 h cycle.
Using

the

thermal

decomposition

of

1,4-dimethylnaphtalene

endoperoxide, it was shown that the carotenoids could act as effective

quenchers of synglet oxygen in G. polyedra.

G. polyedra pigments were extracted every three hours over 24 hours.

The amounts of peridinin and chlorophyll a remain constant over the day while
the levels of p-carotene oscillate, being two times higher at the day than at the
night phase. This variation persists when the cells were kept under constant
dim light.
The dose-response curve for light-induced warotene synthesis showed

a linear response up to 45 minutes of light exposure, after which night-phase

cells contained the same levels of p-carotene as day-phase cells. Cells
exposed to light pulses at different times displays the highest p-carotene
induction in the middle of the night. This may suggest that p-carotene rnay be
one of the light-harvesting compounds involved in the light induced phase-shift
in G. polyedra.
To identify which was the photoreceptor involved in p-carotene
synthesis, cell of the middle of the night-phase (CT 18) were exposed for 45
minutes to different irradiations (red, blue and green) and their pigments
extracted and analysed. Also, cells were grown under red, blue and green light
during the light phase (12 h light: 12 h dark ) for 36 hours and their pigments

analysed. The results suggested that the circadian oscillation and the photoinduced response synthesis of p-carotene, are related to a blue light receptor.
The amounts of RuBisCo II and PCP do not change over the circadian
cycle when the cultures were grown under constant dim light. The levels of
these proteins also remain constant when cells were kept under either white
light or different light qualities (red, blue and green ) in light: dark (12: 12 h)
regime.
The G. polyedra RuBisCo form II transcrits levels are the same in
middle-day and middle-night cells, suggesting a post-translational control for
this enzyme in this organism.
Adverse environmental conditions elicit the encystment of G. polyedra.
Our results showed an alteration in pigment composition of cysts. An increase
in peridinin levels and a decrease in B-carotene and chlorophyll a content were
observed. Although RuBisCo form II protein levels remained constant, there
was a reduction in the amounts of PCP in cysts. This suggests an important
role in thylakoids structure stabilizer for free peridinin.

1. INTRODUO

1.1

Ritmos Biolgicos

Os ritmos biolgicos podem ser definidos como oscilaes expressas

por organismos vivos com frequncias definidas. Estes ritmos podem estar
relacionados s variaes geofsicas, pois, as divises de tempo astronmicas
tais como dia, fases da lua ou ano podem ser consideradas, ecologicamente,
compartimentos temporais. A mudana dia-noite o sinal mais importante para
o sistema circadiano (circ8, prximo - dies, dia) nos organismos. Embora os
ritmos circadianos (- 24 h) sejam os mais estudados devido a facilidade de seu
monitoramento, existem ritmos maiores e menores que 24 h j descritos como
podemos visualizar na tabela 1.
Alm dos ritmos biolgicos sofrerem a influncia dos fenmenos
astrofsicos, eles tambm podem ser definidos como endgenos. Ou seja, um
organismo

pode

ter

um

ritmo

biolgico,

cuja

regulao

depende

exclusivamente de suas necessidades fisiolgicas. Nesse sentido, o ritmo

biolgico endgeno caracterstico em um determinado organismo e seus
mecanismos de expresso

podem ser estudados

independentemente.

Segundo Kippert (1985) o ritmo circadiano de vrios ciclos endgenos evoluiu

concomitantemente com ciclos de claro-escuro. Portanto, a capacidade de um
organismo preparar-se para este evento (antecipar) constitui uma vantagem
adaptativa na evoluo dos organismos procariotos e eucariotos. A maneira
mais simples de se obter tal resultado, seria o desenvolvimento de um
mecanismo capaz de detectar diretamente a presena ou ausncia de luz,
atravs de fotorreceptores. No entanto, os organismos desenvolveram um
sofisticado relgio biolgico para controlar esta regulao temporal endgena.

12

Tab. 1: Exemplos de ritmos e ciclos com perlodos mais curtos (ultra) iguais (circa) e mais longos (infra) que 24

horas (extraido e modificaclo de Hastings et aI., 1991).

Ultradianos
Batimentos flagelares de espermatozides

0,01 segundos

Ondas cerebrais

0,1 segundos

Batimentos cardacos

1 segundo

Respirao humana

5 segundos

Batimento de asas de Drosophila (corte nupcial)

1 minuto

Ciclos celulares

20 minutos-horas

Mars

12,6 horas

Circadianos
Bioluminescncia em Gonyaulax

22,5 horas

Migrao vertical Gonyaulax

24 horas

Sntese RNA m gene frq em Neurospora

22 horas

Corticosterona na corrente sangunea

24 horas

Temperatura corprea

24 horas

Movimento das folhas de Phaseolus (feijo)

23,5 horas

Abertura de flores de Kalanchoe

22,8 horas

Infradianos
Ciclos estrais em ratas

4-5 dias

Semi-lunar

14,8 dias

Ciclos mentruais em primatas

28 dias

Lunar

29,5 dias

Encistamento em dinoflagelados

365 dias

13

o valor adaptativo dos relgios biolgicos no tempo,

relacionados com

as variaes geofsicas, to importante que estes so considerados

essenciais para a sobrevivncia e evoluo das espcies, uma vez que o
ajuste da organizao temporal interna com a ritmicidade ambiental
proporciona economia energtica aos seres vivos. Estes ritmos so expressos
em situaes variadas, como a poca de migrao de pssaros, peixes e
mamferos (baleias); a florao de plantas; a diviso celular; a excreo renal
de vrios componentes; a susceptibilidade infeco por microorganismos,
entre outros (Johnson & Hastings, 1986).
Tm sido demonstrado que alguns procariontes e todos os organismos
eucariotos, incluindo os humanos, possuem um relgio biolgico interno cuja
funo fundamental controlar o perodo do dia no qual os diferentes
processos acontecem (Wever, 1979; Johnson & Hastings, 1986), sendo capaz
de ser influenciado e sincronizado por fatores ambientais. Alm dos ciclos de
claro: escuro, o relgio biolgico sofre influncia de variaes na temperatura,
capaz de compensar este efeito alterando ligeiramente a frequncia dos
marcapassos circadianos (Johnson & Hastings, 1986). O estudo dos relgios
biolgicos, em especial o circadiano, iniciou-se como uma mera curiosidade
biolgica, derivando para uma rea com enormes implicaes para a medicina
clnica. Vrias terapias farmacolgicas com drogas e radiao, bem como
cirurgias invasivas, tm demonstrado influncias marcantes da variao do dia
(Moore-Ede et ai., 1982; Moore-Ede, 1983).
A autonomia do relgio biolgico pode ser constatada quando
organismos so mantidos em condies de "livre curso" (por exemplo, luz
constante). Nestes casos os organismos apesar de no sofrerem quaisquer
influncias dos ciclos geofsicos, continuam exibindo ciclos regulares de suas
atividades fisiolgicas por longos perodos de tempo (Sulzman et ai., 1982
e1984; Morse et ai., 1990).
Uma das caractersticas mais surpreendentes do relgio biolgico est
relacionada ao fenmeno denominado "phase-shift" (troca de fase), o qual
consiste na habilidade de um organismo de acertar o seu relgio interno em
relao ao tempo por influncia de pulsos de luz ou drogas (Broda et ai.,
14

1989). Acredita-se que a troca de fase parece estar envolvida no mecanismo

central de temporizao, portanto estudos moleculares dos fatores que
causam alterao de fase representam uma abordagem importante para o
entendimento do marcapasso (temporizador) do organismo.
No ambiente natural, os ritmos dirios so condicionados a perodos de
24 h por uma repetitiva alternncia de claro e escuro. As diferentes
intensidades de luz alimentam um oscilador endgeno circadiano, o qual
diretamente sincroniza temporalmente vrios

processos

bioqumicos e

fisiolgicos. Tal condicionamento temporal ocorre quando a luz, de alguma

maneira, troca a fase do oscilador, causando ento uma troca de fase do ritmo.
A intensidade e direo da troca dependem exclusivamente da fase na qual a
luz aplicada. Preparando-se grficos da intensidade da troca contra a fase
na qual pulsos de luz so incididos, geralmente durante o perodo de escuro,
produz-se a chamada curva de resposta de fase. Os organismos, em geral,
tm a capacidade de alterar suas fases. Isto devido a pulsos de luz serem
aplicados em determinados momentos, nos quais os fotorreceptores celulares
estejam preparados para captar os ftons de luz e transduzir

o sinal ao

oscilador.
Em muitos organismos estudados, um simples e pequeno pulso de luz
no incio do perodo de escuro, acarreta em um atraso de fase em relao ao
ciclo normal; j um pulso de luz a partir do meio da noite resulta em um
adiantamento de fase. Este atraso de fase no incio da noite seria explicado
como uma preparao do organismo para um perodo de escuro, j o
adiantamento seria a preparao do organismo para um perodo diurno
(Hastings, 1991).
A luz pode sincronizar ou induzir um ritmo. Segundo Schmidt (1987),
pulsos de luz em determinados perodos do dia podem de alguma maneira
sincronizar ou modificar algumas atividades fisiolgicas. A sincronizao de
um ritmo verificada pelo reajuste de fase, e, na maioria dos casos, a luz azul
e a luz vermelha desempenham um papel importante. No est claro at este
momento, se a atuao da luz ocorre diretamente sobre o relgio biolgico ou
se atravs de fotorreceptores que traduzem a mensagem temporal para o
relgio.
15

Nos mamferos, o ncleo supraquiasmtico (NSQ) foi descrito como

responsvel pelo controle de vrios processos metablicos como o controle de
temperatura, o ciclo de sono viglia, a funo renal, a diviso celular e a
liberao de hormnios entre outros (Golombeck et a/., 1997). A quantidade
dos

hormnios

cortisol,

prolactina,

corticosterona,

do

crescimento,

prostaglandina, testosterona e melatonina na corrente sangunea variam ao

longo de 24 h.
A sntese de melatonina (principal hormnio temporal) partir do
triptofano ocorre, principalmente, na glndula pinel. Esta se inicia com a
captao do triptofano pelos pinealcitos convertendo-o em 5-hidroxitriptofano
(5-HT) e serotonina. A converso de 5-HT em melatonina envolve a atividade
de duas enzimas: serotonina n-acetil transferase (NAT), considerada a etapa
limitante da biossntese de melatonina, e a hidroxindol-O-metil transferase
(HIOMT). Golombeck et alo (1997) demonstraram uma resposta bioqumica
imediata da atividade destas enzimas luz ambiental, com maior atividade na
fase de escuro. No dinoflagelado marinho G. po/yedra, a melatonina
produzida em concentraes algumas vezes maiores que na glndula pineal,
exibindo um ritmo de expresso cujo mximo pronunciadamente noturno
(Hardeland et a/., 1995). Segundo Binkley (1993) a melatonina tem um papel
determinante como sinalizador qumico "do escuro" nos organismos, sendo
uma fonte importante de informao em ciclos circadianos e anuais.
O relgio biolgico est associado com vrias desordens temporais,
chamadas genericamente de cronopatologias. As depresses devido s
prolongadas estaes do ano com baixa luminosidade nos pases nrdicos,
tm sido tratadas pela exposio dos pacientes luz branca intensa (acima de
2500 lux) em diferentes perodos do dia (Lewy et a/., 1987; Moreno et a/.,
1997). Outro exemplo de cronopatologia o "jet lag", experimentado por
pessoas que realizam vos transmeridianos. Estas pessoas apresentam
desorganizao temporal interna e dificuldade de adaptao que podem afetar
o humor, o sono e os sistemas digestivo e cardiovascular. Analogamente,
existem estudos com trabalhadores noturnos de fbricas e hospitais
demonstrando variabilidade na produtividade, maior incidncia de erros,
respostas mais lentas e quando a desorganizao temporal cronicamente
16

mantida, pode acarretar em uma menor expectativa de vida para estes

indivduos (Moreno et ai., 1997).
Contudo,

natureza

qUlmlca

do

relgio

circadiano,

mais

especificamente a identidade e a organizao dos componentes moleculares

envolvidos na gerao e o acerto dos processos rtmicos dirios, permanecem
como um dos aspectos desconhecidos dentro da biologia (Johnson & Hastings,
1986; Hastings & Schweiger, 1976; Roennenberg & Morse, 1994).
A literatura tm mostrado que o relgio biolgico capaz de regular a
expresso de protenas nos nveis de (i) transcrio, (ii) processamento de
RNAm, (iii) traduo e (iv) ps-traduo ou endereamento de protenas, como
mostra a figura 1 (extrada de Marques et aI., 1997).

17

Dentre os mecanismos chamados no-transcricionais, existe uma

variedade de opes de controle. Em alguns casos, a modulao da
estabilidade do transcrito, os eventos de modificaes cclicas (como
fosforilaes reguladas pelo ciclo celular) e a expresso rtmica de proteases
controlariam a quantidade de determinadas protenas durante o ciclo
circadiano (Sassone-Corsi, 1994). Segundo Hastings (1983), o controle no
nvel de traduo tambm pode estar relacionado biossntese de fatores de
traduo.
As investigaes envolvendo os componentes centrais do relgio
biolgico esto mais avanadas em espcies nas quais foram identificados
mutantes de perodo como Neurospora crassa e Drosophila melanogaster.
Estudos sobre os mecanismos do relgio biolgico nestes organismos (N.
crassa e D. melanogaster) demonstraram que o mecanismo central de

oscilao envolve um controle de retro-alimentao negativa onde a

transcrio inibida como resultado do acmulo da protena correspondente
(Dunlap, 1996).
Na mosca de fruta D. melanogaster foram descobertos dois loci
necessrios para a produo de ritmos circadianos: per ("period") e tim
("timeless"). Mutaes em qualquer um destes locus podem eliminar a
ritmicidade ou alterar o perodo do ritmo (Price et aI., 1995). Konopka & Benzer
(1971) identificaram trs mutantes de ritmo de ecloso nesta espcie: o
mutante arrtmico pel; o mutante de perodo longo pel (28 h) e o mutante de
perodo curto pe,s (19 horas). Os mutantes fim no apresentam ritmicidade
circadiana na transcrio de per, nem o transporte de per para o ncleo (Price
et aI., 1995). Foi verificado por estes autores que as protenas PER e TIM

interagem fisicamente, e esta associao necessria para que ocorra o

controle da fosforilao e o transporte de PER para o ncleo. A localizao de
PER no ncleo, por sua vez ir resultar na supresso da transcrio de per e
fim (Price et aI., 1995).

No fungo N. crassa observa-se uma alterao da periodicidade dos

padres de maturao sexual dos condios, expressando ritmos circadianos de
crescimento. Dos seis loci gnicos envolvidos no controle temporal, o mais
19

estudado o gene frequency (frq) localizado no cromossomo VII (Crosthwaite

et aI., 1995). Os genes ligados ao relgio biolgico wc-2 ("white-collar"mutante incolor) e frq em Neurospora satisfazem os critrios bsicos propostos
para componentes do oscilador circadiano (Dunlap et aI., 199; Crosthwaite et

aI., 1997). Alm da sua prpria transcrio, a protena FRQ de N. crassa, ativa
a transcrio de outros genes (ccg1, ccg2 e cab- "clock controlled genes").
Em Arabidopsis thaliana foi verificado que existe um elemento
responsivo ao relgio (CRE) que se liga ao promotor da enzima ribulose-1,5bifosfatase carboxilase oxigenase ativase, regulando a sua transcrio
circadianamente (Liu et aI., 1996). Nesta mesma planta (Millar et aI., 1995 e
1997), e em Chlamydomonas reinhardti (Jacobshagen et aI., 1996) foi
demonstrado que a transcrio do gene cab est sob o controle do relgio
biolgico. interessante ressaltar que o relgio biolgico pode manter o ciclo
circadiano, mesmo em organismos onde a diviso celular ocorre em um tempo
menor que 24 horas. Kondo et aI. (1997) verificaram a transcrio circadiana
de vrios genes em Synechococcus sp, apesar destas clulas se dividirem
cada 10 horas.
claro que quanto maior a complexidade de um organismo, maior a

dificuldade de estudar os componentes celulares responsveis pelo acerto do

relgio biolgico. Portanto, organismos eucariotos unicelulares tais como
amebas, Acetabularia, Chlorella e outras microalgas so excelentes modelos
de estudo.

1.2

A alga marinha unicelular Gonvau/ax po/yedra

G. polyedra (recentemente este dinoflagelado foi classificado como

Lingulodinium polyedra -Vernet et aI., 1996) uma alga unicelular marinha

fotossinttica, que juntamente com outros organismos responsvel pelo
fenmeno de "mar vermelha" nos oceanos. G. polyedra um dinoflagelado
holoftico, medindo aproximadamente 40 I-lm de dimetro.
Os dinoflagelados possuem muitas caractersticas distintas quando
comparados a outros organismos eucariotos. Spector (1984) observou que ao
20

fotografar seces celulares destas clulas em microscpio eletrnico, o DNA

nuclear estava

arranjado

em

um

grande

nmero

de

cromossomos

permanentemente condensados. Estes aspectos morfolgicos do ncleo so

semelhantes aos nucleides bacterianos. Alm desta semelhana, existe
tambm a ausncia de histonas nos dinoflagelados, e, portanto, o seu DNA
no pode ser arranjado em nucleossomos. Entretanto, foram detectadas
protenas bsicas no-histnicas em quantidades semelhantes s encontradas
em

bactrias.

Uma

outra

caracterstica

morfolgica

no-usual

em

dinoflagelados a grande quantidade de DNA. Em G. polyedra, por exemplo,

Holm-Hansen (1969) encontrou aproximadamente 200 pg de DNA por ncleo,
praticamente 60 vezes mais do que encontrado em um ncleo de clula
haplide humana (3,2 pg).
Os cloroplastos de dinoflagelados diferem de outros plastdeos por
possuirem trs membranas. Recentemente, Zhang et aI. (1999a) mostraram
que apesar da origem comum a outros plastdeos, estes adotaram uma
arquitetura genmica mpar, na qual cada gene possui o seu prprio minicrculo, isto , os cloroplastos de dinoflagelados contm um grupo pequeno de
molculas semelhantes plasmdeos, cada um carregando um gene que
codifica para uma protena ou um RNAr. Estes autores descobriram que todos
os mini-crculos em uma dada espcie de dinoflagelados possuem uma regio
repetitiva que mantm a identidade entre estes crculos. Zhang et aI. (1999a)
sugerem que esta regio contenha a origem de replicao e auxilie na
segregao destes crculos durante a diviso do cloroplasto.
Outras caractersticas ultraestruturais tpicas de G. polyedra so: o
ncleo em forma de "C" contendo os cromossomas condensados; a presena
de tricocistos (agregados proticos); corpos multivesiculares; "scintillons"
(organelas que emitem luz); grande parte da clula ocupada por cloroplastos,
e uma teca elaborada. Os cloroplastos possuem uma forma reticular e ainda
no se sabe se so constitudos por vrias organelas que se comunicam ou
por um nico cloroplasto com vrias ramificaes (Behrmann & Hardeland,
1995).

Dois

tipos

de

cloroplastos

ou

regies

de

cloroplastos

com

caractersticas surpreendentemente particulares so encontradas nas clulas

mastigotas. Na periferia destas clulas, so encontrados cloroplastos mais
21

compactos, contendo lamelas com dois ou trs tilacides e pouca distncia

interlamelar. A medida que avanamos para o interior da clulas, os plastdeos
apresentam menos lamelas e predominantemente dois tilac6ides (Schmitter,
1971). Os cloroplastos de clulas mastigotas exibem ritmicidade circadiana
com respeito a sua topologia e distribuio intracelular (Rensing et aI., 1980).
Durante o perodo de luz, os cloroplastos da periferia apresentam-se
compactados, enquanto os da regio central esto expandidos. Esta estrutura
expandida desaparece durante o perodo noturno, e na metade da noite
somente cloroplastos do tipo compacto so observados. Grnulos de amido
esto presentes durante o dia e nas primeiras horas do perodo escuro. Estes
grnulos no esto ligados membrana e no foi encontrada nenhuma
associao com os cloroplastos ou outras organelas (Schmitter, 1971).
Behrmann & Hardeland (1995) descreveram recentemente as mudanas
ultraestruturais que ocorrem em formas csticas de G. polyedra.

Os cistos

deste dinoflagelado apresentam cloroplastos compactados, perda de parte dos

"scintillons", presena de grnulos de amido e vacolos lipdicos e reduo no
nmero de tricocistos.
Fritz et aI. (1989), empregando microscopia eletrnica, descreveram
com detalhes o ciclo de vida de Gonyaulax tamarensis (figura 2). Estes autores
concluram que apesar da maior parte da reproduo em dinoflagelados
ocorrer atravs da diviso mit6tica de clulas vegetativas, a reproduo sexual
que ocorre eventualmente de extrema importncia. Alm dos benefcios
conhecidos da recombinao gnica, ela propicia a formao de cistos, os
quais podem auxiliar na disperso da espcie, iniciar a florao em casos
favorveis e garantir a sobrevivncia em situaes desfavorveis. A
reproduo sexual no gnero Gonyaulax

envolve a formao de gametas

mveis, os quais fundem-se para formar um zigoto m6vel (planozigoto). O

planozigoto (presumivelmente dipl6ide) nada durante alguns dias at perder a
sua mobilidade e transformar-se em um cisto de paredes espessas, o
hipnozigoto. Esta transio ocorre quando o planozigoto perde seus flagelos e
deposita-se no fundo da coluna d'gua (Von Stosch, 1973). Como no caso de
outros dinoflagelados onde a formao do hipnozigoto foi observada, este
estgio constitui a fase de dormncia no ciclo de vida. Sob condies normais
22

de cultivo, o perodo de encistamento pode variar de 12 horas at meses,

dependendo

da

("desencistamento")

espcie.

Em

surge

uma

G.

tamarensis,

clula,

com

provavelmente

excistamento

ainda

diplide,

denominada planomeiocito. Esta clula (plameiocito) divide-se relativamente

rpido e dentro de 24 horas aps o excistamento, a primeira diviso produz
duas clulas. Ao final de mais um dia, quatro clulas esto presentes,
semelhantes clula vegetativa em tamanho e forma (Anderson et aI., 1984).

