MICROTCNICA DE AGLUTINACIN EN GEL

FUNDAMENTOS Y TCNICAS BSICAS

T.H. Jorge GOLFFED

Asesora Tcnica:

Presentacin:

T.H. Martn GULARTE

Dr. Andrew MILLER

T.H. Mariana LPEZ

Dra. Lourdes Viano

T.H. Danielle WIKMAN

PRLOGO
La microtcnica de aglutinacin en gel represent un avance cuntico en
cuanto a la inmunohematologa. En una poca en la cual las enfermedades
transmisibles dominaban el inters de quienes trabajaban en Medicina
Transfusional, sta tcnica vino a centrar nuevamente la atencin en la
inmunohematologa: centro focal de la transfusin de sangre.
La rapidez, facilidad de empleo y sensibilidad de la microtcnica de
aglutinacin en gel permiten resolver las complejas situaciones planteadas
en pacientes que presentan aloinmunizacin antieritrocitaria y requieren
soporte transfusional o cursan un embarazo.
No obstante, la microtcnica en gel requiere aplicar cuidadosamente los
procedimientos recomendados a los efectos de obtener resultados
confiables y reproducibles.
El autor proporciona rica informacin de la microtcnica en gel, recogida
de su prctica de largos aos utilizando la misma y aporta la valiosa
experiencia de numerosos autores y especialistas tanto nacionales como
internacionales.
El lector encontrar en sta publicacin un material de lectura muy
interesante para el aprendizaje y para usar como referencia obligada en la
prctica diaria.
Felicitamos a Jorge Golffed por el esfuerzo desplegado y su preocupacin
por compartir con los dems colegas del medio los secretos del arte de
una actividad tan fascinante como lo es la inmunohematologa.

Dr. Andrew MILLER

Jefe del Laboratorio de Inmunohematologa
Servicio Nacional de Sangre
Administracin de Servicios de Salud del Estado
Montevideo - Uruguay

En memoria de mi querido viejo:

Jos Golffed.
(12.12.1928 - 14.03.1998)

PREFACIO
El presente trabajo es un material de divulgacin cientfica de la
microtcnica de aglutinacin en gel de DiaMed (MTS: Micro Typing
System) realizado sin fines de lucro para el autor.
Se trata de una tcnica revolucionaria para el trabajo diario en los Servicios
de Inmunohematologa y Bancos de Sangre.
Sencillez, comodidad, rapidez y exactitud son algunos de los tantos
atributos que merece este mtodo de trabajo.
Casualmente el prximo ao, Saiden S.A. (importador para nuestro pas)
cumple 20 aos de representacin de DiaMed ID en Uruguay.
Este material lleva dormido algunos aos en mi escritorio. Escribir es
apasionante, pero consume algo muy valioso: el tiempo.
Tiempo que se le quita a la familia, y an consciente de ese delito, segu
adelante con este proyecto.
El Laboratorio de Inmunohematologa del Servicio Nacional de Sangre
realiza ms de 3000 estudios por microtcnica de aglutinacin en gel por
ao, habiendo comenzado a trabajar en ella en el ao 1995, lo cual lo
convierte sin lugar a duda en el Centro Nacional de Referencia.
Nada de este material que llega a la colectividad tcnica de Hemoterapia
sera posible sin el apoyo que me brindaron la Direccin del Servicio
Nacional de Sangre en la persona de la Dra. Lourdes Viano, el Jefe del
Laboratorio de Inmunohematologa, Dr. Andrew Miller; la tolerancia y
paciencia de tres notables tcnicos como los son T.H. Martn Gularte,
Mariana Lpez y Danielle Wikman quienes no escatimaron de su valioso
tiempo y conocimientos para conmigo.
Mi reconocimiento al Sr. Gustavo Buela (por Saiden S.A.) por su apoyo en
este proyecto y al Sr. Ricardo Mendillo (representante de DiaMed ID

Argentina por permitirme nombrar la marca del producto y autorizarme a

reproducir fotografas de insumos y aplicacin de las tcnicas.

No por ltimo y menos importante, deseo agradecer de corazn a mi

esposa, por haberme acompaado en este emprendimiento literario.
Fue en el ao 1992 cuando escrib el Manual de Tcnicas Bsicas en
Hemoterapia el cual comprender el lector, trataba de tcnicas
convencionales en el material de esa poca, vigentes an.
En ese ao naca mi primera hija, Natalie a quien le dediqu el libro y
quien hoy con 22 aos de edad es quien ha compaginado, editado y
traducido del ingls al espaol buena parte del material que se presenta en
este trabajo.
Lo ms sorprendente para m fueron los tropiezos de pasar de una
mquina de escribir a un ordenador personal, pero con ayuda de Luca (mi
segunda hija de 10 aos) y sus conocimientos de computacin, todo fue
mucho ms ameno y sencillo.
A ambas cmplices: gracias por su constante apoyo.
A todos ellos y a ustedes, gracias por el tiempo dispensado.

T.H. Jorge GOLFFED

Montevideo Julio 2014

Un libro abierto es un cerebro que habla; cerrado, un amigo que espera;

olvidado, un alma que perdona; destruido, un corazn que llora.

Proverbio hind.

MICROTCNICA DE AGLUTINACIN EN
GEL.
FUNDAMENTOS Y TCNICAS BSICAS.

INTRODUCCIN.
El mtodo tradicional de evidenciar la interaccin entre anticuerpos de grupos
sanguneos y sus respectivos antgenos en los hemates es la reaccin de
aglutinacin, sea esta en medio salino, macromolecular, de baja fuerza inica,
a diferentes temperaturas con hemates tratados o no por enzimas proteolticas
y por pruebas con el suero antiglobulina humana.
Durante dcadas y hasta nuestros das, estos ensayos se realizaron en tubos de
vidrio o de material plstico descartable.
El punto clmine de aquellas pruebas radica en la lectura e interpretacin de
las mismas. Ms an, en caso de pruebas dbiles la interpretacin es de
apreciacin subjetiva an en manos de profesionales expertos.
La lectura de una prueba que para un tcnico era calificada como dbil,
para otros era interpretada como negativa.
Ahora bien: qu ocurre a la hora de dificultades en la interpretacin?
Fue as que en la dcada de los 80, el Dr. Yves Lapierre desarrolla y patenta
el mtodo de hemaglutinacin en gel, el cual fue comercializado por la
empresa Diamed-Suiza a partir del ao 1988.
DiaMed Suiza fue fundada en 1977 por un pequeo grupo de expertos en
diagnstico de laboratorio para el desarrollo y fabricacin de sistemas de
prueba destinada a proporcionar a los laboratorios la facilidad de uso,
seguridad y fiabilidad.
En el ao 2007 Bio-Rad Laboratories, una empresa multinacional vinculada a
la investigacin biolgica fundada en 1952, adquiere el paquete accionario de
DiaMed Holding AG.

En el Uruguay DiaMed hizo su arribo en el ao 1995 a travs de su

representante Saiden S.A.

El Sistema DiaMed de Micro Tipificacin en Gel revolucion el trabajo en

los laboratorios de inmunohematologa de los grupos sanguneos.
Ha sido desarrollado tanto para la determinacin de grupo sanguneo,
investigacin, identificacin, titulacin de anticuerpos irregulares y pruebas
de compatibilidad sangunea pretransfusionales en un nuevo formato cuya
lectura no admite dudas de interpretacin y ms an permite nuevas lecturas
hasta 48 horas despus de la ejecucin de la prueba.
El catlogo ID-System de Bio-Rad rene 65 variedades de tarjetas de gel con
una gama que abarca la determinacin de grupos sanguneos ABO y Rh D
para donantes, pacientes y recin nacidos, prueba inversa, fenotipo Rh, Kell,
antgenos simples, test de coombs directo, investigacin e identificacin de
anticuerpos irregulares, pruebas de compatibilidad y estudios en medio
enzimtico entre otras aplicaciones.

PRINCIPIO DEL MTODO.

La prueba se basa en la exclusin en base al tamao de los elementos
reactantes que tiene lugar en el seno de una matriz inmunolgicamente inerte.

El ID MICROTYPING SYSTEM DE DIAMED incorpora dentro de la

columna de gel el reactivo conteniendo: un anticuerpo especfico, NaCl o
suero antiglobulina humana.
Los hemates sensibilizados reaccionan con el antisuero especfico durante la
centrifugacin dejando los lquidos reactantes (incluyendo cualquier
globulina no fijada) en la cmara de reaccin.
Solamente los hemates ingresan en la matriz de gel.
Los hemates no sensibilizados, en la fase de centrifugacin de la prueba,
forman un punto o botn en la base del microtubo en tanto que aquellos
que hayan sido aglutinados se distribuirn a lo largo de la columna de gel.
Segn sea la intensidad de la reaccin, los hemates podrn ocupar la parte
superior de la columna de gel o dispersarse a lo largo de la misma.
A continuacin se presenta una microfotografa de reacciones de aglutinacin
de hemates en gel de Sephadex (cortesa de DiaMed-ID).

10

FORMA DE LOS MICROTUBOS.

Los microtubos estn incorporados en una pieza integral de 70 milmetros de
largo por 53 milmetros de alto, denominada tarjeta (ID-Card).
La extremidad superior de los mismos es ancha (4 milmetros de dimetro) de
manera tal de permitir en l la incubacin de los reactantes.
Al extremo superior se lo conoce tambin como CMARA DE
REACCION.
La parte intermedia o COLUMNA, es larga y estrecha, lo cual permite en la
fase de centrifugacin un contacto prolongado de los hemates con el gel.

11

El fondo del microtubo tiene aspecto CNICO. Cuando los hemates

atraviesan la columna de gel durante la fase de centrifugacin forman un
punto en el fondo del mismo segn sea el gradiente de aglutinacin.

ASPECTO DE LA TARJETA

COMPOSICIN DEL GEL.

El gel utilizado es el SEPADEX G ultra fino y se presenta en tres
modalidades bsicas:

GGGGGGG

GEL NEUTRO.

GEL ESPECFICO.

GEL ANTIGLOBULINA HUMANA.

12

COMPOSICION DEL GEL

NEUTRO
Sin antisuero especfico.
Contiene NaCl.

ESPECFICO
Mezcla de gel y antisuero
especfico.

GEL ANTIGLOBULINA HUMANA

Mezcla de gel y suero antiglobulina humana.

13

VOLMENES A DISPENSAR

ID-PIPETOR FP-4
Se trata de volmenes de suspensiones de hemates y plasma (o suero) muy
pequeos dispensados por pipetas que descargan volmenes prefijados.
50 l de suspensin de hemates y 25 l de suero o plasma.
En las tradicionales pruebas en tubo, el volumen de suero o plasma a utilizar
es de 2 gotas dispensadas por pipeta Pasteur (lo que equivale a 100 l), en
tanto que para esta microtcnica se necesitan solamente 25 l.
En el sistema ID es importante la mxima precisin en el pipeteo.
Se respetar rigurosamente el orden para dispensar los reactantes: en primer
lugar sosteniendo la pipeta en un ngulo de 45 y con el puntero apuntando a
la pared lateral del microtubo, se vertern 50l de la suspensin de hemates
(previamente preparada en el diluyente que corresponda) y en segundo lugar,
manteniendo la pipeta en posicin vertical y prximo a la boca del microtubo,
se vertern 25 l del suero o plasma en estudio.

14

CONDICIONES DE INCUBACIN.

Aqu se aprecia el incubador

seco de tarjetas, en el cual las ubicamos cuando la temperatura requerida de la
reaccin sea de 37 Celsius.
El tiempo de incubacin es de 15 minutos.
CONDICIONES DE CENTRIFUGACIN.

La centrifugacin debe ser constante a 85g durante 10 minutos, siendo ste un

paso crtico en la tcnica.

15

Una vez finalizada la misma, la lectura macroscpica permite distinguir todo

el rango de aglutinaciones: desde los resultados negativos (-) hasta toda la
variedad de resultados positivos que se expresan en forma de cruces segn su
intensidad en: 1+,2+,3+,4+ y dp (doble poblacin).

Un exceso o un defecto en la fuerza g aplicada arrojar resultados falso

negativo o falso positivo respectivamente.
Dado que la fuerza g se expresa en rpm (revoluciones por minuto) y que
disponemos de centrfugas con cabezales para 6,12 y 24 tarjetas, las rpm
varan para cada equipo, a saber:

EQUIPO
ID-CENTRIFUGE 6 S
ID-CENTRIFUGE 12 II
ID-CENTRIFUGE 24 S

CABEZAL
6 TARJETAS
12 TARJETAS
24 TARJETAS

RPM
1175
1030
910

VENTAJAS DE LA MICROTECNICA ID-Card

Se trata de una tcnica estandarizada en sus procedimientos lo cual conduce a
reacciones e interpretacin de los resultados en forma OBJETIVA.
La prueba de Coombs, sin necesidad de realizar los lavados (que si requiere si
se hiciera en la clsica prueba en tubo) disminuye las posibilidades de
errores tcnicos y aumenta la sensibilidad de la prueba.
Por qu no se lavan los eritrocitos, previo a la fase de Coombs?
La tcnica de gel tiene la capacidad de separar los hemates del fluido que lo
rodea.
Durante la centrifugacin de la tarjeta, los hemates son removidos fuera de la
suspensin por accin de la fuerza centrfuga e ingresan al gel, en tanto que
las inmunoglobulinas no conjugadas permanecen sobre el gel.
En forma simultnea se pueden procesar gran cantidad de muestras y por
tratarse de una microtcnica se utilizan pequeos volmenes de reactantes.
La lectura de las pruebas se realiza en forma MACROSCPICA y tambin
pueden ser ledas por lectores automticos.
16

Cada tarjeta de gel tiene en su reverso un cdigo de barras para su

identificacin.
Si bien la macrolectura es posible, un lector automtico y con un software
especial, permite visualizar en pantalla los resultados y tambin transcribirlos
a una impresora con lo cual acotamos los errores administrativos.

Banjo ID- Reader

Este equipo permite leer e interpretar las reacciones de las tarjetas ID-Cards
proyectando imgenes claras de los resultados de las pruebas en el monitor.
A su vez los resultados pueden ser validados, almacenados, imprimirse y
enviarse a la computadora.

17

PATRONES DE LECTURA

REACCIN 4+
Las clulas rojas aglutinadas forman una banda slida en la parte superior del
gel.
REACCIN 3+
Las clulas rojas aglutinadas comienzan a dispersarse por la columna de gel y
se concentran en el tercio superior de la columna de gel.
REACCIN 2+
Las clulas rojas aglutinadas comienzan a dispersarse por la columna de gel y
se las observa ocupando toda su longitud.
REACCIN 1+
Las clulas rojas aglutinadas se dispersan por el gel y se concentran en el
tercio inferior del microtubo.

18

REACCIN NEGATIVA
Todas las clulas rojas atraviesan el gel y forman un botn celular bien
definido en la base del microtubo.
DOBLE POBLACIN.
La reaccin de doble poblacin tambin conocida como campo mixto se
caracteriza por una banda de clulas rojas aglutinadas en la parte superior de
la columna de gel en tanto que las clulas no aglutinadas se depositan en el
fondo del microtubo. Un ejemplo de doble poblacin se observa en detalle en
la tarjeta de la pgina 22.

A continuacin presentamos una fotografa tomada a una tarjeta, capturando

algunos de los diferentes patrones de lectura arriba detallados.

En la tarjeta apreciamos de izquierda a derecha las siguientes lecturas:

Microtubo #1: reaccin 4+

Microtubo #2: reaccin 3+.

Microtubo #3: reaccin 2+

Microtubo #4: reaccin 1+.

19

Microtubo #5: reaccin negativa

Microtubo #6: reaccin negativa.

OTRAS CONSIDERACIONES.
Cogulos, fibrina, detritus y otros artefactos pueden atrapar hemates en la
parte superior del gel, induciendo a lecturas e interpretaciones errneas.
Por tal motivo se solicita que las muestras a analizar sean extradas mediante
una correcta tcnica (exenta de hemlisis) en tubos con EDTA (de
preferencia).
El EDTA es una solucin de sales sdicas y potsicas que se comportan como
poderosos anticoagulantes ya que inhiben la participacin del in Ca++ en la
cascada de la coagulacin de la sangre.
Tambin se lo conoce como secuestreno dado que acta secuestrando al in
Ca++.
PLASMA O SUERO? :
IMPORTANCIA DEL COMPLEMENTO.
Si bien las instrucciones de trabajo impartidas en los insertos de las diferentes
ID-Cards dan por indistinto el uso de suero o plasma, sabido es que el
Complemento es necesario para la reaccin de algunos anticuerpos poco
frecuentes.
El Complemento se conserva en cantidades suficientes cuando la muestra de
suero es mantenida a 4C durante dos semanas, pero en pacientes, la
conservacin es variable y debe considerarse siempre inferior.
Por lo general se recomienda un tiempo que no exceda las 72 horas de
extrada la muestra (habiendo separado hemates del suero por centrifugacin)
y si el estudio se realizare ms all de ese tiempo, la muestra de suero debe
congelarse en alcuotas a -30C durante un plazo no superior a los tres meses.
Se debe utilizar suero en lugar de plasma por el hecho de que se requieren
iones Ca++ y Mg++ para que intervengan como catalizadores de la cascada
de activacin del Complemento.
La lisis inmunolgica de los hemates es signo de la presencia de
aloanticuerpos, por lo tanto el suero a analizar ha de estar libre de
hemoglobina.
En caso de que la presencia de hemoglobina libre en el suero en estudio sea
inevitable, se debe comparar el color sobrenadante de la prueba con el color
presente en el suero problema separado inicialmente de los hemates.

20

Se desaconseja la congelacin y descongelacin de sueros, dado que durante

esa prctica, se destruyen protenas e inmunoglobulinas.
Por tal motivo, se sugiere conservar los sueros en estudio en forma de
alcuotas congeladas.

DILUYENTES.

