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Gnero Mycobacterium spp

FAVET-UFRGS
Prof. Marcos JP Gomes
2013

Gnero Mycobacterium spp


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Tuberculoses
Paratuberculoses

ATUALIDADE
Atualmente (2013), na List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature
do pesquisador J.P. Euzby h citao de 156 espcies e 13 subespcies no gnero
Clostridium spp, conforme o site www.bacterio.cict.fr/c/clostridium.html

INTRODUO
As

micobactrias

pertencem

ordem

Actinomycetales,

famlia

Mycobacteriaceae. O gnero Mycobacterium inclui:


1-O complexo M. tuberculosis;
2-O complexo M. avium;
3-Outras micobactrias e numerosas espcies saprfitas presentes no solo e na gua.
O complexo M. tuberculosis inclui M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M.
canettii, M. caprae, M. microti e M. pinnipedii.
O complexo M. avium inclui M. avium subsp avium, M. avium subsp hominissuis,
M. avium subsp paratuberculosis e M. intracellulare.
Outras micobactrias de importncia clnica so: M. chelonae, M. fortuitum, M.
kansasii, M. leprae, M. marinum, M. ulcerans e o M. scrofulaceum.
Muitas espcies foram includas a partir dos anos 2000. As ltimas espcies
includas foram: M. paraffinicum (Toney et al. 2010); M. paraseoulense (Lee et al. 2010);
Mycobacterium abscessus subsp abscessus (Leao et al. 2011); Mycobacterium abscessus
subsp bolletii (Leao et al. 2011); Mycobacterium algericum (Sahraoui et al. 2011);
Mycobacterium europaeum (Tortoli et al. 2011); Mycobacterium sherrisii (van Ingen et al.

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2011); Mycobacterium shinjukuense (Saito et al. 2011); Mycobacterium koreense (Kim et


al. 2012) e Mycobacterium litorale (Zhang et al. 2012);

HISTRICO

A tuberculose j era conhecida como causa de morte em algumas mmias egpcias


h 3.000 anos. Recentemente, foram detectadas evidencias de tuberculose pulmonar
incluindo a presena de bastonetes AAR em mmias no Peru datadas de 700 anos DC.
Hipcrates, Celsius e Galeno acreditavam na importncia do descanso e ar fresco
como sendo essenciais no tratamento da tuberculose.
Reconhecida como uma doena contagiosa na regio do Mediterrneo, durante o
sculo 16 e denominada como tsica as caractersticas anatmicas e patolgicas da
tuberculose foram relatadas no tratado Opera Medica de Silvius, em 1679 e foi seguida da
descrio de achados patolgicos da tuberculose miliar por Manget, em 1702. A natureza
da tuberculose da tuberculose foi suspeitada pelo mdico militar francs Jean-Antoine
Villemin no inicio de 1865 quando uma infeco semelhante tsica foi reproduzida com
sucesso em coelhos e cobaias que haviam sido inoculadas com leses suspeitas de
tuberculose.
Conhecida como praga branca, a tuberculose foi a principal de morte na Europa e
Estados Unidos no sculo 19, com uma taxa de mortalidade estimada em 400/100.000, em
1830, nos Estados Unidos.
Em 1873, o mdico Noruegus Gerhard Henrik Armauer Hansen identificou o agente
da responsvel pela lepra que posteriormente possua muita semelhana com bastonete da
tuberculose descoberto 9 anos depois pelo Robert Koch, que foi capaz de cultiva-lo em
meio de soro coagulado assim como visualiza-lo utilizando um mtodo de colorao
especial em 1882. Outro importante avano na pesquisa da tuberculose inclui a descoberta
da caracterstica AAR desses organismos e as caractersticas da colorao de Ziehl-Neelsen
(contribuio de Ehrlich, Ziehl e Neelsen); a diferenciao entre o bacilo avirio e bacilo
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humano realizado, em 1890, por Rivolta e Maffucci; descrio dos postulados de Koch;
preparao da tuberculina, em 1891 e a descrio do bacilo da tuberculose bovina por
Theobald Smith, em 1902.
A mortalidade de tuberculose diminuiu dramaticamente para 200/100.000 devido a
melhoria das condies sanitrias e sociais, melhoria da alimentao e nutrio e o uso de
sanatrios espalhados na Europa e Estados Unidos alem de terapia ativa baseada em
mtodos cirrgicos. A descoberta dos raios X tornou possvel o acompanhamento da
progresso da doena pela primeira vez.
Entre 1908 e 1920, Calmette e Gurin do Instituto Pasteur, na Frana, utilizaram um
meio de cultivo para atenuar a virulncia do M. bovis. Este trabalho proporcionou a base
para o desenvolvimento do bacilo da vacina de Calmette e Gurin ou BCG utilizada pela
primeira vez, em 1821 e ainda hoje utilizada. Outro marco importante foi a descoberta de
Waksman que em 1944 descobriu a estreptomicina um antimicrobiano que ainda utilizado
na quimioterapia da tuberculose. A subseqente descoberta de outras drogas
antimicobacterianas tais como o cido para aminosaliclicoem 1949 a isoniazida em 1952 e
a rifampicina em 1967 forneceram a base da quimioterapia contra a tuberculose em que 3 a
4 drogas so administradas por um perodo de 6 a 9 meses.

CARACTERSTICAS GERAIS
Bastonetes retos ou levemente curvos com 0,2 - 0,7m de dimetro e 1,0 - 10 m de
comprimento; podem possuir ramificaes; crescimento filamentoso ou miceliar que se
fragmenta em bastonetes ou cocos AAR em algum estgio do crescimento; Gram positivo
fraco; imvel; no esporulados; sem cpsulas; aerbios e quimiorganotrficos. Crescimento
lento ou muito lento; colnias visveis aps 2 - 20 dias em temperatura tima; colnias
geralmente rseas, laranjas ou amarelas, especialmente quando expostas luz; pigmento
no difuso; superfcie grosseira e rugosa; algumas espcies de difcil crescimento,
necessitando de meios especiais; outras no so cultivveis (M. leprae); catalase positivos;
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arilsulfatase positivo; lisozima resistente; amplamente distribudos no solo e gua; algumas


espcies so parasitas obrigatrios e patgenos de vertebrados.
O grupo contm um nico gnero Mycobacterium spp. So bastonetes finos;
lcool-cido-Resistentes (AAR); aerbios; crescimento lento, geralmente de vida livre ou
patgenos de vertebrados. As espcies de Mycobacterium podem ser confundidas com
outros gneros relacionados (Corynebacterium spp, Nocardia spp ou Rhodococcus spp).
A propriedade de AAR est relacionada grande quantidade de material lipdico da
parede celular, sendo importante na identificao das micobactrias. A tcnica de colorao
denominada Ziehl-Neelsen (ZN) deve ser cuidadosamente realizada, pois a colorao
facilmente se desfaz. As micobactrias so bactrias AAR, pois resistem ao efeito
descolorizante do lcool cido, quando coradas pela carbol-fucsina aquecida. Os
componentes lipdicos da parede celular representam mais de 60% do peso seco. A grande
concentrao de lipdios responsvel pela: hidrofobicidade das micobactrias em meio
lquido; crescimento lento; resistncia aos cidos, resistncia aos desinfetantes, resistncia
aos anticorpos e resistncia dissecao. A parede celular da micobactria rica em cido
miclico e outros lipdios complexos. Os cidos miclicos conferem a AAR. Os micosdios
so responsveis pela permeabilidade celular e esto relacionados com a resistncia s
enzimas solveis em gua; aos antimicrobianos e aos desinfetantes. O fator corda da parede
celular est relacionado com o crescimento colonial das bactrias virulentas.
As micobactrias so potentes adjuvantes, pois quando inoculadas com outros
antgenos estimulam a produo de anticorpos ao antgeno. Por exemplo, coelhos
inoculados somente com albumina bovina responderam somente para a produo de
anticorpo, mas quando inoculado com albumina bovina e micobactrias, ele desenvolveria
hipersensibilidade retardada albumina srica bovina.
As micobactrias requerem mtodos especiais para estudo, pois muitas crescem
lentamente; outras necessitam de meios especiais na diferenciao das espcies, sendo

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tarefa geralmente realizada por especialista. As espcies de crescimento rpido podem ser
identificadas com mais facilidade, enquanto que as de crescimento lento so mais difceis.
A distino entre as espcies com crescimento lento e rpido determinada pelos
seguintes critrios:
a) As espcies com crescimento lento requerem mais de sete dias em meios ricos
para produzir colnias, facilmente visveis de inculos diludos.
b) A espcie dita rpida evidencia crescimento em menos de sete dias. Certas
espcies so intermedirias quanto velocidade de crescimento.
Micobactrias devem ser manipuladas em cabinas de segurana para prevenir a
disseminao de patgenos ao homem. O material deve ser desinfetado pelo calor, pois as
micobactrias so resistentes aos desinfetantes qumicos.
As espcies saprfitas podem causar doena, em determinadas condies sendo
consideradas oportunistas. Outras podem causar infeco quando introduzidas em
ferimentos ou em animais tratados com imunossupressivos.