23

Fig. 2. Ciclo de vida do gnero Gonyaulax. Da clula vegetativa central (forma mastigota) podem ser visualizados trs
ciclos possfve;s.-cicIo-A~-diviso-mittlca;-ciclo B. forlllao tle istos temporrios; ciclo C: reproduo sexual com a
formao de gametas mveis, sua fuso e a produo de um zigoto com quatro flagelos, e ,em sequncia a formao
de um zigoto i,mYel-{cisto}~-o-excistameRtg, regeRer:aRdg~~-mvel.-Oivises-<:leste-z~,~-GIulas
vegetativas (Extrado de Fritz et aI., 1969).

24

Como abordado anteriormente, o processo de encistamento (temporrio

ou no) em dinoflagelados representa uma condio adaptativa para escapar
de condies adversas. Em G. po/yedra, este pode ser desencadeado por
vrios sinais, tais como: dias-curtos (Balzer & Hardeland, 1991; 1992), baixas
temperaturas (Hardeland, 1994); estresse mecnico ou qumico (Wolf et a/.,
1994; Okamoto et a/., 1998). Quando as clulas mastigotas (vegetativas) so
colocadas em regime de dias curtos (10 h de claro: 14 h de escuro) e
temperatura de 15 oC, observa-se aps 4 dias encistamento de 100% das
clulas. A despeito do modo como as clulas so induzidas ao encistamento,
existem etapas essenciais. Estas so: retrao do protoplasto, perda do
flagelo, ruptura e liberao da teca, e, formao de uma parede celular
caracterstica de cistos. Estas caractersticas morfolgicas podem ser
observadas "in vivo" sob microscpio tico (Fig. 3). O encistamento de G.
po/yedra pode ocorrer inclusive durante a diviso celular, indicando a
importncia e a dominncia deste processo morfognico (Behrmann &
Hardeland, 1995). Segundo estes autores o encistamento acompanhado de
uma reorganizao de organelas e estruturas celulares.

25

Gonyau/ax po/yedra

Fig. 3 Morfologia das clulas mastigotas (A) e encistadas (B) de G. po/yedra. As clulas foram fotografadas
sob microscpio de Epifluorescncia (Diaphot-tmd, Nikon). Aumento de 40 X.

26

Os cistos induzidos por dias curtos e temperatura de 15C apresentam

principalmente cloroplastos do tipo compacto. As lamelas consistem de dois ou
trs tilacides. Plastdeos expandidos ocorrem somente ocasionalmente e no
se expandem para o interior da clula. Como resultado, os plastdeos ocupam
somente uma pequena rea da clula. A estrutura dos cloroplastos de cistos
induzidos por dias curtos assemelha-se a de clulas mastigotas do perodo do
escuro. Alm disso as clulas encistadas apresentam uma maior quantidade
de grnulos de amido e vacolos lipdicos, o que tambm tpico para clulas
mastigotas durante a maior parte do perodo escuro (Schmitter, 1971; Rensing

et aI., 1980). A presena de produtos de estocagem em clulas encistadas

permite que estas sobrevivam condies adversas.
Hardeland & Rodriguez (1995) verificaram que na forma cstica de G.

polyedra a quantidade de melatonina aumentada. Estes autores sugererm

que a melatonina desempenhe um papel muito importante como supressora de
espcies reativas de oxignio neste organismo.
Como dito anteriormente, o dinoflagelado G. polyedra frequentemente
utilizado como modelo de investigao de ritmos biolgicos. Este organismo
apresenta muitos ritmos circadianos j descritos. Entre estes podemos citar: a
diviso celular (Sweeney e Hastings, 1958; Chisholm, 1981), a migrao
vertical na coluna d'gua e o padro de agregao (Roenneberg et aI., 1989),
a bioluminescncia (Hastings & Ounlap, 1986), a capacidade fotossinttica
(Przelin et aI., 1977; Hastings et aI., 1961) a atividade da enzima superxido
dismutase (SOO) (Colepicolo et aI., 1992; Asano et aI., 1995) e da nitrato
redutase (Ramalho et aI., 1995) entre outros (figura 4).

27

Fig. 4. ExprSSO das atividades elreadlanas em G. polyedf4.

28

processo de diviso celular em G. polyedra rtmico (Sweeney e

Hastings, 1958) e o trabalho de Chisholm (1981) mostrou que este processo

est restrito a 5 h durante a transio entre claro-escuro e que o intervalo das
divises est prximo de 24 h. Alm destes, o dinoflageldo G. polyedra exibe
uma migrao vertical, na qual as clulas esto na superfcie das guas
durante o dia, migrando para o fundo noite, e um padro de agregao
diurnos capazes de persistir por vrias semanas mesmo em livre curso
(Roenneberg et aI., 1989).
A bioluminescncia neste dinoflagelado ocorre de dois modos ("flash" e
"glow") e ambos exibindo ritmicidade diria (Hastings & Dunlap, 1986). Estes
autores observaram a emisso de luz que se segue aps estimulao
mecnica- "f1ash"- mxima na metade da noite e mnima durante o dia. O
outro tipo de emisso denominado "glow", consiste de uma emisso
espontnea que ocorre no final do perodo de escuro. Os componentes da
reao de bioluminescncia esto localizados em organelas denominadas
"scintillons". Estas organelas exibem ritmicidade circadiana nos processos de
sntese, compactao e degradao (Johnson et aI., 1985).
Morse et aI. (1989) demonstraram que a capacidade para emitir
bioluminescncia de G. polyedra estava relacionada com a presena de
componentes bioqumicos envolvidos nesta reao: a enzima luciferase, seu
substrato a luciferina e uma protena que se complexa luciferina e a mantm
no estado reduzido, denominada LBP ("Iuciferin binding protein"). Esta reao
ocorre a partir da ao da enzima luciferase sobre o seu substrato, a luciferina.
Contudo, a ligao de uma outra protena luciferina (LBP) determina se esta
enzima ter ou no acesso ao substrato. Milos et aI. (1990) demonstraram que,
embora a expresso de LBP seja rtmica, os nveis de RNAm que a codificam
permanecem constantes no perodo de 24 h, sugerindo que o controle no seja
transcricional. Recentemente Mittag (1996) demonstrou que a regulao da
expresso da LBP ocorre na traduo. Estes resultados mostraram uma
protena repressora, controlada pelo relgio biolgico que se liga regio 3'
do RNAm da LBP, impedindo a sua traduo. A atividade de ligao desta
protena tambm apresenta variao circadiana.

29

Em G. polyedra a capacidade fotossinttica varia ao longo do dia, sendo

mxima no meio da fase de claro e mnima no meio da fase escura (Przelin et
aI., 1977; Hastings et aI., 1961). Este ritmo persiste mesmo em condies de

livre curso (sob luz atenuada) (Przelin & Ley, 1980). A capacidade
fotossinttica de G. polyedra est sob controle do oscilador circadiano, cujo
perodo e fase

podem

ser alterados

por

inibidores

de

fotossntese

(Roennenberg & Morse, 1993). O fluxo de eltrons atravs dos dois

fotossistemas em G. polyedra rtmico (Samuelsson, 1984 em Lonergan,
1984). Isto indica que a coordenao dos dois fotossistemas e a cadeia de
transporte de eltrons interconectada envolvida no fluxo no-cclico de
eltrons, controlada em parte pelo relgio biolgico (Lonergan, 1984).
Segundo Samuelsson (1984), a atividade do PSI no rtmica, mas a atividade
do PSII oscila e parece ser a responsvel pelo ritmo fotossinttico observado
em G. polyedra.
Em G. polyedra foram descritas duas enzimas cuja atividade mxima
ocorre durante o dia, prxima do mximo de atividade fotossinttica: a enzima
superxido dismutase (SOO)(Colepicolo et aI., 1992; Asano et aI., 1996), e, a
nitrato redutase (Ramalho et aI., 1995). Estes dados sugerem uma interao
dos mecanismos metablicos com a maior atividade celular diurna e, portanto,

temporizao pelo relgio biolgico.

As enzimas SOO catalizam a converso de superxido (0 2- e) em
perxido de hidrognio (H 2 0 2 ) e oxignio (0 2 ) (McCord & FridovichK, 1968) e
esto agrupadas em classes de acordo com os metais presentes no stio ativo.
Asano et aI. (1995) mostraram que existem trs isoformas da enzima SOO em
G. polyedra (MnSOO, FeSOO e CuZnSOO), e que os nveis proticos das
isoformas

MnSOO

FeSOO

atividade

especfica

total

variam

circadianamente com perodo de aproximadamente 22 h. Estes autores

observaram que a acrofase de atividade de SOO coincide com a acrofase da
capacidade fotossinttica (meio do dia), corroborando a hiptese da funo de
fotoproteo exercida pela FeSOO (presente nos cloroplastos) nos tilacides,
durante os horrios de maior produo de O2 .
A assimilao de nitrato constitui o principal meio de obteno de
nitrognio para a biossntese de constituintes celulares em algas. Este nitrato
30

presente no ecossistema marinho deve ser reduzido primeiramente a nitrito e

ento amnia ou a amina para ser utilizado pelas clulas. A enzima que
catalisa a passagem de nitrato nitrito a nitrato redutase (NR), considerada
a etapa limitante do processo de assimilao de nitrognio. Em G. polyedra,
Ramalho et aI. (1995) verificaram que a atividade da NR exibe um padro
circadiano endgeno, com atividade quatro vezes maior durante o dia.
Roenenberg & Morse (1993) sugeriram que exista pelo menos dois
osciladores independentes em G. polyedra, um controlando o ritmo da
bioluminescncia e outro o ritmo de agregao das clulas. Posteriormente,
Morse et aI. (1996) demonstraram que a sntese protica em G. polyedra pode
ser iniciada em trs horrios distintos. Embora publicaes recentes defendam
a existncia de mais de um relgio biolgico em uma nica clula, a
comunidade cientfica ainda discute a validade desta hiptese, bem como a
funo de cada relgio.

1.3

Espcies Reativas de Oxignio e os Antioxidantes

Embora o oxignio molecular seja essencial para a sobrevivncia dos

organismos aerbicos atravs da fosforilao oxidativa, na qual o oxignio
reduzido a gua por quatro eltrons, os sub-produtos formados decorrentes do
metabolismo aerbico so txicos.

Tais espcies semi-reduzidas so

chamadas genericamente de espcies reativas de oxignio (EROs) (Sies,

1986; Cadenas, 1989; Halliwell & Gutteridge, 1991). Estas espcies semireduzidas e altamente reativas compreendem entre outros o radical superxido
(02--), o perxido de hidrognio (H202), o radical hidroxila (OH-), oxignio
singlete [02C~g)] e radicais alcoxila (HRO-) e peroxila (HROO-).
Sabe-se que o oxignio molecular possui dois eltrons no pareados
*

em orbitais degenerados 1t anti ligante, estando portanto, no estado triplete. O

"spin" destes eltrons possue o mesmo valor quntico de momento magntico.
Isto faz com que para ocupar o espao vacante de seu orbital, o oxignio
molecular somente reaja com molculas possuidoras de "spins" paralelos.

31

Como a grande maioria das molculas possui eltrons de "spins" invertidos

(no-paralelos), isto explicaria a baixa reatividade do oxignio molecular
quando em soluo. Esta restrio de "spin" torna, portanto, difcil a reao
entre o oxignio molecular e outras molculas. Vrios autores tm proposto
uma reduo parcial do oxignio para explicar a sua reatividade e gerao de
outros derivados. Nishinaga (1977) props que a excitao eletrnica do
oxignio molecular, com a inverso do "spin" geraria 02C~g). As reaes de
transferncia de apenas um eltron por vez pode originar as espcies O2-., H2
O2 , OH, como mostrado abaixo:
Reduo do oxignio molecular atravs da adio de um eltron.

HO.

e- OH

O2

O -.-

OH.----.. H2 0

Harber-Weiss Fe\

OH.

Allen et ai. (1972), propem a formao de 02C~g) pela reduo de

H20 2 por superxido. O oxignio singlete, uma vez gerado, pode produzir o
seu estado triplete, por desativao, como observa-se a seguir:

Gerao de oxignio singlete a partir da dismutao espontnea do nion superxido

(Allen et aI., 1972)

Kellog & Fridovich (1975), baseados na reao de Harber-Weiss,

cogitam a hiptese de formao do 02C~g), na presena de Fe2 +, como
exemplificado abaixo:

32

Reao de Harber-Weiss com produo de oxignio singlete e radical hidroxil (Kellog

& Fridovich,1975).

Krinsky (1984) discute amplamente a gerao biolgica e fotobiolgica

de 02CL\g), reportando outras fontes, tais como: a formao de oxignio
singlete a partir de radicais peroxil e reao do hipoclorito com perxido de
hidrognio em neutrfilos. O on hipoclorito (OCr) gerado por enzimas como
as mieloperoxidases (protenas mais abundantes em neutrfilos) partir de
e H20 2 . O

ocr

cr

um oxidante muito potente que pode causar leses nas

clulas e que, reagindo com H2 0 2 pode produzir o 02CL\g), que participa do

seu sistema bactericida. Mesmo uma simples acidificao do

ocr pode

gerar

oxignio singlete (Khan et ai., 1992). Em alguns casos, portanto, a gerao de

EROs em um organismo pode ser benfica. Os macrfagos e neutrfilos, sob
determinados estmulos, so capazes de liberar grandes quantidades de EROs
nos focos inflamatrios para combater os microorgannismos invasores. Esta
produo em larga escala resultante da ativao de uma enzima de
membrana, a NAD(P)H-oxidase, que estimulada por: fagocitose, interaes
celulares mediadas por anticorpos, cidos graxos insaturados, steres de
forbol e retinides (Brigago & Colepicolo, 1996; Rabadji et aI., 1996).
Devido a sua alta reatividade, as EROs so conhecidas pelos seus
efeitos deletrios sobre os tecidos celulares pela sua capacidade de reagir e
oxidar biomolculas fundamentais como os lipdeos de membrana, protenas,
clorofila (organismos fotossintticos) e DNA, provocando a perda de suas
funes biolgicas (Halliwell & Gutteridge, 1999). Para contornar este
problema, os seres vivos desenvolveram mecanismos de proteo contra as
EROs, que podem ser via reaes enzimticas ou por compostos de baixo
peso molecular. As enzimas responsveis pelo controle das EROs nas clulas
esto descritas nas seguintes reaes:

33

Proteo enzimtica contra as EROs.

soo

+
catalase

2H 20 2

SH 2

ascorbato

H 20 2

+ 2H 20 2

2H 2O
peroxidase

peroxidase

(A)

O2

(B)

2H 2O

(C)

dehidroascorbato

2H 2O

(O)

A enzima superxido dismutase (SOO) especfica para a remoo

cataltica do radical superxido, como mostra a reao (A) acima. A isoforma
mais abundante desta enzima a que contm os metais cobre e zinco
(CuZnSOO) e est presente em todas as clulas eucariontes e, inclusive, em
algumas bactrias (Halliwell & Gutteridge, 1999). As formas mais comuns de
SOO encontradas em bactrias so a MnSOO e a FeSOO. A MnSOO tambm
est presente nas mitocndrias de clulas eucariontes e a outra isoforma que
contm Fe tambm foi encontrada em algas e plantas superiores, e est
localizada nos c1oroplastos (Halliwell & Gutteridge, 1999).
As catalases e as peroxidases so enzimas envolvidas na remoo do
H2 0 2 das clulas (reaes B, C e O). A enzima glutationa peroxidase tem como
substrato a glutationa, composto tilico de baixo peso molecular, encontrado
3

na maioria dos organismos em altas concentraes (10- moles por litro). Esta
enzima est presente em animais, algas e fungos, mas geralmente ausente
em bactrias e plantas superiores. Em animais a catalase encontra-se
amplamente distribuda em todos os tecidos e rgos, mas sua localizao
intracelular limita-se aos peroxissomos. Em plantas, alm dos peroxissomos, a
catalase est localizada nos glioxissomos e nas mitocndrias. Uma enzima
importante encontrada nos cloroplastos de plantas a enzima ascorbato
peroxidase, cujo papel principal parece ser a remoo do H2 0 2 formado
durante a reao de Mehler (Willekens et aI., 1997).
Devido ao

grande nmero de EROs produzidas fotoquimicamente,

existem vrios sistemas de desativao das mesmas. presentes no cloroplasto.

34

Estes sistemas anti-oxidantes incluem alm dos sistemas enzimticos,

compostos como cido ascrbico (vitaminaC), vitamina E, cido rico,
melatonina e carotenides (Asada & Takahashi, 1987; Hardeland & Rodriguez,
1995; Krinsky, 1989).
Segundo Halliwell & Gutteridge (1999) um dos compostos mais
importantes na manuteno dos nveis intracelulares de EROs o cido
ascrbico. Esta molcula reage com o HO- resultando em radical ascorbil (vit
C-) e on hidrxido (OH}
Existem experimentos comprovando a reduo dos nveis de 02C~g) e
HO- pela vitamina E, evitando assim a lipoperoxidao de membranas
biolgicas e danos ao DNA, e que cido rico um potente supressor de
radicais peroxila (R0 2-), 02C~g) e HO- (Halliwell & Gutteridge, 1999).
A melatonina produzida pela glndula pineal e vrios orgos
extrapineais em vertebrados, mas tambm encontrada em invertebrados,
angiospermas e organismos unicelulares. Em mamferos, a melatonina
responsvel por vrias respostas humorais, mas tambm um poderoso
supressor de EROs. Foi demonstrado recentemente que a melatonina tem a
capacidade de terminar reaes de EROs iniciadas por fotooxidantes, R0 2 -,
ou HO- (reviso em Hardeland & Rodriguez, 1995).
Os carotenides reagem com 02C~g) e/ou impedem a sua formao por
reagirem com o estado triplete da clorofila (Krinsky, 1979; Krinsky, 1989). Os
carotenides

so

molculas

normalmente

associadas

essencialmente
membranas.

hidrofbicas

Dentro

da

encontradas

categoria

dos

carotenides, encontram-se os carotenos, constitudos por cadeias longas de

carbono e hidrognio (com ligaes duplas conjugadas) e as xantofilas, que
so cadeias longas de hidrocarbono com a presena de oxignio (figura. 5)

35

A descoberta por Foote ei ai. (1970) de que os carotenides poderiam

captar o 02(\ig) foi um importante avano no entendimento da eficincia dos
carotenides em evitar o dano fotooxidativo em sistemas biolgicos (Krinsky,
1989). Quando a luz atinge um sistema biolgico que contm um sensitizador
apropriado (S), como no caso a clorofila, este sensitizador excitado ao seu
primeiro estado de excitao singlete (1S) o qual

pode sofrer uma

transformao para o estado triplete excitado meta-estvel (3S), como na

reao abaixo (1):

hv
S

Os

sensitizadores

(1 )

no

estado

triplete

podem

iniciar

reaes

fotossensveis do Tipo I e do Tipo 11. Na reao do Tipo I, o sensitizador

excitado no estado triplete inicia reaes de radicais pela abstrao de
eltrons ou hidrognio das molculas vizinhas, criando, portanto EROs. No
Tipo 11, o sensitizador excitado no estado triplete reage com oxignio no estado
fundamental, formando o 02C~g), que altamente reativo, como mostra a
reao (2):

(2)

O mecanismo atravs do qual os pigmentos carotenides protegem os

sistemas biolgicos contra os danos devido ao 02C~g) consiste na supresso
fsica da energia proveniente da molcula de oxignio excitada. A reao de
supresso fsica envolve a transferncia da energia de excitao do 02C~g) ao
carotenide, resultando na formao do carotenide triplete, como mostra a
reao (3). Ento, em uma reao subseqente (4) a energia de excitao
dissipada sem causar danos atravs de interaes vibracionais e rotacionais

37

entre o caroten6ide triplete e o solvente, regenerando a molcula de

caroten6ide original.

CAROTENIDE

3CAROTENIDE

---)

---)

CAROTENIDE

30 2

CALOR

3CAROTENlDE

(3)

(4)

Deste modo, os pigmentos caroten6ides atuam de maneira cataltica na

neutralizao do potencial oxidativo da molcula de 02C~g) (Foote et aI.,
1970; Krinsky, 1989) e assim, funcionando diretamente como anti-oxidante
prevenindo de forma eficaz as reaes oxidativas, que eventualmente possam
ocorrer nos cloroplastos.
As xantofilas, caroten6ides com oXlgenlo, possuem um papel muito
importante no controle das EROs atravs de um mecanismo conhecido como
"ciclo das xantofilas". Este "ciclo das xantofilas" envolve reaes dirigidas pela
luz, a qual transforma xantofilas contendo um grupo epoxi em outras sem o
grupo epoxi. Em plantas superiores e algas verdes, os pigmentos envolvidos
neste ciclo so violaxantina, anteraxantina e zeaxantina (Buch, 1995). Em
dinoflagelados como G. polyedra, o caroten6ide correspondente na formao
do complexo caroten6ide:clorofila:protena a peridinina (Knoetzel & Rensing,
1990a), que a correspondente nesta alga violaxantina de plantas
superiores. A formao da zeaxantina ajudaria no processo de fotoproteo da
clorofila e aparato fotossinttico.

No fitoplncton

ocorre

uma reao

equivalente de epoxidaol de-epoxidao com os pigmentos diadinoxantina e

diatoxantina, que esto presentes em dinoflagelados (Liaaen-Jensen, 1978).

38

1.4

Biossntese de Carotenides

Em 1831, Wackenroder props o termo caroteno ao descrever o

pigmento que ele havia isolado e cristalizado partir de cenouras. Berzelius
(1837)

denominou

xantofila,

pigmento

amarelo

isolado

de

folhas

senescentes. Tswett, reconhecendo a natureza qumica semelhante dos

compostos chamados de carotenos e xantofilas,

criou

a designao

"caroten6ides" em 1911, englobando as duas classes de pigmentos (Armstrong

& Hearst, 1996).