Diluyente 1:
ID-Diluent 1 es una solucin de bromelina modificada, con actividad
enzimtica estabilizada por un prolongado perodo.
Se la utiliza para preparar suspensiones de hemates destinadas a la
determinacin de grupos sanguneos en tarjetas de gel con reactivo de origen
humano y como aditivo para pruebas enzimticas con hemates no tratados
para deteccin de anticuerpos y pruebas de compatibilidad.
Las enzimas proteolticas modifican los antgenos eritrocitarios con lo que
aumentan la reactividad de algunos sistemas de grupo sanguneo (en especial
los del sistema Rh), aunque suprimen otros como los antgenos de los
sistemas MNSs, Duffy y Xg.
Las enzimas ms utilizadas en la serologa de grupos sanguneos son la
papana y la bromelina.

21

La papana suele emplearse para el tratamiento enzimtico de los hemates

antes de su uso, en tanto que la bromelina se utiliza adems como reactivo
aditivo.

Diluyente 2: Liss modificada para suspensiones de hemates.

La solucin de baja fuerza inica (Liss) aumenta la tasa de asociacin de
anticuerpos, con lo que potencia las reacciones antgeno anticuerpo.
ID-Diluent 2 es una solucin modificada de baja fuerza inica destinada a
preparar suspensiones de hemates al 5% para determinacin de grupos
sanguneos en tarjetas de gel con reactivo de origen monoclonal as como
suspensiones de hemates al 0,8% para pruebas de compatibilidad, pruebas de
la antiglobulina humana, y hemates de prueba preparados en el laboratorio.

22

El elefante muerto deja sus colmillos; el tigre su piel, y el hombre, su

nombre.

Annimo.

23

REACCIN SEROLGICA DE
AGLUTINACIN
La interaccin antgeno eritrocitario y anticuerpo puede ser detectada por
distintas tcnicas serolgicas.
Las tcnicas utilizadas con mayor frecuencia en los laboratorios de
inmunohematologa tienen como resultante la hemlisis o aglutinacin de los
hemates.
La hemlisis se produce si se activa la secuencia completa del complemento
despus que interactan antgeno y anticuerpo.
Muchos anticuerpos de grupo sanguneo activan el sistema de complemento,
pero la secuencia suele interrumpirse a nivel del componente C3 y por ello la
lisis in vitro no siempre se produce.
La aglutinacin de los hemates es el indicador de la reaccin antgeno
anticuerpo ms comnmente usada en los Servicios de Hemoterapia.
La aglutinacin es una reaccin serolgica que se produce en dos etapas:
Primera etapa: SENSIBILIZACIN

Es el proceso mediante el cual el anticuerpo y su correspondiente antgeno se

unen en la superficie del hemate.
En sta fase influyen varios factores:
a) Temperatura ptima de reaccin para cada anticuerpo.

24

Las reacciones antgeno - anticuerpo son exotrmicas, por tanto a

temperaturas ms bajas la velocidad de reaccin disminuye y existe
menor fijacin de anticuerpo.

La temperatura tambin puede afectar la accesibilidad del antgeno

situado en la superficie de la membrana del hemate, dado que
dependiendo de la misma, se producen cambios morfolgicos en el
antgeno.
A temperaturas bajas en el orden de los 4C, quedan expuestos ms
lugares antignicos permitiendo un aumento de la fijacin de
anticuerpos de tipo IgM al hemate.
Sin embargo la mayora de estos anticuerpos no tienen significacin
clnica.
Con objeto de evitar la interferencia de estos anticuerpos, las pruebas
de compatibilidad pre-transfusionales se realizan a 37C permitiendo
evidenciar los anticuerpos clnicamente significativos.
Para cada reaccin de grupo sanguneo existen mrgenes ptimos de
temperatura.
Bsicamente se clasifica a los anticuerpos de grupo sanguneo en dos
categoras: los que reaccionan en fro en rango de 4 a 25C, en su
mayora de tipo IgM y los que reaccionan en caliente en
temperaturas que oscilan los 30 a 37C, mayoritariamente de tipo IgG.
La mayora de los anticuerpos de grupo sanguneo reaccionan en
rangos trmicos restringidos.
No obstante hoy se admite que la temperatura de la reaccin ptima
entre antgeno y anticuerpo, se vincula ms con la naturaleza qumica
del antgeno, que con la clase de anticuerpo.
Los antgenos de tipo carbohidrato suelen relacionarse con anticuerpos
reactivos en fro (ej: antgenos A,B,Lewis y P) y los proteicos con
anticuerpos reactivos en caliente (ej: antgenos Rh,M,N).

25

Efecto de la temperatura en la morfologa del antgeno.

b) pH
Las modificaciones de pH pueden afectar las uniones electrostticas.
Se desconoce el pH ptimo de la mayora de los anticuerpos de grupo
sanguneo, pero se presume que se aproxima al rango fisiolgico.
Ciertos anticuerpos como ser los anti M, reaccionan mejor a pH por
debajo de 7.
26

A un pH inferior al punto isoelctrico, el anticuerpo tiene carga

positiva.
Esto facilita la unin con los hemates (que tienen carga superficial
negativa), por tanto el pH ptimo para la fase de sensibilizacin estara
entre 6,5 y 7.
Un marcado descenso en el pH, incrementa la disociacin de los
complejos antgeno anticuerpo.
La solucin salina fisiolgica tiene un pH que oscila entre 5 y 6.
La solucin salina amortiguada (PBS o Solucin Salina Buffer Fosfato
por su sigla en ingls) asegura ptimas condiciones de trabajo para los
estudios serolgicos.

c) Concentracin de antgeno y anticuerpo

Exceso de anticuerpos Zona de equivalencia

Fenmeno
PROZONA

Exceso de antgenos
Fenmeno
POSTZONA

Para cada reaccin antgeno anticuerpo existe una proporcin ptima

de antgeno a anticuerpo: zona de equivalencia.
Cuando estas condicionantes se dan, resultan reacciones completas y
claramente visibles.

27

Es ms probable que se produzca la sensibilizacin cuando el

anticuerpo se presente en una concentracin elevada. Esto puede
lograrse aumentando la proporcin de suero en relacin a la de
hemates.
A tener en cuenta:
En la mayora de los estudios eritrocitarios, el exceso de antgenos
reduce el nmero de molculas de anticuerpo unidos a cada glbulo
rojo, limitando su capacidad de aglutinacin.
Por lo tanto, en la mayora de los procedimientos de rutina es preferible
contar con anticuerpos en exceso.
Si los anticuerpos a investigar y/o a identificar son dbilmente
reactivos, el aumento de la concentracin de los mismos puede
acrecentar la sensibilidad de la prueba.
Muy rara vez el exceso de anticuerpos puede inhibir la aglutinacin y
provocar un fenmeno de Prozona.
No obstante el aumento de la concentracin de anticuerpos incrementa
la sensibilidad de las pruebas de aglutinacin.
En el Laboratorio de Inmunohematologa del Servicio Nacional de
Sangre y con el fin de enriquecer y acrecentar la sensibilidad de las
pruebas de investigacin e identificacin de anticuerpos irregulares en
medio liss/coombs a temperatura ambiente (22C exclusivamente), se
considera apropiado duplicar la cantidad de suero a analizar: 50l en
lugar de los habituales 25l.
Para las mismas tcnicas de investigacin e identificacin de
anticuerpos irregulares ensayadas en medio liss/coombs a 37C, el
aumento de la concentracin de anticuerpos, no ha mostrado
incrementar la sensibilidad de la prueba.
Si la proporcin de antgeno excede en demasa a la de anticuerpos,
tambin podra obtenerse una reaccin negativa, fenmeno conocido
como postzona.
d) Potencial inico del medio
Los eritrocitos tienen carga negativa en su superficie y dado que las
cargas iguales se rechazan, ste fenmeno logra mantener separados los
hemates entre s.
Cuando los hemates se hayan suspendidos en solucin salina
fisiolgica los iones Na+ y Cl- forman una doble capa elctrica
alrededor de cada clula.
28

Los iones Na+ (con carga positiva) de la solucin salina fisiolgica son
atrados por la carga negativa de los hemates y forman la capa interna
y los iones Cl- (con carga negativa) forman la capa externa.
El potencial elctrico que se desarrolla entre la carga negativa de los
hemates y las capas inicas es lo que se conoce con el nombre de
potencial Z.
Este debe ser superado para que se produzca la aglutinacin.
Cuando los hemates estn suspendidos en una solucin de baja fuerza
inica, la nube de cationes (iones con carga positiva) que rodea a los
hemates es menos densa que si stos estuvieran suspendidos en
solucin salina fisiolgica. Esa concentracin disminuida de cationes
alrededor de los hemates permite a las molculas de anticuerpo tener
ms fcil acceso a los sitios antignicos de la membrana eritrocitaria,
aumentando as la tasa de sensibilizacin.

e) Tiempo de incubacin
El intervalo necesario para alcanzar el equilibrio depende del
anticuerpo de grupo sanguneo del que se trate.
Las variables significativas incluyen requerimientos trmicos, clase de
inmunoglobulina e interacciones especficas entre la configuracin
antignica y el sitio Fab de los anticuerpos.
En los sistemas salinos que utilizan suero antiglobulnico para
demostrar la fijacin del anticuerpo, la incubacin en tubo a 37C
durante 30 60 minutos permite detectar la mayora de los anticuerpos
clnicamente significativos.
Cuando se usa solucin salina de baja fuerza inica (Liss) el tiempo de
incubacin a 37C se reduce a 10 minutos.
Prolongar el tiempo de incubacin podra deteriorar la sensibilidad de
la prueba.

29

Segunda etapa: AGLUTINACIN

Esta etapa es el resultado de puentes entre los hemates adyacentes
formando un complejo fcilmente apreciable.
Una vez que los anticuerpos se han unido a los antgenos de la superficie
eritrocitaria, las clulas sensibilizadas conforman una red y este hecho
permite visualizar la reaccin.

Hemates aglutinados.
(Prueba realizada en lmina).
30

Cuando la reaccin antgeno anticuerpo es mediada por anticuerpos de tipo

IgM, las dos etapas (sensibilizacin y aglutinacin) se superponen y se
observa fcilmente la aglutinacin resultante.
Los anticuerpos de tipo Ig M son molculas grandes (pentmeros de
inmunoglobulinas) de elevado peso molecular y de gran carga neta, lo que les
posibilita cubrir la distancia adyacente entre un hemate y otro, estableciendo
puentes de unin entre ellos.
Cuando la reaccin de aglutinacin es mediada por anticuerpos de tipo IgG,
se produce solo la primera fase (sensibilizacin), es decir la unin del
anticuerpo con su correspondiente antgeno.
La molcula de IgG es un monmero de inmunoglobulina, de poco peso
molecular y de poca carga neta, incapaz de cubrir la distancia entre dos
hemates y por ende de provocar la aglutinacin.

En sta fase influyen varios factores:

a) Potencial inico del medio y potencial Z.
Cuando los hemates se encuentran en suspensin en una solucin
electroltica conteniendo iones libres (aniones y cationes +), su carga
negativa de membrana atraer a los cationes de la suspensin, formndose
una envoltura o nube de cargas positivas alrededor de aquellos,
convirtindolos en partculas cargadas de electricidad del mismo signo que
experimentan fuerzas de repulsin entre ellas. A esa fuerza de repulsin se la
denomina POTENCIAL Z.
El potencial Z puede ser alterado por variacin de la carga electrosttica de
los hemates y por la variacin en la concentracin de cationes libres en el
medio de la suspensin hemtica.
Reduciendo la densidad de la nube de cationes, los anticuerpos pueden
acercarse ms fcilmente a la superficie de los hemates favoreciendo la
sensibilizacin y posterior aglutinacin.
Para eliminar la repulsin y potenciar la aglutinacin se usan varias
estrategias como ser la reduccin de la carga negativa de los hemates por el
uso de enzimas proteolticas, introduccin de macromolculas como la
albmina y polietilenglicol y el uso de soluciones de baja fuerza inica
(LISS).
31

Tratamiento enzimtico de los hemates.

Los anticuerpos de grupo sanguneo de molcula pequea tipo IgG,
pueden aglutinar los hemates si estos se tratan con soluciones tamponadas
de enzimas proteolticas.
El mecanismo de accin de las enzimas puede interpretarse como una
disminucin de la repulsin electrosttica entre los hemates.
Las enzimas proteolticas actan mediante la digestin superficial de la
membrana de los hemates con separacin del cido silico disminuyendo
el nmero de cargas electrostticas negativas de aquella y en consecuencia
disminuye el potencial Z lo cual redunda en un mayor acercamiento entre
los hemates.
En otras palabras: al reducir la fuerza de repulsin entre los hemates, se
facilita su aglutinacin en medio salino mediada por anticuerpos de tipo
IgG.
Las enzimas proteolticas ms utilizadas en inmunohematologa son la
bromelina (extrada del tronco del anan), la ficina (extrada de la higuera,
de aplicacin limitada por ser txica, aunque es la enzima que produce
mayor disminucin del potencial Z), la papana (extrada de la fruta de la
papaya) y la tripsina (extrada del pncreas de origen animal).
Aunque todas ellas potencian la aglutinacin mediada por algunos
anticuerpos, desnaturalizan ciertos antgenos eritrocitarios, en especial los
M, N, S, s, Fy a, Fy b y Xg.

32

CUADRO COMPARATIVO DE
ENZIMAS PROTEOLTICAS
SISTEMAS

Rhesus
Lewis
Kidd
Kell
Duffy
MNSs
Xg a

EXPRESIN ANTIGNICA

Expresin aumentada por el uso de enzimas.

Expresin aumentada en particular por la Tripsina y
Ficina.
Expresin aumentada en particular por la Tripsina y
Papana.
Expresin no aumentada por el uso de enzimas.
Sus antgenos son destrudos por el uso de enzimas.
Expresin anulada en los antgenos M,N,S y muy
debilitada en el antgeno s.
Expresin anulada por el uso de la Papana.

Otra consideracin a tener en cuenta y muy importante es que las

enzimas proteolticas potencian la reaccin de las autoaglutininas fras
normales presentes en los sueros y por ello es que las reacciones en las
cuales las utilizamos no deben ser nunca a temperaturas inferiores a 37C.
Otro dato importante es que la presencia de un autoanticuerpo puede
producir una aglutinacin espontnea en los hemates tratados con
enzimas.
Existen otros mtodos que facilitan el acercamiento entre los hemates en
suspensin, como ser el agregado de molculas grandes bipolares como ser
la albmina bovina.
Si bien fue un mtodo muy utilizado durante dcadas, en la actualidad ha
quedado en desuso. Su efectividad radica en dispersar algunas de las cargas
positivas situadas alrededor de los hemates y por ende logra una reduccin
del potencial Z.
El polietilenglicol (PEG) es un polmero lineal hidrosoluble que se usa
como aditivo para incrementar la reaccin antgeno anticuerpo.
La molcula de PEG excluye molculas de agua del medio y logra mayor
captacin de anticuerpos.

33

La solucin de baja fuerza inica (LISS: Low Ionic Strength Solution)

aumenta notablemente la velocidad de sensibilizacin de los hemates y sus
respectivos anticuerpos.
En comparacin con la solucin salina normal (0,17 M) la solucin LISS
tiene una molaridad de 0,03 M.

b) Temperatura.
La mayora de las pruebas que se basan en reacciones entre antgenos y
anticuerpos eritrocitarios se efectan a a 37C mayoritariamente, a
temperatura ambiente y ocasionalmente a 4C.
c) Densidad del antgeno.
Cuanto mayor es el nmero de antgenos en la superficie del hemate,
mayor ser el grado de sensibilizacin y se aumentan las posibilidades que
al anticuerpo pueda establecer puentes entre aquellos.
La fijacin de molculas de anticuerpos disminuye el potencial Z y
aumenta la aglutinacin.

d) Agrupacin y movilidad de los antgenos.

La situacin prxima de los antgenos en la membrana del hemate
facilita la aglutinacin ya que supone mayor nmero de probabilidades
para la fijacin del anticuerpo en el lugar antignico determinado.
Algunos antgenos del sistema Rh solamente estn agrupados luego
del tratamiento enzimtico en tanto que otros antgenos pueden ser

34

arrastrados a travs de la membrana por la accin de anticuerpos

pasando as a formar agrupaciones.
e) Caractersticas del anticuerpo.
La capacidad de un anticuerpo para aglutinar hemates depende de la
clase de inmunoglobulina a la que pertenezca.
As, la molcula de IgM tiene un mayor tamao que la de IgG siendo
ms efectiva para producir aglutinacin.
De todos modos se puede modificar qumicamente la molcula de IgG
mediante la reduccin permanente de los puentes disulfuro que unen las
dos cadenas H (pesadas), permitiendo su elongacin para que
cubra la distancia entre dos hemates adyacentes sin necesidad de
agregar suero anti-IgG a la prueba.

35

PRUEBA ANTIGLOBULNICA HUMANA

El principio de esta prueba fue descrito por Moreschi en 1908 pero fue
en el ao 1945 cuando Coombs, Mourant y Race la aplicaron para
detectar la fijacin de anticuerpos que no provocan el fenmeno de
aglutinacin.
Esta prueba emplea anticuerpos contra globulinas humanas y se
denomina Prueba Antiglobulina Humana.
Todas las molculas de anticuerpo son globulinas.
En inmunohematologa, las pruebas antiglobulnicas producen
aglutinacin visible de los hemates sensibilizados.

La prueba antiglobulnica directa (PAD) se usa para demostrar la

sensibilizacin eritrocitaria in vivo mediada por anticuerpos o
fracciones del complemento, en particular IgG y C3d unidos en la
superficie de los hemates.

Esta prueba se aplica para:

Diagnstico de la Enfermedad Hemoltica del Recin Nacido.

Investigacin da Anemia Hemoltica Autoinmune.
Investigacin de hemates sensibilizados por medicamentos.
Investigacin de reacciones transfusionales.

36

Test Antiglobulina Humana Directo practicado en ID-Card

La prueba antiglobulnica indirecta (PAI) pone de manifiesto las

reacciones in vitro entre los hemates y los anticuerpos libres
presentes en el suero, que sensibilizan, pero no aglutinan.