CLASSIFICAO DAS MICOBACTERIAS


A velocidade de crescimento das micobacterias lenta com o tempo de gerao
varivel, entre 2 a 20 horas. As micobactrias podem ser classificadas como micobacterias
de crescimento lento e as de crescimento rpido, tendo como base, o tempo de gerao. As
de crescimento lento requerem mais de 7 dias para formar colnias visveis em meio de
cultivo slido, enquanto que as de crescimento rpido formam colnias em at 7 dias. As
micobactrias podem tambm ser classificadas pela
1) Velocidade de crescimento e pigmentao e
2) Relao agente-hospedeiro.

Velocidade de crescimento e pigmentao, conforme Runyon em: Grupo I, Grupo


II, Grupo III e Grupo IV.
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Grupo I: Fotocromognicas possuem crescimento lento; produzem pigmento


amarelo, quando exposto luz, em 7 dias ou mais. Ex. M. ulcerans, M. marinum e M.
kansasii.
Grupo II: Escotocromognicas possuem crescimento lento; produzem pigmento
amarelo-alaranjado, na escurido. Exemplos M. scrofulaceum e M. xenopi.
Grupo III: No cromognicas e no fotocromognicas possuem crescimento lento;
No produzem pigmento ou pouco; Assemelham-se ao gnero Nocardia spp; Formam
colnias lisas; So resistentes isoniazida. Exemplos: M. bovis, complexo M. avium
Grupo IV: Pigmentao varivel. Crescimento rpido em menos de uma semana a
25 ou a 37 C. Exemplos M. fortuitum, M. phlei e M. smegmatis.

Relao Agente-Hospedeiro
a) Parasita intracelular obrigatrio (M. leprae e M. lepraemurium).
b) Parasita intracelular facultativo; Maioria das micobactrias patognicas est nesse
grupo; Principal clula que serve de hospedeiro para essas micobactrias so os
macrfagos; So parasitas do sistema fagoctico mononuclear (M. avium, M. bovis, M.
tuberculosis, M. fortuitum, M. marinum, M. ulcerans, M. kansasii, M. intracellulare, M.
scrofulaceum e M. fortuitum) na grande maioria das infeces iniciais.
c) Parasita saproftico (a maioria das espcies M. phlei, M. smegmatis, M.
butyricum, M. gordonae).
Tabela 1. Classificao clnica das micobactrias.
______________________________________________________________________________
Grupos

Exemplos

_______________________________________________________________________________
1. Patgeno Obrigatrio

M. tuberculosis, M. bovis, M. leprae, Map.

2. Patgeno cutneo

M. marinum, M. ulcerans.

3. Patgeno oportunista

M. kansasii, M. avium intracellulare, M. xenopi.

4. No ou raramente patgeno

M. gordonae, M. smegmatis.

5. Patgeno Animal

M. lepraemuriu, M.caprae M.pennipedi

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CARACTERISTICAS GERAIS DO GNERO


A tuberculose lidera o nmero de mortes no homem como causada por um nico
agente infeccioso. responsvel por mais de 2 milhes de mortes anuais. Ela causada
primariamente pelo M. tuberculosis. O M. africanum, M. bovis e M. canettii so
responsveis por menos de 1% das tuberculoses humanas. O M. bovis bem adaptado aos
bovinos. Entretanto, outras variantes do M. bovis adaptaram-se a outros hospedeiros tais
como o M. pinnipedii (adaptado aos pinpedes) e o M. caprae (adaptado aos caprinos). Uma
amostra de M. bovis foi atenuada pela passagem in vitro em rodelas de batata e
posteriormente, utilizadas como vacina humana de uso mundial, conhecida como BCG. O
M. africanum e o M. canettii so patgenos humanos. O M. microti foi isolado de roedores,
do homem e alguns outros animais.
As micobactrias saprfitas possuem propriedades morfotintoriais semelhantes s
patognicas e, os microbiologistas devem estar preparados e treinados na diferenciao das
espcies, atravs de tcnicas bacteriolgicas. A responsabilidade do laboratrio grande ao
isolar e identificar micobactrias de animais vivos ou de tecidos colhidos, durante a
necropsia. necessrio diferenciao entre as espcies patognicas e oportunistas.
As micobacterias patognicas produzem leses granulomatosas em muitas espcies
domsticas e silvestres, alem do homem.
Informaes definitivas sobre a patognese da tuberculose ainda no so totalmente
conhecidas, embora o bastonete da tuberculose tenha sido descoberto h mais de 129 anos
atrs. Existem diferenas inexplicveis na suscetibilidade entre os bastonetes AAR e as
diferentes espcies animais, apesar de todo o conhecimento.

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O M. tuberculosis produz doena generalizada e progressiva em primatas no


humanos, caninos, sunos e cobaias, mas bovinos e gatos so mais resistentes. O M.
tuberculosis induz sensibilidade cutnea em bovinos e outros animais.
O M. bovis, agente da tuberculose bovina, um organismo no fotocromognico
que causa doena em outros animais domsticos e silvestres, alem de relatos no homem em
muitos pases. Testes bioqumicos esto disponveis na diferenciao do complexo M.
tuberculosis, mas as tcnicas moleculares esto somente difundidas em laboratrios de
referncia do mundo.
O M. leprae, agente da lepra ou doena de Hansen, uma doena granulomatosa
crnica. Ela ainda considerada um problemas de sade pblica em pases da frica e
Sudeste Asitico, atingindo uma prevalncia de 1 caso a cada 10.000 indivduos. O M.
leprae e a lepra tm sido identificadas, em tatus, nos Estados Unidos. O M. lepraemurium
foi isolado e identificado em leses semelhantes lepra em gatos, ratos e camundongos.
O M. chelonei, M. intracellulare, M. marinum, M. nonchromogenicum e outras
micobactrias tem sido isoladas de leses granulomatosas em animais de sangue frio.
Espcies do complexo M. avium tem o maior nmero de hospedeiros entre todas as
micobactrias. O M. avium subsp avium (sorovares 1, 2, e 3) foi isolado em leso
tuberculosa nas aves, nos animais domsticos, nos animais silvestres e no homem. Nas
aves, a doena progressiva com leses no fgado e bao, enquanto que as leses nos
outros animais esto confinadas, geralmente aos linfonodos associados ao trato
gastrintestinal.
O M. avium subsp hominissuis a subespcie mais frequentemente causadora de
leses nos sunos e homem e o M. intracellulare causa leses granulomatosas,
principalmente em animais de sangue frio distribudos no ambiente. Coelhos so muito
suscetveis infeco experimental pelo M. avium subsp avium, mas relativamente
resistente ao M. intracellulare. As aves so suscetveis ao M. avium subsp avium, mas
resistentes s do complexo M. tuberculosis.
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O M. avium subsp paratuberculosis (Map) causa uma doena infecciosa, intestinal e