Os pigmentos caroten6ides ocorrem amplamente distribudos na
natureza, so encontrados em bactrias fotossintticas e no fotossintticas,
algas, fungos, leveduras, pssaros, insetos, crustceos e peixes. A maior parte
dos caroten6ides composto de um esqueleto linear de hidrocarbonetos (C4Q)
contendo uma srie de ligaes duplas conjugadas (entre 3 e 15). O esqueleto
construdo partir de oito unidades isopren6ides Cs' Os caroten6ides
contendo unicamente carbono e hidrognio so chamados carotenos. Os
carotenos podem ser lineares, como por exemplo o licopeno, ou com
compostos aromticos, como o ~-caroteno. Os caroten6ides que alm de
carbono e hidrognio contm tambm grupos funcionais com oxignio, tais
como os grupos hidroxi, metoxi, oxo ou epoxi; aldedos ou cidos carboxlicos,
so chamados de xantofilas. Os caroten6ides tambm existem na forma de
steres ou glicosdios.
O nmero de duplas ligaes conjugadas nos polienos responsvel
pela cor caracterstica e espectro de absoro dos caroten6ides. Todos estes
absorvem fortemente a luz visvel, e em alguns casos, pr6ximo a regio
ultravioleta do espectro. O espectro de absoro tambm influenciado pela
ciclizao. Apesar de ter o mesmo nmero de duplas ligaes conjugadas,
licopeno e ~-caroteno tm diferentes mximos de absoro. O max 446, 472
e 505 nm do licopeno alterado para os valores mais baixos de max 425,
451 e 483 caractersticos do ~-caroteno devido presena dos anis neste
composto.

39

 sabido que os carotenides so essenciais para a sobrevivncia dos

organismos fotossintticos. Os caroten6ides agem como agentes protetores da
destruio irreversvel do aparato fotossinttico por um mecanismo de
proteo contra o dano foto-oxidativo j abordado anteriormente (tem 1.3).
Os carotenides de plantas, algas, fungos e da maior parte das
bactrias carotenognicas so sintetizados pela rota dos isopren6ides. A
maioria dos animais no realizam a sntese de novo dos carotenides, mas
conseguem converter biossinteticamente os caroten6ides ingeridos em outros
tipos de caroten6ides (Armstrong & Hearst, 1996).
As reaes iniciais da biossntese de caroten6ides so mediadas por
um precursor do isopreno Cs, o isopentenil pirofosfato (IPP). O cido
mevalnico convertido em IPP, o qual sob isomerizao resulta na formao
do dimetilalil pirofosfato (DMAPP). Uma molcula de IPP condensada com
uma molcula de DMAPP pela enzima preniltransferase para formar geranil
pirofosfato (GPP, C10). Adies subseqentes de molculas de IPP conduzem
formao de farnesil pirofosfato (FPP, C1S), e ento, geranilgeranil
pirofosfato (GGPP, C20). Todos os pirofosfatos intermedirios at GGPP
(includo) tambm so utilizados em outras ramificaes da rota de biossntese
de outros isopren6ides. FPP um precursor dos esqualenos e esterides,
enquanto que GGPP utilizado na sntese de fitohormnios tais como
giberilinas, e nas cadeias laterais de fitil das quinonas, tais como ubiquinona e
plastoquinona. A biossntese de clorofila e bacterioclorofila est ligada
biossintese de caroten6ides porque o GGPP tambm utilizado na sntese
das cadeias laterais de fitil ou geranilgeranil esterificadas da clorofilal
bacterioclorofila (Armstrong & Hearst, 1996).
A condensao de duas molculas do intermedirio C2Q GGPP, produz o
prefitoeno pirofosfato (PPPP). Esta a primeira reao na rota biossinttica
dos isopren6ides considerada exclusiva na produo de carotenos (Britton,
1983; Goodwin, 1976; Goodwin, 1980; Goodwin, 1988). O PPPP sofre uma
converso estereo-especfica cs- ou trans-fitoeno, sendo que o primeiro C4Q
caroten6ide, 15-cs-fitoeno predomina em plantas superiores, algas e fungos
(Goodwin, 1988). As reaes nas quais o PPPP e o fitoeno so formados so
catalisadas

pela

primeira

enzima

especfica

para

biossntese

dos
40

carotenides: a fitoeno sintase (Dogbo et ai., 1988). O fitoeno oxidado

neurosporeno em trs etapas sucessivas de dehidrogenao via fitof1ueno e

caroteno. A cada etapa de dehidrogenao, dois tomos de hidrognio so

removidos pela trans-eliminao partir das posies adjacentes e a dupla
ligao adicionada.
O neurosporeno um intermedirio comum maioria dos organismos
carotenognicos. Nos organismos contendo carotenides cclicos, tais como
plantas superiores, a prxima etapa a dessaturao do neurosporeno
licopeno seguido da ciclizao do licopeno p-caroteno. A hidroxilao do pcaroteno resulta na formao da zeaxantina. As vrias posies da duplas
ligaes insaturadas nos anis resultam em uma variedade de xantofilas.
Resumindo, a biossntese dos pigmentos carotenides pode ser comparada
uma rvore invertida, com o tronco representando as reaes iniciais, comuns

todos os organismos, e os galhos representando a enorme quantidade de

xantofilas que surgem partir da introduo espcie-especfica de funes de
oxignio em carotenos cclicos e acclicos (Armstrong & Hearst, 1996). A figura
5A mostra a via biossinttica dos carotenides proposta por Armstrong &
Hearst (1996) em diferentes organismos.

41

As enzimas envolvidas na biossntese dos carotenides tm sido de difcil

purificao e caracterizao. O isolamento das fraes enzimticas, as quais
so capazes de converter MVA, IPP e GGPP fitoeno, menos complexo.
Entretanto, as etapas subseqentes so difceis de atingir, pois a maior parte
destas enzimas esto ligadas membrana do cloroplasto. Acredita-se que as
enzimas relacionadas as vias biossintticas dos carotenides formam um
complexo multienzimtico para se tornarem funcionais (Giulliano et ai., 1993).
Nos timos anos muitas destas etapas enzimticas foram estabelecidas
geneticamente (Armstrong et ai., 1993; Hoshino et ai., 1993; Ma et ai., 1993;
Tabata et ai., 1994) e as seqencias de genes de muitos organismos j esto
disponveis. Todos os genes da biossntese de carotenides em Rhodobacter
capsulatus esto agrupados em um plasmdeo de 46kb (Marrs, 1981). Os

genes da via biossinttica de carotenides das bactrias no-fotossintetizantes

Erwinia herbico/a e Erwinia uredevora j foram sequenciados (Hundle et ai.,

1993; Misawa et aI., 1990; Shivanand et aI., 1992). Existem seis genes
envolvidos na biossntese destas enzimas em E. herbico/a e E. uredevora, e a
seqncia de aminocidos deduzida destas protenas nas duas bactrias 50
a 60% idntica. Alm disso, a seqncia de aminocidos deduzida para os
genes envolvidos nas etapas

GGPP~PPPP~fitoeno~neurosporeno

nestas

bactrias tambm so semelhantes seqncia dos genes de R. capsulatus

(Armstrong et aI., 1993).
Os

genes

codificadores

da

via

biossinttica

dos

carotenides

designados e sequenciados de Rhodobacter capsulatus e Erwinia conduziram

identificao de genes correspondentes de muitos outros organismos. Por

exemplo, o gene crtB (que codifica a enzima fitoeno sintase) de R. capsulatus
e E. herbico/a assemelha-se ao produto protico do gene cDNA de tomate
(pTOM5), que diferencialmente expresso durante a maturao da fruta

(Giuliano et aI., 1993). O produto gnico codificado PDS em Synechococcus

PCC7942,

assemelha-se ao do gene crtE (fitoeno desaturase) de R.

capsulatus (Armstrong et aI., 1993). Em Neurospora crassa, um outro

homlogo de um gene de R. capsulatus (crt!) , o al-1, foi identificado, que

codifica a enzima geranilgeranil difosfato sintase (Baima et ai., 1992).

43

Em dinoflagelados, Johansen et aI. (1974) identificaram o

como o nico carotenide

presente,

e vrias

xantofilas:

~-earoteno

dinoxantina,

pirroxantina, diatoxantina, astaxantina, diadinoxantina, peridinina, peridinol, e

pirroxantinol. Em todos os gneros, em que estava presente, a peridinina era o
caroten6ide dominante (63-85% do total de carotenides). Os dinoflagelados
que

no apresentaram peridinina possuam a fucoxantina

como

seu

carotenide dominante. Em G. polyedra, o trabalho pioneiro de Liaaen-Jensen

(1978) descreveu a ocorrncia dos carotenides ~-caroteno (o nico caroteno
presente), diatoxantina, diadinoxantina, dinoxantina e peridinina (xantofilas)
como j foi mostrado anteriormente (figura 5).
Vrios autores (Frosch & Mohr, 1980; Corona et aI., 1996; Bonk et aI.,
1997) sugerem que exista uma biognese coordenada entre os pigmentos
caroten6ides (principalmente o ~-caroteno) e as clorofilas. A biossntese de
caroten6ides no uma rota independente, tendo numerosas ramificaes
com

atividade

de

formao

de

prenil-lipdios

competindo

por

seus

intermedirios, como j foi abordado anteriormente. No estgio do GGPP,

monoterpenos so formados e ao longo da via biossirittica, reaes de
formao de clorofilas, tocofer6is,

quinonas, giberelinas, entre outros,

competem pelo substrato GGPP. Muitos destes produtos so vitais, portanto,

seu fluxo metab61ico deve ser estrategicamente regulado. Por exemplo, os
carotenos e as clorofilas devem ser sintetizados quantitativa e qualitativamente
de maneira coordenada para garantir a manuteno do funcionamento do
aparelho fotossinttico (Bonk et aI., 1997). As clorofilas so os tetrapirris mais
importantes e mais abundantes nos organismos fotossintticos (Reinbothe &
Reinbothe, 1996). Esto envolvidos na captao de luz e na transduo de
energia durante a fotossntese.
Os carotenides e as clorofilas so ligados no-covalentemente
protenas intrnsecas das membranas dos tilac6ides (Thornber, 1975). Cada
complexo caroten6ide-c1orofila-protena tem sua composio de pigmentos
especfica (Braumann et aI., 1982).
Oelmller & Mohr (1985) descreveram que a sntese de carotenos em
milho (Sorghum vulgare) poderia ser regulada em trs nveis diferentes: um

44

controle mais amplo atravs de um fotorreceptor (no caso sugeriram o

fitocromo); uma regulao mais "fina" em conexo com o acmulo de clorofila
e, por ltimo, a estabilizao do holocomplexo contra a fotodecomposio.

1.5 Influncia da Luz e o Papel dos Fotorreceptores

Os fotorreceptores so a primeira via de captao de luz e identificao

do ciclo ambiental e, dependendo do organismo, os pr6prios pigmentos
fotossensveis constituem-se em receptores. Estudos com herbicidas que
bloqueiam a biossntese de caroten6ides em plntulas de milho indicam a
participao de carotenides na fotorrecepo primria (Vierstra & Poff, 1981).
Em Euglena gracilis, protoclorofildios e um ou mais fotorreceptores que
absorvem a luz azul mediam o desenvolvimento de c1oroplastos e o aumento
correspondente nos pigmentos caroten6ides (Cohen & Schiff, 1976; Fong &
Schiff, 1979). Em fungos e bactrias, o fotocontrole da carotenognese feito
por uma porfirina ou um pigmento fotorreceptor de luz azul. Em plantas
superiores o fitocromo regula o desenvolvimento de cloroplastos e a
biossntese de caroten6ides (Harding & Schropshire, 1980).
Considerando as funes, bem como a ampla distribuio dos
pigmentos caroten6ides, no parece surpresa que a biossntese destes
pigmentos seja controlada pela luz em muitos organismos. A luz azul ativa
vrios processos metab61icos, de desenvolvimento e comportamentais em
plantas, em organismos procariotos e eucariotos unicelulares, e sua influncia
direta e indireta na regulao da sntese enzimtica bem documentada
(Fontes et al.,1993; Rau & Schrott, 1979). O controle da biossntese de
caroten6ides pela luz azul tem sido descrito para algas Euglena gracilis
(Dolphin, 1970; Vaisberg & Schiff, 1976) Scenedesmus obliquus (Britton &
Young, 1993) e Chlorella vulgaris (Claes, 1966; Desbach & Kowallik, 1974),
fungos Phycomyces (Eslava et aI., 1974; Jayaram et aI., 1979), Fusarium

aquaeductuum (Lang-Feulner & Rau, 1975; Rau 1976), Neurospora crassa

(Harding & Shropshire, 1980) e Verlicillium agaricinum (Rau, 1976), e bactrias
como Flavobacterium dehydrogenans (Weeks et aI., 1973), Myxococcus
45

(Buchard & Hendricks, 1969) e Mycobacterium (Batra et aI., 1969). Caratolli et

aI. (1994) demonstraram que em N. crassa a biossntese de carotenides

regulada pela luz azul, principalmente atravs da ativao da transcrio de

alguns genes-chave na via biossinttica enzimtica da carotenognese.
Entretanto, a extenso da regulao da sntese pela luz difere de organismo
para organismo. Em muitos organismos uma quantidade razovel de
carotenides sintetizada no escuro e a iluminao apenas aumenta a taxa de
sntese. Este parece ser o caso da acumulao de carotenos em plantas
superiores mediada por fitocromo (mas no um efeito de luz azul) (Deng,
1994). Em outras espcies, a iluminao obrigatria para uma sntese
substancial de certos carotenides, mas o acmulo destes pigmentos
processa-se durante a iluminao, significando que a presena permanente do
indutor (luz) essencial para a resposta. A fotorregulao da carotenognese
em fungos como F. aquaeductuum serve como exemplo do terceiro tipo. A taxa
de acmulo baixa no escuro, e apenas poucos minutos de exposio luz
so suficientes para uma produo de pigmentos substancial no subseqente
perodo escuro e somente por um certo perodo de tempo. Este tipo de
fotocontrole exibe todas as caractersticas de um mecanismo clssico de
induo, no qual a luz serve como "gatilho" e todas as reaes no escuro so
conseqncias da foto-induo.
A fotorregulao da biossntese dos carotenides levanta muitas
questes, por exemplo: (i) quais so os fotorreceptores responsveis pela
transduo de sinal, (ii) quais as etapas da rota biossinttica esto sob
fotocontrole e (iii) quais os mecanismos fisiolgicos envolvidos.

1.6 Fotossntese

A fotossntese realizada por uma ampla variedade de organismos indo

de bactrias e algas unicelulares aos grupos mais complexos de plantas
superiores. As reaes iniciais do processo envolvem a absoro da luz por
pigmentos antena seguida da transferncia da energia de excitao aos
centros de reao PS I e PS 11. Dentro das membranas dos tilacides, os
46

caroten6ides esto na maioria das vezes ligados a complexos proticos

especficos Uunto com a clorofila) dos dois fotossistemas (PS I e PS 11). A
unidade fotossinttica dos produtores primrios funcionalmente organizada
em dois tipos de complexos protenas-pigmentos; i) os complexos antena que
so responsveis pela captao dos f6tons, transferncia de energia de
excitao e o relaxamento no-fotoqumico desta excitao sob condies de
super-saturao; ii) os centros de reao onde ocorre a separao inicial de
cargas. Nestes organismos fotossintticos, a funo antena desempenhada
por um caroten6ide (espcie-especfico) e as clorofilas (em G. polyedra,
peridinina e as clorofilas a e C2). Como todos os pigmentos fotossinteticamente
ativos se ligam protenas especficas para formar complexos pigmentosprotenas (Iglesias-Pietro & Trench, 1997), as alteraes nas concentraes
celulares destas protenas devido

foto-aclimatao

podem fornecer

informaes sobre o funcionamento do aparato fotossinttico.

O complexo PCP (peridinina-clorofila a-protena) encontrado somente
em dinoflagelados, assim como a peridinina que est ligada esta protena
(Le et ai., 1997). Existem duas formas de PCP presentes em dinoflagelados,
uma com peso molecular de 17 kDa e outra com 32 kDa. A estrutura da
protena de 32 kDa foi elucidada em Amphidinium cartereae. A apoprotena
trimrica liga duas clorofilas a, oito peridininas e duas molculas de
digalactosil diacil glicerol (DGDG), que mantm a peridinina pr6xima clorofila
para uma transferncia eficiente de energia do caroten6ide para a clorofila
(Hoffmann et ai., 1996). Estruturalmente, cada monmero possui um eixo duplo
de simetria, sugerindo que a protena evoluiu da forma menor de PCP (17 kDa)
por um evento de duplicao gnica.
O estudo de Koka & Song (1977) mostrou que no complexo PCP de G.
polyedra esto ligadas quatro molculas de peridinina e uma molcula de

clorofila.
Em organismos unicelulares como as cianobactrias Synechococcus
sp., foi demonstrado que os genes envolvidos em funes fisiol6gicas comuns

esto arranjados em "cluster" (agrupados) no genoma e que a deleo de uma

parte do operon que codifica as subunidades grande e pequena da enzima

47

RuBisCo, impedia a sntese de clorofila no escuro (Ronen-Taranzi et aI.,

1995).
A enzima RuBisCo (ribulose- 1,5-bifosfato carboxilase-oxigenase) a
enzima chave na fotossntese de plantas, algas e da maioria das bactrias
fotossintetizantes (Palmer, 1996). Esta enzima catalisa a primeira etapa da
fixao do carbono no Ciclo de Calvin via a carboxilizao de acares de
cinco carbonos (ribulose-1,5-bisfosfato) para produzir duas molculas de
fosfoglicerato. Esta enzima bi-funcional, catalizando duas reaes que
competem entre si: a assimilao fotossinttica de CO 2 e a oxidao do
carbono por fotorrespirao (Ishida et aI., 1998).
Por sua abundncia, importncia e distribuio a RuBisCo tida como a
enzima mais estudada em plantas (Palmer, 1996). A partir das sequncias de
aminocidos j descritas para mais de 2000 plantas da subunidade maior
desta enzima, avanos incrveis foram realizados na sistemtica molecular
(Clegg, 1993). A ribulose- 1,5 -bifosfato carboxilasel oxigenase tipo I, que se
encontra presente em plantas, algas, cianobactrias e na maior parte das
bactrias, uma protena de alto peso molecular (Mr= 500.000- 560.000),
composta de oito sub-unidades maiores e oito sub-unidades menores. A subunidade maior contm o stio ativo e codificada por um gene diferente da
sub-unidade menor. A RuBisCo tipo /I, tpica de bactrias, apresenta apenas
as sub-unidades maiores (Hayashi et aI., 1999).
Diferentemente de outros eucariotos, os dinoflagelados que contm
peridinina possuem uma forma de enzima RuBisCo antes s descrita para
algumas espcies de proteobactrias; a forma 11. Alm disso, esta RuBisCo
no codificada pelo DNA do cloroplasto, como em outros organismos, mas
pelo DNA nuclear sugerindo uma origem evolutiva distinta para os cloroplastos
de dinoflagelados (Morse et aI., 1995).
A enzima RuBisCo experiencia vrias modificaes p6s-traducionais
durante a sua expresso, importao, montagem e funcionamento (Ying et aI.,
1999).

Em

plantas

superiores foram

evidenciadas modificaes

ps-

traducionais nas sub-unidades da RuBisCo. A sub-unidade maior codificada

por um gene do plastdeo e traduzida e montada na holoenzima RuBisCo
dentro do estroma do cloroplasto. Os espectros de massa e as anlises das
48

sequncias de aminocidos dos peptdios, preparados partir da RuBisCo,

mostraram que a sub-unidade maior processada pela remoo dos resduos
metionina-1

e serina-1,

N-terminais e pela acetilao da prolina.

polipeptdeo da sub-unidade menor ps-traducionalmente importado para o

cloroplasto e processado por uma peptidase presente no estroma que remove
a pr-sequncia alvo. O resduo de metionina N-terminal resultante da subunidade menor submetido a uma N-metilao antes de ser acoplado subunidade maior na holoenzima. Em ervilha, tabaco e espinafre, a mesma metiltransferase processa as duas sub-unidades.
Os experimentos in vitro de Salvucci et ai. (1986) ressaltam que para
que a RuBisCo seja cataliticamente competente, so necessrios CO 2 e Mg 2 +,
que se ligam a um resduo de lisina, prximo ao stio cataltico da sub-unidade
maior.
Hayashi et ai. (1999) encontraram um gene, o cbbQ, localizado
"downstream" (anterior na sequncia de DNA) ao gene da RuBisCo que
controla a atividade desta enzima na bactria Hydrogenovibrio marinus. Este
gene codifica uma protena que possui um motivo de ligao de ATP ("ATP
binding-motif) e que desempenha um papel importante na regulao pstraducional, modificando o estado conformacional da RuBisCo e assim
regulando a sua atividade. Segundo estes autores (Hayashi et ai., 1999), a
anlise da sequncia desta protena mostrou uma semelhana desta com a
NirQ de Pseudomonas aeruginosa, que ativa a enzima xido ntrico redutase
(essencial no processo de desnitrificao).
Em plantas, a RuBisCo ativase uma protena de cloroplasto codificada
pelo ncleo, necessria para a ativao da RuBisCo pela luz in vivo. Esta
enzima varia a atividade da RuBisCo atravs da retirada de ribulose- 1,5
bifosfato (RuBP) e outros fosfatos inibitrios do acar em um processo que
requer a hidrlise do ATP. A atividade da RuBisCo varia com a intensidade
luminosa, da mesma forma que a fotossntese, por alternncia entre as formas
ativaI inativa (Zhang & Portis Jr., 1999). A transcrio do gene da enzima 1,5-

ribulose bifosfatase carboxilaseloxigenase ativase (RCA) em Arabidopsis

regulado peJa luz e pelo relgio biolgico, e esta transcrio uma resposta
luz vermelha, mediada pelo fitocromo (Liu et ai., 1996).

49

Segundo Pechorowicz et ai. (1981), o fator ambiental mais importante

no controle da atividade da RuBisCo a variao diria na intensidade
luminosa. Durante o processo de fotossntese existe uma razo ADPI ATP
varivel. A atividade da RuBisCo ativase pode ser regulada pela razo ADPI
ATP presente no estroma. O ADP inibe a reao de hidrlise do ATP da
ativase, a qual necessria para remover os inibidores (Zhang & Portis Jr.,
1999).

