Protocolo de purificacin de LDH de pechuga de pollo

Luz del Carmen Castellanos Romn

1. La carne de pollo 20 g se corta en cubos (puede congelarse) y se licua en
aproximadamente dos y medio volmenes de amortiguador A fro . Se realiza la
operacin a 4C mediante pulsos, se enjuaga el vaso de la licuadora con 10 mL del
mismo amortiguador y se agrega al licuado. Se registra el volumen del licuado F0 y se
almacenan tres alcuotas de 50 L para posteriores anlisis.
2. Se centrifuga a 10 000 rpm por 10 a 4C. Se filtra el sobrenadante con una gasa, ste
es la fraccin F1, se determina su volumen y se almacenan tres alcuotas de 50 L.
3. Se agrega lentamente sulfato de amonio pulverizado hasta alcanzar una concentracin
del 55 % de saturacin (0.351 g/mL). Se centrifuga a 10 000 rpm por 10a 4C. Se
colecta el sobrenadante F2, se registra el volumen final y se almacenan tres
alcuotas.
4. A la fraccin F2 se le agrega lentamente sulfato de amonio pulverizado hasta alcanzar
una concentracin del 75 % de saturacin (0.141 g/mL). Se centrifuga a 10 000 rpm
por 10a 4C. El precipitado se resuspende en 1 mL de agua destilada, esto es la
fraccin F3, se registra el volumen final y se almacenan tres alcuotas.
Desalado
5. En una columna de 2.5 mL de Sephadex equilibrada con 3 mL de amortiguador A, se
cargan 600 L de F3 y se eluye con 2 mL de amortiguador A, se desecha el volumen
vaco aproximadamente 1 mL, se colecta el primer mL, F4, y el segundo; se almacenan
tres alcuotas de F4.
Cromatografas
Macroprep
A una columna de Macroprep de 1.5 mL equilibrada con 5 mL de amortiguador A,
se cargan 200 L de F4. Se lava con 2 mL de amortiguador A y se eluye con 2 mL
de amortiguador A + NaCl 1 M, se toman fracciones de 1 mL.
Cibacron
A una columna de 0.5 mL de Cibacron Blue equilibrada con 10 mL de amortiguador
A se le carga con 700 L de F4, se lava con 10 mL de amortiguador A y se eluye
con 5 mL de amortiguador B, se colectan fracciones de 2.5 mL. Se lava con 10 mL
de amortiguador A.
Determinar cantidad de protena y actividad enzimtica, en cada alcuota reservada
durante la tcnica. Calcular enriquecimiento y rendimiento de cada paso.

Amortiguador A: TRIS pH 8.6 20 mM , PMSF 1 mM, 2-mercaptoetanol 0.5 mM

Amortiguador B: TRIS pH 8.6 20 mM, PMSF 1 mM, 2-mercaptoetanol 0.5 mM,
NADH 1 mM
Amortiguador A + NaCl 1 M

Para el clculo de la concentracin de protena

Se toman 10 L de la fraccin ms 990 L de agua y se lee en celdas de plastibrand a
260 y 280 nm, ajustando a cero con agua destilada. Se utiliza la siguiente frmula para
el clculo.
mg/mL = (1.51 A280 0.76 A260 )dilucin
Se toman como criterios de pureza:
A260 /A280 DNA puro = 2

A260 / A280 protena pura = 0.57

Ensayo para medir la actividad de LDH

Amortiguador de fosfatos 100 mM
Piruvato 10 mM
Agua
NADH 4 mM
Enzima

515 L
30 L
395 L +9 L
50 L
1 L

*Se recomienda hacer diluciones de las fracciones F0, F1, F2, F3: 1L + 9 L agua
y de sta tomar 1 L para el ensayo de actividad.
Macropre
Fracciones F0
F1
F2
F3
F4
po
Cibacron

A260
A280
Prot.
mg/mL

t (s)

0
10
20
30
40
50

F0

F1

F2

F3

F4

Macropre
po
Cibacron

60
Si es necesario tomar las lecturas por ms tiempo.