crnica conhecida como paratuberculose ou Doena de Johne (DJ) que tem impacto
econmico na pecuria. Bovinos, ovinos, caprinos, bubalinos e outros ruminantes silvestres
so suscetveis. Alem dessas espcies, existem dados que sugerem que o Map pode ser o
agente etiolgico da Doena de Crohn (DC), uma doena intestinal inflamatria do homem,
mas este assunto permanece controverso. Uma caracterstica til na diferenciao desse
organismo a sua depncia micobactina, um agente quelante do ferro e substncia
necessria no seu cultivo in vitro. A micobactina foi inicialmente extrada do M.
tuberculosis, mas logo substituida pelo M. phlei. Mais tarde, a micobactina J e certos
compostos de ligao ao ferro extracelular foram isolados do M. avium. Tcnicas
moleculares como a PCR e a anlise de restrio da endonuclease foram desenvolvidas para
identificar o Map.
M. ulcerans o agente etiolgico da lcera de Buruli, uma grave doena crnica
humana. Ela inicia como uma tumorao que ulcera sob uma base necrtica, podendo
atingir a gordura subcutnea. Ela ocorre principalmente na frica, Austrlia e Mxico. A
infeco por M. ulcerans resulta em necrose severa e persistente, sem uma resposta
inflamatria aguda. A presena de alteraes histopatolgicas distantes do local de infeco
sugere que a patognese da toxina pode ser mediada. Um policetdeo macroldeo chamado
micolactona foi isolada e identificada como citotxica e responsvel pela parada do ciclo
celular das clulas L929 (fibroblastos murinos). A inoculao intradrmica de toxina
purificada em cobaias produziu uma leso semelhante lcera de Buruli do homem. Essa
toxina pode representar apenas um dentre os fatores de virulncia associados s patologias
das doenas micobacterianas como a lepra e a tuberculose. Estudos apontaram que insetos
aquticos da famlia Naucoridae so vetores transmissores do M. ulcerans.
M. marinum um patgeno de peixes e, encontrado nas guas. A infeco pode ser
transmitida ao homem quando inoculado, atravs da pele, quando tanques de peixes
tropicais so limpos ou quando se banham em piscinas contaminadas. Ndulos cutneos
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podem ulcerar ou formar abscessos com difuso linftica local. O M. marinum causa
tuberculose em peixes e anfbios e leso cutnea granulomatosa no homem, doena
conhecida como granuloma de piscina.
Outras espcies de micobacterias tm sido isoladas de vrios animais. O M.
fortuitum, uma micobacteria no cromognica e de crescimento rpido tem sido isolada de
ces e do homem com leses pulmonares; de mastite bovina e de linfonodos de bovinos e
sunos, no matadouro. O M. chelonae, uma micobacteria de crescimento rpido foi isolada
de suinos e do homem.
O M. kansasii, uma micobactria fotocromognica e de crescimento lento, tem sido
isoladas de leses granulomatosas em sunos e bovinos, as quais se assemelham s leses
causadas pelo M. bovis. A infeco pulmonar com o M. kansasii tem incio em pacientes
com doena pulmonar previa ou doena pulmonar crnica. Produz uma doena que
semelhante tuberculose pulmonar, mas um pouco mais lenta. O organismo pode ser
isolado em suprimentos dgua.

FATORES DE VIRULENCIA
Antigamente, na maioria dos livros didticos sobre o assunto, se dizia no haver
fator de virulncia produzido por micobactrias patognicas. No havia endotoxinas,
exotoxinas, enzimas extracelulares, hemolisinas, leucocidinas mesmo quando o fator corda
estivesse associado ao crescimento de bactrias virulentas.
Recentemente, muito progresso foi obtido na compreenso da patogenia e dos
fatores de virulncia associados s infeces causadas por micobactrias, especialmente na
aplicao de ferramentas moleculares, tais como o sequenciamento completo do genoma e
sua anlise comparativa. A cincia genmica tornou possvel elucidar o mapa gentico de
vrias micobactrias importantes (animais homem e ambiente). Sequncias genmicas
completas esto disponveis para o M. abscessus, M. avium subsp hominissuis, M. avium
subsp paratuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. gilvum, M. leprae, M. marinum, M.
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smegmatis, tres linhagens do M. tuberculosis, M. ulcerans, M. vanbaalenii e quatro


micobactrias no classificadas como espcie. Esses genomas possuem alto contedo de
GC ( 65%).
A cepa K-10 do Map foi isolada de uma vaca com paratuberculose e seu
sequenciamento concludo e publicado em 2005. Esta linhagem possua um baixo nmero
de passagens in vitro e o sistema gentico inclua transposon de mutagenese disponvel
para a criao de cepas mutantes. O genoma da K-10 um cromossomo circular com
aproximadamente 4,8 Mb e 4.344 open reading frames (ORFs) com 69,3% de GC.
Aproximadamente 60% dos ORFs possuem homlogo conhecido na base de dados,
enquanto que 25 % codificam produo de protenas de funes ainda desconhecidas.
Aproximadamente, 75% dos genes do Map tm contrapartida no M. tuberculosis.
Entretanto, a maioria deles, no possui homologia com o M. avium subsp hominissuis,
existindo provavelmente 39 protenas que so nicas no Map. Os ORFs so identificados
pelo nmero de locao seguindo o padro de convenes, por exemplo, o Map 1152
significa ORF1152 do ORF0001-DnaA- no sentido horrio. O genoma possui alta
redundncia por causa da duplicao gnica, especialmente, para aqueles genes envolvidos
no metabolismo dos lipdios e no metabolismo redox. Alem disso, o gene da salicil-MP
ligase (mbtA) truncado, o que provavelmente justifique o seu defeito na biosntese da
micobactina. A anlise do polimorfismo gentico, especialmente aquelas, incluindo grandes
sequncias indicaram que o Map originou do M. avium subsp hominissuis num processo
evolucionrio bifsico. Primeiro, um clone original patognico do Map surgiu pela
aquisio de um novo DNA tornando-se polimrfico. Segundo, as cepas de bovinos e
ovinos descendendes desse clone ancestral evoluiram pela subseqente deleo linhagemespecfica.
O seqenciamento genmico do M. bovis relizado em 2003, revelando um genoma
com 4.345.492 bp da cepa bovina virulenta AF2122/97; uma verso menor do genoma do
M. tuberculosis (4.411.532 bp do isolado humano H37Rv), possui mais de 99,95% de
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identidade e nenhum material gentico novo quando comparado ao M. tuberculosis. As


delees no M. bovis so as principais contribuies a essas diferenas que podem ser
encontradas afetando os genes envolvidos no transporte, na estrutura da superfcie celular e
no metabolismo intermedirio. Essas delees podem remover genes que modificam a
adaptao a um hospedeiro diferente ou a muitos. O ponto de mutao tem um papel
importante na definio do fentipo como o caso da resistncia pirazinamida. As
variaes seqenciais tm sido encontradas em genes que codificam protenas da parede
celular e protenas secretoras, tais com as famlias de protenas PE_PGRS e PPE. Outra
mudana a mutao no gene da piruvato quinase do M. bovis que o tornou incapaz de
utilizar o glicerol como fonte de carbono. Outras mudanas nas sequncias envolveram os
genes mestres na expresso de famlias de genes mltiplos. A anlise do genoma do M.
bovis desafiou a hiptese epidemiolgica de que o M. tuberculosis era uma variante
humana adaptada do M. bovis adquirida de bovinos. A perda irreversvel do ADN do M
bovis foi detectada pela anlise sistemtica e pelo seqenciamento do polimorfismo num
grande nmero de cepas levaram ao novo paradigma de que o M. canettii seria espcie
ancestral provvel do complexo M. tuberculosis. Sucessivas delees do ADN, comeando
pela perda da regio RD9 (RD = regions of difference) levaram a diferenciao do M.
africanum, M. bovis e do M. microti. A cepa do M. bovis BCG sofreu delees posteriores
com a perda da RD1, implicada como mecanismo de atenuao da virulncia ocorrida
durante sua adaptao laboratorial in vitro. A evoluo dos genomas das micobacterias
envolve um processo de delees redutivas semelhana como ocorreu com o Map. Os
estudos genmicos comparativos so mostrados no diagrama do processo genmico
evolutivo das principais micobactrias na Fig.1 abaixo.

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Figura 1. Proposta Evolucionria do complexo M. tuberculosis e do complexo M. avium


Complexo M. tuberculosis
------------------------------------------------------------------------------M. canettii

M. tuberculosis

(homens)

(homens)

M. africanum
(homens)

-------------------------------------------------------------------M. microti

M. bovis

M. pinnipedi M. caprae

(roedores)

(rumin homens)

(penpedes) (caprinos)

_________________________________________________________________________
Complexo M. avium
---------------------------------------------------------------------------------Ma hominissuis

M.a. avium

(homens; suno; rum)

(aves)

M. intracellulare

------------Map Doena de Crohn

Linhagens Bovinas

Ovinas

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(aves; homens)

