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por:
Comit de Tesis
Profesor Gua: Rui Miguel S.
Profesores Informantes:
Fernando Bas
Ivn Pea
Octubre 2012
Santiago-Chile
Agradecimientos
Dedicado a:
Mi madre Vernica, por sus incansables esfuerzos y apoyo incondicional.
NDICE
ABSTRACT. 1
INTRODUCCIN... 2
MATERIALES Y MTODOS 8
-Condiciones experimentales de los peces analizados.. 8
-Muestreo................. 9
-Preparacin de las muestras . 9
-Anlisis bioqumico........ 10
-Anlisis histolgico..... 12
-Anlisis estadstico.. 13
RESULTADOS.. 13
DISCUSIN 27
-Efecto del nivel de protena dietaria en los indicadores de estrs oxidativo....... 29
-Efecto de la utilizacin de lupino en los indicadores de estrs oxidativo. 36
CONCLUSIN.. 38
RESUMEN..... 40
LITERATURA CITADA..... 41
ANEXOS..... 49
Efecto del nivel y tipo de protena dietaria en indicadores enzimticos del estrs oxidativo en
juveniles de rbalo (Eleginops maclovinus).
Luis Alberto Molina Abarza
Departamento de Ciencias Animales, Facultad de Agronoma e Ingeniera Forestal, Pontificia Universidad
Catlica de Chile. Vicua Mackenna 4860, Macul, Santiago, Chile.
Abstract
Molina-Abarza, Luis. Effect of dietary protein level and protein source in enzyme levels
and other indicators of oxidative stress of Patagonic blennie juvenile (Eleginops
maclovinus). Tesis, Magister en Ciencias Animales, Facultad de Agronoma e Ingeniera
Forestal, Pontificia Universidad Catlica de Chile. Santiago, Chile. 50pp. The aim of this
work was to evaluate the metabolic effect of the utilization of isoenergetic and isolipidic diets
with different levels of fish protein and also the effect of a partial replacement of fish protein by
vegetable protein in juvenile Patagonic blennie (Eleginops maclovinus). The hepatic activity of
antioxidant enzymes (CAT, SOD, GPX, GST, GR and G6PDH) and indicators of tissue
damage (lipid peroxidation, oxidized proteins and hepatic and intestinal histology) were
determined. Patagonic blennie juvenile were randomly distributed into 24 groups of 40 fish
each. Eight experimental diets were randomly assigned to triplicate groups and fed during 14
weeks. Six diets had increasing levels of protein (9, 14, 21, 28, 35 and 42% protein) and
additionally two diets were formulated with 28 and 35% of protein and 20% inclusion of lupin
meal (Lupinus albus). At the end of the experiment the enzymes CAT, SOD, GPX and GST
showed higher activity in the groups fed with lower protein diet- Diets 9P and 14P. Similarly,
TBARS and oxidized proteins analyses in liver samples showed a higher oxidation degree in
fish fed low protein content diets, indicating an oxidative stress in these groups. The GR and
G6PDH activity increased with the protein content and a high activity of CAT was also
observed in fish fed with a high level of protein inclusion, suggesting an increase in metabolic
activity in these groups. Histological analysis of liver and intestine of fish fed with low protein
diets showed nuclei grouped in rosettes with irregular shape in liver and a decrease goblet cell
number and shorter microvilli in intestine, indicating the occurrence of cell damage in both
tissues. As for the use of vegetable protein, the results did not show an increase of oxidative
stress in the two dietary protein levels tested. The parameters studied in this work confirmed
that patagonic blennie juvenile present a high metabolic tolerance to the different diets tested,
showing an increased oxidative stress when fed diets with a very low protein inclusion.
Key words: Eleginops maclovinus, Oxidative stress, Antioxidant enzymes, Lipid peroxidation,
Oxidized proteins.
Introduccin
Los peces, al igual que otros organismos de respiracin aerbica, presentan una
incompleta reduccin del oxgeno a nivel celular, la cual tiende a formar diversos radicales
libres, denominados especies reactivas del oxgeno, ERO. Las ERO pueden comportarse
como prooxidantes y las formas ms comunes son el anin superxido (O2-.), el perxido
de hidrgeno (H2O2) y el radical hidroxilo (OH.), aunque existen tambin otros radicales
que pueden contribuir a la oxidacin. En condiciones normales, cerca de 1% diario de
ERO escapa al control de las defensas antioxidantes del organismo y repercute en
diversos daos a nivel celular (Berger, 2005). La reactividad de las ERO se debe a que
son molculas cargadas elctricamente en donde el ltimo orbital tiene un electrn
desapareado, lo cual les confiere inestabilidad fsica (Sierra et al., 2004). Esta
inestabilidad las obliga a buscar y capturar electrones desde otras molculas para
neutralizarse. Generalmente el primer ataque oxidante es neutralizado por los
mecanismos antioxidantes del organismo, sin embargo muchas veces esta primera
defensa no es totalmente eficiente y se forma otro radical libre, ocurriendo la generacin
de una cadena de creacin de radicales libres (Percival, 1996). Se pueden distinguir dos
orgenes principales en la generacin de ERO: endgenas (metabolismo, cadena
respiratoria Morel y Barouki, 1999) o exgenas (efecto de xenobiticos Ferreira et al.,
2008b; efectos nutricionales Sitj-Bobadilla et al., 2005) - figura. 1.
Fuentes
Figura 1. Fuentes que pueden gatillar el aumento en la produccin de ERO a nivel intracelular. Adaptado de (Morel y
Barouki, 1999).
intermedia, puede causar detencin del crecimiento o senescencia y, si hay una gran
produccin de ERO, se puede causar la muerte celular, tanto por necrosis como por
apoptosis (Sierra et al., 2004. Figura 2).
Cuando el aumento del contenido intracelular de EROs, sobrepasa las defensas de la
clula, ya sea por un exceso en la generacin de ERO o porque los mecanismos de
defensa antioxidante naturales contra ellas es deficiente, se produce estrs oxidativo
(EO). El EO puede afectar a varias molculas biolgicas, tales como lpidos, protenas y
cidos nucleicos, generando dao molecular (Pervical, 1996). Adems, se ha estudiado
que el EO se presenta en diversos estados patolgicos en los cuales se altera la
funcionalidad celular, contribuyendo o retroalimentando el desarrollo de enfermedades
degenerativas (Gutteridge y Halliwell, 1999). El EO fue definido por Sies (1991) como un
disturbio en el equilibrio oxidante-antioxidante favorable al primero que puede provocar
enfermedades potenciales. Efectivamente, el exceso de radicales generados durante el
metabolismo celular es la principal causa de mutaciones que podran generar
enfermedades neurodegenerativas y cncer (Thannickal y Fanburg 2000). As mismo, se
ha relacionado al EO con una disminucin en la respuesta del sistema inmune (Walsh et
al., 1995; Beiqing et al., 1996).
