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FACULTAD DE MEDICINA
ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE
MEDICINA
CATEDRA DE BIOQUIMICA
2015
PRACTICA N 01
FOTOCOLORIMETRIA
COMPETENCIAS PROCEDIMENTALES:
Al finalizar esta prctica, el alumno:
1. Explica la ley de Lambert y Beer y sus limitaciones.
2. Construye una curva de calibracin.
3. Aplica los dos mtodos de clculo de la concentracin de una muestra
problema.
INTRODUCCIN:
Fotocolorimetria es la medida de la luz absorbida por una solucin coloreada
empleando el fotocolormetro. Si la solucin no tiene color, es posible inducirle color
empleando reactivos. Si no fuera posible se debe emplear un espectrofotmetro. La
diferencia entre ambos equipos es que el fotocolormetro mide en la regin visible y el
espectrofotmetro mide en la regin ultravioleta y visible. Esta medicin permite la
cuantificacin de sustancias.
El fundamento de ambos equipos es el mismo y est basado en la medicin de la
intensidad de la luz monocromtica transmitida a travs de una solucin, ya sea que
se trate de sustancias naturalmente coloreadas o que se has hecho de tan calidad
mediante reacciones qumicas adecuadas en caso se disponga solo de
fotocolormetro.
La mayora de los cuerpos en solucin tienen una capacidad de absorcin selectiva
sobre determinadas radiaciones luminosas, cuando sta absorcin se realiza en la
zona espectral visible, las soluciones las ve el observador de un color que es
producido por las radiaciones que no has sido absorbidas.
FUNDAMENTOS FISICO QUIMICO:
Cuando un haz de luz (Luz, Incidente, I0) atraviesa una solucin, una parte de la
radiacin queda absorbida por las molculas del soluto coloreado, sufriendo una
reduccin de su intensidad (Luz Transmitida, It), proporcional a la capacidad de
absorcin de dicha molcula, otra parte de la radiacin se pierde por fenmenos
fsicos como reflexin, refraccin y difraccin de la luz.
IO
Luz Incidente
It
Luz Transmitida
La longitud de onda en la que las molculas de dicha sustancia absorbe con mayor
intensidad la luz, se denomina Longitud de mxima absorcin o Lambda mxima.
log ( I o / I t ) 1 c A D.O.
Dnde:
Io = Intensidad de la Luz Incidente.
It = Intensidad de la Luz Transmitida.
= Coeficiente de Extincin Molar.
Valor constante dependiendo de la naturaleza de la sustancia
y de la longitud de onda.
l = Espesor del recipiente en cm.
C = concentracin de la solucin
A = D.O = Absorbancia = Densidad ptica = Extincin
La Absorbancia (A) aumenta conforme disminuye la
Transmitancia (T) y la relacin entre ambas es logartmica.
FUNDAMENTO DE LA FOTOCOLORIMETRIA
La luz que llega a la celda fotoelctrica genera una corriente elctrica en proporcin
directa a la luz incidente. Esta seal elctrica pequea es incrementada por un
amplificador, y la seal amplificada llega a un galvanmetro calibrado a una escala
logartmica que da directamente las lecturas en absorbancia.
En los fotocolormetros se efecta una seleccin de la longitud de onda en la que se
produce la mayor absorcin mediante el uso de un prisma que descompone el
espectro de luz blanca, y para eliminar el factor que depende del espesor del
recipiente, se usan celdas especiales de longitud estndar.
La medida de la densidad ptica de las soluciones se ven una escala expresada en
unidades logartmicas que van de 0,000 2,000, el 0,000 corresponde 100% de
transmite es decir una absorcin igual a cero y el 2.000 correspondiente a una
absorcin del 100% y no se transmite luz.
Se coloca primero la solucin blanco, suele ser agua destilada, y se ajusta el
galvanmetro a una absorbancia de cero. Luego se coloca la solucin problema y se
lee directamente la absorbancia.
(1)
(2)
(3)
Donde:
VR = volumen real de la muestra en el tubo de reaccin.
La concentracin de la muestra problema queda expresada en mg/dL o g/dL
dependiendo de las unidades de W en unidades qumicas de molaridad (mol/L,
mol/L, etc.)
PROCEDIMENTOS EXPERIMENTALES
Los ensayos a realizar en la prctica son dos y consistirn en medir las absorbancias
en cantidades creciente y decreciente.