50

2. OBJETIVOS ESPECFICOS DA TESE

objetivo deste trabalho obter informaes sobre os processos

circadianos envolvidos na sntese de pigmentos em Gonyau/ax po/yedra e a

relao da quantidade destes pigmentos com o relgio biolgico e outros
processos ligados este. Alm disso, sabendo que os carotenides so
sistemas de defesa antioxidante no cloroplasto, objetivou-se verificar a
eficincia do extrato de carotenides desta alga em suprimir o 02C.::\g) in vitro.
Para isso foram traadas as seguintes metas experimentais:
(i) utilizao do extrato de pigmentos carotenides como supressor do
02C.::\g) no teste de oxidao do Rubreno;

(ii) quantificao de pigmentos carotenides (~-caroteno e peridinina) e

clorofila a por HPLC ao longo do perodo circadiano;
(iii) determinar a curva de dose-resposta da sntese de J3-caroteno fotoinduzida e o horrio em que a sua induo mxima;
(iv) induo da sntese de pigmentos por exposio a diferentes tipos
de luz (verde, vermelha e azul) e tentativa de identificao dos fotorreceptores
envolvidos neste processo;
(v) avaliao das possveis alteraes na expresso da enzima fitoeno
sintetase (a primeira na via biossinttica) de carotenides ao longo do dia
atravs de sondas e clonagem deste gene em G. po/yedra;
(vi) variao circadiana do contedo protico da enzima ligada
fotossntese a RuBisCo (forma 11) e da protena que se liga ao carotenide
peridinina e clorofila (PCP), a qual tem extrema importncia na captao de luz
nesta alga.
(vii) verificao de diferenas na composio de pigmentos e nos nveis
proticos da RuBisCo 11 e da PCP em clulas mastigotas e encistadas;
(viii) determinao dos nveis de RNAm da enzima Ru 11 em clulas do
dia e da noite, com vista a entender os mecanismos envolvidos na regulao
gnica;

51

3. MATERIAL E MTODOS
Reagentes

Meio de Cultura: nitrato de sdio, tiamina, biotina, vitamina B12 , sulfato

de zinco heptahidratado, cloreto de cobalto hexahidratado, cloreto de

mangans tetrahidratado, molibdato de sdio tetrahidratado, cloreto de ferro
hexahidratado, cloreto de cdmio, cloreto de mercrio e nitrato de chumbo
(Sigma).

Fosfato

de

sdio

monobsico

anidro

sulfato

de

cobre

pentahidratado (Merck).
Condies de crescimento das culturas:

Incubadoras (Precision

Scientific) equipadas com lmpadas fluorescentes TLT 40W/ 75 RS (Phillips),

papel gelatina azul (nmero 119), papel gelatina vermelho (nmero 164) e
papel gelatina verde (nmero 139) (Rosco).
Extrao de pigmentos: clorofrmio e metanol (Cintica Qu"imica), BHT

(hidroxitolueno butilado), cloreto de sdio (Sigma) e hidrxido de sdio

(Reagen).
Supresso de Ol1L1g}: ~-caroteno (Sigma), Rubreno (Aldrich).
Cromatografia lquida de alta performance (HPLC): metanol e acetato de

etila (Merck), filtros 0,22

~m

(Millipore),

~-caroteno

e clorofila a (Sigma), coluna

C18 / pkB 100 com 5 ~m e 25 cm com pr-coluna compatvel (Supelco)

Extrao e anlise de cidos nuclicos: glicerol (Nuclear), fosfato de

sdio bibsico, etanol, isopropanol (Merck), agarose, brometo de etdio,

padres "DNA e RNA ladder", "PCR Reagent System Kit", proteinase K,
"Random Primers DNA Labeling Kit", Rnase (Gibco BRL), EDTA (cido
etilenodiaminotetraactico),

EGTA

aminometlico) N,N,N',N'-tetractico),

(cido

etilenoglicol

bis

(~-

hidrxido de sdio (Reagen),

ter
2-

mercaptoetanol (Fluka), acetato de sdio, cido brico, cido clordrico,

ampicilina, azul de bromofenol, cloreto de ltio, clorofrmio: alcool isoamlico,
CTAB (hexadecil trimetil brometo de amnio), DEPC (dietil pirocarbonato),
fenol:

clorofrmio:

lcool

isoamlico,

FicoU,

formamida,

formaldedo,

isotiocianato de guanidina, meio LB (Luria Broth), MOPS (3-(N-morfolino) cido

52

propano-sulfnico),

N-Iaurilsarcosina,

PIPES

(piperazina-etano

cido

sulfnico), PVP (polivinilpirrolidona), tetraciclina, Tris-base, xileno cianol

(Sigma), a[32 p ] dCTP (3000Ci/mmol), membrana de "nylon" Zeta-Probe
(Amersham), papel de filtro 3 MM (Whatmann), fime fotossensvel X-OMAT AR
e solues de revelao e fixao (Kodak), dodecil sulfato de sdio
(Polyscience), filtros O, 22 Jlm (Nuclepore), borato, cloreto de ccio (Vetec),
enzimas de restrio (New England Biolabs)
Anlise de Protenasllmunodeteco: cido actico (Cintica Qumica),

Kit ECL para Western Blot, Hyperfilm (Amershaml Pharmacia), Reagente de

Bradford (BioRad), membrana PVOF (Ou Pont), SOS, Tween 20 (Polyscience),
fosfato de sdio monobsico (Vetec). Persulfato de amnio, acrilamida, bisacrilamida, Tris, glicina, azul de bromofenol, TEMEO (N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina), padro de peso molecular "Oalton Mark VII-L", BSA (soro
albumina bovina), Ponceau Red (Sigma), [ y 1251]_ protena A (Amersham).

53

3.1 Cultivo de Gonyaulax polyedra

o clone Gp70 originrio do banco de algas do Instituto Oceanogrfico

de Woods Hole (EUA) e foi isolado em 1975 por Barbara B. Przelin. Culturas
unialgais (no axnicas) de G. polyedra STEIN foram cultivadas em frascos
Fernbach contendo 1,5L de meio de cultura f/2 (Guillard & Ryther, 1962)
omitindo o silicato. Este meio consiste de gua do mar filtrada e autoclavada
suplementada com vitamina, nitrato, fosfato e metais-trao (vide abaixo). Os
frascos Fernbach foram colocados em incubadoras (Precision Scientific,
modelo 818 com lmpadas fluorescentes TLT-40 W/ 75 RS) com ciclos de 12 h
de claro e 12 h de escuro (C:E), alternados. A temperatura nas incubadoras foi
ajustada para 19C e a irradincia durante o perodo diurno (claro) de 69 J.lmol
m-2s- 1 medida por um quantameter com sensor esfrico (Biopherical
Instruments Inc., modelo QSL-100- SENSOR 41t). Para os experimentos de luz
branca constante atenuada (C: C Aten), houve uma diminuio de 30% (49 J.lmol
m-2s- 1) da intensidade da lmpada. Esta diminuio foi feita com a cobertura
de uma das lmpadas com papel preto opaco.
Em todos os experimentos foram utilizadas clulas coletadas durante a
fase exponencial de crescimento (106 clulas / mL), onde as mesmas
encontram-se no seu timo fisiolgico. A quantidade de clulas foi avaliada por
contagem em hemacitmetro de Neubauer. Os experimentos foram sempre
realizados em triplicata. Cada ponto representa a mdia entre trs amostras de
frascos diferentes. Cada experimento foi realizado no mnimo duas vezes para
confirmar os resultados.

Meio de cultura f/2:

Para cada litro de gua do mar, previamente filtrada foi adicionado
0,1 mL de soluo estoque de vitaminas e 1 mL de cada uma das seguintes
solues estoque:
-soluo de nitrato

7,5g Na N0 3 / 100mL H2 0

S4

-soluo de fosfato

0,5g Na HP04 .H 20 1100mL H20

-soluo de metais-trao

3,15g FeCI 3 .6H 20 + 4,36g Na2EDTA 1 900mL de H20 e 1mL de cada

uma das seguintes solues:
0,98g CuS04 . 5H 20 1100mL H20
2,20g ZnS0 4 . 7H 20 1100mL H20
1,05g CoCI 2 . 6H 20 11 OOmL H20
1,80g MnCI 2 . 4H 20 1 100mL H2 0
0,63g Na 2Mo0 4 . 4H 20 1100mL H20
( o volume final da soluo deve ser completado para 1 litro com H20).

meio de cultura completo foi ento autoclavado por 20 minutos,

resfriado 20 C e este foi adicionada a soluo de vitaminas (40

~UL

de

meio).
-soluo estoque de vitaminas

O, 19 tiamina + 0,005g biotina + 0,005g vitamina B12 /1000mL H20.

3.1.1 Variao Circadiana de Pigmentos, RuBisCo 11 e PCP

Para verificar a ocorrncia de variao circadiana na quantidade de

pigmentos e nas protenas Ru 11 e PCP, e avaliar a influncia da luz e do
relgio biolgico nesta variao, foram realizados experimentos durante 36
horas seguidas. Culturas de clulas mantidas sob condies de C: E e C: C
(detalhes no tem 3.1) foram coletadas a cada 3 horas para anlise de seus
pigmentos por HPLC e a cada 6 horas para determinao da quantidade das
protenas de intereresse por imunodeteco em Western Blots.
A anlise estatstica dos dados foi realizada pela tcnica de Anlise de
Varincia

para

Experimentos

Inteiramente

Casualisados

(ANOVA),

complementada pelo "Teste de Comparaes Mltiplas t de Studenf. No

55

presente trabalho, adotamos o nvel de 5% de significncia (p< 0,05), para

todas as concluses abordadas.
Nos experimentos de claro: escuro (C: E), o momento em que as luzes
se acendem considerado como tempo "O", e nos casos dos experimentos em
claro constante este momento denominado "CT O" ("circadian time O"). Nas
clulas mantidas sob iluminao constante, a noite subjetiva corresponde ao
perodo do dia onde estas estariam no escuro, caso estivessem em ciclos
claro: escuro.

3.1.2 Diferentes Irradiaes

Estes experimentos visam o estudo do efeito da qualidade de luz sobre
a transduo de sinal e resposta do relgio biolgico frente a diferentes
fotorreceptores.

Culturas de

G.

po/yedra foram expostas diferentes

irradiaes durante o perodo do claro do ciclo claro: escuro. Para obteno de

luz verde, vermelha e azul foram utilizados diferentes cores de papis gelatina
(Rosco), cujos espectros de absoro so observados na figo 6. Tais filtros
foram recomendados pelo Prof. Mikya Muramatsu, especialista em tica do
IFUSP.

56

100

A
%r

o
nm

200

:100

400

700

500

100

B
D" T

o
nm

20G

300

400

500

tiOO

100

700

%T

o
nm

200

:loa

400

500

600

700

Fig. 6. Espectros da porcentagem de transmitncia (% 1) dos papis gelatina utilizados como filtros nos experimentos
de irrandincirann difeielltes faixas do espedlo IUlllilioso. AzuliA};-verdeiB}1! yellllelho -(C). Delallies.-vide-Material
e Mtodos.

57

Clulas crescendo em ciclo claro: escuro (12: 12 h) com luz branca (69
~mol. m-2s- 1) foram transferidas na primeira hora do perodo de luz para

incubadoras forradas com papel gelatina de diferentes cores (azul # 119,

vermelha # 164 e verde # 139). A posio dos frascos em relao luz foi
considerada para que no houvesse diferenas na intensidade luminosa em
cada tipo de luz. As clulas foram coletadas a cada 6 horas durante 36 horas
para a anlise por HPLC de seus pigmentos carotenides e clorofilas, e
determinao da quantidade das protenas Ru "e PCP por Western Blots.

3.1.3 - Induo da sntese de pigmentos em clulas do escuro

Curva de Dose- Resposta

Para determinar o tempo de induo da sntese de

~-caroteno

no qual a

resposta linear, frascos contendo clulas do meio do perodo noturno foram

expostas luz branca (intensidade luminosa de 69 ~mol. m- 2s- 1) por
diferentes intervalos de tempo e sua quantidade de

~-caroteno

avaliada por

HPLC.

Induo Mxima de j3-caroteno

Sabendo-se do tempo de induo adequado,

foram

realizados

experimentos para determinar em que momento da noite as clulas

apresentavam uma induo mxima. Clulas de diferentes horrios do perodo
noturno foram expostas por 45 min luz branca (intensidade luminosa de 69

~mol. m-2s- 1) e a quantidade de ~-caroteno presente nestas clulas avaliada

por HPLC.

Induo da Sntese de Pigmentos

Com o objetivo de verificar o efeito da qualidade de luz visvel na

induo da sntese de carotenides e clorofilas foram testadas vrias
irradiaes: branca, verde, vermelha e azul em clulas do meio do perodo

58

escuro (induo mxima). Culturas mantidas em ciclo claro: escuro (12: 12 h)

com luz branca foram expostas pulsos de luz branca, azul, vermelha e verde
(intensidade luminosa de 69 JJmol. m-2s- 1) por 45 mino Como controle foram
usadas clulas da metade do perodo escuro no-expostas luz. Aps a
exposio aos pulsos de luz as clulas foram coletadas para anlise do
contedo de pigmentos por HPLC.

3.1.4 - Induo formao de Cistos

Cultivos da alga foram mantidos como descrito no tem 3.1. Para a
induo do dinoflagelado G. po/yedra ao encistamento, clulas do meio do dia
foram colocadas em uma incubadora Precision com ciclo de claro: escuro (10:
14 h ) com sua temperatura ajustada para 15C (Behrmann & Hardeland,
1995). Estas culturas permaneceram por quatro dias nesta temperatura sob Cf
intensidade luminosa de 69 ~ moI. m-2s- 1e a porcentagem de clulas
encistadas foi avaliada por microscopia tica. Aps este perodo, a totalidade
da populao se apresentava sob a forma cstica. Como, controle foram
utilizadas culturas provenientes do mesmo inculo que permaneceram 20 C
sob regime de luz:escuro usual (12:12 h). Alm das amostras para anlise de
pigmentos por HPLC, foram coletados 200 mL de clulas para anlise
imunodeteco das protenas PCP e Ru 11 por Western Blots.

3.2 Anlise por HPLC

3.2.1- Extrao de Pigmentos Totais
Em todos os experimentos relacionados extrao de pigmentos, foram
considerados os cuidados descritos na literatura, para evitar sua degradao.
Isto significa que todas as etapas de extrao foram realizadas sob luz

59

vermelha fotogrfica ou no escuro, sob atmosfera inerte (fluxo de Nz) e baixa

temperatura (mxima 20C).
Culturas de clulas densas (106 clulas por mL) foram filtradas vcuo
(Whatmann #3 ) e os seus pigmentos carotenides e clorofilas extrados do
papel de filtro picado exaustivamente com metanol, em banho de gelo, por 5
horas no escuro. Experimentos preliminares demonstraram a eficincia desta
metodologia na completa extrao dos pigmentos desta alga. As amostras
foram ento filtradas em filtro Millipore para solvente orgnico (0,22 /lm) para
no danificar a pr-coluna e a coluna do HPLC. As amostras foram estocadas
no escuro -20C.

3.2.2 - Condies Cromatogrficas

As anlises foram realizadas por HPLC de fase reversa (Shimadzu) em
uma coluna C 18 (pkB 100- Suplex; especificaes: 25 cm de comprimento com
5 /lm de porosidade), com pr-coluna compatvel (Suplex). Para que os
pigmentos carotenides e as clorofilas de G. polyedra fossem resolvidos ao
mesmo tempo, foi utilizado um gradiente linear binrio com a fase mvel
descrita a seguir. Dentre todas as condies testadas, esta fase mvel e este
gradiente foram considerados os mais adequados para as nossas anlises.

Eluente A: Metanol 75% em gua Milli-Q

Eluente B: Acetato de Etila 100%

Anlise:

Gradiente

Tempo 0,01 min

concentrao de B 50%

Tempo 15,0 min

concentrao de B 100%

Tempo 19,0 min

concentrao de B 50%

Tempo 25,0 min

concentrao de B 50%

Fluxo: 0,7 mU min

60

Dos cromatogramas resultantes foram feitas as anlises quantitativas e

qualitativas. Foram feitas corridas em paralelo no detector visvel no
comprimento de onda de 452 nm (que o mximo de absoro do

~-caroteno)

e no detector "diode array", que permite uma varredura minuto a minuto em

todos os comprimentos de onda (230-700 nm). Para quantificarmos o ~
caroteno, a clorofila a e a peridinina presentes nos extratos, foram utilizadas
curvas de calibrao dos padres e as reas relativas a cada pigmento nos
cromatogramas. Os resultados representam a quantidade destes pigmentos
por clula. Os grficos foram elaborados com o aplicativo Microsoft Excel
(verso para Windows 97) utilizando os valores da quantidade mdia dos
pigmentos e os seus respectivos desvios-padro, analisados por HPLC, ao
longo do tempo. Para traar a linha de tendncia utilizou-se a funo includa
no programa, com curva polinomial de ordem 4 em todos os grficos.

3.3 Supresso de O~CAg) por Carotenides de G. po/yedra in vitro

3.3.1 Extrao de Pigmentos Carotenides
Para a extrao exclusiva dos pigmentos carotenides, 100 mL de
clulas foram concentradas por centrifugao e tratadas com 5 mL de uma
soluo clorofrmio:metanol (1: 1) (v: v) contendo uma soluo de NaOH- 5%
(m: v) e mantidas por 2 h no escuro. Esta etapa de saponificao remove o
material lipdico indesejado e, em organismos fotossintetizantes, elimina as
clorofilas (Davies, 1976). A extrao foi repetida algumas vezes para garantir a
mxima recuperao dos carotenides. A fase orgnica foi lavada vrias vezes
em funil de separao com uma soluo de NaCI de 0,9%. As solues foram
mantidas no escuro e sob atmosfera de nitrognio durante todo o processo.

3.3.2 Teste da Oxidao do Rubreno

61

A eficincia do extrato de caroten6ides em suprimir o 02C~g) in vitro foi

determinada pela sua capacidade em retardar a oxidao do Rubreno
(5,6, 11,12-tetrafenilnaftaceno) em comparao com o p-earoteno comercial. O
Rubreno um hidrocarboneto vermelho brilhante o qual reage rapidamente
com 02C~g) (Kr = 4 X 107 M-1 S-1) (Monroe, 1985) formando um composto
incolor (Khan et a/., 1992). A reao foi monitorada em um espectrofotmetro
da marca Hitashi (U2000) a 540 nm. O 02C~g) foi gerado quimicamente pela
termodissociao do endoperxido DMN0 2 (1,4-dimetilnaftaleno) que produz
DMN e 02C~g) (Di Mascio et a/., 1992), segundo a seguinte reao:

Reao de gerao do oxignio singlete

DMN0 2

DMN

A constante global da taxa de supresso kt (= k q + kr) foi calculada

partir das curvas obtidas da reao monitorada em espectrofotmetro
utilizando a equao para reaes que seguem o modelo de Stern-Volmer:

kclk = 1+ (kq + k r) k/ (Q]

onde kq a taxa de supresso fsica, k, a de supresso qumica de

02C~g) pelo supressor (Q] e kd a constante de decaimento do 02C~g). A

meia vida do 02C~g)( =231 19 IJs) em clorofrmio usada para o clculo de kt
uma mdia dos valores descritos por diferentes autores para este solvente
(Monroe, 1985). A concentrao final do supressor (Q] (p-caroteno comercial
ou extrato de carotenides de G. po/yedra ) variou at 4 IJM. A constante da
taxa de oxigenao ko ou k do Rubreno foi medida na ausncia e na presena
dos supressores, respectivamente. Com os carotenides, k q > k" portanto,
a supresso qumica pode ser desconsiderada permitindo com este mtodo a
determinao direta da kq . A adio de BHT (hidroxitolueno butilado) no
mostrou diferenas na k q , exclundo a possibilidade de interferncia de radicais
livres.

62

3.4 Southem Blots

3.4.1 Extrao de DNA genmico

Em todos os experimentos desenvolvidos foi utilizada a centrfuga de

bancada Sorvall TLC 6 e o rotor ST-Micro.
Foram seguidos protocolos descritos em Sambrook et aI. (1989). As
clulas (peso fresco de 2 g) foram maceradas em almofariz com nitrognio

lquido e 1 mL de tampo GIT (isotiocianato de guanidina 4,0 M; Tris-base

0,05 M; EDTA 70 mM; EGTA 0,025 M; N-Iaurilsarcosina 2%; 2-mercaptoetanol
1%).

Ao

macerado

foi

adicionado

igual

volume

da

mistura

fenol:clorofrmio:lcool isoamlico (25:24:1) e a soluo centrifugada 5000

rpm por 15 min a 4 C. Recuperou-se a fase aquosa e uma nova extrao foi
realizada. A seguir os cidos nucleicos foram precipitados com a adio de 0,7
volumes de isopropanol. Com o auxlio de um basto de vidro o DNA foi
recolhido, lavado em soluo de etanol 70% e ressuspenso em TE (Tris-base
10 mM pH: 8,0; EDTA 2,0 mM) e mantido por 16 h 4C. Foi adicionada
proteinase K (concentrao final de 50

~gl

mL) e a amostra incubada 37C

durante 2 h. Aps o trmino desta reao, foi adicionado amostra o mesmo

volume de tampo CTAB (Tris-base 0,18 M; Na2EDTA 0,063 M; CTAB 55 mM;
NaCI 1,8 M), pr-aquecido 65C, seguido de incubao 65C por 30 min
para a remoo de polissacardeos. Na etapa seguinte foi realizada uma
extrao com 1X o volume de clorofrmio:lcool isoamlico (24: 1) e a amostra

foi mantida sob agitao durante 1 min e centrifugada a 7000 rpm por outros

1 mino O sobrenadante foi recolhido e os cidos nucleicos precipitados com

adio de 0,6 volumes de isopropanol durante 4 h ( a-20C). Os cidos
nuclicos foram recolhidos com um basto de vidro, lavados com etanol 70% e
solubilizados durante a noite a 4C em tampo TE. No dia seguinte foi
realizada nova extrao com CTAB e depois de precipitada e solubilizada em
TE, a amostra foi incubada com RNase A

(25~g/mL)

por 2 horas, 37C.