A nivel celular, el lugar de produccin y de ataque de las ERO puede ser tambin variable.
De hecho, varias molculas pueden migrar hacia otras zonas desde su sitio de
generacin, transportando as el radical y/o accin oxidante desde un tejido hacia otro
tejido objetivo (Sies, 1997).
El dao celular resultante de una situacin de estrs oxidativo puede ser visible en
diferentes rganos, pero en particular se observa en el hgado, por su alta actividad
metablica y donde se reflejan altas actividades enzimticas (Trenzado et al., 2006).
Figura 2. Efecto de la cantidad de radicales libres producidos sobre la actividad celular. (Adaptado de Sierra, et al., 2004)
Para que ocurra la reaccin de las enzimas antioxidantes, es necesaria la presencia del
NADPH, en su forma reducida, el cual es mayoritariamente producido por la enzima
G6PDH (Glucosa 6 fosfato deshidrogenasa). Por este motivo, esta enzima, adems de su
accin en diferentes vas metablicas (Kletzien et al., 1994), es igualmente considerada
un indicador de la ocurrencia de estrs oxidativo, al participar indirectamente en la accin
de proteccin de las enzimas dependientes del glutatin (Halliwell y Gutteridge 1999). La
interaccin entre las enzimas antioxidantes, enzimas de soporte, ERO y productos de
oxidacin se puede observar en la figura 3.
Oxidacin ADN
Oxidacin protenas
Oxidacin lpidos
Figura 3. Interaccin entre enzimas antioxidantes (cuadro azul), enzima de soporte (cuadro gris), molculas
oxidadas (texto rojo) y ERO a nivel intracelular. Adaptado de Almroth 2008.
Existen tambin otros indicadores no enzimticos de estrs oxidativo, tales como el grado
de peroxidacin de lpidos (LPO) y el grado de oxidacin de protenas (PROTOX). Ambos
son indicadores de dao celular y se han utilizado en diferentes especies de peces como
herramientas efectivas para confirmar un estado de estrs oxidativo (Parvez y Raisuddin,
2005; Ferreira et al., 2005; 2007; 2008a; 2008b).
La oxidacin de cidos grasos poliinsaturados (LPO), an siendo un proceso complejo de
mltiples etapas, est comprendida por 3 etapas principales conocidas como: Iniciacin,
Propagacin y Trmino (Halliwell y Gutteridge, 1989). El proceso de oxidacin comienza
por el ataque de los radicales libres a los cidos grasos poliinsaturados (PUFAs, por su
sigla en ingls). Comnmente esta etapa de iniciacin parte con la formacin de un radical
5
y Campodnico, 1973;
Gosztonyi, 1979; Pequeo, 1979; Pavs et al., 2005; Licandeo et al., 2006). Asimismo, no
existe informacin publicada en cuanto a sus requerimientos en macronutrientes en
condiciones de cultivo. Los resultados zootcnicos del proyecto en que se inserta el
presente estudio demostraron que los juveniles de rbalo presentan una necesidad
proteica de 35,5% MS para alcanzar una tasa de crecimiento especifica (TCE) mxima.
Adems, se demostr que para niveles de inclusin protena de 28% y 35%, valores
cercanos a las necesidades proteicas, no se observa un efecto significativo en el
crecimiento cuando se utiliza 20% de lupino como fuente proteica alternativa a la harina
de pez. Por otro lado, se observ en ese mismo estudio que la digestibilidad del alimento,
protena y energa, disminuyen cuando el nivel de protena en la dieta es inferior a 21%.
Estos resultados estaran de acuerdo con Gosztonyi (1979), quien afirma que el rbalo
tiene un rgimen alimenticio predominantemente herbvoro. Adems, el bajo nivel de
protena determinado para obtener un mximo crecimiento, sugiere que el rbalo se
acerca a una especie omnvora/herbvora (Wilson, 2002). No obstante, posibles efectos
prejudiciales de la utilizacin de dietas desbalanceadas no son detectados al nivel del
crecimiento o de la digestibilidad, pero s ocasionan alteraciones al nivel histolgico (Uran,
2008) o promueven una situacin de estrs oxidativo. Hasta el momento, el efecto de la
utilizacin de diferentes niveles de protena y el efecto de la utilizacin de diferentes dietas
isoenergticas, con diferentes niveles de protena, en la histologa intestinal es, hasta el
momento, desconocido. Asimismo, un posible efecto de proteccin a la oxidacin celular
resultante de la utilizacin de fuentes proteicas vegetales es igualmente desconocido.
Efectivamente, se demostr que algunos compuestos presentes en muchos vegetales
podran actuar como antioxidantes (Moure et al., 2001) y su efecto en juveniles de rbalo
no ha sido todava probado.
7
El objetivo del estudio fue estimar la respuesta de las enzimas antioxidantes e indicadores
de dao tisular en juveniles de rbalo alimentados con dietas que diferan en el porcentaje
de inclusin de protena de pescado. Adicionalmente, determinar la respuesta de estos
mismos parmetros frente a la utilizacin de lupino blanco (Lupinus albus) como
reemplazante proteico a dos niveles distintos de inclusin proteica de la dieta. Finalmente,
se analiz el efecto de las dietas en histologa heptica e intestinal de rbalo para evaluar
el dao oxidativo generado. La ocurrencia de una regulacin nutricional de estos
indicadores permitir a futuro estimar un posible efecto negativo o benfico de una dieta
especfica para el cultivo de esta especie, permitiendo adems prever posibles efectos en
el crecimiento, sistema inmune, entre otros (Zhu et al., 2008).
Materiales y Mtodos
Condiciones experimentales de los peces analizados
El material biolgico analizado en el presente trabajo fue obtenido al final de la realizacin
de un experimento de crecimiento con juveniles de rbalo, conducido en las instalaciones
de Fundacin Chile, subestacin de Quillaipe, Regin de Los Lagos, en los meses de
diciembre 2009 a febrero 2010.
Para realizar este experimento, se utilizaron juveniles de rbalo con un peso inicial de
411.3g acondicionados en un sistema flujo continuo de agua de mar con estanques
circulares de fibra de vidrio, de 350 L de capacidad. Antes de iniciar el experimento, 960
peces fueron aclimatados al sistema de cultivo durante un mes y alimentados con una
dieta comercial. La distribucin de los peces se realiz de forma aleatoria en 24
estanques (40 peces/estanque), con un flujo de agua de 10L/min en cada estanque. La
temperatura del agua fue de 14C 1.5C y el fotoperiodo de 12h luz/12h oscuridad,
siendo estos parmetros controlados y mantenidos a lo largo del experimento. La
alimentacin se realiz manualmente, dos veces al da a la saciedad visual aparente,
durante 14 semanas, segn lo descrito por S et al., 2006.