37

Esta prueba se aplica, entre otros, para:

Investigacin e identificacin de anticuerpos empleando antgenos
conocidos.
Test de compatibilidad transfusional.
Control de aloinmunizacin durante el perodo de embarazo.
Fenotipar hemates en ciertos sistemas antignicos.

Test Antiglobulina Humana practicado en ID-Card Liss/Coombs

38

REACTIVOS ANTIGLOBULNICOS HUMANOS.

Anti-IgG, C3d; Poliespecfico.
Contiene anti-IgG y anti C3d. Puede incluir otros anticuerpos anticomplemento y anti-inmunoglobulina).
Anti-IgG.
Contiene anti-IgG sin actividad anti-complemento (no necesariamente
especfico para cadenas gamma).
Anti-IgG, cadenas pesadas.
Slo contiene anticuerpos reactivos contra las cadenas gamma
humanas.
Anti-C3b.
Slo contiene anticuerpos anti-C3b sin actividad antiinmunoglobulnica.
NOTA: el anticuerpo que se produce en respuesta a la inmunizacin
generalmente se dirige contra el determinante antignico que se
encuentra en la sub-unidad C3c; algunos profesionales lo denominan
anti-C3c pero en el rtulo del envase se debe designar como antiC3b.
Anti-C3d.
Slo contiene anticuerpos anti-C3d sin actividad-inmunoglobulnica.
Anti-C4b.
Slo contiene anticuerpos
inmunoglobulnica.

anti-C4b

sin

actividad

anti-

Anti-C4d.
Slo contiene anticuerpos
inmunoglobulnica.

anti-C4d

sin

actividad

anti-

Existen antisueros especficos para otras inmunoglobulinas (IgA, IgM)

y subclases (IgG1, IgG3).

39

MECANISMO DE SENSIBILIZACIN DE
ERITROCITOS CON COMPLEMENTO.
a) Activacin del Complemento por anticuerpos de grupo sanguneo.
Ciertos anticuerpos de grupo sanguneo tienen la capacidad de fijar el
Complemento a la membrana eritrocitaria.
Algunos los hacen eficientemente y se manifiestan por causar la lisis de
los eritrocitos normales que presentan los antgenos respectivos.
Claro ejemplo lo constituyen los anticuerpos anti-A, Anti-B mientras
que anticuerpos de otras especificidades pueden sensibilizar eritrocitos
sin causar hemlisis, caso de anticuerpos anti-Lewis, anti-Kidd, antiDuffy, anti-S, anti-s,anti-I, anti-i y anti-P1.
Se desconoce el motivo por el cual algunos anticuerpos son capaces de
fijar abundante C3 a la membrana eritrocitaria, lo cual se manifiesta en
en una Prueba Antiglobulina Directa fuertemente positiva sin llegar a la
etapa de hemlisis.
Algunos de estos anticuerpos son de tipo IgM y adems de lograr
aglutinacin, sensibilizan con C3 (algunos anti-A, anti-B, anti-I, antiLewis).
Otros anticuerpos menos frecuentes de tipo IgM, no logran la
aglutinacin en condiciones normales, pero sensibilizan los hemates de
modo tal que son detectables con la Prueba Antiglobulina Humana
Directa (algunos anti-Lewis, anti-Kell, anti-Duffy y anti-Kidd).
Otros anticuerpos son de tipo IgG y sensibilizan hemates con
fracciones del Complemento de modo tal que si se usa antiglobulina
monoespecfica anti IgG se obtiene un resultado dbil, pero si se usa un
reactivo conteniendo anti C3 se obtendr un resultado fuerte (algunos
anti-Kell, anti-Kidd y anti Duffy).
b) Activacin del Complemento por Complejos Inmunes.
En algunas circunstancias los complejos inmunes pueden adherirse
inespecficamente a los eritrocitos mientras que en otras circunstancias
se encuentran en solucin en el plasma. Un ejemplo de ello lo
constituyen la accin de ciertos medicamentos, de manera tal que se
forman complejos medicamento-anti-medicamento que se adhieren a
la membrana del hemate en forma inespecfica, activan el
Complemento y fijan las fracciones a la misma.

40

Mecanismo de adsorcin. La droga se fija a las protenas de la

membrana eritrocitaria. Si el paciente desarrolla anticuerpos antidroga
potentes, stos reaccionan con el frmaco fijado. En consecuencia la
prueba de Coombs Directa con reactivos anti-IgG es positiva. En
general el complemento no se activa y la lisis es sobre todo
extravascular. La droga prototpica es la penicilina.

41

Mecanismo de accin del reactivo antiglobulina humana.

En suma: la adicin de medios macromoleculares, enzimas

proteolticas, solucin de baja fuerza inica, suero antiglobulina
humana y centrifugacin constituyen estrategias para detectar la
sensibilizacin de los hemates por anticuerpos de tipo IgG, que
generalmente no producen aglutinacin.

42

Un experto es una persona que ha cometido todos los errores que se

pueden cometer en un determinado campo.
Niels Bohr.
Fsico dans
1885 - 1962

43

Pruebas en ID-Card Liss/Coombs

Para un resultado ptimo, las determinaciones deben realizarse con

muestras que cumplan la normativa local del laboratorio en cuanto a
criterios de aceptabilidad de las mismas.
Deben ser extradas mediante una correcta venopuncin en
anticoagulante EDTA.
Cuando sea necesario emplear el suero de la misma, se sugiere
centrifugar la muestra durante 10 minutos a 1500g para evitar la
presencia de residuos de fibrina que podran interferir con el patrn de
reaccin.
Preparacin de la muestra de sangre:
Deje que el diluyente 2 alcance la temperatura ambiente antes de
utilizarlo.
Para preparar:

* Autocontrol
* Test de Coombs Directo (PAD)
* Prueba de Compatibilidad Transfusional

Prepare una suspensin de los hemates a utilizar, al 0.8% en IDDiluent 2 de la siguiente manera:
ID-Diluyente 2

1.0 ml
+

Hemates concentrados

10l
o

Sangre total / Segmento de la tubuladura (*)

44

20l

(*) En caso de utilizar sangre tomada del segmento de tubuladura se

aconseja realizar un lavado con solucin salina fisiolgica previo a su
suspensin en el diluyente 2.

Antes de utilizar una ID-Card, verifique su fecha de caducidad e

inspeccinela en busca de signos de desecacin, burbujas en el gel, y
sellado defectuoso.

I)

PRUEBA DE ANTIGLOBULINA DIRECTA.

1. Marque el/los microtubo(s) a utilizar de la tarjeta con el
nombre del/ los paciente/s o nmero de muestra a analizar.
2. Retire la lmina de sellado slo de los microtubos que vaya a
utilizar manteniendo la ID-Card en posicin vertical.
3. Pipetee 50l de la suspensin de hemates en el/los microtubos
correspondiente/s.

4. Centrifugue la tarjeta ID-Card durante 10 minutos en la IDCentrifuge.

5. Lea y registre los resultados.
Una reaccin negativa indica la ausencia de anticuerpos IgG o
componente del complemento C3d detectable en los hemates.
Una reaccin positiva (sea cual fuere el patrn de aglutinacin)
indica que los hemates analizados se encuentran sensibilizados
(por anticuerpos IgG, C3d o ambos).

45

A continuacin se muestra un ejemplo:

II)

PRUEBA DE COMPATIBILIDAD TRANSFUSIONAL.

1. Identifique los microtubos correspondientes en la tarjeta IDCard LISS/Coombs con el nombre o nmero del receptor y de
la muestra a compatibilizar.
2. Retire la lmina de sellado slo de aquellos microtubos que
vaya a utilizar, manteniendo la ID-Card en posicin vertical.
3. Pipetee 50 l de la suspensin de hemates en el o los
microtubos correspondientes.
4. Para el AUTOCONTROL, pipetee 50 l de la propia
suspensin de hemates del paciente en el microtubo
correspondiente y claramente identificado.
5. Agregue 25 l del plasma del paciente a cada microtubo.
6. Incube la tarjeta ID-Card Liss/Coombs por espacio de 15
minutos en el ID-Incubator.
7. Centrifugue la tarjeta durante 10 minutos en la IDCentrifugue.
8. Lea y registre los resultados.

46

Ejemplo:

Las pruebas de compatibilidad en los microtubos 1,2,3,7 y 11 son positivas.

Los nmeros detallados en la parte inferior de la tarjeta indican la intensidad
acuerdo a los patrones de reaccin (ver pginas 9 y 10).
Las pruebas de compatibilidad en los microtubos 4,5,6,8,9 y 10 son negativas
al igual que el autocontrol.

Una reaccin negativa, indica compatibilidad entre la sangre seleccionada

para transfundir y el receptor de la misma.
Una reaccin positiva indica la incompatibilidad debido a la presencia de un
anticuerpo (o ms) en el receptor, dirigidos contra antgenos presentes en los
hemates del dador.
Deben ampliarse los estudios para identificar la especificidad del o los
anticuerpos involucrados.

47

III)

INVESTIGACIN DE ANTICUERPOS IRREGULARES

(SCREENING o TAMIZAJE)

El Reglamento Tcnico de Medicina Transfusional (Decreto del Poder

Ejecutivo N 385/000 del 26 de diciembre del ao 2000, con entrada en
vigencia el 9 de enero del ao 2001) ordena que el suero de todos los
donantes, pacientes y embarazadas sea estudiado para descartar la presencia
de aloanticuerpos aglutinantes, hemolizantes o sensibilizantes de la
membrana eritrocitaria.
Detallaremos en ste apartado el escrutinio de anticuerpos irregulares en
medio liss/coombs y a continuacin en medio enzimtico.
ESCRUTINIO DE ANTICUERPOS IRREGULARES EN TARJETA LISS-COOMBS

Emplee para esta prueba eritrocitos ID-DiaCell I-II I-II-III, ampliamente

fenotipados por el fabricante.
Los requerimientos de configuracin antignica de los eritrocitos de prueba
son rigurosos: de modo tal de asegurar la deteccin de todos los anticuerpos
clnicamente significativos.

48

Para los sistemas Rh, MNSs, Duffy y Kidd la dotacin antignica debe estar
presente en forma homocigota. Tambin han de estar presentes los antgenos
Lewis y el raro antgeno Kpa.

Deje que los hemates de prueba y las muestras a analizar alcancen la

temperatura ambiente antes de usarlos.
1. Marque los microtubos correspondientes de la tarjeta ID-Card
Liss/Coombs con el nombre o nmero de la muestra a analizar (sea de
un receptor o de un donante).
2. Retirar la lmina de sellado slo de los microtubos que se vayan a
utilizar manteniendo la ID-tarjeta en posicin vertical.
3. Pipetee 50l de cada reactivo de hemates (vial I y II I-II y III) en el
microtubo correspondiente.
4. Si va a incluirse un AUTOCONTROL, pipetee 50l de la propia
suspensin de hemates de la muestra en el correspondiente microtubo.
5. Aada 25l del plasma o suero del receptor o donante (segn
corresponda) a cada microtubo.
6. Incube la tarjeta ID-Card durante 15 minutos a 37C en el IDIncubator.
49

7. Centrifugue la tarjeta ID-Card durante 10 minutos en la IDCentrifugue.

8. Lea y registre los resultados.

Una reaccin negativa indica la ausencia de anticuerpos irregulares

detectables en el suero o plasma del paciente o donante estudiado.
Una reaccin positiva indica la presencia de anticuerpo (s) irregular (es).
Las reacciones obtenidas deben trasladarse a la tabla de antgenos.
Compruebe que el nmero de lote de los hemates reactivo I-II o I-II-III
corresponde con el nmero de lote indicado en la tabla de antgenos.

50

51

Segn sea el patrn de reacciones y la configuracin de antgenos, puede

llegarse a dilucidar el o los anticuerpos involucrados.
Un autocontrol negativo y una reaccin positiva a uno o ms tipos de
hemates, sugieren la presencia de un anticuerpo especfico, en tanto que un
autocontrol positivo y reacciones positivas a todos los hemates puedan
vincularse a reacciones no especficas.
Si existe una reaccin positiva a todos los hemates que conforman el panel,
un autocontrol positivo, pero uno o ms hemates que muestren una reaccin
positiva ms intensa que el autocontrol, deben cumplirse pruebas adicionales
en la muestra para estudiar la posibilidad de un aloanticuerpo subyacente.

IV) IDENTIFICACIN DE ANTICUERPOS IRREGULARES.

Emplee los hemates reactivo listos para usar ID-DiaPanel.
Deje que los viales y las muestras alcancen la temperatura ambiente
antes de usarlos.

1. Marque dos tarjetas ID-Cards Liss/Coombs con el nombre o nmero

del paciente o donantes en quien queremos identificar el anticuerpo
irregular.
2. Numere del 1 al 6 la primera tarjeta y del 7 al 11 y AC (autocontrol) en
la segunda tarjeta.
3. Retirar la lmina de sellado solo de los microtubos que se vayan a
utilizar manteniendo la ID-Card en posicin vertical.

52

4. Transfiera de cada vial numerado del 1 al 11, una gota (50l) a cada
microtubo igualmente numerado.
5. En el ltimo microtubo (nmero 12) destinado a autocontrol (AC),
pipetee 50l de la propia suspensin de hemates.
6. Agregue a todos los microtubos 25l del plasma o suero del paciente o
donante en estudio.
7. Incube ambas tarjetas durante 15 minutos a 37C en el ID-Incubator.
8. Centrifugue ambas tarjetas durante 10 minutos en la ID-Centrifuge.
9. Lea y registre los resultados en la tabla de antgenos.
EFECTO de DOSIS
Al momento de leer y registrar los resultados en la tabla de antgenos,
resulta frecuente de observar que ciertos antgenos de los sistemas RhHr, MNSs, Kidd, Kell y Duffy entre otros, se expresan serolgicamente
con mayor intensidad si el individuo es homocigoto para el gen que
codifica el antgeno. Vale decir que hered de sus dos progenitores los
genes que codifican el mismo antgeno.
Por el contrario, quienes son heterocigotos para un determinado
antgeno, presentan una intensidad de aglutinacin menor.
Esto se debe a que el nmero de sitios antignicos del individuo
homocigoto es casi el doble que el que presenta un sujeto heterocigoto.
El efecto de dosis contribuye a la determinacin de la especificidad
de los aloanticuerpos.

Ejemplo de efecto de dosis

53

54

Segn el patrn de las reacciones y la configuracin de los antgenos,

el tipo de anticuerpo presente puede identificarse en la mayora de los
casos, tenga presente que la reaccin del microtubo de autocontrol debe
dar resultado negativo.
Una reaccin positiva con todos los hemates ID-DiaPanel y un
autocontrol negativo, puede deberse a reacciones no especficas o bien
indicar la presencia de un aloanticuerpo dirigido contra un antgeno de
alta incidencia.
Una reaccin positiva con todos los hemates ID-DiaPanel y un
autocontrol positivo, puede deberse a reacciones no especficas.

Compare el patrn de reaccin entre el autocontrol y el resto de los

microtubos.
Si estos ltimos arrojan reacciones ms intensas que el autocontrol,
puede que estemos frente a un aloanticuerpo subyacente, por lo que se
requerirn estudios adicionales.
No resulta infrecuente que coexistan auto y aloanticuerpos.
Recuerde que los anticuerpos frente a antgenos de los sistemas MNSs y
Duffy no se detectan en medio enzimtico ya que al tratarse de antgenos de
naturaleza proteica; son destruidos por aquellas.
Nos puede ayudar para la identificacin del anticuerpo, conocer el fenotipo de
los hemates del paciente, ya que los antgenos correspondientes a los
aloanticuerpos detectados en el suero deben estar ausentes en los mismos.
En el caso de autoanticuerpos o estudio de un eludo, por el contrario el
antgeno debe estar presente.
Cuando se ha identificado un aloanticuerpo, debe procederse a la
determinacin en los eritrocitos del paciente del antgeno especfico para
comprobar su ausencia.
Tener en cuenta que si el paciente ha sido transfundido recientemente, el
estudio de su fenotipo puede darnos resultados errneos.
Por ltimo y a modo de orientacin, cuando se detecta un anticuerpo de
especificidad anti-D en mujeres en edad reproductiva, asegurarse de que no se
trate de un anticuerpo pasivo resultante de la profilaxis con
inmunoglobulina anti Rh D.

55

Pruebas en ID-Card NaCl

Enzime Test and Cold Agglutinins
Esta tarjeta es apta para la deteccin de anticuerpos reactivos en tcnica salina
y enzimtica, a saber:

pruebas sricas inversas

deteccin de anticuerpos irregulares
identificacin de anticuerpos irregulares
pruebas de compatibilidad en medio salino y/o enzimtico.

Introduccin:

Las tcnicas salinas se emplean para detectar anticuerpos que reaccionan

fundamentalmente a 4C o a 18 25C (temperatura ambiente), tales como
anti M, anti N, anti P1, anti Le a y anti Le b.
Tambin se la utiliza para definir la anemia hemoltica por anticuerpos fros.
Las tcnicas enzimticas son de utilidad cuando se busca una mayor
sensibilidad en la deteccin de anticuerpos.
Las enzimas potencian las reacciones de determinados anticuerpos en
particular en los sistemas Rh, Kell y Kidd pero destruyen algunos antgenos
como ser el M ,N ,S, Fy a y Fy b, por tanto nunca debe emplearse una tcnica
enzimtica como nico mtodo.

56

No se considera necesario incluir la prueba salina a temperatura ambiente en

las pruebas de rutina de deteccin de anticuerpos, pero la prueba salina a 4C
puede emplearse para detectar aglutininas fras.

Preparacin de la muestra de sangre

Deje que el diluyente 2 alcance la temperatura ambiente antes de utilizarlo.
Para: Autocontrol y pruebas de compatibilidad en medio salino y enzimtico,
proceda a preparar una suspensin de hemates al 08% en ID-Diluent 2 de la
siguiente manera:

ID-Diluent 2

1.0ml
+

Hemates concentrados

10l
o

Sangre total / Segmento de tubuladura (*)

20l

(*) En caso de utilizar sangre tomada del segmento de tubuladura se aconseja

realizar un lavado con solucin salina fisiolgica previo a su suspensin en
diluyente 2.
La suspensin preparada puede utilizarse inmediatamente.
Antes de utilizar una ID-Card, verifique su fecha de caducidad e
inspeccinela en busca de signos de desecacin, burbujas en el gel, y sellado
defectuoso.