Seguiram-se extraes orgnicas com fenol:clorofrmio (5:1) e por fim

somente clorofrmio. O DNA foi precipitado novamente com 0,6 volumes de

63

isopropanol e ressuspendido em TE. Para a quantificao, 5 !J.L foram

utilizados para leitura em espectrofotmetro 00 260 segundo descrito a seguir:

Quantidade de ONA (!J.gl mL)=

A O 50

onde:
A= absorbncia
0= diluio
50= fator de converso para determinar a concentrao de ONA

3.4.2 Obteno da sonda psyAra17

Dos pesquisadores Glenn Bartley e Pablo Scolnik da Ou Pont
americana foi obtido o plasmdeo contendo o gene da fitoeno sintase de
Arabidopsis thaliana (pArapsy17). O clone de 1,769 kb encontrava-se em um

vetor pBluescript SK- com resistncia a Ampicilina (figura 7; mapa de

restrio).

64

Enzimas

.stios .reconhecimento (bp)

Asel
Ban 11
Bgll/
BspHI
BstNl
Bst YI
Cfol
Cla I
Ode I

64,
1410

Dpnl
FoI< I
Hae /I
Hae 11/
HgiAI
Hinc /I
Hind /I
Hind 11/
Hinfl
Hpal
Mnl/

926
1348
699

-52,

926

318,
7a6,
551,
1224,
1413,

754,
1140,

t598

645,
1270,
1507,

766,
1285,
1637,

200,
1074,
1274

TiJ5,

1t90,

1432

1.687
1687
548,
274,

727
423,

452

1128,
120,
1614

1318
123,

1252,

1457,

1572

200,
1074,

T.fJ,
1143

1186,

1193

53,
1022,
B63,
1642
868,
1410
216,
276,
1~,

249,
1138
993,

Sall
Sca I
Styl
Xbal

-50,
1269,
348
992
892
1422
12,
1410
53,
1022,
1269
1571
892,
419,

429

Xholl

52,

926

Muni
Ncil
Ncol
Nhel
Rsa I
Saci
Sal3A

500

5'

1705

97,

1643
1147
1.393
1667
927

1143

1000

927,

1500

3'

Fig. 7. Mapa de ruttio do gene completo{1.73d bp) da~ma moeno sintase de A. thaliana{psyAra17),
utilizado como sonda em experimentos de Southem BIot.

65

sob UV manual e isolada segundo o protocolo descrito a seguir (Heery et ai.,

1990) a fim de ser utilizado como sonda.
As fatias de gel contendo o fragmento de DNA de interesse so
transferidas a um Eppendorf estril e furado (na lateral junto ao fundo) cujo
fundo continha l de vidro compactada (Saiki et ai, 1988). Este foi colocado em
cima de outro Eppendorf estril e o sistema foi centrifugado a 6000 rpm por 10
mino O eludo contendo o fragmento de DNA foi coletado no tubo inferior e a
recuperao pde ser visualizada pelo exame de sua fluorescncia sob UV. O
mtodo indica recuperao de 90% para fragmentos entre 0,1 e 3,0 Kb.

3.4.3 Slot Blots

Como controle da sonda, foram realizados experimentos de Slot-Blots

com o DNA de Arabidopsis thaliana. Cerca de 5 Jlg, 10Jlg e 15Jlg de DNA
genmico de G. polyedra e 5 Jlg de DNA genmico A. thaliana foram
transferidos sob vcuo para uma membrana Zeta-Probe utilizando o sistema
de transferncia "Slot-Blot" da Bio-Rad. Para a marcao radioativa da sonda
e a hibridao foram utilizados os protocolos descritos a seguir (tem 3.4.4).
Aps a incubao, a membrana foi exposta em filme X-Omat AR (Kodak) por 3
dias e procedeu-se a revelao.

3.4.4 Gel de Agarosel Transferncial Hibridao

Aproximadamente 10IJg de DNA genmico de G. polyedra foi digerido

por 24 h com as enzimas de restrio Pst I, Eco RI e Xho I (50 U cada) 37
oCo Uma alquota de 10 JlL (Jlg de DNA ) resultante desta digesto foi
submetido eletroforese em gel de agarose 1,0 % em tampo TBE 1x (TBE
5X: Tris-HCI 0,44 M; Borato 0,44 M; EDTA 10,0 mM). Como controle, foi
aplicado o plasmdeo (-2 Jlg) contendo o gene psy de A. thaliana . A

67

eletroforese foi realizada a 20 V por 16 h. Como padro de peso molecular foi

utilizado o marcador "Ladder" 1 Kb.
Para a eletroforese do DNA foi utilizado o tampo TBE 1x. Aps a
eletroforese, o gel com os fragmentos de DNA foi visualizado sob luz UV e
documentado com o aparelho Image Master VDS (Pharmacia Biotech, USA)
O gel foi desnaturado por 30 min em soluo de NaOH 0,4 M/NaCI 0,8
M, copiosamente enxaguado com gua deionizada autoclavada e os
fragmentos de DNA do gel transferidos por capilaridade para uma membrana
Zeta-Probe em SSC 10X (1,5 M NaCI; 0,15 M citrato de sdio) durante 16 h,
segundo o protocolo descrito por Sambrook et aI. (1989).
Aps a transferncia a membrana foi mantida a 80 C por 2 h, para fixar
o DNA e a seguir hibridada com a sonda psyAra17 segundo os dois protocolos
abaixo (Sambrook et aI., 1989). A membrana foi mantida por 30 min em
soluo de hibridao (pr-hibridao) antes de ser adicionada a sonda
radioativa. Para a marcao da sonda foi utilizado o kit "Random Primers DNA
Labeling System" (GIBCO BRL). Cerca de 25ng de DNA (fragmento de fitoeno
sintase de A. thaliana) foram desnaturados a 95 C por 5 mino Depois que a
amostra estava no gelo, foram adicionados

1~L

de soluo de dATP,

1~L

de

dGTP, 1~L de dTTP, 20~L de tampo (2,5 X), 5~L (-50~Ci) de 32p dCTP,
gua destilada para completar

49~L

e 1~L do Fragmento "Klenow". A amostra

foi incubada a temperatura ambiente por 2 h e a sonda adicionada

membrana imersa em soluo de hibridao. A membrana foi incubada com a
sonda por aproximadamente 16 h, sob agitao constante a 48 ou 42 C e
submetidas as lavagens como descrito abaixo.

Protocolo I
Soluo de hibridao

e pr-hibridao

Pr-hibridar por 2 h 65 oC, remover a soluo e incubar 48' C por 16

h com a seguinte soluo: 5 x SSC; 0,1% SDS; 0,25% leite em p desnatado;
0,2% PVP; 0,2% FicoU

Solues de lavagem

68

Lavar uma vez 48C por 15 min nas solues:

A: 5x SSC; 0,5% SOS

B: 3xSSC

Protocolo II

Soluo de hibridao e pr-hibridao

Pr-hibridar por 15 min 45C e hibridar por 16 horas 42C com a
seguinte soluo: 50% Formamida; Na2HP04 0,12 M pH:7,2; 7% SOS; NaCI
0,25 M; EDTA 1mM

Solues de lavagem
Lavar 42C duas vezes com cada soluo por 15 mino

A: 2X SSC; SOS 0,1%

B: 0,5X SSC; SOS 0,1%

Aps a incubao, a membrana foi exposta em filme X-Omat AR (Kodak)

durante cerca de 3 dias e revelada.

3.4.5 Anlise das Sequncias de Fitoeno Sintase

Aps consulta do GenBank foram obtidas todas as sequenclas de

aminocidos desta enzima que j haviam sido descritas na literatura. De posse
destas

informaes,

organismos

herbicola,

distintos

foram

comparadas

(Arabidopsis

Lycopersicon

estas

thaliana,

esculentum,

sequncias

Capsicum

Neurospora

de

annum;

crassa,

vrios

Erwinia

Rhodobacter

capsulatus; Synechocystis sp.; Synecococcus sp). Foi constatado que existem

algumas regies de cerca de 7aminocidos, distantes entre si em 33
aminocidos, conservadas entre estes organismos. Estes fragmentos de
sequencia so adequados para a construo de "primers" para a gerao de
sondas a partir dos produtos amplificados. A figura 8 mostra o resultado do

69

alinhamento entre as sequncias da enzima fitoeno sintase, executado pelo

programa MACAW (verso 2.05). Os resduos conservados esto destacados
em negrito, ao longo da sequncia de aminocidos. Estes blocos como regies
conservadas foram utilizados para a sntese de "primers" degenerados.

70

BLOCO 1

POSiO NA SEQU~NCIA

Arabidopsis thaliana

KTFYLGT

144-151

Capsicum annum

KTFYLGT

141-148

Lycopersicon esculentum

KTFNLGT

133-140

Neurospora crassa

ETSYLGL

141-148

Rhodobacter capsulatus

YTFHAAS

19-26

Synechocystis sp.

KTFYLGT

61-68

Synecococcus sp

KTFYLGT

31-38

BLOCO 2

POSiO NA SEQU~NCIA

Arabidopsis thaliana

FDMLDAAL

205-213

Capsicum annum

FDMLDAAL

205-213

Erwinia herbicola

RDLNDAAL

167-175

Lycopersicon esculentum

FDMLDGAL

193-201

Rhodobacter capsulatus

FDMEADAL

66-73

Synechocystis sp.

EDDCDVAL

91-99

BLOCO 3

POSiO NA SEQU~NCIA

Arabidopsis thaliana

NILRDVG

294-303

Capsicum annum

NILRDVG

282-289

Lycopersicon esculentum

NILRDVG

294-303

Neurospora crassa

NIARDIV

478-485

Rhodobacter capsulatus

NIARDVG

170-177

Synechocystis sp.

NILRDVG

216-223

BLOCO 4

POSiO NA SEQU~NCIA

Arabidopsis thaliana

GRVYLP

308-314

Capsicum annum

GRVYLP

308-314

Lycopersicon esculentum

GRVYLP

294-300

Neurospora crassa

GRVYLP

490-496

Rhodobacter capsulatus

GRIYLP

182-188

Synechocystis sp.

GRIYLP

128-134

Fig. 8. Estudo comparatillO das sequncias de frtoeno sintase de diferentes organismos disponlveis no GenBank,
Os reslduos conservados esta<> destacados em negrito, ao longo da sequncia de aminocidos. Estes blocos com regies
conservadas foran utilizados para a confeco de "primers"degenerados.

71

3.4.6 Sntese de "primers" degenerados- peR

Oligonucleotdeos foram sintetizados pela Gibco BRl para servirem com

"primers" (iniciadores) das reaes de amplificao. Os "primers" foram
confeccionados

considerando

regies

conservadas

da

fitoeno

sintase

identificadas no alinhamento (figura 8). Estes esto relacionados na tabela 2.

TOO.2. Oligonucleotdios sintticos utilizados como "primers" na anpIiflCaOO do gene da fltoeno sintase por peR,
elaborados partir dos blocos de aminocidos conservados em vrios organismos. Sentido direto (F- fONard), sentido

reverso (R).

...3'
BLOCO 1: F- AA(A.G)ACNTT(T,C)TA(T,C)(C.T)TNACNGG
BLOCO 2: F- TT(T.C)GA(T,C)AT(A,G)(T.C)TNGA(T.C)GCNGCN(T.C)T
BLOCO 2: R- NA(A,G)NGCNGC(A.G)TCNA(A,G)(T,C)AT(A,G)TC(A,G)AA
BLOCO 3: F- GA(T.C)AT(T,C,A)(G.T.C)(C.T)NAG(A.G)(T.C)AT(A.G)TNG(G,T)
BLOCO 3: R- N(C.A)CNA(T,C)NAC(A,G)TC(T.C)CTN(G,A)(C,A,G)(A.G,T)AT(A,G)TC
BLOCO 4: R- NGGNA(A,G)(A,G)TANA(T.C)(T,C)CTNCC

A amplificao por "Polymerase Chain Reaction" (PCR) foi feita aps a

extrao de DNA total de G. polyedra, utilizando -5,0 ng de DNA por
amplificao.

sequncia

alvo,

determinada

pela

hibridao

de

oligonucleotdeos especficos amplificada exponencialmente atravs de

ciclos repetitivos de desnaturao do DNA molde, hibridao dos "primers" e
extenso com DNA polimerase Taq (Sambrook et ai., 1989).
As reaes de amplificao foram realizadas utilizando o Kit PCRREAGENT SYSTEM da Gibco- BRl segundo o descrito a seguir: 5 fll da
soluo de DNA molde (25 ngl J.!l) , 23 J.!l de gua destilada, 5 J.!l de tampo
10X com magnsio para a Taq polimerase (fornecido pelo Kit), 6 J.!l de dNTPs,
5 J.!l de cada um dos dois "primers" (0,25 J.!gl ml) e 1 J.!l de Taq polimerase.

superfcie da reao foi adicionado leo mineral, para evitar a evaporao.

As amplificaes foram feitas em um aparelho de PCR do modelo PTC-1
Cycler da Ufe Technologies Inc. segundo o esquema abaixo:

72

Amplificao por peR

(35 ciclos)

94 C, 7 mino

94C, 1 mino
72 C, 1:30 mino

72 C, 10 mino

39C, 1 mino

4C,oo

Para as reaes de amplificao foram sempre feitos controles positivos

e negativos em paralelo. O controle positivo consistiu da utilizao de um DNA
molde e "primers Mix" disponveis no Kit (Gibco: "peR Reagent System Kit") e
para o controle negativo foi omitido da reao o DNA molde.
Aps a amplificao, uma alquota de 8 JlL foi submetida eletroforese
em gel de agarose 2% em TBE 1X, empregando marcador de peso compatvel

( ~1741 Hinf).

73

3.5 Northern Blots

3.5.1 Extrao do RNA total

Para a extrao e a manipulao do RNA, foram utilizados todos os

procedimentos necessrios para evitar a sua degradao. Todo material foi
autoclavado e colocado em estufa 180C e todas as solues preparadas
com gua Milli-Q tratada com OEPC (0,1%) por 10 h e autoclavada.
As clulas de G. po/yedra foram filtradas vcuo, raspadas do papel de
filtro e maceradas em um almofariz (pr-gelado) com nitrognio lquido at a
pulverizao total, sendo imediatamente armazenadas em freezer a -70C.
Para a extrao do RNA total, as clulas pulverizadas foram suspensas
em tampo de extrao (Tris-HCI (100 nM- pH=9,0); LiCI 8M; 1,00 mL EOTA
0,5M; SOS 10% em H20) e centrifugadas por 10 min 3000 rpm. Ao
sobrenadante foram adicionados 10 mL de fenol: clorofrmio: lcool isoamlico
(24:25:1). Na fase aquosa desta mistura encontram-se o ONA e oRNA
enquanto que na fase orgnica so encontradas protenas, lipdios e as
carapaas das clulas. Aps nova centrifugao do sobrenadante por 10 min
3000 rpm, seguiu-se uma outra extrao com fenol: clorofrmio: lcool
isoamlico.

sobrenadante resultante foi centrifugado por 5 min 3000 rpm,

transferido para um novo tubo, e submetido a extrao com clorofrmio: lcool

isoamlico (24: 1).
Para a precipitao do RNA, foi adicionado cloreto de ltio, ao
sobrenadante da etapa anterior, em quantidade suficiente para que a
concentrao final da soluo fosse de 2M, e incubado -20C por 1h. Esta
soluo foi ento centrifugada por 20 mino 10000 rpm e o sobrenadante
descartado.

precipitado contendo o RNA foi ressuspenso em 600 IlL de H20

e esta soluo foi adicionado LiCI para a concentrao final de 2M. Repetiuse as etapas de incubao -20C por 1h e a centrifugao por 20 mino
10000 rpm.

precipitado foi ressuspenso em gua e a sua concentrao

medida em espectrofotmetro 00260 ,

74

Quantidade de RNA (f.!gl mL)=

A D 40

onde:
A= absorbncia
D= diluio
40= fator de converso para determinar a concentrao de RNA

o RNA foi visualizado sob luz UV e documentado com o aparelho /mage

Master VOS (Pharmacia Biotech, USA)

3.5.2 Obteno da sonda Rull

A sonda da enzima RuBisCo forma 11 proveniente de G. po/yedra foi
enviada pelo Prof. David Morse da Universidade de Montreal (Canad) (figura
9-mapa de restrio). Este fragmento possui 1,3 kb e mostra alto grau de
homologia de sequncia de aminocidos com enzimas de proteobactrias.
Foram utilizados os mesmos procedimentos de isolamento descritos para a
sonda psyAra17 (tem 3.4.2).

75

200

5'

400
I

600

800
I

1000

1200

3'

Fig. 9. Mapa d.e-restfie-do-jeAe-Ga-eA2ima-RuBisGe-tipe~-ee-G.pelyedR3-{1.300-bp},~-como

sonda em experimentos de Northem Blot.

76

3.5.3 Gel de Formaldedol Transferncial Hibridao

As amostras de RNA total extrado de clulas do meio do dia e do meio

da noite, mantidas sob ciclo 12:12 h (claro: escuro), foram submetidas
eletroforese em gel de agarosel formaldedo 1,2% (Sambrook el ai., 1989). s
amostras de RNA (5,0- j.1L) foram adicionados 1,0 j.1L de tampo MOPS 10 x
[MOPS 0,2 M (pH 7,0); NaOAc 80 mM; EDTA 10 mM (pH 8,0)], 3,5 j.1L de
formaldedo 35%, e 10 j.1L de formamida (100%). Esta reao foi incubada em
um banho 65C por 10 min e colocada em gelo por 15 mino cada amostra
adicionou-se 1,0 j.1L de uma soluo de brometo de etdeo (2,0 mg/mL) e 1,0
j.1L de "RNA Loading Buffer" (glicerol 50%; EDTA 1 mM; Bromofenolblue
0,25%; Xileno cianol 0,25%; H 20DEPC 1,48 mL). Uma pr-corrida (20-40 V) por

1 min do gel precedeu a aplicao das amostras, que foram separadas 30 V

durante 4 horas.
A transferncia e a hibridao foram executadas como descritas no tem
3.4.4. A soluo de hibridao empregada, no entanto foi a descrita por
Church & Gilbert (1984) por ser mais adequada para esta sonda.

Soluo de hibridao

e pr-hibridao

As membranas foram pr-hibridadas por 2 h 65C e hibridadas por 16

h, sob agitao na mesma temperatura na seguinte soluo: 1% BSA; 1 mM
EDTA; 0,5 M NaHP0 4 pH 7,2; 7% SDS

Solues de lavagem

As membranas foram lavadas 2 vezes na sol. A e 8 vezes na sol. B por

5 min, substituindo as solues a cada lavagem.
Soluo A:

0,5% BSA; 1mM EDTA; 40 mM NaHP0 4 pH 7,2; 5% SDS

Soluo B:

1mM EDTA; 40 mM NaHP04 pH 7,2; 1% SDS

As membranas secas foram autorradiografadas em filmes X-OMAT 80C por dois dias utilizando "intensitying sreens" e a seguir procedeu-se a
revelao.

77

3.6 WESTERN BLOTS

3.6.1 Obteno de Extrato Bruto Protico

Para a preparao de extratos brutos proticos, culturas densas (10 6

clulasl mL) foram filtradas atravs de um sistema vcuo, utilizando papel de

filtro Whatman como suporte. As clulas retidas neste filtro foram removidas
com esptula e suspensas em tampo fosfato 100 mM (pH 7,5). As clulas
foram rompidas por presso em bomba de N2 sob uma presso de 2000 psi
(Parr lnstr.), por 20 min, em banho de gelo. O homogenado foi centrifugado por
20 min, a 4 C a 12000 g. O precipitado, constitudo por tecas e membranas
celulares foi descartado e o sobrenadante utilizado para anlises posteriores.
O contedo protico de cada amostra foi estimado pelo mtodo descrito
por Bradford (1976) usando o BSA como padro.

3.6.2 SOS-PAGE/ Transferncia para Membrana PVDF

As amostras de extratos brutos proticos de G. po/yedra coletados em

diferentes horrios foram submetidas eletroforese em gel de poliacrilamida
12% em condies desnaturantes (SOS-PAGE), seguindo a metodologia
descrita por Laemmli (1970). O gel de corrida 12% consistiu de:: 12% de
soluo acrilamida/bis-acrilamida em tampo TRIS-base 380 mM, (pH 8,9),
0,4% SOS; 0,3% de persulfato de amnio (soluo estoque 10%) e 0,1%.de
TEMEO. Para o empilhamento foi utilizada a seguinte soluo: 4% de de
acrilamida/bis-acrilamida em tampo TRIS-base 62 mM, (pH 6,8); tampo de
eletrodo: 25 mM TRIS-base, 190 mM de glicina; 0,1% SOS; 0,3% de persulfato
de amnio e 0,1% TEMEO. O tampo de corrida utilizado foi: soluo de 25
mM TRIS-base, 190 mM de glicina e 0,1% SOS.
Foi adicionado s amostras do extrato bruto tampo de amostra [4 X:
SOS 10% (m, v); Glicerol 20% (v, v); 2-mercaptoetanol 30% (v, v); tampo de

78

empilhamento 12,5% e azul de Bromofenol 2% (m, v) em gua deionizada]

com concentrao final de 1 X e a seguir estas foram mantidas a 100C por 5
mino e colocadas em banho de gelo por 15 mino
O contedo protico da protena PCP e da enzima RuBisCo 11 foram
determinados por imunodeteces em "Western Blor (Towbin et a/., 1979),
utilizando-se anticorpos policlonais contra estas protenas purificados de G.
po/yedra. Estes anticorpos marcam bandas proticas especficas de 32 kDa

(PCP) e 55 kDa (RuBisCo 11) quando imunoprecipitados.

Em um sistema BioRad Mini-Protean 11 Slab Cell, aplicamos o extrato
bruto (20 Ilg de protena). Estas amostras foram submetidas eletroforese por
3 h. A diferena de

potencial utilizada na eletroforese foi de 50 V para o

empilhamento e 100 V para a corrida.

Aps a eletroforese, as protenas foram transferidas para uma
membrana de PVDF utilizando o aparelho BioRad Mini Trans-Blot Cell. A
transferncia foi efetuada por 2 h, uma voltagem constante de 100 V em
banho de gelo. O sistema composto por gel de poliacrilamida, papel de filtro e
membrana PVDF estava imerso em uma soluo de transferncia (20 % de
metanol (v, v), 25 mM de TRIS-base, 1% SDS e 190 mM de glicina 190 mM).
Ao final da transferncia, a membrana de PVDF corada com uma
soluo de "Commassie Blue" ("Commassie Blue" 0,1% em metanol 50%) e
descoradas com uma soluo "De-stain" (50% metanol, 10% cido actico
glacial e 40% gua) para que seja verificada a sua eficincia.