De las dietas entregadas, seis presentaban niveles crecientes de protena (9%, 14%,
21%, 28%, 35% y 42% de protena en la dieta) y adicionalmente dos dietas fueron
formuladas con 28% y 35% de protena, con una inclusin de harina de lupino (Lupinus
albus) al 20%. Las ocho dietas experimentales eran isoenergticas e isolipdicas, (anexo
Muestreo
Durante los dos das subsecuentes al trmino del experimento de crecimiento, pasadas 6
horas desde la primera alimentacin del da, 2 peces fueron aleatoriamente muestreados
desde cada estanque (6 peces por tratamiento para anlisis de actividad enzimtica). Los
peces fueron anestesiados mediante inmersin en agua de mar con benzocana (BZ-20,
Laboratorios Veterquimica, Santiago, Chile), a una concentracin del 0.03% y sacrificados
mediante golpe craneal, siguiendo los procedimientos indicados para prctica de
eutanasia descritos en el Manual de tratamiento y utilizacin de peces en
experimentacin, del Canadian Council on Animal Care (2003). Posteriormente se
extrajeron las muestras tisulares retirando el hgado y una porcin de msculo sin piel
desde la regin anterior dorsal. Se muestrearon adicionalmente 2 peces por tratamiento
destinados a un anlisis histolgico. El material biolgico muestreado fue rpidamente
congelado en nitrgeno lquido y luego almacenado a -80C para posterior anlisis
bioqumico o fijado en formalina, para proceder a su anlisis histolgico.
Preparacin de Muestras
Hgados:
Para efectuar el anlisis de los indicadores de estrs oxidativo enzimticos y de dao
tisular, una porcin de hgado de cada tratamiento (siempre mantenida en hielo) fue
homogeneizada en tampn de homogeneizacin, en una proporcin de 1:10, durante 2
minutos, en un homogeneizador de vidrio potter-elvehjem. El tampn utilizado fue tampn
Tris HCl 100 mM, Tritn 0,1% X-100 y Na2EDTA 0,1 mM, pH 7.8. Luego se realiz una
centrifugacin del homogeneizado a 15.000g durante 20 minutos, a 4C. El sobrenadante
obtenido fue alicuotado en varios microtubos y nuevamente almacenado a -80C para
posterior anlisis enzimtico siendo el pellet depositado en el fondo del microtubo
centrifugado descartado.
Msculo:
Para muestras de msculo se sigui el mismo procedimiento antes descrito, sin embargo
por la mayor dureza del tejido, la homogeneizacin fue realizada en un homogeneizador
de tipo Ultra-turrax.
Anlisis bioqumico
Se determin la actividad de las enzimas: CAT, SOD, GPX, GR Y GST e indicadores de
dao tisular: LPO y PROTOX en los homogeneizados obtenidos de tejido heptico. Para
los homogeneizados de msculo, se midieron solamente indicadores de dao tisular, LPO
Y PROTOX. La metodologa para cada indicador es detallada a continuacin.
La actividad de la enzima Catalasa (CAT, EC 1.11.1.6) fue determinada segn Aebi, 1974
y Ferreira et al., 2008b. Se midi el consumo de H2O2 a 240 nm siendo el coeficiente de
extincin 40 Lmol1 cm1. El volumen del medio de reaccin en la microplaca fue 300ul y
contena 67.5 mM L1 de buffer KPi, pH 7.5, y 12.5 mM L1 de H2O2. La reaccin se inici
mediante la adiccin del medio de reaccin a la microplaca que contena la muestra. La
actividad de CAT se expresa en nmol min1 mg protena heptica-1.
La actividad de la enzima Superxido Dismutasa (SOD, EC 1.15.1.1) fue determinada
segn Ferreira et al., 2005; 2007, por un mtodo indirecto que envuelve la inhibicin de la
reduccin del Citocromo C. En este mtodo, la SOD compite con el Citocromo C por el
anin superxido generado en la reaccin entre base purnica xantina y enzima xantina
oxidasa. La actividad de la SOD se mide como el grado de inhibicin del Citocromo C, a
550 nm (McCord y Fridovich, 1969). La actividad se expresa en unidades de SOD mg
protena heptica1, donde 1 unidad de SOD corresponde al 50% de inhibicin de la
reaccin de la xantina oxidasa. La actividad obtenida fue comparada contra estndares de
SOD con concentracin conocida.
La Glutatin peroxidasa (GPx, EC 1.11.1.9) se determin segn lo descrito por Bell et al.,
1986, utilizando el kit de Cayman para GPx (N 703102), el cual determina la actividad de
esta enzima indirectamente por una reaccin acoplada con la enzima Glutatin Reductasa
(GR). El glutatin oxidado (GSSG), producido por la reduccin de un hidroperxido con la
GPx, es reciclado a su estado reducido por la GR en presencia de NADPH. La oxidacin
de NADPH a NADP+ es acompaada por una diminucin en absorbancia a 340nm. La
actividad de la GPx se expresa en nmol de NADPH oxidado min-1 mg protena heptica-1.
La Glutatin Reductasa, (GR, EC 1.6.4.2) fue medida mediante el kit para GR de Cayman
(N 703202). Esta enzima cataliza la reduccin NADPH-dependiente del Glutatin
Oxidado (GSSG) a glutatin reducido (GSH). Este kit comercial de GR determina la
10
una completa disolucin del pellet. Finalmente, el contenido en grupos carbonilo fue
cuantificado mediante la absorbancia de las muestras a 370nm. Los resultados son
entregados en nmoles de DNPH incorporado mg de protena-1, basado en un coeficiente
de extincin molar de 22.000 L M-1cm-1.
Para estandarizar las mediciones de los indicadores, se determin contenido de protena
en las muestras mediante el mtodo de Bradford (1976), usando albumina de suero
bovino (BSA) como estndar. Las unidades de los indicadores de estrs oxidativo se
entregan por gramos de protena. De esta forma se corrige la variacin de la composicin
proximal de los tejidos analizados, la cual puede variar con el tratamiento dietario al que
los peces fueron sometidos.
Los anlisis de cintica enzimtica fueron realizados mediante un anlisis de absorbancia
(Abs) en UV visible en el tiempo (t), en un lector de microplacas BioTek, modelo
PowerWave HT, utilizando el software Gen5 v1.10. Las lecturas se realizaron en
microplacas de 96 pocillos (Coastar). La variacin de Abs por unidad de tiempo (Abs/t)
obtenida fue comparada con la concentracin de protena presente en la muestra para as
determinar tanto la actividad enzimtica como para cuantificar los indicadores de dao
tisular.