A.- AZUL DE METILENO - AUMENTO DE LA ABSORBANCIA
Preparar la siguiente batera de tubos:
Solucin Stock: Azul de metileno 6 mg/L
Tubos N
Azul de metileno 6 mg/L
ml. Agua destilada
Concentracin mg/L
0,5
3,5
1
3
1,5
2,5
2
2
100
900
200
800
300
700
400
600
4
3
2
1
Tubo ref.
50
----L. AGUA
-50
50
50
50
L. Vitamina C
950
950
950
950
950
L ABTS*+
Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente por 7 minutos. Leer a 734 nm.
absorbancias
Luego,
1.- Determine la pendiente de la curva de la vitamina C.
2.- Mida la absorbancia de la muestra problema que el profesor le entregar.
3.- Determine la concentracin de la muestra problema empleando el grfico.
CUESTIONARIO
1- Qu diferencia hay entre un espectrofotmetro y un fotocolormetro? Fue
necesario un espectrofotmetro para la realizacin de la prctica? Por qu?
2- Qu limitaciones tiene la ley de Lambert- Beer?
3- Describa con ejemplos dos mtodos para la eleccin de la longitud de onda
ptima para medir la absorbancia de una solucin?
4- Muestre dos ejemplos de mediciones por espectrofotometra uno por aumento y
otro por disminucin de absorbancia de aplicacin en bioqumica.
5- Problema: Una solucin coloreada presenta una A (absorbancia) de 0,450 en una
cubeta de 2 cm, hallar la A cuando la sustancia se ha diluido 5 veces y se lee en
una cubeta de 1 cm.
BIBLIOGRAFIA:
Fritz, J . S. Schenk, G. H. 1992. Qumica Analtica Cuantitativa. Editorial Limusa. S.A.
Mxico D.F. Mxico.
Melona, C.E. Kiser, R. M. 1973. Problemas y Experimentos en Anlisis Instrumental.
Editorial Revert S.A. Mxico D.F. Mxico.
Snchez, L.D. 1995. Instrumentacin en Bioqumicas. Fundamentos
Bsicos.
CONYTEC. Lima - Per.
Skoog, D.A. 1989. Anlisis Instrumental. MC Graw-Hill. Mxico D.F. Mxico
http://www.bioquimica.dogsleep.net/Laboratorio/Plummer/Chp04.pdf
PRACTICA N 02 A
FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
COMPETENCIAS PROCEDIMENTALES:
Al finalizar la practica el alumno:
1. Explica la influencia de los factores que afectan la actividad enzimtica.
2. Determina el pH y la T ptima de la enzima pepsina.
INTRODUCCION:
Las enzimas son macromolculas catalticas principalmente de naturaleza proteica
que aumentan las velocidades de reaccin bioqumica, siempre que sean
termodinmicamente posibles. Una enzima hace que una reaccin energticamente
posible pero que transcurre a una velocidad muy baja, sea cinticamente favorable, es
decir, transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la enzima. 1
Casi todos los procesos en las clulas necesitan enzimas para que ocurran a
velocidades compatibles con la vida. A las reacciones mediadas por enzimas se les
denomina reacciones enzimticas.
Como todos los catalizadores, las enzimas funcionan disminuyendo la energa de
activacin (G) de una reaccin, de forma que se acelera sustancialmente la tasa de
reaccin. Las enzimas no alteran el balance energtico de las reacciones en que
intervienen, ni modifican, por lo tanto, el equilibrio de la reaccin, pero consiguen
acelerar el proceso incluso millones de veces.
La actividad de las enzimas puede ser afectada por diversos factores. Existen
molculas que actan como inhibidores enzimticos, estos disminuyen o impiden la
actividad de las enzimas, mientras que los activadores son molculas que incrementan
dicha actividad. Asimismo, gran cantidad de enzimas requieren de cofactores para su
actividad. Muchas drogas o frmacos son molculas inhibidoras. Igualmente, la
actividad es afectada por otros factores como la temperatura, el pH,
la concentracin de la propia enzima y del sustrato, y otros factores fsico-qumicos.
La catlisis enzimtica es un fenmeno importante en la existencia de la vida tal como
la conocemos. Por esto el estudio de las enzimas y de la catlisis enzimtica es de
inters; en ausencia de una enzima apropiada, una gran cantidad de reacciones
qumicas no slo ocurren muy lentamente sino que pueden no ocurrir del todo, esto
indica que la presencia de la enzima es capaz de acelerar la velocidad de reaccin de
una reaccin qumica especfica.