3.6.3 Utilizao de Anticorpos Policlonais

A membrana foi incubada com os anticorpos policlonais contra RuBisCo

forma 11 e PCP purificados de G. po/yedra, cedidos pelo Prof. David Morse da
Universidade de Montreal. O protocolo de imunodeteco segue a seguir:

Bloqueio: as membranas foram submetidas incubao em soluo de

albumina srica bovina (BSA) 3% (m, v) em tampo TBS-T [1M Tris (pH 7,4); 5

79

M NaCI; 0,05% Tween 20] para bloqueio de possveis ligaes inespecficas

das protenas de G. po/yedra com os anticorpos primrios e secundrios.
Incubao com Anticorpo-primrio: Os anticorpos primrios AbRuBisCo
11 (anti-RuBisCo forma 11) e AbPCP( anti-Protena ligada a peridinina e cloroflia
a) foram diludos 1:500 e 1:1000, respectivamente, em TBS-T e as membranas
incubadas por 16 h nesta soluo 4 C sob agitao. A lavagem do excesso
de anticorpo primrio da membrana foi efetuada sob agitao durante 30 min
com trs trocas de tampo TBS-T em temperatura ambiente.
Incubao com Anticorpo-secundrio: As membranas foram ento
tratadas seguindo o protocolo do reagente ECL. Estas foram incubadas por 3 h
com anticorpos secundrios conjugados peroxidase (diluio de 1:5000, em
TBS-T). A membrana foi lavada como descrito anteriormente. As membranas
foram colocadas sobre um filme plstico e a elas foram adicionados os
reagentes 1 e 2 do Kit ECL. Aps a retirada do excedente desta soluo (1+2),
o filme plstico foi fechado e as membranas colocadas em um cassete (todas
as etapas subsequentes foram realizadas sob luz fotogrfica vermelha). As
membranas envolvidas pelo filme plstico foram expostas ao filme Hyperfilm
por 3 mino e o filme prontamente revelado.

80

4. RESULTADOS

4.1 Anlises por HPLC

A extrao utilizada e as condies cromatogrficas empregadas

permitiram separar os pigmentos de G. polyedra investigados: clorofila a, pcaroteno e a xantofila peridinina (figura 10). Para a identificao e
quantificao do p-caroteno e da clorofila a foram utilizados padres
comerciais como descrito no tem 3.2.1 de material e mtodos. Para a
identificao e quantificao da peridinina utilizou-se um padro purificado e
caracterizado em nosso laboratrio (Pinto Jr. et aI., 2000). Todos os pigmentos
analisados foram caracterizados por espectroscopia de massa (MS) pelo
nosso grupo. A figura 10 mostra um exemplo do perfil cromatogrfico de uma
das amostras analisadas.

81

mAbs

~ill

100

""'"

.~[

I'
50
,

o
o

Al

11

10

,,-

.-

3
j,

10-

t'

'[]
o

10

10

15

20

15 MIft

25 mino

Fig. 10. Cromatograma obtido em anlise por HPLC a 452 nm dos pigmentos de clulas mastigotas de G. poIyedra.
Pico 1: peridinina; pico 2: clorofila a e pico 3 P-caroteno. direita, visualizam-se os perfis cromatogrficos dos
padres utilizados. A- peridinina; B- clorofila a e C- p-caroteno. Detalhes: vide Material e Mtodos.

82

4.1.1 Variao Circadiana nas diferentes Irradiaes

Os resultados mostram uma variao circadiana significativa na

quantidade de

~-earoteno

ao longo das 36 horas de experimento nas clulas

mantidas em ciclo claro: escuro (12:12 h), com a luz branca incidente durante
o perodo de luz (figura 11 a). O grfico mostra que a maior quantidade deste
carotenide ocorre durante o meio do dia (5,31O,25 J-lmol X 10~ cl.) e que a
menor ocorre durante a noite (2,60O,15 J-lmol X 10~ cl.). Esta variao na
quantidade parece ser resposta um controle endgeno, pois, o ritmo persiste
em condies de luz constante (figura 11 b).
Com o intuito de verificar os efeitos da qualidade de luz sobre o relgio
biolgico, as clulas foram submetidas a trs faixas de luz "monocromticas":
luz vermelha, luz verde e luz azul (espectros de absorbncia visualizados na
figura 5). Considerando-se as clulas mantidas sob luz azul e luz verde
durante o perodo de luz (figura 12 a e b) verifica-se que sob estas irradiaes
no ocorreram diferenas significativas em relao ao controle (mantido sob
luz branca) no ritmo circadiano da quantidade de

~-earoteno.

Por outro lado,

as clulas expostas no ciclo claro: escuro luz vermelha durante o perodo

iluminado (figura 12 c), apresentam uma alterao no ritmo, que diminui em
amplitude, e sofre um deslocamento de 3 h no seu mximo, no segundo
perodo de luz. Este deslocamento pode estar caracterizando um aumento do
tamanho do perodo deste ritmo ('t) em relao ao controle (figura 11 a).
As quantidades de peridinina e clorofila a (J-lmol X 10~ cl.) ao longo das
36 horas de experimento no variaram de maneira significativa. As figuras 13 e

14 mostram que a razo peridininal clorofila

a tambm no variou

significativamente a despeito das diferentes irradiaes que foram expostas

as clulas.

83

-r----~--::'----'-----=------------_'_,.

I r

CF

II

9"

24

18

12

30

36

tempo (~l

6~-'--~~1'
o

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o

6.

12

18

24

30

36

tempo (h)

Fig. 11. Anlise por HPLC da quantidade de p- caroteno (lJITIol X 1~ cl.) em G. polyedra ao longo de 36 h.
A: clulas manpdas.sobr~ o.ciclo ~o: .escuro-{C: EJ j2:12./l) ~-8: cJulas-mantidas sob luz ~nte a1en. 30%
(C: C AI")' A rea sombreada representa a noite ou a noite subjetiva no caso das clulas expostas luz constante.
Os experime~osforam realizados em triplicatas e os dados representam a mdia e o desvio padro dos mesmos.

84

Fig. 13. Anlise por HPLC da razo peridininal clorofila a em G. polyedra ao longo de 36 h.
A: clulas mal)tidas "sobr~-() ~icloclaro: -escuro -{C: 8 -12: 12 h)-eB: clulasmafllidas sob luz
constante atenuada 30% (e: CAI..,)' A rea sombreada representa a noite ou a noite subjetiva
no caso das e4luJas~stas.luz constante. OsexpeLimentos foram Iealizados~m1ripcatas
e os dados representam a mdia e o desvio padro dos mesmos.

86

O+.---...:.......:.--'r-~=--::----"i'-:':""""'O'---.:-~...----.:::-.-...--,----""-=--'-r'---=-""------'l

.0

: - 6

O+---c--'-:"''-'''----i''"-'-':-.;;..;;->L:-::::..;--=~':_'_-_F_....c..:.~-'''-_T_~'''-''''''''-_'_1''---.---:-''''''--___i

36

Fig_ 14. Anlise por HPLC da razo peridininal clorofila a em G_ poIyedra ao longo de 36 h.
Clulas manti~ssobr.e o cicIo.cla~.escuro (12:12J:l). A: luzazuloo.per.odo de.luz; B: luz
verde no perodo de luz e C: luz vermelha no periodo de luz. A rea sombreada representa
a noite (periodp de escuro). Os experimentos foram realizados em triplicatas.eos.dados representam a mdia e o desvio padro dos mesmos.

87

4.1.2 Induo da Sntese de Pigmentos em Clulas do Escuro

Curva de Dose- Resposta

A figura 15 mostra a curva Dose-Resposta para a o aumento na

concentrao de J3-caroteno (J.lmol X 100$ cl.) em porcentagem do valor
mximo obtido. Verificou-se que o maior aumento ocorre quando as clulas do
perodo noturno so expostas por 45 minutos luz branca.

Induo Mxima de p-caroteno

Quando as clulas de diferentes horrios do perodo noturno so

expostas por 45 minutos luz branca, a maior resposta indutiva, isto , o
aumento da concentrao de J3-caroteno (J.lmol X 100$ cl.) verificada nas
clulas do meio da noite (18 horas aps o incio da luz) como podemos
evidenciar na figura 16.

88

durao do pul$o (ri.n.)

""':.

Fig. 15. Induo do aumento na concentrao de ~-caroteno (J.ISTl01 1(}li cl.). As clulas do perodo noturno
foram expostas por diferentes intervalos de tempo (pulsos) luz branca (69 /I. moi. m-2 . S-1) e a quantidade
de ~ -caroteno avaliada por HPLC. Os dados foram plotados em porcentagem do valor mximo obtido e
representam a mdia de seis experimentos.

89

Fig. 16. Induo mxima de p-caroteno. Clulas de diferentes horrios do perodo noturno foram expostas por 45 rnin
1~ cl.) presente nestas clulas avaliada por HPLC. Smbolos
abertos representam as clulas induzidas e smbolos fechados o controle. Incio do perodo de escuro: 12 h. A rea
sombreada indica o perodo de escuro.

luz branca e a quantidade de P-caroteno (fJITlol.

90

A tabela 3 apresenta os resultados da anlise por HPLC da induo de

peridinina e clorofila a (em IJmol X 10-6 cl.) em clulas de G. po/yedra do meio
do perodo escuro por exposio de 45 min a diferentes irradiaes: azul,
vermelha, verde e branca. Como controle foram utilizadas clulas do meio da
noite.

Tal.> 3. Concentraao de peridinina e clorofila 8 (Ilmol X 1<r' cI.) e razo peridininal clorofila 8 em G. poIyedm

aps induo. Clulas do meio da noite foran elCpOStas por 45 min diferentes inalialles (branca, azul, Ie'de e Ie1T1ElIha)
na mesma intensidade (69 IJmoI. m-2s-1) e a quantidade destes pigmentos avaliada por anlise por HPLC. Os experimentos
foram realizados em triplicatas e os dados representam a mdia e o desvio padrAo dos mesmos.

peridinina

clorofila a

Peridininalclorofila a

Controle

49,693,50

10,B71,SO

4,SO0,01

Branca

49,612,SO

10,941,70

4,SO0,01

Azul

46,403,60

10,9S2,60

3,60O,30

Verde

47,432,BO

11,132,10

3,90O,06

Vermelha

49, 143,00

11,072,90

4,10O,03

Nenhuma alterao significativa foi verificada nas concentraes de

peridinina e clorofila a em resposta exposio das clulas por 4S min as
luzes branca e vermelha em relao ao controle (no expostas). Por outro
lado, as clulas expostas a luz verde e luz azul apresentaram uma reduo
significativa desta razo. Quando consideramos os nveis de

~-caroteno,

estes

revelam um aumento significativo em resposta as luzes branca, azul e verde

como mostrado na figura 17, sugerindo que a induo da sntese deste
pigmento ocorra atravs de um fotorreceptor de luz azul/verde.

91

Fig. 17. Induo da sntese de p-caroteno em G. poJyedra. Clulas do meio da noite foram expostas por 45 minutos
diferentes irradiaes (branca, azul, verde e vermelha) na mesma intensidade (69 lJITlol . m- 2 . SI) e a quantidade
de f3-caroteno (lJITlol . 1~ cl.) presente foi avaliada por HPLC. Estes experimentos f oram realizados em triplicatas
e os dados representam a mdia e o desvio-padro dos mesmos.

92

4.1.3 Quantificao dos Pigmentos em Cistos.

A forma cstica de G. po/yedra foi induzida por abaixamento da

temperatura e dias curtos como descrito no tem 3.1.4 e os seus pigmentos
analisados. A figura 18 apresenta um exemplo do perfil cromatogrfico de
extratos metanlicos obtidos de clulas encistadas analisados por HPLC.
Comparando-se a figura 18 com a figura 10 (clulas mastigotas) observa-se
um aumento no pico relativo peridinina (1) e uma reduo nos picos
referentes a clorofila a e fl-caroteno (2 e 3). A tabela 4 mostra os resultados da
concentrao dos pigmentos identificados (f.1mol X 10-Q cl.) e a razo
peridininat clorofila a em cistos e em clulas mastigotas (controle) nas
tiplicatas.

Tab. 4. Quantidade (I!moI X 1~ cI.) de cada pigmento e

razao entre as qua'1tidades de peridinin&'cIorofila 8

e l3-

caren<Y'cIorofila 8 estimadas por aMIise por HPLC nos extratos metanlicos obtidos de cistos e clulas mastigcias de G.
poIyedra. As clulas de G. poIyedra forem induzidas ao encistanento (100% de clulas encistaias) por estarem crescendo

sOO ciclo cla"o: escuro (10:14 h) a 15 C; como cootrole focam utiIizacIas clulas mastigOOls do mesmo horrio, crescendo
sOO ciclo cla"o: escuro (12: 12h) e temperatura de 20" C. Estes resultados se referem s mdias e desvios-padro entre

as triplicatas.

peridinina

clorofila a

p~aroteno

peridlnlnaf

lJ-carotenol

clorofila a

clorofila a

Cistos

59.H 1,3

4,7O,6

1,8O,1

12.61,7

O.3O,OO1

Controle

5O.4O.6

10,5O.2

4,4O.1

4.8O,1

O.4O,O2

A anlise da tabela 4 indica que os pigmentos nos cistos de G. po/yedra

apresentam uma situao diferente do controle. verificado um aumento
significativo na quantidade de peridinina (20%) e uma diminuio drstica na
concentrao da clorofila a (55,17%) e do fl-caroteno (59,41%) nas clulas
encistadas quando comparadas com as clulas mastigotas. A existncia de

93

uma alterao significativa na razo entre as quantidades peridininal clorofila a

nos cistos, sugere uma possvel reorganizao do maquinrio fotossinttico.

94

"mAbs
100

50

I
~

,
~
"

o
o

"

J..

iUI~
~\ f
lJ

10

0.

15

20

25 mino

Fig. 18. Cromatograma obtido em anlise por HPLC a 452 nm dos pigmentos de cistos de G. poIyedra. Pico 1: peridinina;
2: clorofila a e 313 -caroteno. Detalhes: vide Material e Mtodos.

95

4.2 Supresso de O~CAg) por Carotenides de G. polvedra in vitro

Os carotenides presentes em G. po/yedra foram mais eficientes em

suprimir o 02CAg) gerado quimicamente que o ~-caroteno comercial (figura
19). A figura 19 mostra os resultados do ensaio de oxidao do Rubreno onde
utilizamos a termodissociao do 1,4- dimetilnaftaleno para gerar o 02CAg). A
partir da inclinao das retas, derivaram-se os valores de kt =kq + k, , usados
na equao de Stern-Volmer. Os valores da constante de supresso de
02CAg) k t calculados foram de 2,04 X 109 M-1
e 4,75 X 109 M-1

S-1

S-1

para o ~-earoteno comercial

para o extrato de carotenides de G. po/yedra.

Considerando tais valores pode-se sugerir um papel eficiente e importante dos

carotenides em suprimir o 02CAg) gerado nos cloroplastos nesta alga.

96

rubreno oxidado

':;.

Fig. 19. Anlise de Stem-Volmer. Os dados representam a supresso do O2 (ll'>g) gerado quimicamente pela
termodissociao do DMN02' pelo extrato de carotenides de G. polyedra e l3-caroteno comercial em clorofrmio, monitorada em espectrototmetro. Smbolos abertos: extrato de carotenides e smbolos fechados:
l3-caroteno comercial. Detalhes: vide Material e Mtodos.

97

4.3 Slot-Blots
Para determinar se o fragmento de fitoeno sintase proveniente de
Arabdopss thalana (psyAra17) era capaz de reconhecer e hibridar com o

DNA

de G. po/yedra foi realizado um "Slot-Blot". Na figura 20, podemos

observar que ocorreu a hibridao da sonda psyAra17 apenas com o DNA de

A. thalana, controle positivo. Apesar da realizao das hibridaes em

condies de baixa estringncia, no houve nenhum sinal de reconhecimento

desta sonda pelo DNA de G. po/yedra. Novas condies de hibridao em
"Southern Blots" foram ento testadas na expectativa de que, com o DNA total
de G. po/yedra digerido por enzimas de restrio, o resultado fosse positivo.

98

Southem blots
A
1 2 3 4 5

B
1 2 3 4 5

1636 bp

1769 bp

1018 bp

Fig. 21. Hibridao em Southem blots com a sonda psyAra17 de A. thaliana. A: Resultado da digesto
do DNA genmico de G. polyedra (10 1J9) em gel de agarose 1%. Canaleta 1: padro de peso molecular,
2: DNA digerido; 3: DNA no digerido, 5: plasmideo coma a sonda psyAra17. B: Autorradiografia da
hibridao com a sonda psyAra17.Verificamos a hibridao apenas com o plasmdeo (canaleta 5).

101

4.5 Northem Blots

Com o objetivo de verificar se a enzima RuBisCo forma 11 (Rull) presente

em G. po/yedra apresentava variao circadiana na quantidade do seu RNAm,
foram realizados experimentos em "Northern Blot". A figura 22 mostra que a
quantidade do transcrito rull no variou, pois encontramos as mesmas
quantidades deste nas clulas do meio do dia e do meio da noite, o que
sugere um controle no-transcricional deste gene.

102

Northern b/ot

A
Dia Noite

B
Dia Noite

1,3 kb

Fig. 22. Hibridao em Northem blotde RNA total de clulas de G. polyedra, coletadas no meio do dia e no meio da
noite, com a sonda Ru 1/. A: RNA total (2 f.IQ) em gel de Formaldeido 1,2%; B: Autorradiogratia mostrando o resultado
da hibridao com a sonda RU 11 (1,3 Kb).

103

Quando as concentraes destas protenas em clulas mastigotas

(controle) e clulas encistadas de G. po/yedra foram comparadas, verificamos
que a quantidade da Ru 11 permanece inalterada mas a PCP se encontra
diminuda nos cistos em relao ao controle (figura 25 a e b).

105

Westem blots

55kDa

32kDa

c:::::::>

18

24

12

18

24

tempo(b)

..

55kDa

32kDa
~

"'....
-,2

'

R_

!.i 100
oe

96

12
tIImpo(1I1

18 .

24

12

18

24

tempo (li)

Fig Z3. W8stem biole anlise densitomtrica correspondente. A: AbPCP .cluJasmantidas em C: E; B:AbRuJl
clulas mantidas em c: E; C: AbPCP nas clulas mantidas C: C-.; e O: AbRull nas clulas C: CAl., 30%
(canaletas 8-12), As clulas folam coletadas.a.cada 6 hao longo de 24.11, Detalhes em Material e Mtodos.

106

Western blots
55kDa

32kDa

12

18

36'

24

titmpo(hl

B,

12

18

24

30

24

30

tempo (h)

55kDa

32kDa

12

,18

24

30
.....:'

36

tempo (h)

55kDa

32kDa

titniliO (h)

F.

12

18

36

tempo(h)"

Fig. 24. Westem blot e anlise densitomtrica correspondente. A: AbPCP clulas mantidas em c: E (luz azul); B: AbRull
clulas mantidas em C~ E (luz azul); c: .AbPCP clulas mantidas em c: E (luz verde);D: AbRull.clulas mantidas em C~ E
(luz verde) ; E: AbPCP clulas mantidas em C: E (luz vermelha); F: AbRull clulas mantidas em c: E Ouz vermelha). As
clulas foram coletadas cada 6 h ao longo de 36 h de experimento. Detalhes em Material e Mtodos.

107

Western blots

32 kDa
~

55kDa
~

Fig. 25. Westem blot e anlise -densitomtficacorrespondente. A: AbPCP- canaletas 1 e 3

clulas mastigotas (controle) e 2 e 4 cistos; B: AbRull- canaletas 1 e 3 clulas mastigotas
(controle) e 2 e 4 cistos. Detalhes em Material e Mtodos.

108

5. DISCUSSO

5.1 Variao Circadiana nas diferentes Irradiaes

A maior quantidade de peridinina (valores mdios entre 46,3 - 50,4 Jlmol

X 10-Q cl.) encontrada nas clulas de G. polyedra nos experimentos esta de
acordo com os resultados preliminares de Knoetzel & Rensing (1991) que
sugerem que este o pigmento mais abundante nesta alga. A maioria dos
dinoflagelados possui a peridinina como carotenide predominante. Este
pigmento forma um complexo com a clorofila, conhecido como PCP (peridinin:
chlorophyll a: protein), possibilitando que o organismo capte energia solar na
regio azul/verde do espectro (470 550 nm), a qual inacessvel para a
clorofila (Hoffman et aI., 1996). Estudos mostram que 60% da peridinina esto
ligados aos centros de reao PS I e PS 11 e os outros 40% esto ligados ao
PCP (Knoetzel & Rensing, 1991). Em G. polyedra a razo no complexo PCP
de 4 molculas de peridinina para 1 molcula de clorofila (Song et aI., 1976).
Os resultados obtidos mostram que os valores mdios da quantidade de
clorofila a variaram entre 10,8 -

11,1 Jlmol X 10-Q cl. ao longo dos

experimentos, valores que esto coerentes com os apresentados na literatura.

Estudos preliminares com dinoflagelados (Hastings, 1961; Przelin et aI.,
1977) verificaram que os dinoflagelados Ceratium furca, Glenodinium spp e G.

polyedra apresentavam ritmo circadiano no seu PSII mas que as quantidades

de peridinina e de clorofila a no variavam em 24 h, ou seja, eram constantes
ao longo do ciclo circadiano'. Os resultados obtidos por anlise em HPLC
confirmam estas evidncias preliminares. Ao longo do experimento (36 h) a
concentrao destes pigmentos (peridinina e clorofila a) variou de forma
aleatria e no significativa (dados no mostrados). Shimura et aI. (1975)
testaram as mesmas radiaes monocromticas (verde, azul e vermelha) em
culturas da diatomcea Phaedactylum tricornutum e tambm no evidenciaram
alterao na composio dos pigmentos destas algas.