Anlisis histolgico
Cortes histolgicos de hgados e intestinos de 2 peces por tratamiento fueron preparados
en dependencias del Instituto de Ciencias Marinas y Limnolgicas de la Universidad
Austral de Chile, Valdivia, Chile. Se conservaron en formalina al 6% y fueron
deshidratados de acuerdo a tcnicas histolgicas estndar, siguiendo el procedimiento
descrito en el Cuadro 1. Se prepararon cortes histolgicos con un espesor de 7 micras y
la tincin utilizada fue hematoxilina-eosina. Las muestras se analizaron mediante
microscopa ptica (x10) y las imgenes presentadas corresponden a magnificaciones de
x4 y x20, para intestino e hgado respectivamente. Se realiz un anlisis observacional,
evalundose en hepatocitos la conformacin y disposicin nuclear y en el intestino medio
se observ el largo de las vellosidades intestinales y el nmero de clulas caliciformes.
12
Cuadro 1. Descripcin del proceso de preparacin de las muestras para anlisis histolgico.
Etapa
Fijacin
Lavado
Lavado
Lavado
Lavado
Lavado
Lavado
Lavado
Lavado
Lavado
Inclusin
Inclusin
Producto
Formalina al 6%
Alcohol al 50%
Alcohol al 70%
Alcohol al 80%
Alcohol al 90%
Alcohol al 96%
Alcohol al 100%
Alcohol al 100% + Butanol
Alcohol de Butanol
Butanol + Paraplast
Paraplast
Paraplast
Tiempo
4 semanas
30 min
30 min
30 min
30 min
30 min
30 min
30 min
10 min
15 min
20 min
30 min
N veces
1
4
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Anlisis estadstico
Se evalu un diseo completamente al azar con descomposicin polinmica del efecto de
los niveles crecientes de protena (9, 14, 21, 28, 35 y 42) en cada indicador de estrs
oxidativo estudiado. El coeficiente de determinacin R2 fue utilizado para determinar el
porcentaje de varianza que es explicado por el modelo. El modelo utilizado corresponde a:
Yij i ij
i 1, 2 , 3
Yij= Corresponde a la actividad enzimtica promedio del estanque i, alimentados con el nivel de
protena j.
= respuesta promedio a un aumento del porcentaje de inclusin de protena en la dieta.
i= Efecto del tratamiento j.
ij= Error residual
Para describir el efecto del origen de la protena, nivel de inclusin e interaccin entre
ambos se evalu una estructura factorial 2x2 en las dietas 28P - 28PLU y 35P - 35PLU.
Finalmente, para evaluar una posible accin conjunta entre los indicadores de estrs
oxidativo, se realiz un anlisis de correlaciones simples entre todos los indicadores
analizados. El nivel de significancia se determin con p< 0.05 y se utiliz el software SAS
enterprise guide v9.2 para Windows.
Resultados
la incorporacin dietaria de 20% de harina de lupino (HL) en dos dietas con niveles de
protena diferentes.
Los resultados obtenidos para la enzima CAT mostraron diferencias significativas al
evaluar el efecto del nivel de protena en la dieta. El modelo de regresin que mejor se
aproxima a la representacin de la actividad enzimtica en funcin del nivel de protena
fue de tipo cuadrtico. Los valores ms altos de la actividad de la enzima fueron
observados en los tratamientos con los niveles ms altos y ms bajos probados de
inclusin proteica (Figura 4). Al analizar el efecto factorial de la inclusin de lupino al 20%
de la dieta, se observa un aumento significativo de la actividad de esta enzima con el
aumento de la protena de la dieta y no se observ un efecto significativo de la utilizacin
de lupino.
nm/min/mg prot
Anlisis de regresin
210
180
150
120
90
60
30
0
R2
p
0,69 0,04
9P
14P
21P
28P
35P
Coef. Var.
7,6%
42P
nm/min/mg prot
Anlisis Factorial
HP
Nivel
de prot.
s
Origen
de prot.
ns
Int
ns
HL
28
35
14
Para la enzima SOD se observaron diferencias significativas al evaluar el efecto del nivel
creciente de protena en la dieta. El modelo de regresin que mejor se aproxima a la
representacin de la actividad enzimtica en funcin del nivel de protena fue de tipo
cbico. La mayor actividad de la enzima SOD se encuentra en los peces alimentados con
las dietas 9P, 14P y 21P, con un valor mximo en el tratamiento 21P. Se observa una
disminucin de la actividad de esta enzima para niveles ms altos de protena (Figura 5),
comportamiento totalmente diferente a lo visto en la CAT, donde peces alimentados con
dietas altas en protena presentan alta actividad. En los grupos que recibieron dietas con
contenido vegetal (lupino a 20% de inclusin Dietas 28PLU y 35PLU), se observ que la
actividad de la SOD igualmente disminuye al aumentar la protena en la dieta. Tal como
en la CAT, a los niveles de protena probados, no se observ un efecto significativo del
reemplazo de protena de pez por protena de lupino en la actividad enzimtica de la
SOD.
U SOD/mg prot
35
30
25
20
15
10
5
0
R2
p
0,97 0,03
9P
14P
21P
28P
35P
Coef. Var.
4,3%
42P
U SOD/mg prot
35
30
25
20
15
10
5
0
HP
Nivel
de prot.
s
Origen
de prot.
ns
Int
ns
HL
28
35
15
Los resultados obtenidos para la enzima GPX mostraron un efecto significativo al evaluar
el efecto del nivel creciente de protena en la dieta. El modelo de regresin que mejor se
aproxima a la representacin de la actividad enzimtica en funcin del nivel de protena
fue de tipo cuartico. Se observa para GPx altos valores de actividad en los grupos
experimentales alimentados con dietas con bajo nivel de protena, siendo el valor ms alto
de esta enzima observado en el grupo alimentado con la dieta 14P. Luego, la actividad de
la enzima disminuye y presenta un leve incremento en las dietas con mayor contenido
proteico (Figura 6). Contrariamente a lo observado en CAT y SOD, en los grupos de
peces que fueron alimentados con lupino se observ un efecto significativo de la inclusin
proteica de lupino, incrementando la actividad enzimtica, no siendo evidente un efecto de
la protena a los 2 niveles probados.
Anlisis de regresin
14
12
10
8
6
4
2
0
R2
p
0,97 0,04
9P
14P
21P
28P
35P
Coef. Var.
16,1%
42P
14
12
10
8
6
4
2
0
HP
HL
28
Nivel
de prot.
ns
Origen
de prot.
s
Int
ns
35
16
Al evaluar la enzima GST se observ un efecto significativo del nivel creciente de protena
en la dieta. El modelo de regresin que mejor se aproxima a la representacin de la
actividad enzimtica en funcin del nivel de protena fue de tipo lineal, es decir hay una
relacin inversa de la actividad enzimtica con el aumento de protena de la dieta. Al
evaluar el efecto de la inclusin de lupino, no se observ un efecto significativo de la
utilizacin proteica de lupino en la actividad enzimtica, ni tampoco del nivel de protena
en la dieta a los 2 niveles proteicos probados.
100
Anlisis de regresin
80
R2
p
0,65 0,004
60
40
Coef. Var.