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O sequenciamento de micobactrias evoluiu em paralelo aos sistemas genticos


utilizados para criar mutantes definidos e assim elucidar a funo de cada gene na
patofisiologia das micobacterioses. Plasmdios e micobacterifagos so amplamente
utilizados na construo de cepas mutantes e recombinantes, utilizando todos os meios de
troca gentica, incluindo transformao, transduo e conjugao. Uma variedade de genes
reprteres tem sido expressa em algumas micobactrias, incluindo a beta-galactosidase, a
luciferase de vagalume e a protena fluorescente verde. Alm disso, vrios vetores para a
expresso condicional ou expresso anti-senso j esto disponveis. Micobacterifagos so
particularmente teis na criao de mutaes definidas em muitas espcies desse gnero,
incluindo a recente aplicao dessa tecnologia ao Map uma das espcies de crescimento
mais lento dentre as micobacterias. Finalmente, a tecnologia de mutao por
Transposition-site-hybridization (TraSH) tem sido desenvolvidas para definir genes
essenciais sob qualquer condio desejada.
Vrias estratgias foram e esto sendo aplicadas na descoberta de determinantes de
virulncia ou antgenos de importncia diagnstica nos genomas das micobactrias. Uma
delas procura identificar genes homlogos do Map em outras micobactrias, principalmente
no M. tuberculosis, os quais tm sido apontados como determinantes da virulncia. Uma
tirosina fosfatase capaz de interferir na ativao de macrfagos foi identificada no
Map1985 e cujo homlogo no M. tuberculosis o Rv2232. A secreo dessa tirosina
fosfatase (Map-PtpA) dentro do citoplasma do macrfago sugere que esta protena media a
interao entre substrato(s) celular (es) do hospedeiro, interferindo na via de eliminao da
bactria engolfada. Esta interferncia, em parte, pode estar associada com a capacidade do
patgeno em sobreviver dentro do macrfago. H muita curiosidade na identificao de
substratos do hospedeiro capazes de elucidar como a via de transduo do hospedeiro
bloqueada pela atividade da Map-PtpA e capaz de promover a sobrevivncia. As
abordagens gnicas comparativa com outras micobactrias seqenciadas identificaram no
Map um conjunto de 39 genes nicos, os quais codificam protenas especficas para o
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diagnstico laboratorial do Map. A triagem de uma coleo de transposons do M. avium


subsp hominissuis levou identificao de uma ilha de patogenicidade que carreia
determinantes de virulncia envolvidos nos processos de fagocitose bacteriana pelos
macrfagos. Hibridao genmica comparativa identificou ilhas no genoma do Map
diferentes do M. avium subsp hominissuis.
Outra abordagem tem sido com os transposons mutantes. Um desses estudos
sequenciou diretamente os transposons mutantes da cepa ATCC 19698 e os classificou em
grupos funcionais. Baseados na anlise bioinformtica, 11 mutantes foram selecionados e
utilizados em experimentos de virulncia em camundongos, na tentativa de determinar seu
papel na patogenia. Esta anlise permitiu a identificao dos genes: gcpE, pstA, kdpC,
papA2, impA, umaA1 e fabG2_2.
Uma abordagem molecular recente utilizado na identificao determinantes de
virulncia envolve anlise transcripcional e mutagenese Transposition-site-hybridization
(TraSH).

RESISTNCIA
No Brasil, o Ministrio da Sade, em seu manual sobre tuberculose (1994) instituiu
um protocolo padro de procedimentos para o diagnstico da tuberculose, ressaltando que a
resistncia s drogas antituberculosas tm oscilado entre 10 - 15% das amostras testadas. O
trabalho conjunto das diversas instituies envolvidas com epidemiologia da tuberculose no
Brasil resultou em pesquisa do gene de expresso da catalase (KatG) em cepas de M.
tuberculosis-MRD (resistentes a mltiplas drogas); resistncia estreptomicina (genes rpsL
e rrs), rifampicina (gene rpoB) e isoniazida (gene KatG e inhA). A resistncia a
pirazinamida caracterstica do M. bovis por mutaes do gene pncA e OxiR, enquanto a
resistncia estreptomicina, geralmente est associada reduo da associao do rRNA
16S e a protena S12 ribossomal.

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O mtodo de rotina para avaliar resistncia de amostras de micobactrias mais


utilizado tem sido: O mtodo da concentrao absoluta ou concentrao inibitria mnima
(MIC) e o mtodo das propores.
No mtodo das propores, as diluies da cultura recente do complexo M.
tuberculosis so semeadas em meio de cultura com concentrao fixa da droga (0,2 g /
mL de meio de cultura) e avaliadas quanto proporo de desenvolvimento de colnias
resistentes frente a diluies da mesma cultura em meio de cultura sem droga. O mtodo de
MIC utiliza concentrao fixa de micobactrias e concentraes variadas de droga.

DIAGNSTICO CLNICO E LABORATORIAL


O diagnstico clnico tem como base: a anamnese, a apresentao e sinais clnicos.
O diagnstico laboratorial pode ser realizado, atravs da necropsia. A colheita de amostra
suspeita deve ser com coradas pelo Ziehl-Neelsen (ZN).
A confirmao laboratorial importante pelas implicaes em sade pblica. O
cultivo, o isolamento e a identificao so as tcnicas diagnsticas aplicadas. A tipificao
da amostra como M. bovis tem como base sua sensibilidade hidrazida, pirazinamida,
cicloserina e preferncia de crescimento. O diagnstico do agente contempla o uso de
ferramentas moleculares, tais como: seqenciamento de cidos nuclicos; cromatografia de
alta eficincia; cromatografia de camada delgada; PCR; RFLP; alise de oligonucleotdeos
entre seqncias repetitivas diretas (spoligotyping) entre outras, conforme Tab.1 abaixo

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Tabela 1 Caractersticas diferenciais entre espcies do complexo M. tuberculosis


Caractersticas comuns: a) Caract. Positivas: presena das sequncias gnicas IS6110, IS1081 e MPB70
b) Caract Negativas: pigmentao das colnias, catalase termoestvel, arilsulfatase (no estudado no M.
pinnipedii), crescimento na presena de 500 g/mL de p-nitrobenzoato (caract. no estudado no M.
pinnipedii), crescimento na presena de 5% de NaCl (caract. no estudado no M. pinnipedii), crescimento a
45 C.
Caract diferenciais

M. africanum

M. bovis*

M. caprae

M. microti

M. pinnipedii

M. tuberculosis

Presena sequncia
gentica mtp40

Cdon 57 do gene
pncA (amino cido)

CAC
(histidina)

GAC
(cido
asprtico)

CAC
(histidina)

CAC
(histidina)

CAC
(histidina)

CAC
(histidina)

Cdon 463 do gene


katG (amino cido)

CTG
(leucina)

CTG
(leucina)

CTG
(leucina)

CTG
(leucina)

CTG
(leucina)

CGG ou CTG
(arginina ou
leucina)

Cdon 95 do gene
gyrA (amino cido)

ACC
(treonina)

ACC
(treonina)

ACC
(treonina)

ACC
(treonina)

ACC
(treonina)

AGC ou ACC
(serina ou treonina)

Cdon 756 do gene


gyrB

Base em posio
285 do gene oxyR

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Caract diferenciais

M. africanum

M. bovis*

M. caprae

Caract. dos
spoligotipos

Presena de ao
menos um
desses
espaadores
39-43

Ausncia de
espaadores
3, 9, 16 e 3943

Ausncia de
espaadores
1, 3-16, 3033 e 39-43

Disgnica

Disgnica

Excreo do
antgeno MPB70**
Aspecto das
colnias
Tipo respiratrio

Microaerfilo

M. microti

M. pinnipedii

Biovar
Ausncia dos
ratazanas:
espaadores
39-43.
presena
somente
espaadores Existncia de
4 spoligotipos
37 e 38
diferentes.
Biovar
Lhama
presena dos
espaadores
37, 38, 26,
24, 23 e
07/05.
-

Disgnica

M. tuberculosis
Presena de ao
menos um desses
espaadores 39-43

Disgnica

Eugnica

Microaerfilo Microaerfilo

Aerbio

Niacina

Geral -

Reduo de nitratos

Fosfatase cida

Hidrlise do Tween
80

+ (fraco)

Caract diferenciais

M. africanum

M. bovis*

M. caprae

M. microti

M. pinnipedii

M. tuberculosis

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Caract diferenciais

M. africanum

M. bovis*

M. caprae

M. microti

M. pinnipedii

M. tuberculosis

Cresc. presena de
1 g/mL de
TCH***

+****

-*****

Cresc. presena de
50 ou de 100
g/mL de
pirazinamida

Cresc. presena de
500 g/mL
hidroxilamina

Cresc. presena de
0,2 % de cido
pcrico

Cresc. presena de
250 g/mL de cido
olico

Crescimento 25 C

Crescimento 30 C

Caract diferenciais

M. africanum

- (33 C)

M. bovis*

M. caprae

M. pinnipedii

M. tuberculosis

M. microti

* Niemann et al. mostraram que as cepas de Mycobacterium bovis sensveis pirazinamida e um


spoligotipo original (ausncia de espaadores 3 a 16 e 18 a 43). Estas estirpes podem representar
subespcie do Mycobacterium bovis, uma nova espcie do Complexo Mycobacterium
tuberculosis". No entanto, para Aranaz et al. 2003, estas estirpes pertencem a espcie
Mycobacterium caprae. **: Deteco por ensaio imunoenzimtico (ELISA). *** : TCH = hidrazida
do cido tiofeno-2-carboxlico. **** : Mycobacterium caprae resistente a 1 e 2 g de TCH mL-1,
mas sensvel a 5 e a 10 g de TCH mL-1. ***** : As Cepas isoladas da Nova Zelndia resistem a 1
g/mL de THC, mas so sensveis a 10 g/mL de THC.