109

Os valores mdios da quantidade de

~-caroteno

encontrada nas clulas

de G. polyedra variaram entre 2,6 - 5,3 !J.mol X 1O~ cl. ao longo do dia.
Observando-se a figura 11, que mostra a variao na quantidade de

caroteno durante o perodo circadiano, pode se verificar que este pigmento

est presente nesta alga em quantidade duas vezes maior durante a fase de
claro em relao a fase de escuro. Alm disso, essa oscilao diria ritmica,
mantendo a caracterstica circadiana mesmo quando as clulas so colocadas
sob claro constante (figura 11 a e b). Przelin et aI. (1977) tambm
observaram que clulas de Glenodinium spp, transferidas para condies de
luz constante

atenuada,

no apresentavam

alterao

significativa

na

quantidade de seus pigmentos e que o ritmo circadiano da capacidade

fotossinttica persistia.
Johnsen & Sakshaug (1993) afirmam que o fitoplancton tm a capacidade
de rapidamente adaptar a sua composio de pigmentos e caractersticas biopticas qualitativa e quantitativamente em resposta variaes no regime de
luz (irradincia, composio espectral e durao do dia). Dessa forma, seria
esperado uma alterao significativa na abundncia de cada pigmento,
principalmente um aumento nos pigmentos antena como a peridinina, quando
as clulas de G. polyedra fossem expostas luz branca constante atenuada.
Os experimentos de Iglesias-Pietro & Trench (1997) mostraram que a
quantidade de

todos

pigmentos

presentes

aumentada

quando

os

dinoflagelados Symbiodinium microandriaticum, Cassiopeia xamachana e

Symbiodinium kawanagutti, so mantidos em condies de iluminao

constante atenuada (abaixo da intensidade utilizada na fotossntese). Schubert

et aI. (1994) e Johnsen & Sakshaug (1993) tambm observaram um grande

aumento na quantidade de todos pigmentos em microalgas cultivadas em luz
atenuada. Przelin et aI. (1977) observou um aumento na concentrao de
peridinina, clorofila

e clorofila C2, partir de 6 h em iluminao constante

atenuada em Glenodinium spp; e verificou que a razo peridininal clorofila a

aumentava. Em G po/yedra submetida a iluminao constante atenuada este
aumento na razo peridinina/clorofila a foi muito discreto (figura 13 a e b).
Talvez a resposta no tenha sido to evidente porque a atenuao utilizada

110

neste trabalho foi de 30% e nos experimentos de Przelin et alo (1977) a luz foi
atenuada em 50-90%.
Segundo Murtas & Millar (2000) os componentes do sistema circadiano
sofrem influncia da qualidade de luz incidente. O sinal luminoso que chega ao
relgio biolgico resulta das contribuies de mltiplos receptores: alguns
destes funcionando em resposta comprimentos de ondas especficos. Os
principais fotorreceptores j descritos so os fitocromos, que captam a luz na
faixa infra-vermelhol vermelho, e os criptocromos, que absorvem luz azul
(reviso em Bognar et a/., 1999). Em plantas verdes, j foi observado que
existe regulao por luz da transcrio de alguns genes mediada via fitocromo.
Entretanto, os fitocromos foram detectados somente em clorofitas (algas
verdes), implicando que devam existir mecanismos alternativos para respostas

luz vermelhal infra-vermelha nos outros grupos de algas (Lohuis & Miller,
1998). Segundo Cashmore et alo (1999), as flavinas e as clorofilas poderiam
ser responsveis pela fororrecepo da luz vermelha.
Em G. po/yedra observou-se uma diminuio na quantidade de

J3-

caroteno no CT 6 (meio do dia) nas clulas mantidas sob luz vermelha em

relao ao controle (figura 12 c). Considerando todas as outras radiaes
monocromticas utilizadas no presente trabalho, o fl-caroteno manteve o ritmo
circadiano em sua concentrao observado no controle (figura 11 a) quando
as clulas foram expostas luz azul (figura 12 a) em ciclo claro: escuro e luz
verde em ciclo claro: escuro (figura 12 b). A semelhana entre as respostas
luz branca, azul e verde pode ser explicada pelos espectros de absoro
destas radiaes. Os espectros da luz verde e da azul sobrepe-se nos
comprimentos de onda prximos 500 nm e na luz branca sabe-se que existe
um forte componente de luz azul. Levando-se em considerao os resultados
em resposta luz vermelha e o fato da oscilao circadiana na quantidade
deste pigmento persistir mesmo em condies constantes (luz branca
atenuada em 30%), conclumos que a variao na concentrao de fl-earoteno
ao longo do dia est ligada ao relgio biolgico. Os resultados sugerem que o
fotorreceptor envolvido na transduo de sinal do meio externo ao oscilador
um fotorreceptor de luz azul. Recentemente Cashmore et alo (1999) mostraram
que a habilidade de perceber e responder luz azul (400-500 nm) est
111

disseminada entre plantas e animais, e os exemplos so a produo de

antocianinas e carotenides em plantas e fungos e o arrastamento de fase de
ritmos em moscas e mamferos. Por muitas dcadas a natureza deste
fotorreceptor tem sido discutida. Alguns autores sugerem que seja uma
flavoprotena e outros especulam que este fotorreceptor contm um
carotenide ou um cromforo retina!. No caso de G. po/yedra, o p-caroteno
poderia ser um fotorreceptor ligado transduo de sinal do oscilador
controlando a sua prpria sntese, pois a induo da sntese mxima no
mesmo horrio em que existe o deslocamento de fase. Os resultados mostram
que quando as clulas so expostas luz vermelha (figura 12 c) existe uma
diminuio na amplitude do ritmo da quantidade de p-caroteno. Alm disso,
existe no segundo perodo de luz (aps 24 h) um deslocamento do mximo em
3 h, indicando um aumento do tamanho do perodo.
Morse et alo (1994) observaram que o ritmo da bioluminescncia em
clulas de G. po/yedra expostas luz vermelha, teve o tamanho do seu
perodo aumentado, enquanto que a luz azul provocou o efeito inverso. Estes
autores observaram ainda que o ritmo de agregao das culturas de G.
po/yedra no ocorria sincronizado com o ritmo de bioluminescncia, sugerindo

que nesta alga estavam presentes dois osciladores: O oscilador do tipo "'A"
responderia luz azul, e a este oscilador estariam associados os ritmos de
bioluminescncia, diviso celular e fototaxia. O segundo oscilador, o tipo "B",
responderia tanto luz azul quanto a luz vermelha e controlaria os ritmos
descritos de fotossntese, agregao e atividades de SOD e Nitrato Redutase
em G. po/yedra. Em um trabalho posterior, Morse et alo (1996) sugeriram que
existam mais de dois osciladores controlando os ritmos circadianos nesta alga.
Os resultados do ritmo de sntese de p-caroteno indicam que este esteja
ligado ao oscilador tipo "A" ou que um oscilador, que responda tanto luz azul
quanto luz verde, tambm deva existir em G. po/yedra.

112

5.2 Induo da Sntese de Pigmentos em Clulas do Escuro

No ambiente natural, os ritmos dirios so arrastados a perodos de 24

h pela alternncia do ciclo claro: escuro. Estas mudanas na intensidade
luminosa alimentam um oscilador circadiano interno que controla vrios
processos bioqumicos e fisiolgicos. O arrastamento ocorre quando a luz
desloca a fase do oscilador, alterando assim a fase do ritmo (Johnson &
Hastings, 1989). A extenso e a direo do deslocamento depende da fase na
qual a luz administrada.
A curva de dose-resposta (figura 15) mostra que um pulso de luz de 45
min suficiente e capaz de induzir a sntese de p--earoteno em clulas do
perodo noturno (CT 18), sugerindo uma rpida mobilizao desta via
biossinttica quando necessrio. interessante ressaltar que a concentrao
dos outros pigmentos analisados no apresentam variao significativa (tabela
3). O aumento na quantidade de p--earoteno pode ser devido uma rpida
mobilizao de defesas anti-oxidantes, pois nesta situao de iluminao
inesperada (perodo escuro), muitas das enzimas, responsveis pela defesa
anti-oxidante, como por exemplo a SOO encontram-se em menor quantidade
(Asano et ai., 1995). Zhang et ai. (1999b) mostraram que no meio do perodo
de claro (seis horas aps o incio da luz), onde a fotossntese mxima, ocorre
um aumento na quantidade de p--earoteno ligado ao citocromo

btl Estes

autores sugerem que esta ligao aumentaria a proteo do aparato

fotossinttico contra danos oxidativos. Um outro papel do p--earoteno no PS 11
garantir a integridade da protena 01. A protena D1 a protena central do
PS 11 e sua integridade essencial para que a fotossntese ocorra (Shapira et
ai., 1997). Em Chlamydomonas reinhardtii, Trebs & Oepka (1997) observaram
que em clulas tratadas com um inibidor da sntese de p--earoteno, o
norflurazon, aps uma hora de exposio luz, no detectou-se mais protena
01 presente ou um PS 11 funcional. Portanto, parece lgico ter-se observado
nos experimentos descritos, uma rpida sntese de p--earoteno, um pigmento
to essencial para a manuteno da integridade do maquinrio fotossinttico.

113

As clulas de G. polyedra do meio da noite (18 horas aps o incio da

fase clara) apresentaram a induo mxima da sntese de

~-caroteno,

quando

expostas por 45 min luz branca. Essa exposio dobrou a quantidade de

p-

caroteno presente nas clulas do meio perodo noturno, atingindo valores

similares queles das clulas do dia (figuras 16 e 17). Isto caracteriza um
reajuste de fase do oscilador interno ligado sntese de

~-earoteno,

pois

ocorreu um avano de 12 h no perodo deste ritmo. A induo mxima de

sntese de p-earoteno ocorre no mesmo perodo do dia (CT) em que
observamos a mudana de fase (CT18), sugerindo que este polieno possa
estar agindo como um composto captador de luz (fotorreceptor) para o
mecanismo central de temporizao do relgio biolgico.
O mais importante sincronizador para os ritmos circadianos a
alternncia claro: escuro. As alteraes na intensidade luminosa alimentam um
oscilador central circadiano, o qual por sua vez, temporiza vrios processos
bioqumicos e fisiolgicos. O arrastamento ocorre quando a luz desloca a fase
do oscilador, causando uma mudana de fase no ritmo (Pittendrigh & Minis,
1979). A extenso e a direo do deslocamento dependem da fase na qual o
estmulo luminoso dado (Johnson & Hastings, 1989). A representao grfica
da fase de deslocamento de um ritmo contra a fase em que a luz foi
administrada durante o perodo escuro produz a curva de resposta de fase
(PRC). Em G. polyedra, a PRC mostra um pico no CT 18. Mudanas no
perodo circadiano em funo da irradiao so frequentemente explicados em
termos de resposta fase- dependente do dado oscilador luz. Um pulso de luz
administrado na poro avanada do PRC, acelera o relgio e na poro
atrasada do PCR, desacelera o relgio. O arrastamento representa o
equilbrio, onde a quantidade de deslocamento de fase induzida a cada ciclo
igual a diferena entre o perodo natural (....24 h) e o perodo em condies de
luz constante (Di Mascio et aI., 1995). Embora saiba-se que o deslocamento de
fase envolva o mecanismo central de temporizao do relgio biolgico, os
intermedirios do processo de deslocamento de fase e os fotorreceptores so
ainda desconhecidos.

114

Quando as clulas do meio da noite foram expostas diferentes

irradiaes, verificou-se a induo da sntese de l3-earoteno em clulas
expostas luz branca (controle), azul e verde. Estes resultados confirmam que
o fotorreceptor envolvido na sntese deste pigmento um fotorreceptor de luz
azul/verde. Em G. po/yedra, a exposio a luz vermelha no induz a sntese de
l3-earoteno. A no induo da sntese de l3-earoteno por luz vermelha foi
tambm observada em outros organismos, como por exemplo Verlicillium
agaricinum, no qual como em G. po/yedra, a luz azul induz a carotenognese

com aumento de l3-earoteno e a luz vermelha no interfere na sua sntese

(Hsiao & Bjam, 1982).
A foto-induo da sntese de carotenides em micro-organismos tm sido
extensivamente estudada (Cerd-Olmedo, 1987; Rau & Schrott, 1987). Em
bactrias como Myxococcus xanthus, a luz azul necessria para que ocorra a
sntese de carotenides (Buchard & Hendricks, 1969) e estes tambm so
induzidos pela luz verde. Fontes et alo (1993) verificaram que a luz azul ativa a
sntese de carotenides em microorganismos eucariticos. A foto-induo da
biossntese de carotenides em N. crassa uma resposta luz azul (De Fabo
et a/., 1976). Lang-Feulner & Rau (1975) demonstraram que a carotenognese

no fungo F. aquaeductuum normalmente induzida somente por luz azulou

prxima a UV. Infelizmente, nenhum destes organismos se comporta como o
nosso dinoflagelado, por serem no fotossintetizantes. Os experimentos
destes autores mostram que clulas crescendo no escuro, somente aps a
exposio luz apresentam pigmentos carotenides. Poucos autores discutem
qual pigmento carotenide especificamente acumulado, normalmente
tratando o resultado como um todo (medindo a absorbncia a 452 nm em
espectrofotmetro), o que impossibilita uma comparao com nossos
resultados.
O trabalho de Lyman (1980) com Eug/ena sp., relata um aumento rpido
da biossntese de clorofilas (a e b) quando estas algas so expostas s luzes
azul, vermelha e amarela. Em Ch/amydomonas reinhardtii, Herman et alo
(1999)

verificaram

que o gene da

enzima

glutamato

1-semialdedo

aminotransferase, que participa na biossntese de clorofila, induzido somente

por luz azul. No foi verificada uma alterao na quantidade de clorofila a em
115

G. po/yedra, a despeito da faixa do espectro luminoso sob a qual esta alga

cresceu por 36 h. Isto sugere uma sntese independente da luz ou que
mltiplos fotorreceptores traduzam o sinal para o oscilador, garantindo que
esta biossntese ocorra sempre. A reduo na razo peridininal clorofila a
observada nas clulas expostas luz azul e verde talvez esteja relacionada ao
controle enzimtico de uma etapa posterior a sntese de p-earoteno, que leva
formao da peridinina, na via biossinttica dos pigmentos carotenides
nestas irradiaes em G. po/yedra.

5.3 Quantificao dos Pigmentos em Cistos

Alm da luz, a temperatura tambm pode ser considerado um importante
temporizador externo, causando alterao nos ritmos em plantas (Kreps &
Simon, 1997). Foi observado por Hardeland (1994) que clulas de G. po/yedra
crescendo 150 C com um dia curto (10:14) so 100 % induzidas ao
encistamento aps serem mantidas por 4 dias nestas condies.
Foi verificado que aps o encistarnento G. po/yedra apresenta uma
alterao na sua composio de pigmentos (figuras 10 e 18). A figura 18 e a
tabela 5 mostram uma diminuio na quantidade de clorofila a e p-earoteno e
um aumento de 20% no carotenide secundrio peridinina.
Bar et alo (1995) verificaram que a alga verde Ch/ore/la zoofringens
mantida em meio com deficincia de nitrognio tem a sua composio de
pigmentos completamente alterada. Aps trs dias, ocorre uma reduo na
quantidade de clorofila a e (l-caroteno presentes; enquanto um aumento
significativo do carotenide secundrio astaxantina nesta alga observado.
Os cistos de G. po/yedra apresentaram uma alterao semelhante (figura 18 e
tabela 4).
A deficincia de nitrognio ou baixas temperaturas so capazes de
induzir o encistamento em dois dinoflagelados de gua doce: Peridinium
cinctum e Peridinium willey (Chapman & Pfister, 1995). Se a resposta

deficincia de nitrognio e baixa temperatura interferirem nas mesmas rotas

116

bioqumicas em algas unicelulares o mesmo efeito de alterao na composio

de pigmentos

observado em

C.

zoofringens ocorreria

em cistos

de

dinoflagelados.
Quando a alga verde Haematococcus pluvialis cresce sob condies
desfavorveis ou estresse nutricional (depleo de nitrognio ou fosfato),
ocorre uma converso de ~-earoteno astaxantina mediada pela enzima ~-c
4 oxigenase (Lotan & Hirschberg, 1995). Podemos especular que tenha
ocorrido uma converso de J3-earoteno peridinina nos cistos, pois a
quantidade de peridinina aumentou e quantidade de ~-earoteno diminuiu em
uma situao de dormncia. Isto possvel se as enzimas posteriores a
sntese de J3-earoteno forem ativadas, levanto a sntese de peridinina nesta
situao.
O trabalho de Oerenne et aI. (1992) discute que os caroten6ides
secundrios poderiam servir como precursores para a sntese de protenas
semelhantes esporopolenina (uma protena presente em esporos de plantas)
constituinte da parede celular da alga H. pluvialis. Esta sugesto est baseada
em quatro observaes: 1) o aparecimento da esporopolenina sob estresse; 2)
acmulo de caroten6ides secundrios na periferia da clula; 3) inibio da
carotenognese com a formao de compostos semelhantes esporopolenina;
4) marcao radioativa in vivo de caroten6ides secundrios incorporados na
esporopolenina. A parede dos cistos de G. polyedra possui esporopolenina
(Or. Lawrence Fritz, Northern Arizona Univ., comunicao pessoal). Portanto,
pode se assumir que em G. polyedra, uma parte dos pigmentos caroten6ides
pode estar sendo convertida 'a esporopolenina ap6s alguns dias de
encistamento, com o prop6sito de aumentar a rigidez da parede do cisto.
Ao observarem os cistos de dinoflagelados de gua doce sob
microscopia 6tica e eletrnica, Bibby & Oodge (1972) verificaram a presena
de vacolos de reserva ("accumulation bodies" ) cheios de pigmentos
caroten6ides. Estes autores sugerem que as clorofilas, por serem ricas em
nitrognio, so provavelmente catabolizadas e podem eventualmente se tornar
componentes dos cristais que se acumulam em grande nmero nos vacolos.
Behrmann & Hardeland (1995) tambm observaram uma grande quantidade de

117

grnulos de amido e vacolos lipdicos em cistos de G. polyedra. Fritz et aI.

(1990) encontraram uma reduo no nmero de "scintillons" durante o
encistamento em G. polyedra, sugerindo que isto seria uma caracterstica do
estado de dormncia. Os resultados sugerem que neste estado de dormncia,
exista uma menor necessidade da presena de clorofila, um pigmento
essencialmente fotossintetizante.
Segundo

Behrmann

&

Hardeland

(1995)

encistamento

acompanhado de uma reorganizao de organelas e estruturas celulares. Os

cistos induzidos por dias curtos e temperatura de 15 C apresentam
principalmente cloroplastos do tipo compacto e a estrutura dos cloroplastos de
cistos induzidos por dias curtos assemelha-se de clulas mastigotas, no
escuro. Alm disso, as clulas encistadas apresentam uma maior quantidade
de grnulos de amido e vacolos lipdicos, o que tambm tpico para clulas
mastigotas durante a maior parte do perodo escuro (Schmitter, 1971; Rensing
et aI., 1980).

Devemos

ressaltar

que

assim

como

ocorre

uma

reorganizao

morfolgica do cloroplasto deve ocorrer um rearranjo de pigmentos nos

fotossistemas, tendo em vista as razes peridininal clorofila a e (!caroteno/clorofila a nos cistos de G. polyedra, observadas por ns.
Alm de suas funes j bem estabelecidas de captadores de energia
luminosa, supressores de espcies reativas de oxignio e desativadores de
estados triplete da clorofila, os pigmentos carotenides atualmente vm sendo
considerados de importncia estrutural como estabilizadores de membranas de
tilacides nos cloroplastos (Havaux, 1998). Estudos recentes revelaram que
em plantas e algas os carotenides da famlia das xantofilas so deslocados
dos complexos de captao de luz (LHC) para as membranas dos tilacides. A
interao resultante entre as molculas de xantofilas e os lipdios de
membrana causam a diminuio da fluidez da membrana, um aumento na
termo-estabilidade da membrana diminundo assim a suscetibilidade
peroxidao lipdica (Havaux, 1998). O aumento da peridinina em clulas
encistadas de G. polyedra pode estar relacionado a uma nescessidade de
aumentar a estabilidade e a proteo das membranas nos cloroplastos. Como
os cistos podem resistir por vrios anos (Fritz et aI., 1989), o aumento da
118

quantidade de xantofilas exercendo um papel estrutural parece ser uma

estratgia importante para a sua sobrevivncia.

5.4 Supresso de O2 ~ por Carotenides de G. po/yedra in vitro

A fotossntese, o processo pelo qual as plantas transformam a energia

solar para gerar compostos de carbono, como a glicose, sustenta a vida na
terra (Foyer & Noctor, 1999). um processo complexo de sucessivas reaes
de oxi-reduo que utilizam dixido de carbono (C0 2) e gua produzindo
carbohidratos ricos em energia e oxignio como produtos finais. A evoluo da
fotossntese produzindo oxignio alterou radicalmente a atmosfera da Terra e
permitiu o desenvolvimento da vida aerbica. Alm da sua funo de
pigmentos-antena, aumentando o espectro de absoro de luz pela clorofila,
os pigmentos carotenides so compostos biolgicos importantes por sua
habilidade de desativar molculas eletronicamente excitadas como o O2 Ci1g)
por um processo chamado supresso fsica (99% de supresso fsica e 1% de
oxidao de carotenides). Estes polienos so, portanto, considerados
essenciais para a sobrevivncia dos organismos fotossintticos. Telfer et ai.
(1994) demonstraram a habilidade dos pigmentos carotenides de suprimir a
3Chl e o 02Ci1g) em complexos PSII in vtro. Segundo Bjrkman & Schfer
(1989), mesmo plantas cultivadas, com altas taxas fotossintticas, no
conseguem utilizar toda a radiao incidente, e a frao excedente pode ser
to grande quanto a frao utilizada nas cadeias de transporte de eltrons.
Como consequncia, esta energia de excitao no utilizada pode acumular
dentro do sistema fotoqumico, conduzindo reaes adversas, inclusive a
foto-oxidao. Isto tambm foi verificado por Bar et ai., (1995) para a alga
verde Chlorella zofringens. A constatao de que os pigmentos carotenides
presentes em G. po/yedra tinham a capacidade de suprimir o 02Ci1g) em taxas
compatveis com as de difuso deste, demonstra que tambm nesta alga o
controle desta EROs dentro do cloroplasto mediado por carotenides. Os
resultados mostram que os extratos de pigmentos carotenides de G. po/yedra

119

so mais eficientes em suprimir o 02(1,~g) que o ~-caroteno comercial (figura

19). Como foram utilizados extratos totais de carotenides no foi possvel
detectar qual dos carotenides presentes o anti-oxidante mais eficiente nesta
alga.
Recentemente Pinto Jr et ai. (2000) isolaram peridinina e

~-caroteno

de

G. po/yedra e verificaram que a primeira o principal carotenide na

supresso do 02CAg) nesta alga, pois, apesar da constante de supresso do
~-caroteno de

G. polyedra ser dez vezes maior do que a da peridinina, esta se

encontra em maior quantidade nesta alga (peridinina= 55% do total de

pigmentos e

~-caroteno=

4,1% dos pigmentos totais em G. polyedra).