11%
20
0
9P
14P
21P
28P
35P
42P
nm/min/mg prot
Anlisis factorial
60
HP
40
HL
20
Nivel
de prot.
ns
Origen
de prot.
ns
Int
ns
0
28
35
Para la enzima GR, se observaron diferencias significativas entre los distintos grupos de
peces al evaluar el efecto de la protena de la dieta. El modelo de regresin que mejor se
aproxima a la representacin de la actividad enzimtica en funcin del nivel de protena
fue de tipo lineal y directa, es decir con el aumento de protena de la dieta hubo un
17
A. Anlisis de regresin GR
Anlisis de regresin
2,0
R2
p
0,85 0,0002
1,6
1,2
Coef. Var.
21,6%
0,8
0,4
0,0
9P
14P
21P
28P
35P
42P
B. Anlisis factorial GR
Anlisis factorial
2,0
1,6
1,2
HP
0,8
HL
Nivel
de prot.
ns
Origen
de prot.
s
Int
ns
0,4
0,0
28
35
18
nm/min/mg prot
G6PDH
200
R2: 0,99
p: 0,01
CV: 10,7%
160
120
80
40
0
9P
14P
21P
28P
35P
42P
19
Eq MDA/mg prot
Anlisis de regresin
0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
R2
p
0,93 0,004
9P
14P 21P
28P 35P
Coef. Var.
22,3%
42P
Eq MDA/mg prot
0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
HP
HL
Nivel
de prot.
s
Origen
de prot.
ns
Int
ns
28
35
Nivel de protena en la dieta
Figura 10a. Niveles hepticos (H) de LPO en juveniles de rbalo (Eleginops maclovinus). A: Anlisis de regresin: Efecto
del nivel creciente de protena en la dieta para 6 niveles de inclusin (9, 14, 21, 28, 35 y 42). B: Anlisis factorial: Efecto de
la inclusin de harina de lupino en 2 niveles de la dieta 28 y 35; s: significativo, ns: no significativo, int: interaccin. Valores
son presentados como promedios (n=3) desviacin estndar (DE). Significancias p < 0.05.
Eq MDA/mg prot
0,05
0,04
R2
-
0,03
p
ns
Coef. Var.
89,6%
0,02
0,01
0,00
-0,01
9P
14P
21P
28P
35P
42P
20
Eq MDA/mg prot
0,05
0,04
0,03
HP
0,02
Nivel
de prot.
s
Origen
de prot.
ns
Int
ns
HL
0,01
0,00
28
35
21
A. Anlisis de regresion
PROTOX-H
nm DNPH/mg prot
7
6
5
4
3
2
1
0
Anlisis de regresin
R2
0,5
9P
14P
21P
28P
35P
p
0,01
Coef. Var.
6,1%
42P
7
6
5
4
3
2
1
0
Anlisis factorial
Nivel
de prot.
ns
HP
HL
Origen
de prot.
ns
Int
s
28
35
Nivel de protena en la dieta
nm DNPH/mg prot
nm DNPH/mg prot
Figura 11a. Niveles hepticos (H) PROTOX en rbalo (Eleginops maclovinus). A: Anlisis de regresin: Efecto del nivel
creciente de protena en la dieta para 6 niveles de inclusin (9, 14, 21, 28, 35 y 42). B: Efecto de la inclusin de harina de
lupino en 2 niveles de la dieta 28 y 35; s: significativo, ns: no significativo, int: interaccin. Valores son presentados como
promedios (n=3) desviacin estndar (DE). Significancias p < 0.05.
5
4
3
2
1
0
R2
9P
p
ns
Coef. Var.
14,8%
Anlisis factorial
HP
HL
28
Nivel
de prot.
ns
Origen
de prot.
ns
Int
s
35
22
Para determinar si debido a los tratamientos aplicados hubo una variacin similar entre los
indicadores de estrs oxidativo estudiados, se realiz un anlisis de correlaciones simples
de Pearson entre ellos. Entre las correlaciones significativas observadas, caben destacar:
la correlacin negativa entre SOD y CAT (p=0.001, R2=0.077), la correlacin positiva de
CAT con GPX (p=0.02, R2=0.63), la correlacin positiva entre GR y G6PDH (p=<0.0001,
R2=0.91), la correlacin negativa entre GR y LPO-h (p=0.008, R2=0.72), la correlacin
positiva de LPO-h con PROTOX-h (p=0.001, R2=0.76) y la correlacin significativa positiva
observada de GPX y GST con LPO-h y PROTOX-h. En el cuadro 4 se agrupan todas las
correlaciones significativas observadas.
CAT
GPX
GR
GST
LPO-H
PROTOX-H
G6PDH
CAT (-)
SOD (-)
CAT (+)
SOD (-)
GPX (+)
GPX (+)
GPX (+)
SOD (-)
GR (-)
GPX (+)
GST (+)
GST (-)
GR (-)
GST (+)
GST (+)
GR (+)
G6PDH (-)
LPO-h (+)
LPO-h (-)
LPO-h (+)
PROTOX-h (+)
LPO-h (+)
GST (-)
G6PDH (-)
G6PDH (-)
G6PDH (-)
LPO-h (-)
PROTOX-h (+)
GR (-)
PROTOX-H (-)
Signo entre parntesis indica grado de relacin de la correlacin. (+): Correlacin positiva, (-): correlacin negativa
23
presentaron hepatocitos con forma y tamao que se considera normal, sumado a algunos
adipositos (AD) dispersos (Figura 12).
P.N.
AD
N.R.
N.I.
Dieta 35P
Dieta 9P
Figura 12. Comparacin de cortes histolgicos de hgado de rbalo para dietas 9P y 35P (H&E x20).
sugiriendo un
proceso
c.c.
c.c.
i.v.
Dieta 9P
Dieta 35P
Figura 13.Comparacin de cortes histolgicos de intestino de rbalo para dietas 9P y 35P (H&E x4).
24
Dieta 28P15L
Dieta
Dieta28PLU
28PLU
Figura 14. Comparacin de cortes histolgicos en hgado de rbalo para dietas 28P15L y 28PLU. (H&E x20).
Dieta 35PPLU
Dieta 35PLU
Figura 15. Comparacin de cortes histolgicos en hgado de rbalo para dietas 35P15L y 35PLU. (H&E x20).
25
c.c.
c.c.
Dieta 28PLU
Dieta 28P
Figura 16.Comparacin de cortes histolgicos en intestino medio de rbalo para dietas 28P15L y 28PLU.
(H&E x4).
c.c.
Dieta 35P
c.c.
Dieta 35PLU
Figura 17.Comparacin de cortes histolgicos en intestino medio de rbalo para dietas 35P15L y 35PLU,
(H&E x4).