La concentracin del catalizador es importante ya que al aumentar la cantidad de
molculas de enzima presentes en la solucin aumenta la probabilidad de que los
reactantes choquen con la enzima y ocurra as el evento cataltico. La forma en que la
concentracin de un reactante afecta a la velocidad de reaccin se expresa a travs
de lo que se conoce como orden de reaccin.
A.
1)
2)
3)
4)
5)
EXPERIENCIA N 1
EFECTO DE LA CONCENTRACION DE LA TEMPERATURA
OBJETIVO: Determinar la temperatura ptima para la actividad de la pepsina.
1A
3.5
0.5
5
2A
3.5
0.5
5
3A
3.5
0.5
5
B
4
-5
SERIE N 2
TUBOS N
mL pepsina
1B
1
2B
1
3B
1
-----
Pre-Incubar por separado los 6 tubos a 37C por 5 min segn el siguiente cuadro de
temperaturas:
TUBOS N
Temperatura C
1A y 1B
0
2A y 2B
37
3A
37
3B
100
Agregar el contenido de los tubos 1A, 2A, y 3A a sus respectivos tubos 1B, 2B, y 3B.
Luego incubar los 3 tubos a las siguientes temperaturas.
TUBOS N
Temperatura C
MEZCLA
1A+1B
0
MEZCLA
y 2B
37
2A
MEZCLA
3A y 3B
37
Posteriormente colocar los tubos en agua helada por 2 minutos para detener la
reaccin.
Leer las absorbancias en el espectrofotmetro a 450 nm.
La actividad enzimtica se encontrar restando la lectura del tubo blanco (B)
menos lectura de los otros tres tubos (correspondiente a cada temperatura).
Graficar en papel milimetrado:
Actividad Enzimtica (Y) frente a Temperatura (X)
EXPERIENCIA N 2
EFECTO DEL pH
OBJETIVO: Determinar el pH ptimo en el cual la actividad enzimtica de la pepsina
es mxima.
Tubo
mL Agua dest.
1,5
1,5
mL. HCL
mL Na2CO3 10%
2
-
0,5
-
0,5
mL albmina
mL pepsina 1%
5
-
5
-
5
-
5
-
5
-
20
Calcule pH
Determine: Los valores del pH final para cada uno de los tubos
CUESTIONARIO
1. Problema.Las velocidades iniciales a varias concentraciones de sustrato para una reaccin
catalizada por un enzima pepsina son:
[S] (moles/L)
5x10-2
5x10-3
5x10-4
5x10-5
5x10-6
5x10-7
V (moles/min)
0.25
0.50
0.74
0.97
0.99
0.98
BIBLIOGRAFIA:
Bohinski, R.C. 1991. Bioqumica Addison _ Wesley Iberoamericana S.A. Wilmington,
Delaware, USA.
Fritz, J . S. Schenk, G. H. 1992. Qumica Analtica Cuantitativa. Editorial Limusa. S.A.
Mxico D.F. Mxico.
Melona, C.E. Kiser, R. M. 1973. Problemas y Experimentos en Anlisis Instrumental.
Editorial Revert S.A. Mxico D.F. Mxico.
Sanchez, L. D. 1992. Tcnicas Instrumentales de uso ms Frecuente en el Clnico y de
Investigacin. Lima Per.
Snchez, L.D. 1995. Instrumentacin en Bioqumicas. Fundamentos Bsicos.
CONYTEC. Lima - Per.
PRACTICA N 02 B
DETERMINACIN DE LCTICO DESHIDROGENASA
COMPETENCIAS PROCEDIMENTALES
Al finalizar la Prctica de Laboratorio el alumno:
1. Determina la actividad enzimtica de la Lctico Deshidrogenasa en suero.
2. Interpreta y explica el significado de la elevacin de la Lctico Deshidrogenasa
en suero.
INTRODUCCIN: SIGNIFICADO CLINICO
La enzima Lactato deshidrogenasa se encuentra concentrada en el corazn, rin,
hgado, msculo y otros tejidos corporales. El dao a alguno de estos tejidos resulta
en un aumento de los niveles sricos de LDH.
La determinacin de la actividad de lactato deshidrogenasa (LDH) en suero, tiene una
gran variedad de aplicaciones clnicas. Niveles elevados de LDH estn asociados con
infarto del miocardio, dao renal, hepatitis, enfermedades musculares y otras
patologas. Existen al menos cinco isoenzimas de LDH dependiendo de su origen
tisular.