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Mycobacterium bovis
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Tuberculose Animais
Tuberculose Bovina

AGENTE.
O M. bovis o agente da tuberculose em bovinos, sunos, felinos, eqinos, primatas,
caninos, ovinos e caprinos. No acomete as aves.

MORFOLOGIA E COLORAO.
O M. bovis so bastonetes curtos; gordos em esfregaos de tecidos; so maiores e
mais finos, em meio lquido; cora-se em vermelho pelo Ziehl-Neelsen (A.A.R.).

CARACTERSTICAS CULTURAIS E BIOQUMICAS


Os meios de cultivo mais utilizados so: Dorset, Coletsos e Stonebrinks os quais
incorporam gema de ovo, tampo fosfato, sal de magnsio, piruvato de sdio e
ocasionalmente, aminocidos. O glicerol omitido por ser um inibidor desta micobactria.
Os cultivos requerem aproximadamente 3 a 4 semanas em incubao a 37C antes das
colnias se tornarem visveis.
No meio lquido, o crescimento restrito superfcie a menos que o detergente
aninico seja incorporado ao meio (Tween 80).
O M. bovis estritamente aerbio, com crescimento timo a 37 C; no cresce a 25
C; no reduz o nitrato; resistente pirazinamida; no reduz niacina e sensvel a hidrazida.
A tuberculoprotena (tuberculina) uma protena liberada no meio de cultivo, pelo M. bovis
e ativa em reaes de hipersensibilidade do tipo retardada (Tipo IV).
Animais sensibilizados ao M. bovis evidenciam uma reao cutnea quando
inoculados com a tuberculoproteina, arma importante no combate desta infeco.
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RESISTNCIA
Destrudo pela luz solar, mas resiste bastante dissecao, ao cido e ao bsico.

PREJUZOS ECONMICOS
As perdas econmicas determinadas pela tuberculose incluem a morte e reduo de
10-20% na eficincia produtiva (infertilidade e condenao de carcaas).
Na Argentina, calcula-se um decrscimo em 18% na produo de vacas (leite)
quando comparadas com animais sadios. Alem disso, o leite e a carne originrios de pases
onde h tuberculose bovina no podem ser exportados para pases onde ela controlada,
causando prejuzos economia nacional pela menor cotao do produto e perda de mercado
para as exportaes.

EPIDEMIOLOGIA
Os dados da situao no Brasil no perodo de 1989 e 1998 esto no PNCEBT
(2001), indicando oficialmente uma prevalncia de 1,3% de animais infectados. Nesta
mesma publicao a epidemiologia da tuberculose bovina desperta maior ateno quando
verificamos que, no Estado de Minas Gerais, maior produtor de leite no pas, propriedades
produtoras de leite tecnificadas registraram prevalncias de 15% das propriedades com pelo
menos um animal positivo para o teste intradrmico. Os dados sugerem que h risco de
infeco direta para a populao humana numericamente significativa quer sejam
trabalhador rural da indstria de carnes ou veterinrios.
Na Provncia de Santa F, constatou-se entre 1984 e 1998, percentagens de infeco
por M. bovis de 2,4% e 6,2% entre os casos de tuberculose humana do perodo, destacando
a infeco de trabalhadores ligados s atividades que envolvem trabalho com bovinos e
seus derivados (Zanini, 2002).

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ETIOPATOGENIA
A principal via de transmisso aergena, embora seja possvel a transmisso
atravs do leite, congnita e sexual. Tradicionalmente, bovinos leiteiros possuem uma taxa
de infeco maior que os bovinos de corte. O homem infectado pode albergar os
microrganismos em leses pulmonares abertas, podendo ser fonte de infeco para bovinos.
Bezerros podem ser infectados intrauterinamente ou pelo leite de vacas com infeco no
bere. H isolamentos do M. bovis do prepcio, sugerindo que a transmisso venrea seja
possvel, em bovinos. O M. bovis no elabora toxina ou outro fator de virulncia celular,
embora o "fator corda" esteja presente em cepas virulentas e no presentes em cepas
avirulentas. Seu papel sobre a virulncia no compreendido, mas se acredita que tenha
importncia na estimulao da resposta granulomatosa.
Inalao; as bactrias so depositadas nos sacos alveolares Ingesto

macrfagos alveolares Multiplicao lenta que mata o macrfago Reingerido


pelo macrfago hemtico (moncito) Resposta inflamatria no local primrio da
infeco Escapam so filtrados por linfonodos regionais Multiplicao
intracelular Vasos linfticos eferentes Corrente circulatria
Disseminao da doena.
O M. bovis pode sobreviver e multiplicar-se em macrfagos, no permitindo a fuso
do lisossomo com o fagossoma, evitando a digesto intracelular e morte.
A leso primria das micobactrias o granuloma, o qual detectado nos tecidos
afetados e linfonodos. Ele constitudo por um ncleo de macrfagos infectados,
macrfagos-derivados de clulas gigantes rodeados por clulas T, clulas B, neutrfilos e
tecido fibrtico. A estrutura granulomatosa impede que as micobactrias se espalhem para
outras reas, mas tambm oferece um nicho onde a bacteria fica protegida do sistema
imune. As micobactrias podem permanecer em quiescncia por muitos anos enquanto que
o granuloma aparece como uma estrutura dinmica onde o equilbrio de citocinas parece ser
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importante no controle da infeco. Na maioria dos casos, a micobactria est contida


dentro do granuloma e a infeco est sob controle, sendo chamada de "tuberculose
latente", no homem. Se a latncia uma caracterstica de animais infectados com o M.
bovis, ela ainda uma questo aberta. Existem animais que apresentam teste cutneo e/ou
-IFN positivo, mas nenhuma leso detectada, e isso pode refletir a latncia. Alm disso,
durante o programa australiano de erradicao da tuberculose, os animais previamente
negativos desenvolveram a infeco muitos anos aps o rebanho ser declarado livre de
tuberculose. Esses animais poderiam representar a possivel fonte de re-infeco com a
reativao da latncia ou de uma infeco crnica e muito lenta. O mecanismo exato pelo
qual alguns indivduos perdem o controle do foco primrio no claro, mas fundamental
para a compreenso das infeces por micobactrias. provvel que haja muitas e
complexas interaes, especialmente muitas formas de imunosupresso possam levar a
progresso da doena. Este fato pode ser ilustrado na infeco pelo HIV, no homem, onde
uma queda nos nveis de clulas T CD4 + resulta na reativao da tuberculose. A reativao
da tuberculose em pessoas idosas sugere uma resposta imunolgica menos eficiente,
podendo levar perda do controle da infeco dormente.

LESES
Tubrculos so agregados de macrfagos, linfcitos e outros leuccitos que so
formados no local primrio da infeco, no linfonodo regional e nos locais secundrios e
metastticos. Macroscopicamente, a leso translcida e semelhante a uma prola. Mais
tarde, as leses crescem, havendo necrose central de aparncia amarelo-esbranquiada.
Logo aps, surgem as clulas de Langhans, que so macrfagos que se fusionam ou
multiplicam continuamente, sem diviso do citoplasma. O citoplasma destas clulas claro
e o seu ncleo (2 a 10) arranjado em forma de crculos crescentes. Os bastonetes so
vistos dentro destas clulas. medida que a massa cresce, o centro necrtico torna-se
maior e mais clulas gigantes so observadas, em volta do processo granulomatoso. As
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massas tuberculosas antigas podem envolver o lobo pulmonar inteiro e grandes reas do
fgado, bao e linfonodos (20X o tamanho normal). A poro central consiste de um
material seco e semelhante a queijo leses caseosas em que h depsito de clcio,
produzindo um barulho caracterstico ao corte. As leses so envolvidas por um tecido
conetivo denso.
Leses nos bovinos: linfonodos bronquiais, mediastnicos, submaxilares e
retrofarngeos.
Leso ativa: So aquelas em que h evidncia de hiperemia, nas reas de leso
caseosa.
Leso inativa: So aquelas reas em que h leso calcria e muito encapsulada. Os
bastonetes so de difcil visualizao pela microscopia, mas o cultivo e a inoculao em
cobaia so positivos.
Pleurite tuberculosa e peritonite tuberculosa so freqentes em reas endmicas. As
massas so semelhantes a uvas, revestindo as serosas. Geralmente, o tecido pulmonar no
afetado. Em reas onde h grande ocorrncia de tuberculose, a doena causa adeso dos
pulmes parede torcica, sendo o tecido to forte que os pulmes s podem ser removidos
da cavidade pelo corte. Os rgos menos envolvidos so: fgado, bao e linfonodos
mesentricos.
A infeco do bere constatada em menos de 1% das vacas com pleurite ou
peritonite tuberculosa. Quando h envolvimento, os bastonetes podem ser detectados nos
ductos lactferos e o leite conter um grande nmero de bastonetes. Bezerros alimentados
com leite infectado podem desenvolver a doena (leso 1) na cavidade abdominal e
torcica.
A leso nos sunos pode ser progressiva e as leses mais freqentes so nos
linfonodos da cabea, pescoo e abdmen, acompanhando a porta de entrada da infeco.