26
Discusin
Los juveniles de rbalo, al igual que todos los organismos que utilizan oxgeno en
situaciones normales, producen ERO durante su metabolismo. Estos radicales se
consideran molculas mensajero y controlan procesos de ventilacin, relajacin muscular
y funciones inmunolgicas en los peces (Drge 2002). A su vez, las defensas
antioxidantes del organismo aseguran que las EROS no extiendan una accin catablica
toxica sobre el propio organismo, dependiendo as la homeostasis del equilibrio entre
factores oxidantes y antioxidantes del organismo. Este equilibrio es frecuentemente
perturbado por diversas situaciones, tales como la presencia de xenobiticos (Ferreira et
al., 2006); la contaminacin con metales pesados (Pandey et al., 2001; Ferreira et al.,
2008); la presencia de un estrs nutricional (Pascual et al., 2003; Welker et al., 2003;
Sitj-Bobadilla et al., 2005), entre otros. Estas situaciones resultan en una sobreestimulacin y generacin de ERO, la cual, al provocar una situacin de estrs oxidativo
en el organismo, gatilla una respuesta de defensa que es evidenciada por un aumento de
la actividad de algunas enzimas y la cantidad de algunos indicadores celulares, tales
como la oxidacin lipdica o proteica.
El presente experimento prob el efecto de la utilizacin de dietas con diferente contenido
de protena (concentracin y tipo de protena) en el equilibrio redox de juveniles de rbalo
mantenidos en cautiverio, en idnticas condiciones de densidad y de variables
ambientales. De todos los indicadores de respuesta a una situacin de estrs oxidativo
probados, algunos evidenciaron una estrecha relacin con el nivel proteico entregado en
la dieta, mientras que otros indicadores no mostraron tal relacin.
Este estudio comenz del principio de que la utilizacin de un nivel de protena en la dieta
que no sea el ideal para la especie, representa un desbalance nutricional y resultar en
una consecuente variacin del equilibrio entre los EROS formados y la respuesta de
defensa del organismo. La validacin de una relacin entre la actividad de algunos
indicadores de estrs oxidativo y el nivel proteico de la dieta representa un enorme
potencial, pues permitir identificar de forma inmediata una posible situacin de carencia
o exceso de protena al comparar grupos de peces de esta especie mantenidos en
cautiverio y alimentados con diferentes niveles de protena en la dieta.
27
28
1.
proteica y un consecuente dao a la estructura celular. Boer et al., 2010 explica esta
situacin por la ocurrencia de una sntesis de protenas deteriorada, la cual, entre otros
factores, desencadenar un desequilibrio a nivel de la cadena transportadora de
electrones produciendo un incremento de ERO a nivel celular y elevando tambin los
valores de las enzimas antioxidantes.
Relativamente a los grupos alimentados con bajos niveles de protena, se registr una
ingestin de alimento muy baja, observndose el rechazo del alimento e inclusivamente
una prdida de peso en el grupo 9P. En este tratamiento se asume que los peces
metabolizaron parte de los lpidos y protenas estructurales para la obtencin de energa,
situacin que no ocurri en los tratamientos con niveles de protena superiores. En el
grupo alimentado con la dieta con 9% de protena (9P), se observ adems una variacin
en la composicin proximal, con una disminucin significativa del contenido en grasa
relativo a los dems grupos experimentales (Llancabure, 2011). Esta situacin, adems
de explicar los bajos niveles de actividad de la enzima G6PDH, indicadora de sntesis
lipdica, fue acompaada de un incremento en la mayora de los indicadores de estrs
oxidativo y de dao tisular, apuntando este conjunto de resultados a un estado de gran
estrs oxidativo en los grupos 9P y 14P. Cabe mencionar que aunque no se haya
observado en el grupo 14P diferencias en la composicin proximal de los peces
comparativamente a grupos alimentados con mayor nivel de protenas, las diferencias en
el crecimiento son corroboradas por la alta actividad de las enzimas indicadores de estrs
oxidativo, confirmando un estrs nutricional que haba sido apenas sugerido por el menor
crecimiento observado. Para los tratamientos de bajo contenido proteico en la dieta, el
anlisis complementario de otros parmetros sanguneos (lactato, glucosa, cortisol)
ayudarn a confirmar un estado de estrs fisiolgico asociado al estrs celular
encontrado.
Otros trabajos han igualmente asociado la disminucin del crecimiento a una situacin de
estrs oxidativo. Braun et al., 2006; 2008, observaron menor crecimiento en Rhamdia
quelen y Leporinus elongatus, cuando fueron sometidos a hipoxia severa, la cual resulta
en un aumento significativo de radicales libres. Tal como ocurri en el presente trabajo,
estos autores explicaron el menor crecimiento observado por un desvo de la energa
disponible hacia la sntesis de defensas antioxidantes. En estos trabajos, se observ
igualmente una alta actividad de las enzimas SOD y CAT asociada a altos valores de
30
TBARS en los peces sometidos a la hipoxia severa como factor de estrs. La presencia
de una baja tasa de ingestin, baja tasa de crecimiento y una alta respuesta enzimtica
de la CAT, SOD, GPX y GST, adems del aumento de los indicadores de oxidacin tisular
LPO-H y PROTOX-H fueron tambin observadas en dentn (Dentex dentex) cuando fue
sometido a tratamientos de ayuno (Morales et al., 2004), indicando una respuesta
metablica similar al rbalo cultivado en una situacin de carencia nutritiva.
Para otros indicadores estudiados, las enzimas dependientes del glutatin (enzimas GPX,
GR, GST), la enzima GPX present una correlacin positiva con las enzimas CAT, GST, y
con los indicadores LPO-h y PROTOX-h, observndose los mayores valores en los
tratamientos con menor contenido en protena de la dieta. Esta correlacin seala que en
esta especie este grupo de enzimas vara significativamente con el contenido proteico en
la dieta, aumentando su actividad simultneamente a la ocurrencia de dao oxidativo en
las dietas con menor contenido en protena.
Exceso de protena en la dieta:
Los parmetros de crecimiento y composicin corporal obtenidos para este mismo
experimento determinaron que aunque el nivel de protena de 35% haya sido el nivel
31
actividad metablica indicado por la actividad de esta misma enzima en los tratamientos
de alta inclusin proteica. Tal como fue mencionado, la definicin de ambos estados
depender no solamente de la actividad de la enzima CAT, sino que tambin de los
indicadores de LPO y PROTOX que definirn la presencia o no de un estado de EO.