Antes de su uso, deje que los reactivos de eritrocitos de prueba ID, los
diluyentes ID, y las muestras de suero o plasma alcancen la temperatura
ambiente (salvo para aglutininas fras).

57

A continuacin describiremos el procedimiento de las pruebas.

Prueba de compatibilidad en medio enzimtico

(Papana o Bromelina)
1. Marque los microtubos correspondientes de la tarjeta ID-Card NaCl,
enzime test and cold agglutinins con el nombre o nmero de paciente
y quite el papel aluminio de todos los microtubos que vaya a utilizar.
2. Pipetee 50l de la suspensin de eritrocitos del donante en los
microtubos correspondientes.
3. Si se va a incluir un autocontrol, pipetee 50l de la propia suspensin
de eritrocitos del paciente en el correspondiente microtubo.
4. Aada 25l del plasma o suero del paciente a cada microtubo.
5. Aada 25l de ID-Diluent 1 (Solucin de Bromelina modificada) o lo
que es igual de ID-Papain a cada microtubo.
6. Incube la tarjeta ID-Card durante 15 minutos a 37C en el IDIncubator.
7. Centrifugue la tarjeta ID-Card durante 10 minutos en el ID-Centrifuge.
8. Lea y registre los resultados.

Prueba de compatibilidad en medio salino.

Proceda exactamente igual a lo descripto en al apartado anterior (prueba
de compatibilidad en medio enzimtico) pero no realice el paso nmero 5
(no agregue la Solucin de Bromelina ni el ID-Papain) e incube a
temperatura ambiente (18 25C).
Posteriormente contine con los pasos 7 y 8.
Prueba Srica Inversa. (ID-DiaCell ABO)
1. Resuspenda cuidadosamente los eritrocitos de prueba antes de su uso.
2. Marque los correspondientes microtubos de la tarjeta ID-Card NaCl,
enzime test and cold agglutinins con el nombre o nmero del paciente
o donante e indique los microtubos que contendrn los hemates

58

3.
4.
5.
6.
7.

reactivo A1, A2, B y O. Quite el papel aluminio de todos los

microtubos identificados.
Pipetee 50l de cada tipo de eritrocitos de prueba ID-DiaCell ABO
(A1, A2, B y O) en los microtubos identificados a tales efectos.
Aada 50l de plasma o suero del paciente o donante a cada
microtubo.
Incube la tarjeta ID-Card durante 10 minutos a temperatura ambiente,
entre 18 y 25C.
Centrifugue la tarjeta ID-Card durante 10 minutos en la IDCentrifugue.
Lea y registre los resultados obtenidos.

Prueba Srica Inversa Interpretacin.

Hemates A1
negativo
+ a ++++
negativo
+ a ++++

Hemates A2
negativo
a ++++
negativo
a ++++

Hemates B
+ a ++++
negativo
negativo
+ a ++++

Hemates 0
negativo
negativo
negativo
negativo

Interpretacin
Grupo A
Grupo B
Grupo AB
Grupo 0

Observacin: Si la muestra no estuviese hemolizada, pero se observare

hemlisis en la parte superior del microtubo, el resultado debe interpretarse
como POSITIVO.
En caso de discrepancia entre la prueba directa ABO la prueba srica,
inclyase un autocontrol.

Investigacin de anticuerpos irregulares.

I)

Prueba enzimtica con eritrocitos papanizados (*)

(ID-DiaCell I-II-III P)

Resuspenda cuidadosamente los eritrocitos de prueba antes de su uso.

59

1. Marque los microtubos correspondientes de la ID-Card NaCl, enzime

test and cold agglutinins con el nombre o nmero del paciente o
donante en estudio.
2. Quite el papel aluminio de todos los microtubo que vaya a utilizar.
3. Pipetee 50l de cada tipo de eritrocitos de prueba ID-DiaPanel I-II-III
P papainizados en los microtubos correspondientes identificados
como I, II y III.
4. Si va a incluirse un autocontrol, pipetee 50l de la propia suspensin
de eritrocitos del paciente en el microtubo destinado como AC (Auto
Control) y agregue 25l de ID-Papan (**).
5. Aada 25l de plasma o suero del paciente o donante a cada
microtubo.
6. Incube la tarjeta ID-Card durante 15 minutos a 37C en el IDIncubator.
7. Centrifugue la tarjeta ID-card durante 10 minutos en la ID-Centrifugue.
8. Lea y registre los resultados obtenidos.

(*) Si no se dispone de hemates papanizados, puede utilizar hemates de

prueba ID-Cell I-II-III y agregar 25l de solucin 1 (bromelina
modificada).
(**) Si no dispone de ID-Papan, puede utilizar 25l de solucin 1
(bromelina modificada).

II)

Prueba en salino a 4C con ID-Cell I-II-III

Antes de su uso coloque las tarjetas ID-Card NaCl,enzime test and cold
agglutinins en la heladera (4C 2) durante dos horas.
Mantenga refrigerados hasta el momento de la prueba tanto los hemates IDCell I-II-III como el suero o plasma a analizar.

1. Marque los microtubos correspondientes de la tarjeta con el nombre o

nmero del paciente y quite el papel de aluminio de todos los
microtubos que vaya a analizar.
2. Pipetee 50l de cada tipo de eritrocitos de prueba ID-DiaPanel I-II-III
en los microtubos correspondientes identificados como I, II y III.
60

3. Si va a incluirse un autocontrol, pipetee 50l de la propia suspensin

de eritrocitos del paciente en el correspondiente microtubo.
4. Aada 25l de plasma o suero del paciente a cada microtubo.
5. Incube la tarjeta ID-Card durante 30 minutos en la heladera (4C2).
6. Centrifugue la ID-Card durante 10 minutos en la ID-Centrifugue.
7. Lea y registre los resultados obtenidos.
INVESTIGACIN DE ANTICUERPOS IRREGULARES (*)

*Importante: leer el comentario ampliado en el recuadro de la pgina 28.

Tarjeta Liss/Coombs + Enzime Test (Id-n:50581)

Esta tarjeta combina en una sola presentacin la investigacin de anticuerpos
irregulares en medio liss/coombs y en medio enzimtico.
61

Identificacin de Anticuerpos.
I)

Prueba enzimtica con eritrocitos papainizados (ID-Diapanel P).

1. Marque 2 tarjetas ID-Card NaCl, enzime test and cold agglutinins

con el nombre o nmero del paciente o donante y numere los
microtubos del 1 al 11 (12 en caso de incluir autocontrol). Quite el
papel de aluminio que cubre los micritubos.
2. Pipetee 50l de cada tipo de eritrocitos de prueba ID-DiaPanel P
papainizados en los microtubos correspondientes marcados del 1 al 11.
3. Si va a incluirse un autocontrol, pipetee 50l de la suspensin de
eritrocitos del paciente en el microtubo nmero 12.
4. Aada 25l del plasma o suero del paciente o donante a cada
microtubo.
5. Para el autocontrol, agregue 25l de ID-Papain al microtubo nmero
12.
6. Incube las tarjetas ID-Card durante 15 minutos a 37C en el IDIncubator.
7. Centrifugue las tarjetas ID-Card durante 10 minutos en la IDCentrfugue.
8. Lea y registre los resultados obtenidos en la cartilla de antgenos.

II) Prueba Salina a 4C (ID-DiaPanel)

Resuspenda cuidadosamente los eritrocitos de prueba antes de su uso.
Mantenga las tarjetas ID-Card en la heladera (4C 2) por espacio de dos
horas.
Utilice reactivos de eritrocitos de prueba y muestras a analizar refrigerados.
1. Marque dos tarjetas ID-Card, enzime test ando cold agglutinins con el
nombre o nmero del paciente o donante y numere los microtubos del 1 al
11 (12 en caso de incluir autocontrol). Quite el papel de aluminio.
2. Pipetee 50l de cada tipo de eritrocitos de prueba ID-DiaPanel en los
microtubos correspondientes marcados del 1 al 11.
3. Si va a incluirse un autocontrol, pipetee 50l de la suspensin de eritrocitos
del paciente en el microtubo nmero 12.
4. Aada 25l de plasma o suero del paciente o donante a cada microtubo.
5. Incube las tarjetas ID-Card durante 30 minutos en la heladera (4C2).

62

6. Centrifugue las tarjetas ID-Card durante 10 minutos en la ID-Centrifugue.

7. Lea y registre los resultados en la cartilla de antgenos.

INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS.

Principios y consideraciones generales
En la deteccin de anticuerpos:
Una reaccin negativa indica la ausencia de anticuerpos irregulares
detectables en el suero o plasma del paciente o donante.
Una reaccin positiva indica la presencia de anticuerpos irregulares.
Introduzca las reacciones obtenidas en la cartilla de antgenos y
verifique que el nmero de lote de los eritrocitos de prueba
corresponde al nmero de lote indicado en la tabla de antgenos.
El patrn de reacciones y la configuracin de antgenos puede
indicar el tipo de anticuerpo presente.
Una reaccin positiva a algunos eritrocitos de prueba y un
autocontrol negativo, sugieren la presencia de un anticuerpo
especfico.
Si existe una reaccin positiva a todos los eritrocitos de prueba y un
autocontrol positivo, focalice su atencin en los patrones de
reaccin de las muestras.
Si las reacciones fuesen ms intensas que el autocontrol, podra
sugerir la presencia de un aloanticuerpo subyacente.

63

En la identificacin de anticuerpos:
El patrn de reacciones y la configuracin de antgenos permiten en
la mayora de los casos identificar el tipo de anticuerpo presente (el
autocontrol debe arrojar resultado negativo).
Una reaccin positiva a TODOS los eritrocitos de prueba y un
autocontrol negativo, puede deberse a reacciones no especficas o
bien indicar la presencia de un aloanticuerpo contra un antgeno de
elevada frecuencia.
Una reaccin positiva a todos los eritrocitos de prueba y un
autocontrol positivo, se debe probablemente a un autoanticuerpo.
El que exista una reaccin positiva a todos los eritrocitos de prueba
ID-DiaPanel y un autocontrol positivo, pero uno o ms tipos de
eritrocitos de prueba muestren reacciones ms intensas que el
autocontrol, puede indicar la existencia de un aloanticuerpo
subyacente, por lo que se debern ampliar los estudios.
Los anticuerpos fros potentes pueden dar lugar a reacciones
positivas, principalmente en la tcnica enzimtica.
El anticuerpo anti I se especifica frecuentemente en la enfermedad
de aglutinina fra, pudiendo realizarse su confirmacin con el ID-I
Negative Cell (clulas carentes del antgeno I).

En la prueba de compatibilidad:
Una reaccin positiva indica una incompatibilidad debida a la
presencia de anticuerpos irregulares en el suero o plasma del
receptor.
Una reaccin negativa indica que la tcnica empleada no ha
detectado anticuerpos en el suero o plasma del receptor dirigidos
contra antgenos presentes en los eritrocitos del donante.

64

IDENTIFICACIN DE ANTICUERPOS IRREGULARES (*)

*Importante: leer el comentario ampliado en el recuadro de la pgina 28.

65

Es ms fcil juzgar el talento de una persona por sus preguntas que por sus
respuestas.
Duque de Levis (1755 1830)
Escritor francs.

66

Comportamiento Serolgico e Importancia

Clnica de los Anticuerpos de Grupo
Sanguneo.
Definicin de Anticuerpo Clnicamente Significativo:
En trminos generales definimos como anticuerpo clnicamente significativo
a aqul cuya especificidad es pasible de causar una EHRN (Enfermedad
Hemoltica del Recin Nacido), una franca reaccin hemoltica o una
inaceptable disminucin de la sobrevida de los hemates transfundidos.
A grandes rasgos, los anticuerpos reactivos a 37C son ms propensos a ser
significantes que aquellos que reaccionan exclusivamente a temperatura
ambiente.
Los anticuerpos son clasificados de acuerdo al riesgo de provocar una
hemlisis en caso de transfundir sangre incompatible o de afectar al feto en
caso de incompatibilidad materno fetal.
Se clasifican en cuatro grandes grupos segn el siguiente esquema:

GRUPO I

GRUPO II

GRUPO III

GRUPO IV

Clnicamente
Significativos

Benignos

Significativos
slo Excepcionalmente
cuando son activos a significativos
37C

ABO

ChidoRodgers
Xga
Bg
HTLA
Cost
Knopps
McCoy
Cartwright
JMH

Lewis

Vel hemlisis)

MN
P1
Lutheran
A1

Gerbich
Gya
Hy
Sda

Rh (D,C,E,c,e)
Kell (K,k)
Duffy
Kidd
Ss

67

68

69

70

En este mundo, todos necesitamos de todos

Profesor Emrito Dr. Luis Alberto Castillo (1920 2008)
O.R.L. uruguayo.

71

ALOINMUNIZACIN
La transfusin sangunea, drogadiccin intravenosa, embarazo y el
transplante de rganos y tejidos constituyen los mecanismos pasibles de
aloinmunizacin.
El riesgo de sensibilizacin a antgenos eritrocitarios (a excepcin del
antgeno D) por cada unidad de concentrado de hemates transfundidos, oscila
entre el 1 y 2%.
Si bien no tenemos cifras estadsticas al respecto, se estima que de los
pacientes transfundidos en nuestro pas, entre un 1 y 2% de los mismos se
inmunizan.
En tanto que para el caso de embarazo, la inmunizacin ocurre en el 1% de
los mismos.
Se entiende por INMUNOGENICIDAD o ANTIGENICIDAD el
potencial de un antgeno para estimular una respuesta inmune y desencadenar
la produccin de su correspondiente anticuerpo.
Claro est que una prueba de compatibilidad negativa no impide una eventual
inmunizacin, como as tambin los eventos transfusionales y el embarazo no
acarrean la misma suerte de inmunizacin.
El inmungeno ms potente lo constituye el antgeno D del sistema Rhesus
seguido en orden de inmunogenicidad por los antgenos c, E, e y C y luego el
antgenos K del sistema Kell.
Clculo de la inmunogenicidad de algunos antgenos en la prctica
transfusional.

Antgeno
K
c
E
Jk a
Fy a
Jk b
Fy b
C

Probabilidad de
exposicin
0.082
0.204
0.152
0.180
0.225
0.194
0.134
0.218
72

Potencia antignica
0.0500
0.0253
0.0170
0.0089
0.0083
0.0010
0.0007
0.0004

Un elemento a tener en cuenta en la posibilidad de aloinmunizacin por

transfusin radica en la FRECUENCIA con que un antgeno se presenta en
la poblacin.
Cuando un antgeno posee una incidencia de presentacin baja en la
poblacin (caso del antgeno K, frecuencia de 0.09) las posibilidades de
recibir la transfusin de una unidad que lo contenga, aumentan en forma
directa con el nmero de unidades transfundidas.
En tanto que ante un antgeno de alta incidencia de presentacin (caso del
antgeno c, frecuencia de 0.8), las posibilidades de transfusin resultan
elevadas, incluso transfundiendo una sola unidad y aumentando ligeramente
al incrementarse el nmero de unidades transfundidas.
A su vez, cuando un antgeno posea una baja frecuencia de presentacin, las
posibilidades de que se forme el correspondiente anticuerpo sern ms bajas
en el caso de embarazo que en el de transfusin sangunea y ms an en el
supuesto de que la mujer tenga siempre el mismo compaero; puesto que en
la transfusin se involucran distintos donantes y mayor volumen.
Utilizando la microtcnica de aglutinacin en gel en tarjeta ID-Card
Liss/Coombs, en un estudio de seguimiento inmunohematolgico realizado
por el Profesor Dr. Jorge Decaro, durante el perodo 2001 al 2005 en 14.860
gestantes que concurrieron para control de embarazo a los servicios
asistenciales del Banco de Previsin Social (BPS); encontr que 157 de ellas
(1,05%) presentaba anticuerpos anti-eritrocitarios.
De esos 157 casos, 153 presentaban aloanticuerpos y en 4 casos se hallaron
autoanticuerpos.
De los 153 casos con aloanticuerpos, el 55% fueron hallados en gestantes Rh
D positivas y el 45% en gestantes Rh D negativas.
Dentro de las Rh D negativas, el 80% presentaba un aloanticuerpo anti D.
Ms del 90% de los aloanticuerpos hallados, diferentes al D, pertenecan al
sistema Rh (C,E,c,e) y Kell para los cuales y hasta el momento no existe
inmunoprofilaxis.
La nica prevencin consiste en disminuir el nmero de transfusiones de
hemates en mujeres en edad reproductiva y en caso de realizarlas, hacer el
fenotipo Rh y Kell.
En el embarazo resulta inevitable prevenir una aloinmunizacin por pasaje de
eritrocitos fetales a la circulacin materna (salvo en el caso del antgeno D
con la administracin de la globulina hiperinmune anti Rh).
La presencia en el feto de un antgeno heredado del padre y ausente en la
madre, es capaz de provocar aloinmunizacin a dicho factor.
La consecuencia puede ser la enfermedad hemoltica del recin nacido.

73

La probabilidad de aloinmunizacin a distintos antgenos es muy variada en

comparacin con el antgeno D, para el cual existe el tratamiento preventivo
de la misma por administracin de globulina hiperinmune anti D capz de
evitarla.
Otro factor a considerar es que es menor la posibilidad de inmunizacin en el
embarazo en comparacin con la transfusin, en virtud de que el volumen de
la hemorragia transplacentaria en muchos embarazos no llega a constituir un
estmulo suficiente para producir inmunizacin.
La dosis mnima para producir una inmunizacin primaria sera de 0.01 a
0.03 ml de hemates fetales, lo que equivale a 1 eritrocito fetal cada 100.000
maternos.
En la prctica, el volumen de sangrado de una HFM (Hemorragia Feto
Materna) es variable; siendo en el 95% de los casos menor a 15ml en
comparacin con los 300 ml que contiene una unidad de concentrado de
hemates.
Sin embargo, un tercio de los individuos de la especie humana no responden a
la estimulacin antignica (tienen tolerancia inmunolgica) y no forman
anticuerpos.