En el caso del infarto agudo de miocardio (IAM), la actividad de LDH total (junto con
las enzimas CK y GOT) constituye un elemento importante de diagnstico. La misma
comienza a aumentar de 12 a 24 horas despus de producido el infarto; alcanza un
pico entre las 48 - 72 horas y permanece elevada hasta el sptimo o dcimo da.
Por otra parte, tambin se registra un aumento de la actividad de LDH total en
pacientes con necrosis heptica (producida por agentes txicos o por infecciones
agudas como la hepatitis viral) e incluso acompaando a necrosis tubular renal,
pielonefritis, etc.
FUNDAMENTO.La enzima LDH cataliza la reaccin reversible de Piruvato a Lactato, pudindose
emplear ambos como sustratos.
El protocolo a trabajar est basado en el siguiente esquema de reaccin:
Piruvato + NADH + H+
LDH
L-Lactato + NAD+
En este caso la enzima cataliza la reduccin del Piruvato a Lactato oxidando el NADH
a NAD+. La coenzima NADH tiene un pico de absorbancia caracterstica a 340 nm.
La concentracin de LDH se determina midiendo la disminucin de absorbancia a 340
nm a medida que se oxida el NADH.
REACTIVO PROVISTO (se emplear un kit comercial)
Solucin de buffer Tris, pH 7,2 conteniendo Piruvato y cloruro de sodio.
Solucin conteniendo NADH.
PRECAUCIONES
Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro".
B. MUESTRA
Se debe obtener suero de la manera usual libre de hemlisis y separar del cogulo
dentro de las dos horas de su obtencin. Tambin puede usarse plasma
C. MATERIAL Y EQUIPOS DE LABORATORIO
- Espectrofotmetro.
- Micropipetas.
- Pipetas capaces de medir los volmenes.
- Tubos de ensayo.
- Cubetas espectrofotomtricas.
- Reloj.
- Bao de agua a temperatura indicada en el procedimiento.
D. DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE LDH
1.- En una cubeta de cuarzo mantenida a la temperatura de trabajo de 30-37C
colocar:
REACTIVOS
CUBETA
Reactivo LDH
2000 uL
Agua Destilada
1000 uL
Pre-incubar unos minutos, luego agregar
Muestra
50 uL
2.- Mezclar inmediatamente y disparar simultneamente el cronmetro.
3.- Esperar 30 segundos.
4.- Leer la Absorbancia inicial y luego a los 1, 2 y 3 minutos de la primera lectura a 340
nm.
5.- Determinar la diferencia promedio de Absorbancia/min (Abs/min), restando cada
lectura de la anterior y promediando los valores.
6.- Utilizar este promedio para los clculos.
CALCULO DE LOS RESULTADOS
Los clculos se realizan como sigue:
LDH (U/L) = (
VALORES DE REFERENCIA
120 240 U/L a 25C
160 320 U/L a 30C
230 460 U/L a 37C
CUESTIONARIO:
1. Por qu es necesario obtener suero libre de hemlisis?
2. Si la reaccin enzimtica se midiera usando como sustrato lactato, cmo
realizara la medicin de la actividad enzimtica?
3. En un paciente con IAM cuando se debera determinar la concentracin de la
enzima LDH.
4. Un paciente con cncer le comenta a Ud.: me hice el examen LDH me salieron
los valores 19701 U/L? Cmo explicara esa situacin?
5. Un paciente de 37 aos lleva haciendo ejercicios por una temporada y al
realizar esfuerzos siente mucho dolor muscular en los das siguientes. El
mdico le ha realizado una serie de pruebas para determinar si tiene algn
problema muscular, una de las pruebas ha sido la actividad de LDH srica. El
resultado ha sido que todo est bien menos en la parte de bioqumica suero, ya
que la enzima LDH est por debajo de los niveles adecuados; el valor
encontrado fue 160U/L cuando tendra que estar entre 240-480. Cmo
explicara esa situacin?
BIBLIOGRAFIA:
Bohinski, R.C. 1991. Bioqumica Addison _ Wesley Iberoamericana S.A. Wilmington,
Delaware, USA.
Fritz, J . S. Schenk, G. H. 1992. Qumica Analtica Cuantitativa. Editorial Limusa. S.A.
Mxico D.F. Mxico.