Finalmente se destaca una alta correlacin observada entre las enzimas CAT y GPX
(p=0.02, R2=0.63), la cual sugiere una respuesta a situaciones de estrs oxidativo o
aumento metablico (bajos o altos niveles de protena, respectivamente) similar para las
dos enzimas con accin de proteccin antioxidante. A su vez, la enzima GST, aunque
tambin presente una correlacin positiva con las enzimas CAT y GPX, su alta actividad
solamente fue demostrada en los grupos alimentados con bajos niveles de protena, no
registrando un aumento de su actividad con el aumento de la actividad metablica
sugerida para los grupos alimentados con dietas de alto contenido proteico. La importante
accin de la enzima GST frente a una situacin de estrs oxidativo fue tambin detectada
en turbot (Scophthalmus maximus) frente a la presencia dietaria de ingredientes
precursores de radicales libres (Tocher et al., 2003). La actividad de las enzimas GST,
GPX y GR est ntimamente relacionada con la presencia de Glutatin en su forma
reducida u oxidada (GSH o GSSG) y en el presente experimento las enzimas GPX y GST,
aunque hayan presentado una alta actividad en los tratamientos de menor contenido en
protena, podran haber presentado una actividad ms alta si la actividad de la enzima GR
hubiese sido igualmente alta. La forma reducida del Glutatin (GSH), convertida por la
enzima GR, representa el sustrato de las enzimas GPX y GST, que convertiran el
glutatin a su forma oxidada (GSSG) (Leopold y Loscalzo, 2000), estimulando a su vez el
aumento de la actividad de la enzima GR. Diferentes situaciones podran explicar la baja
actividad de la enzima GR y alta actividad de las enzimas GPX y GST: por un lado podra
estar presente un insuficiente aporte nutricional de la forma reducida del glutatin (GSH),
acompaado de una baja disponibilidad de NADPH (sugerido por la baja actividad de la
enzima G6PDH, en estos tratamientos). De este modo estara presente el sustrato de las
enzimas GPX y GST sin intervencin significativa de la enzima GR. Por otro lado, en los
grupos alimentados con bajos niveles de protena en la dieta puede haber ocurrido un
bombeo de la forma oxidada del glutatin (GSSG) hacia el exterior de la clula. Esta
situacin fue observada por Keppler (1999) en situaciones en que la actividad de la GR es
insuficiente para la conversin del GSSG en GSH. Considerando esta posibilidad, esto
explicara una alta actividad de las enzimas GPX y GST y una simultnea baja actividad
33
de la enzima GR. Por el momento no hay informacin que permita confirmar el posible
bombeo de GSSG hacia el exterior de la clula. Por otro lado, los resultados disponibles
hasta el momento siguieren que efectivamente la disponibilidad de NADPH que permita la
accin de algunas enzimas antioxidantes fue significativamente ms alta en los
tratamientos con dietas de alta concentracin proteica en relacin a los tratamientos de
baja concentracin proteica. En este sentido, la actividad de la enzima G6PDH,
productora de NADPH, fue significativamente ms alta en las dietas de mayor inclusin
proteica y, no se observ una variacin significativa de la concentracin lipdica en los
peces de estos grupos experimentales (Llancabure, 2011 y Rioseco, 2011). Esta situacin
sugiere que el poder reductor del NADPH no fue destinado a la sntesis lipdica, siendo
utilizado por las enzimas antioxidantes, tales como la GR. Para corroborar esta hiptesis
se tiene la alta correlacin observada entre las enzimas GR y G6PDH para los altos
niveles de protena probados.
Indicadores de estrs oxidativo en diferentes tejidos:
Los presentes resultados corroboran la necesidad inherente a este tipo de estudios en
determinar la actividad de una amplia gama de indicadores de respuesta a una situacin
de estrs oxidativo. Esto se debe a que las diferentes especies de peces cuentan con
diferentes mecanismos de proteccin antioxidante que responden de forma particular, en
diferentes tejidos y en diferentes situaciones fisiolgicas, que inducen la formacin de
EROS. Concretamente y con respecto a la actividad enzimtica medida, la GPx mostr
ser una efectiva defensa heptica al estrs oxidativo en rbalo, al contrario de lo
observado por Trenzado et al., 2006, que mostr en hgado su menor actividad cuando
fue comparada con otros tejidos. Por otro lado, en este mismo estudio de Trenzado et al.
2006, se observ una mayor actividad de la enzima CAT en hgado que en msculo,
justificando estos autores las diferencias por el mayor consumo de oxgeno y actividad
metablica ms alta observada en hgado.
Con respecto al grado de peroxidacin lipdica (LPO), se observ una alta actividad de
este parmetro en hgado (LPO-H) en los tratamientos de menor nivel de incorporacin
proteica, indicando la presencia de estrs oxidativo y tambin una posible movilizacin de
lpidos (Ferreira et al., 2005; 2007). La correlacin positiva observada entre la LPO y
algunas enzimas de proteccin antioxidante corrobora la presencia de una actividad
34
Las protenas oxidadas (PROTOX) y LPO a nivel heptico y muscular han sido utilizadas
en diferentes trabajos como indicadores de dao celular (Morales et al., 2004; Ferreira et
al., 2008; Ferreira et al., 2010). En el presente trabajo una correlacin positiva entre estos
indicadores de dao oxidativo fue observada en tejido heptico (p=0.001, R2=0.76). En
los trabajos de Ferreira et al. (2008; 2010), una similar correlacin positiva fue observada
para estos parmetros, observndose que el incremento de la LPO en hgado puede ser
responsable por un consecuente aumento del nivel de PROTOX. En el presente trabajo,
en los diferentes grupos experimentales no fueron observadas diferencias significativas
para estos indicadores de oxidacin tisular y tampoco una asociacin fue observada en
tejido muscular, imposibilitando determinar si en el musculo existi un real dao proteico o
lipdico.
A nivel muscular, los valores promedios observados en PROTOX evidencian un bajo nivel
de oxidacin proteica en las dietas de menor y mayor nivel de inclusin proteica. Estos
resultados sugieren que a nivel muscular no ocurri un dao proteico significativo,
presumiblemente debido al efecto protector de las enzimas antioxidantes presentes y que
evidenciaron un aumento significativo de su actividad.
Histologa digestiva:
El anlisis histolgico permiti observar en el grupo de peces alimentado con dietas con
bajo aporte proteico la presencia de hepatocitos anormales, con desplazamiento de los
ncleos hacia la periferia celular, agrupndose en forma de rosetas (N.R.) o presentando
ncleos con bordes irregulares (N.I.). En el tejido intestinal analizado, fue observado para
estas mismas dietas, que los peces presentaron bajo nmero de clulas caliciformes (c.c.)
35
2.