Clculo de la inmunogenicidad de algunos antgenos en el embarazo.

Antgeno (s)
D
CD
C
E
K
Fy a
DE

Probabilidad de
exposicin
0.139
0.218
0.152
0.204
0.082
0.225
0.204

74

Potencia antignica
0.300
0.0210
0.0060
0.0024
0.0022
0.0008
0.0006

IDENTIFICACIN DE ANTICUERPOS
Para decidir cules sern los estudios a practicar al suero problema, a que
hemates enfrentarlos (con o sin tratamiento enzimtico) y a que temperatura
incubar las pruebas, se debe tener en cuenta los resultados obtenidos en la
etapa de investigacin de aloanticuerpos.
Tambin es fundamental recabar datos tales como:
* edad
* sexo
* raza
* transfusiones y/o trasplante de rganos recibidos
* diagnstico clnico
* medicacin que recibe
* nmero de embarazos
* abortos
* recin nacidos con EHRN
* administracin de IgG anti Rh D

PANEL DE ANTGENOS ERITROCITARIOS

Un panel de antgenos eritrocitarios est conformado por un conjunto de
muestras de sangre grupo O, las cuales se encuentran ampliamente
fenotipadas y que han sido seleccionadas por el laboratorio fabricante de
modo tal que representen la mayor cantidad de antgenos.
Para la investigacin de aloanticuerpos los hemates deben contener todos los
antgenos correspondientes a los anticuerpos clnicamente significativos (ver
definicin en la pgina 60): D, C, E, c, e, Cw, K, k, Kp a, Kp b, Js a, Js b,
Fya, Fyb, Lu a, Lu b, M, N, S, s, P1, Le a y Le b.
Los paneles comerciales para investigacin de anticuerpos irregulares se
presentan en viales I y II o I, II y III conocidos comnmente como paneles
cortos.
En tanto que los paneles para identificacin de anticuerpos irregulares son
ms extensos: paneles de 6, 9, 11, 14 y de 17 clulas (viales),conocidos
comnmente como paneles largos.
En este caso por lo menos un vial presenta antgenos de baja frecuencia (Cw,
Kpa, Le a y Lu a) y otro vial no presenta antgenos de elevada frecuencia en
la poblacin (e, k, Kp b, Js b, P1,s y Lu b).
Tambin se recomienda incluir una muestra de sangre de cordn a los efectos
de asegurar la representatividad del antgeno i.

75

Cada panel es acompaado de una cartilla de trabajo en las que estn

consignados los antgenos presentes en cada muestra o vial.
El uso de los mismos requiere experiencia y claros conocimientos del
comportamiento serolgico de los diferentes anticuerpos de grupo sanguneo.

Cmo interpretar los resultados de un panel eritrocitario?

Ejemplo # 1: de identificacin de aloanticuerpo.
Paciente O Rh Negativo (cde/cde).

A la derecha del panel podemos observar los resultados que arrojaron los
estudios en diferentes medios y temperaturas ensayados.
Para el anlisis se recomienda:
1) Buscar la primera muestra que presenta un resultado negativo en
todos los medios y temperaturas ensayados.
2) En la fila superior de la cartilla antignica se procede a eliminar o
tachar todos los antgenos presentes en la muestra que arroj resultados
negativos, ya que si no hay aglutinacin, el anticuerpo investigado no
est reconociendo a ningn antgeno presente en esa muestra.
3) Se repite la misma bsqueda en las muestras subsiguientes y
eliminando de consideracin a aquellos antgenos presentes en las
muestras que arrojaron resultados negativos.
4) Si el paciente no fue transfundido en los ltimos tres meses, realizar
el mismo anlisis para el fenotipo del paciente.
5) Colocar un crculo resaltando los antgenos que quedan sin tachar.

76

Para este ejemplo, se eliminan los antgenos presentes en las muestras

nmero 2 (antgenos c, e ,K ,k ,Fy b), nmero 3 (C, c, e, k y Fy a) y
nmero 6 (E, c, e, k, Fy b).

En nuestro ejemplo, queda sin eliminar el antgeno D y como se observar

para este caso, siempre que hay una reaccin positiva (muestras 1,4 y 5) el
antgeno D est presente.
Nuestro paciente fue fenotipado en el sistema Rh resultando ser D negativo,
cde negativo y el autocontrol result ser negativo.

Conclusin: anticuerpo con actividad anti D.

COMENTARIOS:
1) Si existe un nico anticuerpo, todas las muestras del
panel que presentan el antgeno correspondiente deben
mostrar un resultado positivo y aquellas muestras que no
lo presentan; deben mostrar un resultado negativo.
2) El paciente tambin debe ser negativo para dicho
antgeno.
3) En caso de coexistir ms de un anticuerpo, la
especificidad de los mismos debe ser discriminada:
Una forma de discriminar las especificidades es en base a la reactividad
demostrada en los diferentes medios ensayados (salino, enzimtico,
liss/coombs).
De particular inters resultan las reacciones obtenidas en medio enzimtico ya
que en la mayora de los casos, los anticuerpos del sisitema Rh-Hr son
77

exaltados por el uso enzimtico mientras que los anticuerpos de los sistemas
Duffy y MNSs son inhibidos por las mismas.
Es posible recurrir a estudios con muestras de eritrocitos suplementarios que
presentan el antgeno cuyo anticuerpo se quiere confirmar y que no presentan
los dems antgenos imputados.
De esa manera se incrementa el poder discriminatorio.
Otra alternativa vlida es recurrir a realizar absorciones utilizando eritrocitos
seleccionados de manera de absorber un anticuerpo para poner en evidencia el
o los anticuerpos restantes.

78

Ejemplo # 2: de identificacin de aloanticuerpo.

4- No existen ms muestras que resulten ser negativas. Las muestras

nmero 2, 5 y 6 son positivas en todos los medios y temperaturas. El o los
anticuerpos sospechados; pueden ser el anti E y/o anti Le b.
5- Observemos con detenimiento la composicin antignica del panel y
busquemos si todas las muestras que arrojaron resultado positivo contienen
los antgenos E y Le b.

79

Dicho en otros trminos: qu tienen en su composicin antignica en comn,

las muestras nmero 2, 5 y 6?
Muestra nmero 2: E negativa Le b positivo.
Muestra nmero 5: E positiva Le b negativo.
Muestra nmero 6: E positiva Le b positivo.
Estos resultados nos orientan a la presencia de ms de un anticuerpo.
6- Analicemos el comportamiento serolgico observado en las reacciones
que resultaron positivas (muestras nmero 2, 5 y 6).
a) En las pruebas en salino para anticuerpos completos (IgM), las muestras
nmero 2 y 6 poseen el antgeno Le b, aglutinan a 20C y hemolizan a 37C.
Este es un comportamiento tpico del anticuerpo anti Le b.
b) En los ensayos realizados en medio liss/coombs y medio enzimtico, las
muestras nmero 5 y 6 muestran reacciones francas caractersticas de los
anticuerpos del sistema Rh-Hr.
c) La hemlisis observada en la muestra nmero 2 en el ensayo enzimtico, se
corresponde a la actividad del anticuerpo anti Le b.
Los anticuerpos del sistema Rh-Hr no activan el complemento y por ende no
hemolizan los eritrocitos incompatibles.
7- Se practica el fenotipo del paciente, a saber:
D
0

C
0

E
0

c
+

e
+

Cw

K
0

k
+

Le a Le b
+
0

M
+

N
+

Nuestro paciente result ser antgeno E negativo y antgeno Le b negativo.

8- Se absorbe el suero problema con eritrocitos cuyo fenotipo es E positivo y
Le b negativo.
Recordemos que la tcnica de absorcin se utiliza para separar mezclas de
anticuerpos, dado que si se seleccionan eritrocitos que presentan
determinados antgenos pero carecen de otros y se induce la absorcin, se
estara dejando un solo anticuerpo de una nica especificidad en el suero.
9- Se enfrenta el suero absorbido al panel nuevamente, encontrndose
reactividad en medio salino a 20C y a 37C obtenindose aglutinacin con
las muestras nmero 2 y 6, que son las nicas que tienen en comn al
antgeno Le b.
Conclusin: anticuerpo con actividad anti Le b.
80

Algoritmo de Investigacin de Anticuerpos Irregulares utilizado por el

Laboratorio de Inmunohematologa del
Servicio Nacional de Sangre.

81

Algoritmo de Identificacin de Anticuerpos Irregulares utilizado por el

Laboratorio de Inmunohematologa del
Servicio Nacional de Sangre.

82

TEST de COOMBS.
Algoritmo utilizado en el Laboratorio de Inmunohematologa del
Servicio Nacional de Sangre.
83

FORMULARIO PARA REMITIR ESUDIO

ESPECIALIZADO AL S.N.S

84

CARACTERES DE LA MUESTRA Y CONDICIONES DE

ENVO DE LAS MISMAS PARA LA REALIZACIN DE
ESTUDIOS EN INMUNOHEMATOLOGA. (*)
El Laboratorio de Inmunohematologa del Servicio Nacional de Sangre reitera
y ampla los caracteres de la muestra de sangre y las condiciones de envo de
las mismas para facilitar que se logre un resultado preciso en los estudios de
inmunohematologa solicitados por los Servicios de Hemoterapia.
Los estudios se solicitarn en la BOLETA DE SOLICITUD correspondiente
donde se debern consignar los datos filiatorios del paciente:
Nombres y apellidos tal como figuran en su documento de
identidad.
Nmero de cdula de identidad.
En caso de recin nacido se deber consignar los datos
correspondientes a la madre.
Edad, raza y sexo.

Asimismo se debern consignar:

Datos clnicos completos.
Antecedentes personales.
Antecedentes transfusionales, pasados y recientes.
Inmunoprofilaxis anti-D.
En caso de embarazada: fecha de ltima menstruacin normal y
fecha probable de parto, nmero y ao de embarazos previos,
incidencias durante el embarazo, desenlace de cada embarazo, grupo
sanguneo y evolucin de cada producto.
Estudios realizados y resultados obtenidos, sin perjuicio de que el
Laboratorio de Inmunohematologa realice nuevamente los estudios
que se consideren necesarios.
Antecedentes de estudios previos realizados en el Laboratorio de
Inmunohematologa del Servicio Nacional de Sangre o en otro
Servicio.
Cualquier otro dato que se considere necesario.

Si se requiere consignar ms informacin del espacio dispuesto en el

formulario se podr escribir al dorso del mismo.

85

La solicitud deber ser firmada por un funcionario debidamente

autorizado a tales efectos. En caso de que la solicitud sea realizada por un
Servicio de Hemoterapia que no sea de ASSE, la solicitud deber contener la
autorizacin correspondiente para abonar el costo del estudio.
La solicitud de deber acompaar de la muestra de sangre correspondiente.
En caso de solicitud de estudios de anticuerpos irregulares, posible
aloinmunizacin, prueba de compatibilidad positiva, bsqueda de sangre
compatible o reaccin adversa se deber remitir una muestra de sangre venosa
en dos tubos anticoagulados con EDTA, tubos para hemograma,
conteniendo sangre hasta el enrase, generalmente 2,5 mL cada uno.
Estos se debern remitir sin manipular, sin separar el plasma de los
componentes celulares de la muestra.
Las muestras debern ser debidamente rotuladas: nombre y apellido,
nmero de cdula de identidad del paciente y fecha de extraccin de la
muestra.
Se sobreentiende que la muestra pre-transfusin ha sido manipulada.
En caso de Anemia Hemoltica Autoinmune, sospecha clnica de la misma,
o Test de Coombs Directo positivo previo, la muestra a enviar deber incluir
un tubo seco, sin anticoagulante, y los dos tubos con EDTA, la cual deber
ser extrada, conservada y el plasma/suero separado a 37C antes de permitir
se enfre y traslade la misma.
Si se solicita la bsqueda de sangre compatible y/o se solicita confirmar
fenotipo de unidades de sangre compatibles para pacientes aloinmunizados
conocidos se debern remitir las colitas o segmentos de las tubuladuras
correspondientes, selladas en ambos extremos, asegurndose que contenga
eritrocitos, debidamente identificadas con el nmero de donacin y nmero
de colita visible. El Laboratorio de Inmunohematologa se reserva el derecho
de actualizar estudios de pacientes aloinmunizados, en funcin del tiempo
transcurrido desde el estudio anterior o de los resultados obtenidos.
El traslado de las solicitudes y de las muestras de sangre se deber realizar
en un todo de acuerdo al reglamento respectivo actualmente vigente. La
SOLICITUD se deber colocar dentro de una bolsa de nylon. Las muestras
debern tener un triple empaque. Entre el primer empaque y el segundo se
deber incluir algodn en cantidad suficiente para absorber la sangre en caso
de derrame accidental. El tercer empaque deber ser de paredes rgidas y en
su superficie se deber consignar el destinatario y el remitente en forma
claramente visibles.

86

No se facilitarn resultados por va telefnica. Los resultados se podrn

retirar en RECEPCIN en el plazo estipulado, generalmente 24 horas,
aunque en situaciones especiales el estudio podr requerir ms tiempo. En
caso de urgencia en disponer del resultado del estudio solicitado, los
Servicios se debern comunicar con el Tcnico Transfusionista del
Laboratorio de Inmunohematologa para anticipar la entrega del
RESULTADO.
EN CASO DE NO CUMPLIR CON ESTOS REQUISITOS EL
LABORATORIO NO PUEDE GARANTIZAR LOS RESULTADOS
DEL ESTUDIO.
(*) El texto antes detallado corresponde a la circular redactada por el
Servicio Nacional de Sangre en fecha 3 de Mayo de 2011.

87

Modelo de Informe de Estudio

Inmunohematolgico.

Nota: por razones ticas se ha suprimido el nombre del paciente y del

servicio que solicita el estudio.

88

CLCULO DE PROBABILIDADES
La probabilidad mide la mayor o menor posibilidad de conseguir unidades
compatibles para un receptor y toma valores entre 0 y 1 expresados en
porcentaje entre 0% y 100%.
El valor 0 corresponde a la imposibilidad de conseguir las unidades
compatibles, en tanto que el valor 1 corresponde al suceso seguro de hallarlas.
Para el caso clnico del modelo anteriormente descrito, el paciente estudiado
presenta un anticuerpo con actividad-anti Jka.
Consultando la tabla antignica observamos que la frecuencia del fenotipo Jk
(a-b+) en la poblacin caucsica es del 23%.
Recordemos que la probabilidad toma valores entre 0 y 1, por tanto haremos
el siguiente clculo:
Probabilidad 1....equivale al 100% (100% de probabilidad de encontrar
sangre compatible).
Probabilidad 0,23...equivale a x%
Donde el clculo de x es = 23
Vale decir que por cada 100 unidades de sangre tomadas al azar, tendremos la
posibilidad de conseguir 23 con el fenotipo Jk (a-b+). O lo que es igual, por
cada 10 unidades testeadas, encontraremos 2,3 unidades Jk a-.
Si se requieren ms unidades, el clculo ser proporcional: en ste caso en
particular se requerir fenotipar 20 unidades con la probabilidad de encontrar
4,6compatibles.

89

Pacientes aloinmunizados a mltiples antgenos.

Para calcular la probabilidad de encontrar sangre fenotpicamente compatible
para un receptor aloinmunizado a ms de un anticuerpo, se deben multiplicar
entre s los valores de incidencia NEGATIVA del antgeno involucrado.

Ejemplo 1:
Dado el caso de un paciente aloinmunizado a los antgenos K, Jka y al S,
procederemos a consultar la tabla antignica y ver para cada uno de ellos el
valor de la incidencia u ocurrencia negativa en la poblacin.
En nuestro caso:
Incidencia negativa para el antgeno K: 0,91
Incidencia negativa para el antgeno Jk a: 0,23
Incidencia negativa para el antgeno S: 0,48
0,91x 0,23 x 0,48 = 0,10
0.10 es la probabilidad de hallar sangre compatible, lo que llevada a trminos
de porcentaje equivale a 10%, es decir 10 unidades en 100 estudiadas o su
equivalente de 1 unidad en 10 estudiadas.
Si precisramos 6 unidades para el ejemplo anterior, deberamos analizar unas
60 unidades.

Llevado esto a trminos de porcentaje, podemos aplicar la siguiente frmula:

N% = F1 x F2 x .FX
100

90

Donde:
N = nmero de individuos de la poblacin compatibles.
F1 = frecuencia en la poblacin de individuos antgeno-negativos para uno
de los anticuerpos presentes.
F2 = frecuencia en la poblacin de individuos antgeno-negativo para otro
de los anticuerpos presentes.
FX = frecuencia en la poblacin de individuos antgeno-negativo para
cualquier otro anticuerpo presente.
Ejemplo 2:
Dado el caso de un paciente inmunizado a los antgenos c, K y Fya , el
porcentaje de unidades compatibles aplicando la frmula arriba detallada
ser:
N% = (0,2 x 0,91 x ,034)100.
N = 0,06188 % 6,188 unidades en 1000

91

El xito es hijo seguro de la perseverancia y firmeza en el trabajo.

Orison S. Marden (1853 1924)
Escritor y moralista estadounidense.

92

TIPIFICACIN ABO Rh D
Para receptores, pacientes antenatales y embarazadas; las recomendaciones
actuales sugieren el uso de reactivos anti Rh D que NO detecten el fenotipo
DVI.
Los individuos que tengan el fenotipo DVI podran producir anti D frente a
los eptopes faltantes luego de la inmunizacin por clulas Rh D positivas
transfundidas o fetales (en caso de embarazo).
Para asegurar que se tomen las medidas teraputicas apropiadas, los hemates
de los pacientes DVI deben considerarse como Rh D NEGATIVO.
Inversamente, los donantes de sangre y recin nacidos (por su carcter de
sensibilizantes) deben ser testeados con reactivos anti Rh D que SI detecten la
variante DVI y en ese caso se los considere como Rh D POSITIVO.
De ese modo evitaremos que la unidad de sangre se transfunda a un receptor
Rh D negativo o a un paciente tipificado como D parcial.