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A leso de tuberculose nos eqinos est localizada na regio farngea, mesentrica,


pulmonar, fgado e bao. A leso bastante semelhante com neoplasia e evidenciam
necrose caseosa.
A leso nos ovinos e caprinos principalmente pulmonar. A doena progressiva
s nos jovens.
Gatos so altamente suscetveis ao M. bovis, contraindo a tuberculose pela ingesto
de leite "in natura" de vacas tuberculosas ou comendo carne contaminada. A leso primria
ocorre nos rgos abdominais e secundariamente no pulmo, muito semelhante ao
linfossarcoma felino (neoplasia).

IMUNIDADE
O resultado das infeces por micobactrias dependente de uma complexa
interao entre as bactrias invasoras e a resposta imune do hospedeiro. A resposta imune
tem sido extensivamente estudada nas infeces do complexo M. tuberculosis utilizando o
modelo murino ou em cobaias.
Aps a infeco ocorre uma interao entre a resposta inata, atraves dos macrfagos
e as micobactrias, desencadeando uma srie de eventos decorrentes desse encontro. Os
bastonetes podem ser mortos e eliminados; podem permanecer quiescentes; podem ativar o
desenvolvimento ativo da tuberculose ou reativar a dormencia em algum momento do
futuro. Recentemente, foi demonstrado que espcies do gnero Mycobacterium formam
esporos (Ghosh et al 2009, entretanto o papel dessa estrutura no foi ainda elucidado.
O M. bovis provoca uma reao de hipersensibilidade retardada e o reconhecimento
de clulas T aos antgenos desse agente a principal resposta imune para a tuberculose.
A reao alrgica tida como indicadora da resposta immune em consequencia da
infeco ou doena de diferentes micobactrias.
Pollock e Neill, em 2002, mensurou o papel das clulas B, relatando que estas
clulas induziu resposta humoral somente em estgios avanados da tuberculose bovina.
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Welsh, em 2005, documentou a passagem da resposta celular para a respsota humoral nos
animais tuberculosos. Inicialmente, os animais desenvolveram uma forte resposta celular,
mas com a progresso da doena, a resposta celular diminui enquanto que a resposta
humoral aumenta com a produo de IgG1. A resposta humoral no parece ser capaz de
controlar a infeco; a progresso da patologia e a aumento da eliminao do agente.
Waters e colaboradores, em 2006, relataram que em bovinos experimentalmente
infectados h uma produo de anticorpos precoce com produo de anticorpos especficos
IgM e IgG. A progresso da doena pode explicar a Anergia em alguns animais infectados
aos testes baseados na resposta celular. A ausncia da resposta celular nos animais
infectados ocorre quando a eliminao bacteriana grande.
Denis e colaboradores, em 2007, postularam que os bovinos anrgicos pertencem a
um grupo de animais em que esses componentes antinflamatrios so recrutados,
prevenindo a expresso de marcadores da imunidade da tuberculose, atravs da resposta
PPD. Dados recentes obtidos na tuberculose bovina sugerem que h uma liberao de IL-10
associado com a progresso da doena e relacionando o envolvimento da IL-10 na anergia
PPD. A perda de resposta PPD pode estar ligada ao aumento da ativao de moncitos e
macrfagos, especialmente na liberao de substancias oxidantes ou prostaglandinas
reduzindo a proliferao de linfcitos T e liberao de citocinas.
Informaes considerveis esto disponveis e teorias bem documentadas na
interao entre o agente e o sistema imune do hospedeiro infectado tm sido propostas. No
entanto, quando se aplicam essas hipteses obtidas em camundongos puros para o ser
humano no consanguineo ou bovinos, o resultado mais complexo.
A dificuldade em dissecar o papel individual do tipo celular e de citocinas so, em
parte, devido redundncia do sistema imunolgico. A sobreposio de funes dos
componentes do sistema imune , provavelmente, uma grande vantagem para o hospedeiro
contra as infeces por micobactrias e, na maioria dos indivduos infectados, o hospedeiro
ganha a batalha. No entanto, provvel que haja tambm redundncia e complexidade nos
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fatores envolvidos na virulncia de bactrias, tornando a compreenso da relao ntima


entre agente-hospedeiro fascinante.
Aps quatro (3 - 6) semanas da infeco, h o desenvolvimento da resposta mediada
por clulas, resultando no aumento da morte intracelular. A difuso da infeco no
organismo reduzida ou suspensa. Algumas vezes, os microrganismos da leso primria e
dos linfonodos regionais so completamente eliminados. H ativao dos macrfagos por
meio de linfocinas liberadas pelos linfcitos sensibilizados pelos antgenos do M. bovis. A
atividade bactericida dos macrfagos no especfica e pode ser expresso contra outras
bactrias intracelulares. H evidncia de produo de linfocina especfica contra o M. bovis,
inibindo a multiplicao intracelular deste microrganismo. As linfocinas de linfcitos T
sensibilizados so tambm responsveis pelo processo de necrose caseosa observadas
dentro dos tubrculos. A imunidade protetora, geralmente no elimina todos os organismos
dos tecidos, havendo sempre o risco de futura reativao da infeco ou convivncia com o
agente (portador).
Os linfcitos T permanecem sensibilizados pelo resto da vida e a re-infeco resulta
numa rpida ativao de macrfagos e destruio dos bastonetes invasores, efeito
conhecido como fenmeno de KOCH.
Os anticorpos formados durante a infeco podem ser mensurados por meio de
testes sorolgicos, incluindo precipitao, fixao do complemento, ELISA e
hemaglutinao. Os anticorpos sricos esto diminudos, nos animais tuberculosos; no
estando associado com a resistncia do indivduo. Alguns animais no possuem uma
resposta protetora efetiva, desenvolvendo uma tuberculose generalizada com debilitamento
(caquexia) e morte. A inoculao em animais experimentais importante como mostra o
quadro 1.

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Quadro 1. Prova Biolgica (Experimental) das micobactrias