Para el presente experimento se utiliz lupino blanco (L. albus) como reemplazante de la
harina de pescado, el que ha sido descrito por Sujack et al., 2006, como un cultivo con
uno de los mayores niveles de aminocidos, mejor perfil y ms altos niveles de
aminocidos esenciales, que otras especies por los estndares de nutricin para
humanos y animales. Segn Llancabure (2011), se observ que la inclusin dietaria de
lupino no afect significativamente el ndice Hepatosomtico (IHS) de los peces y
tampoco el crecimiento. Similarmente, en nuestros resultados, la mayora de los
indicadores de estrs oxidativo aqu cuantificados no present significancias frente a la
inclusin de lupino, por lo que se esperaba un comportamiento similar entre estos
indicadores. De las enzimas e indicadores estudiados, solamente la GR y GPX arrojaron
resultados significativos para el tipo de protena utilizado y se observ una interaccin
entre la cantidad de protena y el tipo de protena utilizado y las PROTOX-H en la
interaccin de ambos factores (nivel de protena dietario x tipo protena). Aunque no haya
mucha investigacin realizada en el Rbalo con respecto a estos parmetros, la utilizacin
de lupino dulce en otras especies gener una disminucin del IHS en los peces (Borquez
et al., 2011a), siendo en este trabajo juveniles de truchas arcoris alimentadas con dietas
con un porcentaje de inclusin significativamente ms alto que los que fueron probados
en el reemplazo parcial utilizado en esta investigacin.
36
37
A nivel histolgico, se observ que la utilizacin de 20% de lupino en dietas con 28% y
35% de protena dietaria no genera en juveniles de rbalo alteraciones a nivel de los
hepatocitos, de los enterocitos y ni de los adipocitos. En Borquez et al., 2011a al incluir
harina de lupino blanco entero en las dietas para trucha arcoris, se observ a nivel tisular
que la utilizacin de niveles muy altos de inclusin de lupino (40% de la dieta) puede
resultar en un excesivo aumento de clulas adiposas en hepatocitos. As, Vilhelmsson et
al., 2004 observaron en Oncorhynchus mykiss, que el remplazo dietario del 100% de la
harina de pescado por una mezcla de productos de origen vegetal gener un aumento en
la actividad de la G6PDH y enzima mlica (ME), enzimas indicadoras de la lipognesis.
Sin embargo, niveles menores de inclusin, similares a los utilizados en la presente
investigacin, tales efectos no fueron observados y no se observaron patologas
asociadas al contenido vegetal de la dieta, especficamente, la presencia y cantidad de
clulas adiposas en salmn fue considerada normal cuando se remplaza harina de
pescado por niveles de lupino hasta el 30% (Borquez et al., 2011a; 2011b).
Conclusin
38
39
Resumen
El objetivo de este trabajo fue evaluar en juveniles de rbalo (Eleginops maclovinus) el
efecto metablico de la utilizacin de dietas isoenergticas e isolipdicas con diferentes
niveles de protena de pescado y tambin el efecto de una sustitucin parcial de protena
de pescado por protena vegetal. Para ello, la actividad heptica de las enzimas
antioxidantes clave (CAT, SOD, GPx, GST, GR y G6PDH) y la presencia de algunos de
los indicadores de dao tisular (peroxidacin de lpidos, protenas oxidadas e histologa
heptica e intestinal) fueron determinadas. Los peces fueron distribuidos aleatoriamente
en 24 grupos de 40 peces cada uno. Ocho dietas experimentales fueron asignadas al azar
a los grupos en triplicado y se alimentaron durante 3 meses. Seis dietas presentaban un
aumento de los niveles de protena de pescado (9, 14, 21, 28, 35 y 42% de protena de la
dieta). Adems, dos dietas se formularon con 28 y 35% de protena y con una inclusin de
harina de lupino (Lupinus albus) al 20%. Al final del experimento, las enzimas CAT, SOD,
GPX y GST mostraron una mayor actividad en los grupos de peces alimentados con
menores niveles de protenas -Dietas 9P y 14P. De manera similar, los niveles de TBARS
y protenas oxidadas a nivel heptico mostraron un grado de oxidacin ms alto en los
peces alimentados con dietas con bajo contenido en protena, lo que indica un estrs
oxidativo en estos grupos. La actividad de GR y G6PDH aument con el contenido de
protena en la dieta. Tambin se observ una alta actividad de la enzima CAT en los
peces alimentados con un alto nivel de inclusin de protena, lo que sugiere un aumento
en la actividad metablica en los grupos alimentados con alto contenido de protena. El
anlisis histolgico de los peces alimentados con dietas bajas en protena mostr en
hgado la presencia de ncleos agrupados en rosetas y con forma irregular. En el intestino
se observ una menor presencia de clulas caliciformes y microvellosidades ms cortas y
engrosadas, indicando la ocurrencia de dao celular en ambos tejidos. En cuanto a la
utilizacin de protenas vegetales, los resultados no mostraron un aumento del estrs
oxidativo en los dos niveles de protenas ensayadas. Los parmetros estudiados en este
trabajo mostraron que los juveniles de rbalo presentan una alta tolerancia a las
diferentes dietas y evidencian un alto estrs oxidativo cuando la inclusin de protena
dietaria es muy baja.
Palabras clave: Eleginops maclovinus, Estrs oxidativo, Enzimas antioxidantes,
Lipoperoxidacin, Protenas oxidadas.
40
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Anexos
Cuadro 1. Formulacin y composicin de las dietas experimentales
Dietas
9P
14P
21P
28P
35P
42P
28PLU 35PLU
10,0
17,5
27,5
37,5
47,5
57,5
25,5
35,5
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
20,0
20,0
51,0
45,0
37,0
29,0
21,0
13,0
21,5
13,5
Grano de trigo
18,0
18,0
18,0
18,0
18,0
18,0
18,0
18,0
Aceite de pescado
14,3
13,5
12,5
11,5
10,5
9,5
11,0
10,0
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
NaH2PO4
4,7
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
2,0
1,0
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
(1)
Lupino (2)
Almidn
(3)
(4)
90,42
Protena
8,94
35,19
Lpidos
15,56
Ceniza
1,81
5,77
20,21
P (Total)
1,36
1,39
1,40
1,42
1,44
1,46
1,41
1,43
Proporcin Protena/Lpidos
0,58
0,92
1,37
1,83
2,28
2,73
1,81
2,26
P/E (g / MJ)
7,22
(1)
(2)
(3)
(4)
2,71
3,91
5,11
6,31
7,51
4,57
20,26
Harina de pescado ALIMAR, secada con vapor a baja temperatura (LT), (Prot: 72.8% MS; Lip: 9.9% MS).
Lupino blanco AVELUP
Almidn de betarraga (crudo)
Premix vitamnico y mineral DSM, CLSF26A008
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Y = (0,616134)*(1-euler^(-(0,113414)*(x-(8,90866))))
0,8
0,6
0,4
0,2
SGR
0,0
-0,2 0
8,910
20
35,5 40
50
60
TCE 95%
-0,4
-0,6
30
TCE MANT
-0,8
-1,0
-1,2
Figura 1. Modelo que relaciona la Tasa de Crecimiento Especifica (TCE, SGR en ingls) de juveniles de
Eleginops maclovinus con los diferentes niveles de protena dietaria presente en las dietas experimentales
(%). SGR mxima al 95% se obtiene con 35,5% de protena en la dieta y la TCE que cubre las necesidades
de mantencin (TCE MANT) de la especie se obtiene con 8,9% de protena en la dieta
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