D dbil (weak)

Du D parcial D Variantes

Algunos sistemas de grupo sanguneo presentan variantes raras y el sistema

Rh no es la excepcin.
La mayora de los eritrocitos D positivos muestra aglutinacin macroscpica
inmediata luego de ser testeados con suero anti Rh D.
93

Los que plantean dudas son aquellas muestras que no aglutinan en forma
inmediata o directa.
En algunos eritrocitos D positivos, la demostracin del antgeno D requiere
incubacin con anti D y el agregado ulterior de suero antiglobulina humana
(test de coombs indirecto).
En el pasado, los hemates que demandaban pasos adicionales para la
demostracin del antgeno D, se clasificaban como Du.
Esta designacin ya no se considera apropiada y los hemates portadores
de antgenos que reaccionan dbilmente con el anti D, podran describirse
como D dbil y son considerados Rh D POSITIVOS.
En la actualidad y gracias a los avances logrados con reactivos poli y
monoclonales anti Rh D, es factible detectar clulas Rh D positivas que
haban sido clasificadas como D dbiles cuando se analizaron con reactivos
menos sensibles.
El antgeno D dbil o Du cuantitativo, significa que existen menos sitios
antignicos completos Rh D sobre la membrana eritrocitaria (observar detalle
en la pgina anterior), pero, tanto sea donantes, gestantes como recin nacidos
D dbil, deben ser considerados como Rh D Positivos.
Esta variante fue descripta por primera vez por Stratton en 1946 quien la
denomin Du siendo reemplazada por la denominacin D dbil (weak)
en el ao 1992.
En la dcada de los aos 1960, Wiener y Unger encuentran sujetos Rh D
positivos que presentan anticuerpos anti D.
Es as que se describe una variante ms rara, un D parcial o D cualitativo
de modo tal que personas Rh D positivas pueden tener anticuerpos que NO
reaccionan con sus propias clulas dado que el anticuerpo est dirigido hacia
una parte (eptopo) faltante del antgeno Rh D.
La variante cualitativa ms importante del antgeno Rh D es la variante DVI.
Los antgenos Rh son de naturaleza proteica y est constituda por unos 417
aminocidos.
La variante DVI carece en su parte extracelular de tres aminocidos que s
estn presentes en el antgeno Rh D normal.
La mayora de los sueros hemoclasificadores anti Rh D que se utilizan para la
tipificacin de grupo sanguneo, estn dirigidos contra los epitopos 6/7 de la
protena D.
Esos epitopos son los ms inmungnicos de la protena D y son a la vez los
que se encuentran ausentes en la variante DVI.

94

Los eritrocitos que carecen del complejo antignico D, se denominan D

mosaicos, D variantes, siendo en la actualidad la denominacin D
parcial como la ms apropiada.

95

CLASIFICACIN ABO-Rh EN PACIENTES:

Tarjeta DiaClon ABO/Rh for Patients (Id-n:50012)

Segn Mollison, las frecuencias de los diferentes grupos sanguneos ABO en

la poblacin caucsica son las siguientes:
O. 46%
A. 41%
B 9%
AB. 4%
Aproximadamente el 85% de la poblacin caucsica es Rh (D) positiva.
Para detectar la presencia o ausencia de los antgenos A y B en los eritrocitos,
se emplean anti-A y anti-B que pueden ser de origen humano o monoclonal.
Es importante leer las instrucciones del fabricante para saber en que diluyente
han de suspenderse los hemates a testear en base al origen de los anticuerpos
que contiene la ID-Card.
Para anticuerpos de origen humano, la suspensin se har en diluyente 1
y para anticuerpos de origen monoclonal, la suspensin se har en
diluyente 2.
La determinacin del grupo ABO no puede considerarse completa sin
someter el suero a estudio a la prueba inversa frente a eritrocitos conocidos
A1, A2, B y O (ver descripcin de la tcnica en las pginas 58 y 59).

96

Preparacin de la muestra de sangre:

Una vez obtenida la muestra de sangre, centrifguela a 1500g durante 10
minutos y separe hemates del plasma o suero.
Si opt por extraer la muestra en tubo seco (sin anticoagulante), la
centrifugacin evitar la presencia de residuos de fibrina que podran
interferir con el patrn de reaccin.
Prepare una suspensin de los eritrocitos a analizar al 5% en diluyente 2 de la
siguiente manera:
Deje que el diluyente alcance la temperatura ambiente antes de utilizarlo.
2. Pipetee 0.5 ml de ID-Diluent 2 en un tubo limpio.
3. Aada 50l de sangre total o 25l de sedimento de hemates y agite
suavemente.
La suspensin as preparada puede utilizarse inmediatamente.
Procedimiento de la prueba:
1. Marque la tarjeta con el nombre o nmero del paciente.
2. Despegue la lmina de aluminio sujetando la ID-Card en posicin
vertical.
3. Aada 12,5l de la suspensin de eritrocitos del paciente a todos los
microtubos de la tarjeta ID-Card.
4. Centrifugue la tarjeta durante 10 minutos en la ID-Centrifuge.
5. Lea y registre los resultados.
Interpretacin de los resultados.
Positivo: Los hemates aglutinados forman una lnea roja sobre la superficie
del gel o estn dispersos en el gel.
Negativo: Sedimento compacto de hemates en el fondo del microtubo.
Reacciones para grupos sanguneos ABO:
ERITROCITOS DE PRUEBA
Anti-A
Anti-B
Anti-AB
+++ a ++++
Negativo
+++ a ++++
negativo
+++ a ++++
+++ a ++++
+++ a ++++
+++ a ++++
+++ a ++++
negativo
Negativo
negativo

97

GRUPO
A
B
AB
O

Las reacciones ms dbiles que +++ pueden indicar sub-grupos A o B y

deben realizarse estudios adicionales.
Para una interpretacin correcta debe realizarse una determinacin completa
del grupo (prueba hemtica y prueba srica inversa).
Importante: el microtubo control (ctl) debe mostrar una reaccin negativa, de
lo contario la prueba no es vlida para la determinacin ABO.

Reacciones para Rh D:
+++ a ++++
Rh D Positivo

+ a ++
Rh D dbil positivo

negativo
Rh D negativo

Tal cual lo expresramos al inicio de este captulo, el anti D monoclonal

empleado en esta tarjeta ID-Card DiaClon ABO/Rh for patients NO
reacciona con eritrocitos de fenotipo DVI .
Importante: el microtubo control (ctl) debe mostrar una reaccin negativa, de
lo contrario la prueba no es vlida para la determinacin Rh D.
Reacciones para CDE:
La presencia de los antgenos D, C o E es indicada por reacciones positivas de
+++ a ++++.
Importante: el microtubo control (ctl) debe mostrar una reaccin negativa, de
lo contrario la prueba no es vlida para la determinacin CDE.
Observaciones:
Para dar por vlidos los resultados, el control negativo siempre debe mostrar
una reaccin negativa.
Si el control negativo (ctl) arrojara reaccin positiva, lave inicialmente los
eritrocitos en estudio con solucin salina templada o bien con ID-Diluent 2
antes de preparar la suspensin de eritrocitos.
Si a continuacin, el control negativo muestra resultado negativo, las
reacciones pueden interpretarse y darse por vlidas.
Si la reaccin del control negativo persiste en su positividad, los resultados
ABO/Rh no son vlidos y deben realizarse estudios ulteriores para saber la
causa que origin la discrepancia.
En la tarjeta que a modo de ejemplo se utiliz en la descripcin de la tcnica,
se concluye que se trata de un paciente grupo B Rh Negativo, CDE negativo.

98

CLASIFICACIN ABO Rh EN RECIN NACIDOS:

Tarjeta DiaClon ABO/Rh for Newborns DVI+ (Id-n: 50961)

A diferencia de lo que ocurre con el antgeno Rh; el cual est totalmente
desarrollado al nacer al igual que sus variantes, los antgenos A y B no lo
estn al momento del nacimiento.
Por tal motivo, las reacciones con sueros anti-A, anti-B y anti-AB pueden ser
ms dbiles que con la sangre de adultos.
Los anticuerpos anti-A y anti-B aparecen en el recin nacido luego de los 4 a
6 meses de vida, por consiguiente el grupo srico o inverso no debe
practicarse a los neonatos.
Est indicada la confirmacin del grupo sanguneo ABO del recin nacido
luego que los antgenos A y B estn totalmente desarrollados, tiempo este
estimado a los 2 aos de vida.
En cuanto al antgeno D al igual que el D weak y la variante DVI, es
indispensable su determinacin en recin nacidos de madres Rh Negativas.
Esta tarjeta incorpora un microtubo control (ctl) de uso rutinario y un
microtubo para realizar el test de coombs directo al recin nacido para saber
si sus hemates estn sensibilizados con anticuerpos maternos adquiridos en la
vida intrauterina.
La determinacin de los grupos sanguneos ABO y Rh D incluyendo la
prueba antiglobulina directa en la sangre de los recin nacidos pueden ser
realizados en las siguientes tarjetas:
Tarjeta-ID ABO/Rh for newborns que contiene antisueros humanos
para la determinacin de grupos sanguineos con hemates en
suspensin en ID-Diluent 2 (con posterior adicin de solucin de

99

bromelina), con una incubacin de 10 minutos a temperatura

ambiente.
Esto permite la determinacin directa de la mayor parte de los antgenos
D dbiles (D weak).
O bien:
Tarjeta-ID DiaClon ABO/Rh for newborns que contiene anticuerpos
monoclonales para la determinacin de grupos sanguneos con hemates
en suspensin en ID-Diluent 2 (sin incubacin).
Cabe acotar que el anti-D monoclonal NO reacciona con todos los
antgenos D dbiles (D weak).

MUESTRA de SANGRE:
Resultan vlidas las muestras de sangre venosa y de taln. En caso de
muestras de cordn umbilical, debe eliminarse por consecutivos y cuidadosos
lavados con solucin salina fisiolgica, la gelatina de Wharton.
Preparacin de la muestra de sangre:
Preparar una suspensin de hemates al 0.8% en diluyente 2 de la siguiente
manera:
Dejar que el diluyente alcance la temperatura ambiente antes de su
utilizacin.
1. Pipetear 1.0 ml del diluyente 2 en un tubo limpio.
2. Agregar 10l de concentrado de hemates o 20l de sangre total y
mezclar cuidadosamente.
La suspensin de hemates puede utilizarse inmediatamente.
Procedimiento de la prueba:
1. Identificar la tarjeta con el nombre o nmero del recin nacido.
2. Despegue la lmina de aluminio sujetando la ID-tarjeta en posicin
vertical.
3. Pipetear 50l de la suspensin de hemates en los 6 microtubos de la
tarjeta-ID.
4. Centrifugar la tarjeta-ID durante 10 minutos en la ID-Centrifuga.
5. Lear y registre las reacciones.
100

Interpretacin de los resultados:

Positivo: Los hemates aglutinados forman una lnea roja sobre la
superficie del gel o estn dispersos en el gel.
Negativo: Sedimento compacto de hemates en el fondo del microtubo.
Reacciones para grupos sanguneos ABO:
Anti-A
+ a ++++
negativo
+ a ++++
negativo

Anti-B
negativo
+ a ++++
+ a ++++
negativo

Anti-AB
+ a ++++
+ a ++++
+ a ++++
negativo

GRUPO
A
B
AB
O

Importante: el microtubo control (ctl) debe presentar una reaccin negativa,

de lo contrario la prueba no es vlida para la determinacin del grupo ABO.
Reacciones para Rh D:
+++/++++
Rh D Positivo

+/++
Rh D dbil Positivo

negativo
Rh D Negativo

Importante: el microtubo control (ctl) debe presentar una reaccin negativa,

de lo contrario la prueba no es vlida para la determinacin Rh.
Reacciones para la prueba antiglobulina directa:
Una reaccin negativa indica la ausencia de anticuerpos detectables en los
hemates del recin nacido.
Una reaccin positiva ( hasta ++++) indica que los hemates del recin
nacido estn sensibilizados (hay anticuerpo fijado sobre la membrana de
superficie de los hemates).
Observaciones:
El control negativo (ctl) debe siempre presentar una reaccin negativa.
Si as no fuere, proceda a lavar 3 veces los hemates con solucin salina
fisiolgica o con ID-Diluent 2 antes de preparar la suspensin de hemates al
0.8% en ID-Diluent 2 y repita la prueba.

101

Si el control ctl permanece an positivo, no se puede asegurar la

interpretacin de los resultados del grupo sanguneo ABO y Rh D y ser
necesario ampliar el estudio.
El anti-D monoclonal includo en la tarjeta DiaClon ABO/Rh for newborns
fue seleccionado para que reaccionara con la variante DVI.
Tenga en cuenta que algunas variantes DVI pueden dar reacciones muy
dbiles.
En la tarjeta que a modo de ejemplo se utiliz en la descripcin de la tcnica,
se concluye que se trata de un recin nacido grupo B Rh Negativo con prueba
antiglobulina directa, negativa.

102

CLASIFICACIN ABO Rh EN DONANTES DE SANGRE:

Tarjeta DiaClon ABO/Rh for Donors (Id-n:51011)

Segn Mollison, las frecuencias de los diferentes grupos sanguneos ABO en

la poblacin caucsica son las siguientes:
O. 46%
A. 41%
B 9%
AB. 4%

Para detectar la presencia o ausencia de los antgenos A y B en los eritrocitos,

se emplean anti-A y anti-B que pueden ser de origen humano o monoclonal.
La determinacin del grupo ABO no puede considerarse completa sin haber
sometido al suero en estudio a la prueba inversa frente a eritrocitos A1, A2, B
y O conocidos.
Aproximadamente el 85% de la poblacin caucsica es Rh (D) positiva.
La expresin Rh positivo o Rh negativo alude a la presencia o ausencia
del antgeno Rh (D) en los eritrocitos.
La determinacin puede realizarse empleando suero reactivo anti-D que
puede ser de origen humano o monoclonal.
La sensibilidad del ID-System permite la deteccin directa de la mayora de
los casos con fenotipo D dbil.
Las recomendaciones actuales para la determinacin de Rh D sugieren que,
para los receptores de transfusiones y pacientes antenatales, los reactivos antiD no deberan detectar el fenotipo DVI.

103

El antgeno D consta de numerosos epitopos y en el modelo de 9 epitopos, los

eritrocitos DVI carecen de todos ellos salvo tres.
Esto significa que los individuos con fenotipo DVI pueden producir anti-D
contra los epitopos ausentes tras la inmunizacin por eritrocitos Rh D
positivos fetales o procedentes de una transfusin.
Para asegurarse que se toman las medidas teraputicas adecuadas, los
eritrocitos de pacientes DVI deben considerarse como Rh negativos.
A la inversa, la sangre de donantes debe analizarse con un anti-D que detecte
la variante DVI y considerar a los portadores de la variante como Rh
positivos, para evitar su transfusin a pacientes Rh (D) negativos o D
parciales.
La tarjeta ID-Card DiaClon ABO/Rh for Donors permite determinar en una
nica tarjeta el perfil completo de los antgenos ABO, RhD y CDE.
Contiene anticuerpos monoclonales y el anti-D fue seleccionado para que
reaccione con las variantes DVI.
Preparacin de la muestra de sangre:
Prepare una suspensin de eritrocitos al 5% en ID-Diluent 2 del modo
siguiente:
Deje que el diluyente alcance la temperatura ambiente antes de utilizarlo.
1. Pipetee 0.5 ml de ID-Diluent 2 en un tubo limpio.
2. Aada 50l de sangre completa o 25l de concentrado de eritrocitos y
agite suavemente.
La suspensin de eritrocitos puede utilizarse inmediatamente.

Procedimiento de la prueba:
1. Identifique los microtubos de la tarjetaID-Card con el nombre o
nmero del donante.
2. Despegue la lmina de aluminio de los microtubos sujetando la IDtarjeta en posicin vertical.
3. Aada 12,5l de la suspensin de eritrocitos a todos los microtubos de
la tarjeta ID-Card.
4. Centrifugue la tarjeta ID-Card durante 10 minutos en la ID-Centrifuga.
5. Lea y registre las reacciones.

104

Interpretacin de los resultados:

Positivo: Los hemates aglutinados forman una lnea roja sobre la
superficie del gel o estn dispersos en el gel.
Negativo: Sedimento compacto de hemates en el fondo del microtubo.
Reacciones para grupo sanguneo ABO:
Anti-A
++++
negativo
+++
negativo

Anti-B
negativo
++++
++++
negativo

Anti-AB
++++
++++
++++
negativo

GRUPO
A
B
AB
O

Las reacciones ms dbiles que ++++ pueden indicar subgrupos A o B y se

deben realizar estudios adicionales.
Para una interpretacin correcta debe realizarse una prueba completa de
determinacin de grupo que incluya la prueba inversa.
En presencia de antgenos de expresin dbil o muy dbil, la reaccin puede
ser negativa.
Importante: el microtubo control (ctl) debe mostrar una reaccin negativa, de
lo contrario la determinacin ABO no es vlida.
Reacciones para Rh D:
+++ a ++++
a ++ (*)
negativo
Rh D positivo
Rh D dbil positivo
Rh D negativo
(*) Las reacciones dbiles, las trazas o , deben estar sujetas a una ampliacin
del estudio para distinguir entre los tipos D parciales y D dbiles segn la
categora de la muestra que est siendo estudiada.
El suero anti D monoclonal fue seleccionado para que reaccionara con la
variante DVI, aunque algunas pueden reaccionar muy dbilmente.
Reacciones para CDE:
La presencia de los antgenos Rh (D),C o E es indicada por reacciones
positivas de +++ a ++++.
Importante: el microtubo control (ctl) debe mostrar una reaccin negativa, de
lo contrario la determinacin ABO, Rh D y CDE no es vlida.

105

Observaciones:
Para dar por vlidos los resultados, el control negativo siempre debe mostrar
una reaccin negativa.
Si el control negativo (ctl) arrojara reaccin positiva, lave inicialmente los
eritrocitos en estudio con solucin salina isotnica o ID-Diluent 2 antes de
preparar la suspensin de eritrocitos y proceda a reiterar la prueba.
Si a continuacin, el control negativo muestra resultado negativo, las
reacciones pueden interpretarse y darse por vlidas.
Si la reaccin del control negativo persiste en su positividad, los resultados
ABO/Rh , CDE no son vlidos y debe realizarse estudios ulteriores para saber
la causa que origin la discrepancia.