__________________________________________________________________________
Espcie(s)

cobaia

coelho

ave

__________________________________________________________________________

M. tuberculosis

M. bovis

M. avium

CONTROLE
As doenas micobacterianas so normalmente progressivas e com um grande
nmero de animais subclinicamente infectados. A identificao desses animais difcil,
com os testes diagnsticos disponveis. O agente pode sobreviver no ambiente e muitas
espcies de animais silvestres podem ser infectadas. Estes fatores fazem da tuberculose
bovina e da paratuberculose um grande desafio no seu controle. A maioria dos pases
desenvolvidos tem programas de controle da tuberculose bovina, devido ao risco zoontico
que representa o M. bovis. Estes programas esto geralmente baseados no teste-e-abate e
restrio de circulao de animais.
O teste utilizado o teste alrgico intradrmico, em que o derivado protico
purificado (PPD) do M. bovis inoculado intradermicamente e posteriormente 72h +/- 6h
so mensuradas em mm, o aumento diferencial da espessura da pele como um ndice de
infeco. Apesar desses programas de controle, vrios pases no conseguiram erradicar a
tuberculose bovina. Isto particularmente verdadeiro para os pases que possuem um
reservatrio de vida selvagem, como o Reino Unido, Irlanda e Nova Zelndia. O M. bovis e
Map podem infectar uma grande variedade de animais domsticos e silvestres. At que
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ponto a vida selvagem constitui uma ameaa para os animais domsticos depende da
habilidade da espcie para atuar como hospedeiro de manuteno ou como hospedeito de
passagem. No hospedeiro de manuteno, a infeco pode persistir pela transmisso intraespcies sozinha, enquanto que no hospedeiro de passagem, a infeco no persiste
indefinidamente a menos que haja reinfeco de outro hospedeiro. importante focalizar
nos animais silvestres para controlar a infeco nos animais domsticos. As espcies que
so importantes para a disseminao da tuberculose bovina so os texugos (Meles meles) no
Reino Unido e na Irlanda; o gamb rabo-de-pincel (Trichosurus vulpecula), na Nova
Zelndia e os cervos de cauda branca (Odocoileus virginianus), em Michigan. O Map tem
sido isolado de uma vasta gama de espcies e com maior freqncia de veados e coelhos. A
paratuberculose em criao de cervos e nas reservas de veados prevalente em algumas
reas, parecendo claro que os animais podem manter a infeco em populaes com alta
densidade. No entanto, o significado dos cervos selvagens e outros animais selvagens para
a continuao ou a propagao de paratuberculose em animais no est clara.
Uma alternativa na estratgia da reduo da propagao da tuberculose a
vacinao dos animais silvestres. Essas vacinas injectveis so a melhor opo, mas no
uma alternativa realista para outros animais domsticos, exceto nos ensaios de pesquisa. A
BCG, uma vacina oral contra Tb humana, formulada com liberao lipdica reduziu a
gravidade da doena em um modelo animal com desafio, atraves de aerossis. A resposta
parcial obtida pode levar a uma reduo na excreo de bactrias e, consequentemente,
diminuiu a disseminao da infeco para os animais. A vacinao dos animais silvestres
em conjunto com melhorias no manejo quando complementadas com os programas de
controle atuais pode reduzir a transmisso e controlar a tuberculose nos bovinos. Outra
causa para a propagao da infeco por micobactrias o comrcio de animais.
O perodo de incubao longo e a progresso lenta da doena juntamente com testes
com qualidade inferior tornam dificil identificao de todos os infectados.
Consequentemente, sempre haver risco na compra animais de um rebanho com histrico
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de infeco. difcil quantificar a da disseminao da tuberculose, especialmente se ela foi


causada pelo trnsito de animais; se pela infeco pelos animais silvestres ou pela
sobrevivencia do agente no ambiente.
O diagnstico "in vivo" est baseado na reao de hipersensibilidade retardada
quando da inoculao intradrmica de tuberculina (derivada do M. bovis). A tuberculina
PPD bovina com princpio ativo de tubrculo-protena obtida, atravs de cultura de
amostra AN5 do M. bovis, em meio de Dorset e Henley modificado cuja concentrao
protica e sua potncia so aferidas por testes qumicos e biolgicos. A aplicao
intradrmica na derme da regio cervical ou na regio escapular, ao lado da crista
acromiana da omoplata. Determina-se o local da inoculao pelo corte dos plos
(tricotomia) em rea de um quadrado com quatro cm de lado. Antes da inoculao mede-se
a espessura da derme com um cutmetro de presso. Aps a inoculao, deve ocorrer a
formao de uma ppula, o que caracteriza a inoculao correta (intradrmica).
Inocula-se dose nica de 0,1 ml de tuberculina, contendo 0,1 mg de
tuberculoprotena. A avaliao do resultado (reao) deve ser feita entre 72 +/- 6 horas aps
a inoculao da tuberculina, atravs de nova medio da dobra da pele e registro das
alteraes perceptveis. A interpretao da reao deve basear-se no seguinte esquema.
1-Teste ano caudal (teste de triagem em gado de corte)
Negativo

(sem reao)

Reagente

(qualquer reao)

Tabela 3 Teste cervical simples (PNCEBT, 2001)

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Quadro 1. Teste Cervical Comparativo (PNCEBT, 2001)

______________________________________________________________________________
Reao
Diferena (mm)
Resultado em relao tuberculose
______________________________________________________________________________
Tb < Ta

Negativo

Negativo

Tb > Ta

0 - 1,9

Negativo

Tb > Ta

2,0 - 3,9

Suspeito

Tb > Ta
4,0 ou mais
Positivo
_______________________________________________________________________________
Tb = tuberculina bovina Ta = tuberculina aviria

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A origem dos rros nas tuberculinizaes inclui


1-M aplicao da tuberculina (subcutnea) e no intradrmica.
2-Sensibilizao do animal s outras espcies de micobactrias.
3-Anergia.
4-Perda de resposta pela infeco recente.
5-Idade avanada.
6-Imunodepresso associada ao parto.
7-Dessensibilizao associada com a tuberculose generalizada e avanada.
8-Administrao recente de tuberculina, entre outras.
9-Dessensibilizao criminosa
10-rro de leitura instrumental (paqumetro)
A falha na deteco da infeco, algumas vezes, resulta num dramtico surto em
propriedades consideradas livres da doena.
No Brasil, onde a doena endmica, o Ministrio da Agricultura recomenda o
mtodo teste-e-abate (PNCEBT, 2001) em que todo animal considerado reagente as provas
de tuberculinizao deve ser encaminhado ao abatedouro. Assim procura-se evitar que os
animais infectados desenvolvam a forma clinica de tuberculose e possam dissemin-la
neste ou em outro rebanho. Outra possibilidade seria proteger a populao rural que maneja
diretamente com os animais e na proteo de quem ingere leite ou seus derivados lcteos
no pasteurizados. O controle da tuberculose bovina em regies endmicas ou mesmo em
regies controladas necessita o rastreamento epidemiolgico de fontes de infeco e
caracterizao de amostras de maior patogenicidade, sendo epidemiologia molecular uma
ferramenta indispensvel para esta avaliao.

VACINAO
O desenvolvimento de vacinas (BCG) contra o M. bovis foram realizadas no
passado. Entretanto a perda de eficcia dessas vacinas e o poder de confuso na
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interpretao dos testes de tuberculina impediram o uso de imunizao artificial no controle


da tuberculose bovina.
Vacinao contra as doenas micobacterianas pode reduzir os sinais clnicos e
limitar a propagao do agente, mas no suficiente para eliminar a infeco. Na
paratuberculose, vacinas vivas atenuadas ou inativadas tm sido utilizadas. Uma vez que a
vacinao interfere com testes de diagnstico aplicado na paratuberculose e tuberculose
bovina, ela no deve ser utilizada em pases que tm programas de controle da tuberculose
bovina. As vacinas contra a tuberculose bovina no so atualmente utilizadas pela mesma
razo. O uso de vacinas e testes diagnsticos sofisticados pode contornar esse problema no
futuro. A estratgia usar diferentes antgenos em vacinas e nos testes diagnsticos, uma
estratgia denominada DIVA (Differentiation between Infected and Vaccinated
Animals). Isso j vivel para a tuberculose bovina com a vacina BCG tradicional. O M.
bovis BCG perdeu regies genticas quando comparadas ao M. bovis patognico, incluindo
a protena imunognica ESAT-6. O teste que mede -IFN, aps estimulao "in vitro" com
ESAT-6 pode ser utilizado para diferenciar infectados e vacinados com BCG. Entretanto o
at o teste de -IFN puder ser aprovado, o teste cutneo dever ser documentado quanto a
sua sensibilidade e especificidade. At agora, este ensaio possui menor especificidade,
particularmente nos animais jovens, onde falso-positivos foram relatados como causadas
pela produo de -IFN a partir de clulas NK. Isto preocupante, pois a vacina BCG
protege melhor quando administrado logo aps o nascimento e seria importante testar esses
animais jovens. O teste de -IFN, utilizando antgenos especificos como o ESAT-6 tambm
pode diferenciar animais infectados pelo M. bovis e animais vacinados contra
paratuberculose em reas com tuberculose bovina. O efeito protetor da vacina BCG em
bovinos, assim como no homem, varivel, interferindo com o teste cutneo alrgico.
Apesar da reduo das leses, os animais so ainda susceptveis e possveis fontes de
propagao. H um grande esforo e desafio para desenvolver uma segunda gerao de
vacinas que do um efeito superior a BCG. provvel que a imunidade protetora seja
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dependente de complexas interaes entre as vrias clulas do sistema imunolgico com


uma variedade de mecanismos efetores anti-micobacterianos. Vrias vacinas de DNA e
vacinas de subunidades de protena foram testadas em bovinos, mas utilizadas
separadamente, mostraram menor eficcia do que a BCG. A alternativa mais promissora a
BCG combinadas com vacinas de subunidades que produziria maior proteo em
comparao com BCG. Estes resultados mostram que uma estratgia vacinal parece ser
vivel no futuro, mas precisa ser acompanhada com o desenvolvimento de testes de
diagnstico apropriados.