5.5 Slot-Blots. Southem Blots e peR- Aspectos Moleculares

Existem poucos estudos do DNA de dinoflagelados,

devido a

complexidade do seu genoma e caractersticas atpicas, o crescimento

relativamente lento destas culturas e as dificuldades de utilizar a metodologia
usualmente

empregada

em

biologia

molecular

sem

ter

que

alterar

significativamente os protocolos. At o momento foram clonados poucos genes

em G. po/yedra: LBP, PCP e RuBisCo 11, todos eles amplamente expressos e
presentes em um grande nmero de cpias (PCP-5000 e LBP- 1000 cpias
por clula)
Segundo Sandman (comunic. pessoal, Leiden 1996) o gene relativo a
fitoeno sintase surgiu h mais de 2 bilhes de anos, antes da diviso evolutiva
de bactrias, algas, cianobactrias, fungos e plantas terrestres. Kavourni et ai.
(1995) encontraram 91% de similaridade e 85% de identidade entre as psy de
plantas.
Armstrong & Hearst (1996) observam que as fitoenos sintase de
eucariontes e eubactrias descritas at o momento so conservadas tanto
estrutural quanto funcionalmente. Estes autores sugerem que pelo fato das
reaes iniciais da biossntese de pigmentos carotenides serem comuns a
todos os organismos carotenognicos, as enzimas devam ser semelhantes e
conservadas ao longo da evoluo. O trabalho de Pecker et ai. (1992) relata

120

uma homologia entre o gene que codifica a enzima fitoeno desaturase (a

prxima enzima na via biossinttica de carotenides) entre a cianobactria
Synechococcus e a alga verde Duna/ie//a bardawii. Espervamos que a sonda

de Arabidopsis ou os "primers" conseguissem identificar o gene para esta

enzima em G. po/yedra (figuras 20 e 21). As sequncias da enzima fitoeno
sintase utilizadas para o delineamento dos "primers" utilizados, apesar de no
mostrarem

uma

grande

homologia

entre

si,

apresentavam

regloes

extremamente conservadas de bactrias plantas superiores, regies estas

que foram utilizadas para a contruo destes "primers".
Uma outra hipese para explicar o insucesso em identificar o gene psy
em G. po/yedra pode ser o nmero de cpias deste gene no genoma desta
alga. Corona et alo (1996) mostraram que em tomate este gene se encontrava
em uma nica cpia no genoma. A partir desta descoberta resolvemos
investigar a variao na transcrio do gene da enzima RuBisCo, enzimachave da fotossntese. Em G. po/yedra, a capacidade fotossinttica mxima
no meio do dia e mnima no meio da noite (Przelin et aI., 1977).

5.6 Northem Blots

A vanaao circadiana da transcrio de alguns genes tm sido

amplamente

evidenciada.

maior

parte

dos

genes

controlados

circadianamente, descritos para plantas, esto ligados fotossntese, com o

pico de expresso mxima durante a manh (Wang & Tobin, 1998). Em
Drosophilla as protenas PER e TIM regula em conjunto a transcrio dos seus

respectivos genes de maneira circadiana por um controle de retro-alimentao

(Myers et aI., 1996). Outro organismo onde a transcrio circadiana de alguns
genes (WC-1, WC-2 e FRQ) foi observada no fungo N. crassa (Crosthwaite et
a/., 1997). Tambm Wang & Tobin (1998) encontraram um fator de transcrio

CCA 1 ("circadian clock associated 1") associado variao circadiana do

RNAm do gene /hcb ("Iight-harvesting chlorophylla/b-protein") em Arabidopsis.
No dinoflagelado Amphidinium carterae, o controle da transcrio dos
genes da PCP e da LHC ("Iight-harvesting complex protein") ocorre por de121

metilao de motivos de DNA especficos (CpG/CpNpG), localizados prximos

ou dentro da regio codificadora destes genes (Lohuis & Miller, 1998). Em
Licopersicum esculentum, a enzima RuBisCo exibe um ritmo circadiano de

transcrio (Martino-Catt & Ort, 1992).

Os resultados mostram que no existe variao na quantidade de
transcritos de RuBisCo " (figura 22) e, portanto, este gene no regulado no
nvel de transcrio em G. polyedra. Os outros genes j clonados neste
organismo Ibp e PCP tambm mostram uma regulao na traduo (Morse et
aI., 1989). Na regio promotora do gene da PCP em G. polyedra no foram

encontradas sequncias regulatrias conhecidas como TATA BOX ou os

motivos CCACAC, GCCAAT ou WGATAR (Le et aI., 1997).
Milos et aI. (1990) demonstraram que em G. polyedra, embora a
expresso de LBP seja rtmica, os nveis de RNAm que a codificam
permanecem constantes no perodo de 24 horas, sugerindo que o controle no
seja transcricional. Recentemente, Mittag et aI. (1994) demonstraram que a
regulao da expresso da LBP ocorre na traduo. Estes resultados
mostraram uma protena repressora CCTR ("circadian-controlled translational
regulator"), controlada pelo relgio biolgico que se liga regio 3' do RNAm
da LBP, impedindo a sua traduo. A atividade de ligao desta protena
tambm apresenta variao circadiana e a traduo ocorre quando o CCTR
no est ligado ao RNAm (Mittag et aI., 1995). Em Chlamydomonas reinhardti,
Mittag (1996) encontrou um fator de regulao anlogo ao CCTR que
controlaria a traduo de trs protenas nesta alga (CHLAMY-1, CHLAMY-2 e
CHLAMY-3). Shapira et aI. (1997) investigando a expresso gnica da enzima

RuBisCo I em Chlamydomonas constataram que o gene que codifica a subunidade maior desta enzima que faz parte do repertrio gnico do cloroplasto
tendo sua transcrio regulada pela luz. Por outro lado, o gene da sub-unidade
menor nuclear e no influenciado pela luz. Em G polyedra, a RuBisCo "
codificado pelo ncleo e s apresenta a sub-unidade maior (Morse et aI.,
1995). Os resultados sugerem que, talvez por ser o RuBis Co /I em G. polyedra
tambm um gene nuclear, a luz no influencie a sua transcrio, e, portanto,
clulas do meio do dia e do meio da noite apresentam a mesma quantidade de
transcritos (figura 22).
122

Em populaes da cianobactria Syneehoeoeeus sp crescendo no

ambiente natural, foi verificado por Wyman (1999) uma oscilao circadiana na
quantidade de transcritos dos genes da sub-unidade maior da RuBisCo (rbeL)
e da glutamina sintetase. Em Arabidopsis, este gene codificado no
cloroplasto e tambm tm um controle transcricional (Isono et a/.; 1997). Em
tabaco, Shiina et alo (1998) observaram que a transcrio destes genes era
independente da luz e que quando esta planta colocada no escuro, ocorre
um aumento da estabilidade do RNAm desta enzima para continuar com a
mesma quantidade que as plantas expostas a luz. J o gene da sub-unidade
menor da RuBisCo (rbeS) , era fotoregulado tanto por luz azul quanto por luz
vermelha em Pteris vittata (Eilenberg et a/., 1998). Em milho o controle tambm
dependente de luz, a expresso do gene rbeS ativada por luz branca mas
no ativada por luz vermelha (Bilang & Bogorad, 1996).
No caso do gene da RuBisCo 11 de G. po/yedra, no foi possvel
verificar, com os experimentos desenvolvidos, se ocorre uma transcrio
contnua deste gene ou se existe uma sntese em algum perodo do dia e o
RNAm de RuBisCo 11 estvel o suficiente para que o seu "pool" seja
constante.

5.7 Westem 81015

Constatando-se que no ocorre variao na transcrio do gene
RuBisCo 11 em G. po/yedra, espervamos uma variao circadiana no seu
contedo protico, para justificar a variao diria na capacidade fotossinttica
nesta alga.
O trabalho de Volknandt & Hardeland (1984) mostra gis SOS-PAGE de
protenas totais de G. po/yedra com subsequente incorporao de leucina [3H]
visualizado em autoradiografias. Estes autores observaram que vrias
protenas no identificadas apresentavam variao circadiana nas suas
quantidades. Os padres de sntese protica nesta alga foram agrupados em
trs classes de protenas: final do dial incio da noite; meio da noite e final da
noitel incio do dia (Morse et aI., 1996). Markovic et aI. (1996) estimaram a
123

sntese de vrias protenas, pela quantidade de metionina 8

35

incorporada em

gis bi-dimensionais, durante a marcao in vivo a cada duas horas durante o

ciclo circadiano. Os autores sugerem que a RuBisCo 11 e a PCP esto entre
estas protenas, pois, foram identificadas protenas abundantes com o mesmo
peso molecular (55 kDa e 32 kDa). Estes autores verificaram que apesar da
sntese variar ritmicamente, no ocorreu variao nos nveis das protenas
sintetizadas em 24 h, e, apenas a protena considerada como sendo a LBP
apresentou uma variao na taxa de sntese concomitante variao nos
nveis da protena, correlacionada com o ritmo de bioluminescncia nesta alga.
A partir do horrio em que a sntese das protenas ocorria, Markovic et aI
(1996) sub-dividiram estas protenas em trs classes, onde a RuBisCo
pertence a segunda classe (sntese no incio do CT 18) e a PCP pertence a
terceira classe (sntese entre o CT 21 e CT 1).
Fagan et aI. (1999) verificaram que a traduo da enzima de c1oroplasto
Gliceraldedo-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) era regulada de forma
circadiana em G. polyedra. Estes autores clonaram dois genes nucleares que
codificam para esta enzima, um correspondendo a isoforma citoplasmtica e
outro protena endereada ao plastdeo. Com base nos dados da anlise de
microsequncia destas protenas, Fagan et ai. (1999) concluram que a sntese
da isoforma do plastdeo regulada pelo relgio biolgico. Esta regulao no
est relacionada aos nveis de RNAm, que permanecem constantes ao longo
do ciclo, sugerindo um mecanismo de controle traducional, contrastando com a
regulao transcricional da GAPDH de Neurospora (8hinohara et ai., 1998).
Em G. polyedra, embora o ritmo da sntese de GAPDH tenha uma grande
amplitude, os ritmos de abundncia e atividade so extremamente atenuados,
o que pode ser atribudo grande meia-vida desta protena (Fagan et ai.,
1999).
Aparentemente em G. polyedra a sntese de RuBisCo 11 e de PCP no
esto ligadas a fotorreceptores. Os resultados mostram que o contedo
protico da enzima RuBisCo 11 no se altera quando as culturas so mantidas
por 36 h sob diferentes irradiaes (azul, verde e vermelha) durante o perodo
de claro (figura 24). Por outro lado, quando as clulas do flagelado
Chlorogonium elongatum so transferidas de uma condio heterotrfica para

124

uma condio autotrfica existe um aumento de 10 vezes na quantidade da

enzima RuBisCo que nesta alga codificada pelo genoma do cloroplasto. Foi
verificado que esta era uma resposta a luz azul, e que as clorofilas no eram
os fotorreceptores envolvidos, mas sim os criptocromos (Boege et a/., 1981).
Przelin et alo (1977) sugerem que em G. po/yedra a oscilao
observada na capacidade fotossinttica est ligada atividade da RuBisCO.
Como no se observou uma alterao no contedo desta protena nesta alga
(figura 23), as regulaes ps-traducionais devem ser responsveis por esta
variao.
Com base na literatura, podemos especular o que acontece com a
enzima RubisCo em G. po/yedra. Um dos controles sugeridos por Walter &
Blobel (1981) o processamento no retculo endoplasmtico de protenas
secretadas pelo ncleo que devam ser endereadas ao c1oroplasto. Neste
caso, apenas aps este processamento, a protena se tornaria funcional. Como
a RuBisCo 11 codificada pelo ncleo, talvez ela seja sintetizada fora do
cloroplasto em G. po/yedra e torne-se funcional aps um direcionamento ao
cloroplasto.
Apesar de no ter sido descrita, at o presente momento, a presena de
RuBisCo ativase nesta alga, esse um controle muito difundido entre os
organismos fotossintetizantes. Knoetzel & Rensing (1990 b) tambm sugerem
a existncia de uma RuBisCo ativase em G. po/yedra.
Uma explicao tambm aceitvel seria

a compartimentalizao

regulando a atividade da RubisCo. Segundo Borksenious et alo (1998), de 40 a

100% da enzima localiza-se dentro de pirenides. Os pirenides so
estruturas proteinceas encontradas nos cloroplastos da maior parte da algas
unicelulares, onde ocorre a fixao do CO 2 . Resultados preliminares de
KyungSuk & Fritz (em elaborao) comprovam a localizao da RubisCo 11 em
pirenides tambm em G. po/yedra. Estes autores tambm verificaram que
ocorre uma alternncia rtmica na presena e ausncia de pirenides nesta
alga, e durante a noite esta organela no observada. Pode-se inferir que a
RuBisCo em G. po/yedra s seja funcional quando dentro dos pirenides, ou
seja durante o dia.

125

Uma outra

hiptese para

explicar a diferena

na

capacidade

fotossinttica de G. po/yedra so os mecanismos de regulao pstraducionais ligados fosfatases e quinases. Comolli et a/., (1994; 1996)
sugerem que modificaes ps-traducionais (por fosforilao/desfosforilao)
estejam envolvidas no mecanismo central do relgio biolgico em G. po/yedra.
Em Drosophilla Edery et alo (1994) mostraram que alm das regulaes
transcricionais e traducionais existe um controle rtmico da fosforilao de PER
ps-traduo. A fosforilao tambm regula a atividade de carboxilases em
Bryophyllum, a qual parece neste caso estar sobre controle circadiano (Carter
et a/., 1991).

O contedo protico da PCP tambm no apresenta variao circadiana

ou aps exposio das culturas por 36 h a diferentes irradiaes (figuras 23 e
24). Apesar de no ocorrer variao nos nveis destas protenas ao longo do
dia, j foi demonstrado que a ligao desta protena ao PS 11 varia. Segundo
Knoetzel & Rensing (1990b) durante o dia a PCP est acoplada ao PS 11,
aumentando o tamanho da antena captadora de luz e a noite este complexo
PCP est "solto" no estroma. Elich et alo (1993) demonstraram que as
protenas centrais do PSII,D1; D2 e CP43 sofrem desfosforilao estimulada
pela luz in vivo. Tavez seja esta tambm a regulao da PCP (em ligar-se ou
deslligar-se do PS 11) em G. po/yedra, pois, esta protena tambm faz parte
deste complexo.

126

6. CONCLUSeS

Gonyau/ax po/yedra uma alga unicelular marinha que tem sido

extremamente

utilizada

para

se estudar os mecanismos celulares

moleculares dos relgios biolgicos.

Apesar de j ser conhecido que em G.po/yedra a capacidade
fotossnttica ritmica, a causa desta variao circadiana ainda no foi
esclarecida. Nesta Tese enfocamos os experimentos nos processos de
fotossntese. Estes envolvem a captao de luz por pigmentos auxiliares da
clorofila, os carotenides, que tambm desempenham um importante papel na
proteo dos cloroplastos contra as EROs; e regulao de protenas capazes
de catalisar a montagem do esqueleto carbnico com a liberao de oxignio.
Em nossos resultados mostramos que:
Os pigmentos carotenides presentes em G. po/yedra so eficientes
em suprimir o 02CL\g) in vitro confirmando o seu papel de antioxidantes nos
cloroplastos desta alga;
Os cistos de G. po/yedra apresentam uma composio de pigmentos
diferente das clulas mastigotas, com diminuio da clorofila a e de

13-

caroteno e aumento de peridinina.

Os experimentos de Western Blot mostraram que as duas protenas
investigadas encontram-se presentes nos cistos, mas apenas a PCP se
encontra em menor quantidade, sugerindo que nos cistos uma maior
quantidade de peridinina estaria fora do complexo PCP, desempenhando uma
funo estrutural.
Existe uma variao circadiana na quantidade de f3-earoteno em G.
po/yedra e este ritmo assim como a induo de sua sntese so mediados por

um fotorreceptor de luz azull verde;

A quantidade da protena PCP no varia ao longo do dia, mesmo
quando as clulas so mantidas em iluminao constante atenuada;
A enzima RuBisCo 11 nesta alga tem um controle ps-traduo, pois os
nveis de RNAm e de protenas no variaram ao longo do dia;

127

 A sntese de PCP e RuBisCo 11 aparentemente no esto relacionadas

um fotoreceptor nico ou exclusivo;

128

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Curriculum vi tae
Helosa Candia Hollnagel
Nascida em 26/10/1966 em Porto Alegre, RS
Estado civil: casada, dois filhos
Endereo:

Rua Corinto n. 739, apto 64/ bl. A

CEP 05586-060, Butant, So Paulo, SP
Telefone:(011) 815-3540

Idiomas:
Proficincia em Ingls e Alemo

Formao Acadmica:

1985-1989
Graduao:Bacharelado em Cincias Biolgicas
"Influncia de extratos de folhas de Solanum fastigiatum Willd na
germinao e crescimento de Lactuca sativa varo White Boston".
Orientao: Prof. Or. Maria Estefnia Aquila.
Instituto de Bioscincias na Universidade Federal do Rio Grande do Sul
UFRGS

1991-1994
Ps-graduao: Mestrado em Cincias
rea de concentrao: Oceanografia Biolgica
"Bactrias e outros microorganismos dos sedimentos do infralitoral da
Praia do Perequ, Guaruj, SP".
Orientao: Prof. Or. Hilda de Souza Lima Mesquita.
Instituto Oceanogrfico da Universidade de So Paulo

155

1994-2000
Ps-graduao: Doutorado em Cincias
rea de concentrao: Bioqumica
"Aspectos Bioqumicos da Biossntese de Pigmentos Carotenides em
Gonyau/ax po/yedra (Dinophyceae)".
Orientao: Prof. Dr. Pio Colepicolo
Instituto de Qumica da Universidade de So Paulo

Visitas a laboratrios Nacionais e Internacionais:

Prof. Dr. Helmut Sies. Universidade de Dsseldorf- 1996

Prof. Dr. Rudiger Hardeland- Universidade de Gttingen- 1996

Prof. Dr. Ivonne Balzer- Universidade de Gttingen- 1996

Prof. Dr. Paulo Ferreira. Universidade Federal do Rio de Janeiro1997

Publicaes Cientficas:

Di Mascio, P.; Hollnagel, H.C.; Sperana, M. & Colepicolo, P. (1995).

Diurnal Rhythm of j3-carotene in Photosynthetic Alga Gonyau/ax po/yedra. Bio/.
Chem. Hoppe-Sey/er, 376: 297-301.

Hollnagel, H.C.; Di Mascio, P.; Asano, C.S.; Okamoto, O. K.. ; Stringher,

C.G.; Oliveira, M.C. & Colepicolo, P. (1996). lhe effect of light on the
biosynthesis

of

j3-carotene

and

superoxide

dismutase

activity

in

the

photosynthetic alga Gonyau/ax po/yedra. Braz. J. Med. Bio/. Res., 29: 105-110.

Asano, C.S.; Okamoto, O.K.; Hollnagel, H.C.; Stringher, C.G.; Oliveira,

M.C. & Colepicolo, P. (1996). lhe activity of superoxide dismutase oscillates in
the marine dinoflagellate Gonyau/ax po/yedra. Cincia e Cultura, 48: 64-67.

156

Participao em Reunies Cientficas

Second International Conference- Antioxidant Vitamins and B-carotene

in Disease Prevention. ICC Berlin, 10-12 de outubro de 1994.
Poster:

"Molecular

Basis

of the

Biological

Clock:

Induction

of

Carotenoids may be related to the Clock Reseting in the Photosynthetic

dinoflagellate Gonyau/ax po/yedra".
Autores: Di Mascio, P.; Hollnagel, H.C.; Sperana, M.; Marinelli, D. &
Colepicolo, P.

111 Latin American Symposium on Chronobiology. Caraguatatuba, 23-26

de maio de 1995.
Poster: " Carotenoids may be related to the Clock Reseting in the Marine
Photosynthetic Algae Gonyau/ax po/yedra".
Autores: Hollnagel, H.C.; Di Mascio, P. & Colepicolo, P.

11 th

International

Sympoisum

on

Carotenoids.

Leiden

(Holanda) de 18 a 23 de agosto de 1996.

Poster: "Light Induction of B-carotene Synthesis in the Marine
Photosynthetic Dinoflagellate Gonyau/ax po/yedra".
Autores: Hollnagel, H.C.; Di Mascio, P. & Colepicolo, P.

Universidade de Gttingen (Alemanha) de 24 28 de agosto.

Palestra: "Light Induction of B-carotene Synthesis in the Marine
Photosynthetic Dinoflagellate Gonyau/ax po/yedra" no Instituto de Botnica na
mesma universidade no dia 27 de agosto de 1996.

157

Singlet Molecular Oxvgen: Chemical. Biological and Medicai Aspects.

Caraguatatuba, So Paulo de 02-05 de setembro de 1998.
Poster: "lhe importance of xanthophylls in the quenching of singlet
oxygen in Gonyau/ax po/yedra".
Autores: Pinto Jr., E.; Hollnagel, H.C.; Di Mascio, P. & Colepicolo, P.

29

th

Meeting of the Brazilian Biochemical Societv, Caxamb, Minas

Gerais, Brasil, 27-30 de maio de 2000.

Poster. "Alteration in pigment composition of asexual cysts of the
dinoflagellate Gonyau/ax po/yedra Stein".
Autores: Hollnagel, H.C. & Colepicolo, P.

158