En la tarjeta que a modo de ejemplo se utiliz en la descripcin de la tcnica,

se concluye que se trata de un donante grupo B Rh D Negativo, CDE
Negativo.

Tambin contamos con una tarjeta (DiaClon ABO/D) con determinacin

doble del antgeno RhD. Se trata de la Tarjeta ID-Card # 50481.
(A, B, AB, DVI+, DVI-, ctl).

Tarjeta ID-Card # 50481

El primer anti-D puede detectar la variante DVI y el segundo anti-D es
negativo para la variante DVI. Ambos anti-D son monoclonales.
Algunas variantes DVI podran dar reacciones muy dbiles.

De modo tal que para esta tarjeta, la interpretacin para el Rh sera la

siguiente:
106

Anti-DVI+
+++ a ++++
a ++ **
negativo
+ a ++++
negativo

Anti-DVI+++ a ++++
a ++ **
negativo
negativo
+ a ++++

Interpretacin
Rh D positivo
Rh D dbil
Rh D negativo
DVI+ *
DVI- *

*Para una interpretacin segura debern llevarse a cabo investigaciones

adicionales con ID-Partyal D Typing.
** Las reacciones dbiles, las trazas o deben estar sujetas a una
ampliacin del estudio para distinguir entre los tipos D parciales y D
dbiles segn la categora de la muestra que est siendo estudiada.

Para el ejemplo de la tarjeta ilustrada (tarjeta ID-Card # 50481), se concluye

que se trata de un grupo sanguneo AB Rh D Negativo.

(*) En la fotografa siguiente observamos un ejemplo de DVI

la ID-Card Partial Rh D Typing.

107

utilizando

CARACTERIZACIN DEL TIPO D PARCIAL POR TEST EN GEL.

Esta tabla de interpretacin acompaa al kitt Partial Rh Typing que cuenta

con 6 antisueros monoclonales anti D. Obsrvese las reacciones obtenidas en
la tarjeta de gel y comprelas con las de la cartilla.
Para el ejemplo de la tarjeta, las reacciones positivas con los antisueros 1 y 2,
y negativas con los antisueros 3, 4 ,5 y 6 indican que la muestra testeada
corresponde a la categora DVI.

108

DETERMINACIN DE LOS FENOTIPOS Rh y KELL:

Tarjeta ID-Card # 50110

Adems del antgeno Rh D, el sistema Rh incluye otros antgenos

importantes, a saber: C, E, c y e.
Segn Issitt, sus frecuencias en la poblacin caucsica son las siguientes:
C . 70%
c . 80%
E . 30%
e. 98%
La presencia de uno de estos antgenos en los eritrocitos puede estimular la
produccin de anticuerpos en sujetos carentes de los antgenos C, c, E y e.
Por consiguiente la determinacin de los fenotipos Rh resulta de importancia
en el embarazo o en pacientes que hayan recibido transfusiones anteriormente
y en pacientes portadores de anticuerpos irregulares circulantes coinocidos.
Aproximadamente el 9% de la poblacin caucsica es K (Kell) positiva.
El antgeno K es altamente inmunognico.
Se ha indicado que el anti K puede provocar reacciones post-transfusionales
severas, tanto inmediatas como retardadas, as tambin como enfermedad
hemoltica del recin nacido.
La tarjeta ID-Card DiaClon Rh subgroups +K permite una determinacin
completa del perfil fenotpico Rh e incluye la determinacin del antgeno K y
est compuesta por anticuerpos monoclonales.
109

El microtubo ctl es el control negativo.

MUESTRAS:
Para un resultado ptimo, la determinacin debe realizarse con una muestra
recin extrada, preferiblemente recolectadas utilizando citrato, EDTA o
CPD-A como anticoagulante, aunque tambin son vlidas las muestras
tomadas en tubos secos (sin anticoagulante).
PREPARACIN DE LA MUESTRA DE SANGRE:
Prepare una suspensin de eritrocitos a analizar al 5% en ID-Diluent2 del
siguiente modo:
Deje que el diluyente alcance la temperatura ambiente antes de utilizarlo.
1. Pipetee 0.5 ml de ID-Diluent 2 en un tubo limpio.
2. Aada 50 l de sangre total o 25 l de sedimento de hemates y agite
suavemente.
La suspensin de eritrocitos puede utilizarse de inmediato.
CONTROLES:
Deben incluirse muestras positivas y negativas conocidas de acuerdo a las
normas de garanta de calidad aplicables.
PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA:
No usar las tarjetas ID-Card que muestren signos de desecacin, burbujas en
el gel, sellado defectuoso, gotas del gel o de sobrenadante en la parte superior
de los microtubos o en la superficie interior del aluminio de sellado.
1. Identificar la tarjeta ID-Card con el nmero o nombre de identificacin
del donante o del paciente.
2. Retirar la lmina de sellado slo de los microtubos que se vayan a
utilizar manteniendo la tarjeta ID-Card en posicin vertical.
3. Aada 12,5 l de la suspensin de eritrocitos preparada a todos los
microtubos de la tarjeta ID-Card.
4. Centrifugue la tarjeta ID-Card durante 10 minutos en la ID-Centrifuga.
5. Lea y registre las reacciones.

110

INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS.

POSITIVO: Los eritrocitos aglutinados forman una lnea roja sobre la

superficie del gel o aparecen dispersos en el gel.
NEGATIVO: Sedimento compacto en el fondo del microtubo
Reacciones para los fenotipos Rh y K.
Una reaccin positiva (+ a ++++) indica la presencia del
correspondiente antgeno.
Las reacciones menores o iguales a ++ pueden indicar la presencia
de formas dbiles o variantes del antgeno.
Una reaccin negativa indica la ausencia del correspondiente
antgeno.

Importante: el microtubo ctl (control) debe mostrar una reaccin

negativa. Si as no fuere, la determinacin antignica no es vlida.
El control negativo, es lo que valida la correcta determinacin de la
tcnica.
Si la reaccin fuere positiva, proceda a lavar los hemates en solucin
salina templada o bien en Diluent-2 antes de preparar la suspensin de
eritrocitos.
A continuacin proceda segn se indica en Preparacin de la muestra
de sangre y Procedimiento de la prueba.
Si a continuacin el control negativo muestra un resultado negativo, las
reacciones pueden validarse, leerse e interpretarse.
Si el control negativo, muestra resultado positivo, los resultados de las
determinaciones de fenotipo se darn como no vlidas y debern
realizarse estudios ulteriores mediante tcnicas recomendadas para
averiguar el motivo, a fin de garantizar la validez de la determinacin
antignica.
Recuerde: mutaciones en el gen que codifica el grupo sanguneo puede
dar lugar a formas dbiles o variantes de un antgeno, lo cual puede
acarrear inesperados resultados dbiles o negativos.
El antisuero DiaClon anti C es especfico para el antgeno C y no
reacciona con el antgeno Cw.

111

El antgeno C puede expresarse muy dbilmente en sujetos Cw+ o en

otros fenotipos con expresin deprimida del antgeno C.
En estas raras circunstancias pueden observarse reacciones dbiles o
negativas.
El antgeno Kpa en posicin cis debilita la expresin de los antgenos
K.

112

ESTUDIO DE UNA EMBARAZADA:

Tarjeta DiaClon Type + Screen (Id n: 50682)

Se trata de una tarjeta de confirmacin del grupo sanguneo combinado con la

investigacin de anticuerpos irregulares por medio de la prueba indirecta de la
antiglobulina humana (medio liss/coombs) utilizando tres hemates reactivo
ID-DiaCell I-II-III).
Los antisueros que la integran son monoclonales y la antiglobulina humana es
poliespecfica.
En cuanto al reactivo anti-D cabe acotar que NO reacciona con la variante
DVI.

A las embarazadas Rh Negativas se les investiga la variante cuantitativa D

weak (D dbil).
Si la prueba D dbil es positiva, la embarazada se tipifica como Rh positiva.
En algunos lugares, la prueba del D dbil es opcional o directamente no se
hace y la consecuencia de este acto sera que se est tipificando a una
embarazada como Rh negativa, lo cual llevara a mayores controles
inmunohematolgicos durante la gestacin y por otro lado a que reciba
inmunoprofilaxis anti Rh (D) que NO necesita.

113

MUESTRA de SANGRE:
Para un resultado ptimo, la determinacin debe realizarse con una muestra
recin extrada utilizando citrato, EDTA o CPDA como anticoagulante.
Tambin es posible es posible realizar el estudio en muestras extradas en
tubo seco (sin anticoagulante).
Cuando sea necesario emplear suero en lugar de plasma para la investigacin
de anticuerpos irregulares, se sugiere someter el suero a una centrifugacin a
1500 g durante 10 minutos antes de su uso para evitar la presencia de residuos
de fibrina que podran interferir con el patrn de reaccin.

Preparacin de las muestras de sangre:

Suspensin de hemates para la determinacin ABO/D.
Preparar una suspensin de hemates al 5% en el ID-Diluent 2 como sigue:
Deje que el diluyente alcance la temperatura ambiente antes de utilizarlo.
1. Pipetear 0.5 ml del ID-Diluent 2 en un tubo limpio.
2. Agregar 50l de sangre total o 25l de concentrado de hemates y
mezclar suavemente.
La suspensin de hemates as preparada puede usarse inmediatamente.
Plasma o suero para el escrutinio de anticuerpos.
Una vez obtenidas las muestras de plasma o suero por centrifugacin, debern
conservarse refrigeradas a 4C por un mximo de 48 horas. Transcurrido ese
lapso, congelarlas a -20C.
Controles:
Deben incluirse muestras positivas y negativas conocidas de acuerdo con las
normas de garanta de calidad aplicables.

Procedimiento de la prueba:
Inspeccione la tarjeta en busca de signos de desecacin, burbujas, sellado
defectuoso y otras alteraciones.
Deje que los eritrocitos de prueba y las muestras alcancen la temperatura
ambiente antes de usarlos y resuspndalos suavemente.

114

1. Identifique la tarjeta ID-Card con el nmero o nombre de la paciente.

2. Retirar la lmina de sellado solo de aquellos microtubos que se vayan a
utilizar manteniendo la ID-Card en posicin vertical.
3. Pipetear 12.5l de la suspensin de hemates de la gestante en los tres
primeros microtubos (anti-A, anti-B, anti-D) de la tarjeta.
4. Dispensar 50l de cada ID-Cell I-II-III en los microtubos 4, 5 y 6 de
la tarjeta.
5. Agregar 25l de plasma o de suero de la gestante en los microtubos 4,
5 y 6.
6. Incubar la tarjeta ID-Card durante 15 minutos a 37C en la IDIncubadora.
7. Transcurrido ese tiempo, centrifugar la tarjeta durante 10 minutos en la
ID-Centrfuga.
8. Lea y registre las reacciones.
Interpretacin de los resultados:
Positivo: los hemates forman una lnea roja sobre la superficie del gel o
estn dispersos en el gel.
Negativo: sedimento compacto de hemates en el fondo del microtubo.

Reacciones para los grupos sanguneos ABO:

Anti-A
+++ a ++++
negativo
+++ a ++++
negativo

Anti-B
negativo
+++ a ++++
+++ a ++++
negativo

Grupo Sanguneo
A
B
AB
O

Reacciones ms dbiles que +++ pueden indicar la presencia de subgrupos de

A y/o B, en este caso debern efectuarse estudios adicionales.
Para una correcta interpretacin deber efectuarse una determinacin
completa de grupo sanguneo que incluya la prueba reversa.
En presencia de antgenos de expresin dbil o muy dbil, la reaccin puede
ser negativa.
Reacciones para Rh D.
Rh D positivo
+++ a ++++

Rh D dbil
a ++ (*)

115

Rh D negativo
negativo

(*)Las reacciones dbiles, las trazas o estn sujetas a una ampliacin del
estudio para distinguir entre los tipos D parciales y D dbiles.
El suero anti-D de esta tarjeta no reacciona con las variantes DVI.
Un antgeno Rh D dbil puede dar una reaccin negativa.
Si se la tarjeta se utiliza para el estudio de pacientes y/o gestantes, recuerde
que la mayora de las guas NO recomienda ampliar el estudio para
determinar fenotipos D dbiles o D parciales.

Reacciones para el escrutinio de anticuerpos:

Una reaccin negativa indica la ausencia de anticuerpos irregulares
detectables en el suero o plasma de la paciente.
Una reaccin positiva indica la presencia de anticuerpos irregulares.
Escribir los resultados de las reacciones en la tabla de antgenos.
Cuando se observe una reaccin positiva con todos los hemates test
ID-DiaCell I-II-III; se aconseja realizar un autocontrol (en una
tarjeta Liss/Coombs).
Si el autocontrol es negativo, las reacciones positivas obtenidas con
los hemates reactivo, pueden darse por vlidas y debern realizarse
los estudios suplementarios conducentes a la identificacin del
anticuerpo.
En cambio, si uno o ms hemates reactivo presenta una reaccin
positiva de mayor intensidad que la observada en el autocontrol, se
deber tener en cuenta que adems de la reaccin inespecfica, es
probable la presencia de un aloanticuerpo subyacente. Por lo cual el
estudio del paciente deber completarse con pruebas adicionales que
descarten la presencia de aloanticuerpos subyacentes.

116

LIMITACIONES EN LOS PROCEDIMIENTOS REALIZADOS

EN LAS TARJETAS ID-Card

Todas las tcnicas detalladas en los diferentes apartados de esta obra,

presentan eventuales limitaciones. Por tanto, se aconseja leer atentamente
los siguientes puntos:

a. Las tarjetas ID-Card que muestren burbujas de aire en el gel o gotas en

la parte superior de los microtubos y/o de la lmina de sellado, deben
ser centrifugadas antes de usarlas.
b. Los restos de fibrina de la muestra en estudio pueden atrapar los
hemates no aglutinados, de modo que aparezca una lnea rosada en la
parte superior del gel mientras que la mayora de los eritrocitos se
encuentran en el fondo del microtubo tras el centrifugado.
c. El empleo de soluciones de suspensin para eritrocitos distintas a los
Diluent 2 puede modificar las reacciones.
d. La contaminacin de los materiales empleados, bacteriana o de otro
tipo, puede provocar falsos positivos o falsos negativos.
e. Es esencial atenerse estrictamente a los procedimientos y equipos
recomendados. El equipo debe comprobarse peridicamente segn la
normativa de prcticas de laboratorio correctas (GLP: Good Laboratory
Practice Buenas Prcticas de Laboratorio).
f. Las suspensiones de eritrocitos demasiadas concentradas o demasiadas
diluidas pueden dar lugar a resultados aberrantes.

117

Todo error deja una enseanza, toda enseanza deja experiencia y

toda experiencia deja una huella.
Annimo.

118

PROTOCOLO DE SEGUIMIENTO
INMUNOHEMATOLGICO DE LA GESTACIN.

Una vez obtenido el resultado de la determinacin de grupo sanguneo y Rh y

la investigacin de anticuerpos irregulares en la embarazada, los escenarios
posibles son cuatro, a saber:
1. La gestante puede resultar ser Rh Positiva con una investigacin de
anticuerpos irregulares negativo, caso este que no requiere otro control
inmunohematolgico durante la gestacin.
2. La gestante puede resultar ser Rh Positiva con una investigacin de
anticuerpos irregulares positivo.
Aqu se debe identificar el anticuerpo (ver captulo Identificacin de
Anticuerpos Irregulares) y evaluar su importancia clnica.
En caso de tratarse de anticuerpos del sistema Lewis, anti I o anti P1 a
modo de ejemplo; carecen de significacin clnica para el feto dado que
se tratan de anticuerpos de tipo IgM y por tanto no atraviesan la barrera
placentaria.
La embarazada de este caso no necesita nuevos controles
inmunohematolgicos durante lo que resta de la gestacin.
Si el anticuerpo irregular hallado fuera de tipo IgG (ejemplo de
anticuerpos anti K, anti C, anti E entre otros) puede provocar EHP
(Enfermedad Hemoltica Perinatal) y su seguimiento ser similar al
caso del anticuerpo anti Rh (D).
3. La gestante puede resultar ser Rh (D) Negativa, con una investigacin
de anticuerpos irregulares negativa.
La paciente carece de anticuerpos antieritrocitarios circulantes, pero
debe repetir la investigacin de anticuerpos irregulares entre las
semanas 25 y 28 de la gestacin (ver Algoritmo Diagnstico de
E.H.F.N).
Si la embarazada recibe inmunoglobulina anti Rh (D) se debe dejar
transcurrir ms de 8 semanas para repetir los estudios
inmunohematolgicos dado que el test de coombs indirecto puede
resultar positivo por los anticuerpos anti Rh (D) administrados a la
madre.
4. Un ltimo escenario lo constituye la posibilidad que la embarazada
resulte ser Rh negativa con anticuerpos irregulares positivo, caso este
que requiere identificar al anticuerpo como est planteado en el
numeral 2.

119

En suma: lo primordial es determinar si la gestante tiene o no

anticuerpos irregulares, independientemente si es Rh (D) positiva o
negativa.
Si presenta anticuerpos, se los debe identificar para saber si pueden
causar EHFN o no.
En caso de carecer de anticuerpos irregulares, interesa el factor Rh (D).
Si es Rh (D) positiva no son necesarios ms controles, pero en caso de
resultar ser Rh (D) negativa, se debern repetir los estudios
inmunohematolgicos entre las semanas 25 y 28 de la gestacin.

120

ALGORITMO DIAGNSTICO DE E.H.F.N EN EL

EMBARAZO

121

Invertir en conocimiento produce siempre los mejores intereses

Benjamn Franklin.
(1706-1790).
Filsofo, fsico y poltico estadounidense.

122

EPLOGO
La microtcnica de aglutinacin en gel ha representado un avance
indiscutible en la Inmunohematologa.
Se trata de una tcnica altamente sensible, estandarizada, de fcil lectura e
interpretacin, cuyos resultados pueden ser almacenados y reproducidos a
travs de medios informticos.
El personal Tcnico y Mdico debe cumplir estrictamente con los respectivos
instructivos de uso proporcionados por el fabricante del producto, a fin de que
con esta formidable herramienta, podamos obtener el cien por ciento de sus
beneficios, logrando as a un diagnstico inmunohematolgico certero.
Desde tiempo atrs y de acuerdo a una cuidadosa planificacin que el
Servicio Nacional de Sangre ha puesto en prctica, ao tras ao se instalan en
los Servicios de Hemoterapia dependientes de ASSE, el equipamiento
adecuado para utilizar esta tcnica y apoyar el rea asistencial que prestan.
Agradecemos y felicitamos a Jorge Golffed, quien despus de aos de trabajo
en la Especialidad, sinti la inquietud de apoyar generosamente a sus colegas
con una valiossima recopilacin, minuciosa y actualizada, con base en lo
terico, exponiendo lo prctico y aportando protocolos de diagnstico en una
obra de fcil lectura, que auguro, se transformar en un compaero
inseparable de cada momento en nuestras horas de labor.

Dra. Mara de Lourdes Viano

Direccin
Servicio Nacional de Sangre
Administracin de Servicios de Salud del Estado
Uruguay

123

Definiciones tiles
Absorcin: proceso por el cual se logra la remocin de uno o varios
anticuerpos de un suero al ponerlo en contacto con los hemates portadores
del antgeno adecuado. Por ejemplo; las clulas Rh D positivas pueden
utilizarse para absorber anticuerpos anti Rh D de un suero.
Adsorcin: adherencia no especfica de sustancias solubles y protenas entre
otras, a la superficie de clulas o partculas inertes. En inmunohematologa:
adhesin del anticuerpo a los sitios del receptor ubicados en la superficie del
hemate.
Aglutinacin: agregacin de antgenos celulares por reaccin con anticuerpos
especficos que forman puentes entre los determinantes antignicos de las
clulas contiguas.
Consiste pues, en la agrupacin de los hemates mediante puentes de unin
entre ellos.
Aglutinina: anticuerpo.
Aglutinina atpica: anticuerpo que se encuentra en el suero de ciertos
individuos.
Aglutingeno: antgeno.
Albmina: fraccin proteica plasmtica usada comnmente como medio
macromolecular en la incubacin de las pruebas de laboratorio, que
disminuye el llamada potencial Z.
Como hemoderivado se la utiliza como expansor del volumen plasmtico y
para reposicin proteica en ciertos casos.
Algoritmo: secuencia finita de operaciones que permiten hallar la solucin a
un problema. Dicha secuencia puede ser expresada en forma de un diagrama
de flujo con el fin de seguirlo de una forma ms sencilla.
Amplitud trmica: rango de temperaturas entre las cuales un anticuerpo
reacciona con su antgeno especfico.
Anticoagulante: sustancia que impide la coagulacin sangunea.
Anticuerpo: protena sintetizada por el organismo en respuesta a la
introduccin de algn antgeno.
124

Anticuerpo caliente: anticuerpo cuyo rango ideal de accin se ubica en el

orden de los 37C.
Anticuerpo fro: anticuerpo cuyo rango ideal de accin se ubica a bajas
temperaturas, en el orden de los 5 y 25C.
Anticuerpo irregular: anticuerpo atpico que no se presenta de manera
constante en todos los sujetos, por ejemplo: la presencia de un anticuerpo anti
Rh D.
Anticuerpo monoclonal: anticuerpo homogneo producido por una clula
hbrida producto de la fusin de un clon de linfocito B descendiente de una
sola y nica clula madre y una clula plasmtica tumoral.
Anticuerpo natural: anticuerpo que se presenta espontnea y naturalmente
sin estimulacin antignica aparente.
Antgeno: sustancia extraa al organismo que introducida en l induce una
respuesta inmunitaria.
Antiglobulina: anticuerpo que reacciona con las globulinas plasmticas.
Antisuero: trmino utilizado para denominar un suero o reactivo que
contiene anticuerpos contra un determinado antgeno.
Asptico: relativo a la asepsia. Mtodo que se propone impedir el acceso de
grmenes nocivos al organismo, evitando la produccin de enfermedades.
Autoaglutinina: aglutinina que reacciona con los propios hemates del sujeto
en el cual se encuentra.
Avidez: propiedad de un anticuerpo que determina el tiempo de reaccin con
el antgeno correspondiente.
Complemento: conjunto de protenas sricas termolbiles presentes en el
suero fresco, que constituyen el mediador humoral primario de la reaccin
antgeno anticuerpo.
Crioaglutinina: tambin llamada aglutinina fra, se trata de anticuerpos
aglutinantes detectables a bajas temperaturas (entre los 4 a 25C).

125

Determinante antignico: llamado tambin epitopo, comprende el sitio

particular de un antgeno que determinas la especificidad de la reaccin
antgeno anticuerpo.
EDTA: siglas que representan al cido etilendiaminotetraactico,
anticoagulante utilizado en hematologa.
Efecto de dosis: se entiende como tal la diferencia del grado de reaccin de
un anticuerpo, cuando el antgeno correspondiente se encuentra en estado
homocigoto en relacin al estado heterocigoto.
Elucin: tcnica destinada a la remocin de anticuerpos unidos a la superficie
de una clula. Su producto se conoce con el nombre de eludo, el cual se trata
de una solucin conteniendo el anticuerpo recuperado de la superficie celular
a la cual estaba adherido.
Especificidad: capacidad de un anticuerpo de reaccionar exclusiva y
nicamente con el antgeno respectivo. Existe una suerte de combinacin
exclusiva como el de una llave con su cerradura.
Fenmeno de Prozona: en las pruebas de aglutinacin, sta puede no ocurrir
en los tubos que contengan la concentracin ms elevada de anticuerpos, pero
se manifiesta cuando se diluye el anticuerpo.
Esta ausencia o debilitacin de la aglutinacin en presencia del mximo nivel
de anticuerpo, es conocida como fenmeno de prozona.
Fenotipo: caractersticas evidenciables a la observacin directa de un
individuo.
Genotipo: constitucin gentica de un individuo, frmula gentica.
Globulina: clase particular de protena a la que pertenecen los anticuerpos.
GLP: Good Laboratory Practice Buenas Prcticas de Laboratorio.
Hemoaglutinacin: aglutinacin de los hemates.
Hemolisina: anticuerpo que logra la hemlisis de los hemates en presencia
de complemento.
Hemlisis: lesin de la membrana del hemate con prdida de hemoglobina.

126

ID-Card: trmino comercial con el que se conoce a las tarjetas para trabajo
en inmunohematologa utilizando el sistema MTS (Micro Typing System).
Inmunoglobulina: protena plasmtica asociada a procesos inmunes.
Todos los anticuerpos son inmunoglobulinas, pero no todas las
inmunoglobulinas tienen funcin de anticuerpo.
In vitro: trmino con el cual se designan las reacciones de laboratorio.
In vivo: trmino con el cual se designan los estudios o reacciones en el
individuo.
Lisis: destruccin de clulas o bacterias por lisinas u otros agentes. Se habla
de hemlisis en caso de lesin o ruptura de la membrana del hemate con
prdida de hemoglobina.
Liss: sigla en ingls del reactivo de Solucin de Baja Fuerza Inica (Low
Ionic Strength Solution).
Medio macromolecular: medio que contiene un alto peso molecular, dado
este por la albmina bovina, dextrano, etc.
MTS: Micro Typing System.
Optimo trmico: temperatura ideal u ptima de reaccin entre un antgeno y
su respectivo anticuerpo.
Panel celular: conjunto de hemates de grupo O extensamente fenotipados
utilizados en la investigacin e identificacin de anticuerpos.
Plasma: porcin lquida de la sangre no coagulada.
Potencia: fuerza de un anticuerpo.
Potencial Z: potencial elctrico negativo que media entre la superficie
hemtica y la nube de iones que lo rodea cuando se encuentran suspendidos
en un medio electroltico.
Prueba de Coombs: prueba con suero antiglobulina humana.
Quelante: secuestrante o sustancia de naturaleza qumica que tiene la
facultad de unirse a los iones metlicos. En el caso de la coagulacin

127

sangunea, inhibe la participacin del ion Ca++ en la cascada de la

coagulacin de la sangre.
Rouleaux: fenmeno de aglomeracin de los hemates los cuales se disponen
en forma de pila de monedas. Puede observarse en casos de elevacin de las
protenas plasmticas o bien por la accin de expansores plasmticos de
elevado peso molecular como por ejemplo el dextrano.
Salina normal: solucin isotnica de clorura de sodio, comnmente conocido
como suero fisiolgico.
Screening: hace referencia a un estudio o prueba preliminar o tamizaje.
Suero: porcin lquida de la sangre coagulada.
Ttulo: cantidad de anticuerpo en un suero. Se lo expresa como el valor
recproco de la mayor dilucin del suero en la que el anticuerpo da una
reaccin de aglutinacin visible.
Variante: tipo diferente, forma rara.
Zona de equivalencia: zona ptima de concentracin de antgeno y
anticuerpo en la cual se forman complejos, sin dejar antgeno ni anticuerpo
sobrante.

128

BIBLIOGRAFA CONSULTADA.
1. Manual de Tcnicas y Procedimientos en Bancos de Sangre.
Teresa Romero de Rodriguez y colaboradores.
Editorial Prado 2010.
2. Essential Guide To Blood Groups.
Geoff Daniels and Imelda Bromilow.
Third Edition 2014
Wiley Blackwell.
3. ID-System Bio-Rad Catlogo 2011.
4. DiaMed-ID Micro Typing System 1998 Catlogo 1998.
5. Le gel test: un nouveau procd en Inmuno-Hematologie. Y. Lapierre
Spectra Biologie Nmero 89/4 Septembre 1989.
6. Transfusin de Sangre en Medicina Clnica. P.L. Mollison.
Editorial Revert S.A. 1987.
7. Manual de Inmunohematologa. Laboratorio de Inmunohematologa.
Servicio Nacional de Sangre M.S.P-A.S.S.E Dr. Andrew Miller 2011.
8. Recomendacin para la Prevencin, Diagnstico y Tratamiento de la
Enfermedad Hemoltica Feto Neonatal en la Gestacin. Actualizacin
2010. M.S.P-Uruguay.
9. Technical Manual AABB Ediciones 10, 13, 15 y 16.
10.Transfusin Sangunea J G Kelton, N M Heddle, M A Blajchman.
Ediciones Doyma S.A. 1986.
11.Manual de Banco de Sangre de la Cruz Roja Espaola (Cortesa del
Autor: Dra. Julia Ms Mart) 1986.
12.Serological and Inmunological Methods. Canadian Red Cross-Blood
Transfusion Service. Ao 1980.
13.Transfusin Sangunea. D W Huestis. Editorial Salvat 1985.
14.Tcnicas de Inmunohematologa de la Serie Roja. C Martn Vega.
Cortesa de Laboratorios Menarini.
15.Manual para Bancos de Sangre, USAF SCHOOL FOR LATIN
AMERICA (USAFSO). United States Air Force 1965.
16.Introduccin al Estudio de la Inmunohematologa. Dr. Augusto M.
Romero Alvarez. (Editado por P.L. Rivero & Ca). Argentina .1972.
17.Inmunohematologa, Principios y Tcnicas. Cruz Roja Chilena.
Ediciones Mediterrneo 1988.
18.Inmunohematologa de los Grupos Sanguneos. B E Dood, P J Lincoln.
El Manual Moderno S.A. Mxico 1976.
19.Manual Prctico de Tcnicas para Bancos de Sangre. Ministerio de
Salud Pblica Uruguay 1980.
20.Hemoterapia e Inmunohematologa. Marletta J. Ediciones Cientfico
Tcnicas Americanas. Argentina 1981.
129

21.Microplacas: SU APLICACIN EN INMUNOHEMATOLOGA

BSICA DE BANCO DE SANGRE. Dra. Elena Franco 1998.
22.Manual de Tcnicas Bsicas en Hemoterapia. Jorge Golffed.
Oficina del Libro A.E.M 1992.
23.Enfermedad Hemoltica Perinatal. Dr. Jorge Decaro. Laboratorio
Clausen .2003.
24.MEDICINA TRANSFUSIONAL PERINATAL. Dr. Jorge Decaro.
Laboratorio Clausen. 2011.
25.Transfusion Medicine. Second Edition. Jeffrey McCullough. Editorial
Elsevier. 2005.
26.GUA SOBRE LA TRANSFUSIN DE COMPONENTES
SANGUNEOS Y DERIVADOS PLASMTICOS. Sociedad Espaola
de Transfusin Sangunea. 2006.
27.Instrucciones de Uso. DiaMed-ID Micro Typing System. DiaMed
Argentina S.A.
28.Handbook of Transfusion Medicine. Robert G. Westphal, M.D.
American Red Cross. 1990.
29.Hemotherapy of the Infant and Premature. American Assiciation of
Blood Banks. 1983.
30.Hemolytic Disease of the Newborn. American association of Blood
Banks. 1984.
31.Pgina web: www.diamed.com
32.Pgina web: www.biorad.com/inmunohematology (para consultas
sobre los insertos de las diferentes ID-Card).
33.Instruccin Tcnica. Hospital son Lltzer. Govern de les Illes Balears.
2007.
34.Investigacin de Anticuerpos Irregulares por los Tcnicos Miguel
Gmez y Sergio Ramos.
35.Diccionario de Inmunologa. W.J. Herbert y P.C. Wilkinson Editorial
JIMS. 1974
36.UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER. Manual Tcnico
de Camilo Andrs Valderrama Carrasco. Tesis de Pregrado. 2008.

130

 N D I C E
3.
5.
8.
10.
12.
14.
15.
15.
17.
18.
20.
20.
21.

Prlogo : Dr. Andrew Miller

Prefacio
Microtcnica de Aglutinacin en Gel - Introduccin
Principio del mtodo
Composicin del gel
Volmenes a dispensar. ID-Pipetor FP-4
Condiciones de incubacin
Condiciones de centrifugacin
Banjo ID-Reader
Patrones de lectura
Otras consideraciones
Plasma o suero? Importancia del complemento
Diluyentes

24.
24.
30.
32.
33.
36.
37.
38.
39.
40.

Reaccin serolgica de aglutinacin

Sensibilizacin y factores que la influyen
Aglutinacin y factores que la influyen
Tratamiento enzimtico de los hemates
Cuadro comparativo de enzimas proteolticas
Prueba antiglobulnica humana
Prueba antiglobulnica directa (PAD)
Prueba antiglobulnica indirecta (PAI)
Reactivos antiglobulnicos humanos
Mecanismo de sensibilizacin de eritrocitos con complemento

44.
45.
46.
48.
51.
52.
53.
54.

Pruebas en ID-Card Liss/Coombs

Prueba de antiglobulina humana directa
Prueba de compatibilidad transfusional (en medio liss/coombs)
Investigacin de anticuerpos irregulares (en medio liss/coombs)
Tabla de antgenos: ID-DiaCell I-II-III y ID-DiaCell IP-IIP-IIIP
Identificacin de anticuerpos irregulares (en medio liss/coombs)
Efecto de dosis
ID-DiaPanel ID-DiaPanel-P

56.
58.
58.
58.
59.
59.

Pruebas en ID-Card NaCl Enzime Test and Cold Agglutinins

Prueba de compatibilidad en medio enzimtico (Papana o Bromelina)
Prueba de compatibilidad en medio salino
Prueba srica inversa
Investigacin de anticuerpos irregulares (en medio enzimtico)
Prueba enzimtica con eritrocitos papanizados (ID-DiaCell I-II-III P)

131

60.
62.
62.
62.
63.
63.

Prueba en salino a 4C (ID-Cell I-II-III)

Identificacin de anticuerpos
Prueba enzimtica con eritrocitos papanizados ID-DiaPanel P)
Prueba salina a 4C (ID-DiaPanel)
Interpretacin de los resultados
Principios y consideraciones generales

67. Comportamiento serolgico e importancia clnica de los anticuerpos de

grupo sanguneo
72. Aloinmunizacin
75. Panel de antgenos eritrocitarios
76. Cmo interpretar los resultados de un panel eritrocitario?
81. Algoritmo de investigacin de anticuerpos irregulares
82. Algoritmo de identificacin de anticuerpos irregulares
83. Algoritmo del Test de Coombs
84. Formulario para remitir estudio especializado al Servicio Nacional de
Sangre
85. Caracteres de la muestra y condiciones de envo de las mismas para la
realizacin de estudios en inmunohematologa
88. Modelo de informe de estudio inmunohematolgico
89. Clculo de probabilidades
90. Pacientes aloinmunizados a mltiples antgenos
93. Tipificacin ABO Rh D
96. Clasificacin ABO-Rh en pacientes
99. Clasificacin ABO-Rh en recin nacidos
103.Clasificacin ABO-Rh en donantes de sangre
109. Determinacin de los fenotipos Rh y Kell
113. Estudio de una embarazada
117. Limitaciones en los procedimientos realizados en las tarjetas ID-Card
119. Protocolo de seguimiento inmunohematolgico de la gestacin
121. Algoritmo diagnstico de E.H.F.N. en el embarazo
123. Eplogo: Dra. Lourdes Viano.
124. Definiciones tiles
129. Bibliografa consultada
131. ndice

132

Libros, caminos y das dan al hombre sabidura.

Proverbio rabe.

Obra editada por cortesa de Saiden S.A.

Prohibida su venta.
Presidente Gral. Oscar Gestido 2582
Tel: 27078567 Fax: 27074318
Montevideo - Uruguay

Jorge Golffed
Reservados todos los derechos
Queda prohibida la reproduccin total o parcial por cualquier medio o
procedimiento, segn el artculo 23 de la Ley 15913 del 27/11/1987 sin la
autorizacin del titular del copyright.

ISBN 978-9974-99-524-6
Primera Edicin: julio de 2014

Diseo tapa CD: Melanie Lowinger

Traducciones : Natalie Golffed
Grabado en: Print Centro de Impresin
Miguelete 1881
www.print.com.uy

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