TRATAMENTO
O tratamento da tuberculose bovina com ATMs no deve sequer ser pensado, pois
se trata de uma doena populacional. A indicao o envio de animais reagentes para o
matadouro. O tratamento de tuberculose em primatas, especialmente aqueles pertencentes a
particulares deve ser desencorajado pelo risco Sade Pblica. O clnico veterinrio
obrigado a recomendar cuidados mdicos s pessoas expostas. O M. bovis sensvel
isoniazida (INH), estreptomicina, e rifampicina. A eficincia do tratamento com INH
experimentalmente pode atingir 100 % (Leite e Lage, 1999), mas so citados resultados
clssicos onde a eficincia varia entre 50% e 96,4 %. Lamentavelmente, poucos
pesquisadores brasileiros insistem na utilizao da isoniazida no tratamento da tuberculose
bovina e bubalina, entretanto o tratamento com ATMs deve ser completamente rejeitado
pelo risco de falha no controle da infeco nos animais; pelo perigo Sade Pblica e
desenvolvimento de multirresistncia.
Em casos muito especiais pode ser tentado o tratamento, tendo em mente que a
doena infecciosa e dependente no somente do agente, mas tambm do hospedeiro e
ambiente. Quanto uma linhagem do M bovis resistente aos ATMs se observa uma
crescente preocupao com o aumento de casos de tuberculose, tanto no homem como em
animais. Na Itlia, foi detectada multirresistncia em amostras do M. bovis isoladas em
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rebanhos na Sardenha, frente rifampicina e isoniazida, envolvendo os genes rpoB para


rifampicina e inhA katG e oxyR-ahpC para isoniazida. A presena de linhagens do M.
bovis resistentes s drogas antituberculosas e o seu risco Sade Pblica esto sendo
acompanhadas, desde 1974 na Amrica latina.
No Brasil, em um estudo isolado com 200 amostras de micobactrias de tuberculose
humana, observou-se amostras de M. bovis (3,5 %), sendo 3 amostras multirresistentes s
drogas antimicobacterianas. Levantamentos quanto resistncia INH, atravs de
amostragem aleatria, entre 1985 e 1990 foram realizadas pela OMS, na Amrica Latina.
Verificaram que 63 amostras (6,64 %) de M. tuberculosis resistentes a INH, isoladas entre
948 pacientes tuberculosos. Mecanismos diversos de resistncia do M. bovis a INH tm
sido detectados em funo de casos de M bovis multirresistentes aos antimicrobianos em
pacientes humanos imunodeprimidos e imunocompetentes.

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Mycobacterium lepraemurium
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Lepra murina
Lepra do gato
Systmatique
La lpre du rat a t dcrite en 1902 lors d'une campagne de dratisation conduite en
Ukraine. Un an plus tard, la maladie a t identifie au Royaume Uni puis dans la plupart
des pays. La maladie du rat prsente des analogies clinique et anatomopathologique avec la
lpre de l'homme si bien que, durant de nombreuses annes, l'agent de la lpre du rat a t
assimil Mycobacterium leprae. La prsence de communauts antigniques entre l'agent
de la lpre du rat et Mycobacterium leprae ainsi que des similitudes dans les caractres
bactriologiques sont venus renforcer l'ide d'une identit entre les agents de la lpre
humaine et de la lpre du rat.
En se basant sur des arguments principalement morphologiques (contrairement
Mycobacterium leprae, l'agent de la lpre du rat n'est pas group en amas ou en palissades
au niveau des lsions) Marchoux et Sorel proposent l'appellation de Mycobacterium
lepraemurium pour l'agent de la lpre du rat. Cette dnomination a t incluse dans les
Approved Lists of Bacterial Names et des analyses antigniques ainsi que l'tude des sucres
de la paroi, l'analyse des acides mycoliques, la possibilit de cultiver cette bactrie in vitro,
l'tude des ADN et l'tude des squences des ARNr 16S montrent que Mycobacterium
lepraemurium est une espce distincte de Mycobacterium leprae.
Caractres bactriologiques
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Mycobacterium lepraemurium est un bacille de 2 7 mm de longueur sur 0,3 0,4 m de


diamtre, acido-alcoolo-rsistant mais pouvant prsenter une coloration irrgulire, sensible
au p-nitrobenzoate (500mg/L), sensible l'hydroxylamine (125 mg/L), donnant une
rponse ngative aux tests niacine, nitrate rductase, catalase thermostable, hydrolyse du
Tween 80, urase, nicotinamidase, pyrazinamidase et phosphatase acide.
Cette bactrie est trs difficile cultiver in vitro et elle ne pousse pas sur les milieux
couramment utiliss pour les mycobactries (Lwenstein-Jensen, milieux gloss de
Middlebrook, milieu de Herrold, milieu de Dorset...). Toutefois, le milieu au jaune duf
dOgawa, condition dtre ensemenc de manire abondante et d'tre incub 30 C,
permet la croissance. Les colonies qui apparaissent en 4 8 semaines sont petites,
rugueuses, non pigmentes ou lgrement pigmentes en jaune clair.
Habitat et pouvoir pathogne
Mycobacterium lepraemurium est responsable dune maladie endmique, chronique et
granulomateuse du rat mais cette bactrie est galement responsable de la "lpre du chat".
La preuve de l'identit entre l'agent de la "lpre du chat " et Mycobacterium lepraemurium a
t apporte par la comparaison des squences des ARNr 16S. Toutefois, d'autres
mycobactries, proches de Mycobacterium malmoense, semblent galement tre
responsables

de

la

"lpre

du

chat".

Chez le chien, des mycobactries non identifies sont responsables d'une infection
comparable la lpre et qualifie de "canine leproid granuloma syndrome".
La lpre du chat, dabord dcrite en Nouvelle Zlande, semble avoir une rpartition
mondiale (Australie, Amrique du Nord, Europe). Linfection du chat rsulterait de
morsures de rats et la maladie se traduit par lapparition de un ou de multiples nodules
cutans, de 1 3 cm de diamtre, ulcrs ou non, prsents sur toutes les parties du corps
mais avec une localisation prfrentielle la tte et aux membres. Les nodules sont non
douloureux, ltat gnral de lanimal est non affect mais on observe frquemment une
adnite des nuds lymphatiques drainant la rgion. Lexamen anatomopathologique rvle
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des granulomes inflammatoires prsentant parfois des foyers de ncrose caseuse, des
macrophages et des cellules gantes multinucles. La coloration de Ziehl permet de
visualiser de nombreuses mycobactries notamment dans les zones ncroses et dans le
cytoplasme des macrophages ou des cellules gantes.
Exprimentalement, linjection dun broyat de granulomes reproduit chez le rat ou la souris
une infection tout fait comparable la lpre du rat.
Le traitement fait gnralement appel une excision chirurgicale. La dapsone a t utilise,
notamment en Australie, mais cette substance provoque des effets secondaires importants
chez le chat (anmie hmolytique, troubles nerveux).
Diagnostic bactriologique
Le diagnostic repose sur la mise en vidence dans les lsions de nombreuses bactries
acido-alcoolo-rsistantes, souvent prsentes dans les macrophages, et ne cultivant pas sur
Lwenstein-Jensen (les autres mycobactries telles que Mycobacterium fortuitum,
Mycobacterium chelonae ou Mycobacterium smegmatis, capables de provoquer des
lsions cutanes chez le chat, sont cultivables in vitro sur les milieux couramment utiliss
pour les mycobactries). La technique de PCR dcrite par Hughes et al. peut tre mise en
uvre directement dans les prlvements et, selon les auteurs, donnent un diagnostic de
certitude.
Orientation bibliographique
Site Web : Tuberculose. Techniques de diagnostic en mycobactriologie (Michel Fabre,
Frdric Augu & Stphane Lecaudey)
GREENE (C.E.) : Mycobacterial infections. In : C.E. GREENE (ed.) : Infectious diseases
of the dog and cat. W.B. Saunders Company, 1990, pp. 558-572.

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HUGHES (M.S.), BALL (N.W.), BECK (L.A.), de LISLES (G.W.), SKUCE (R.A.) et
NEILL (D.D.) : Determination of the etiology of presumptive feline leprosy by 16S rRNA
gene analysis. J. Clin. Microbiol., 1997, 35, 2464-2471.
HUGHES (M.S.), JAMES (G.), BALL (N.W.), SCALLY (M.), MALIK (R.), WIGNEY
(D.I.), MARTIN (P.), CHEN (S.), MITCHELL (D.) et LOVE (D.N.) : Identification by 16S
rRNA gene analyses of a potential novel mycobacterial species as an etiological agent of
canine leproid granuloma syndrome. J. Clin. Microbiol., 2000, 38, 953-959.
LEWIS (D.T.) et KUNKLE (G.A.) : Feline leprosy. In: C.E. GREENE (ed.) : Infectious
Diseases of the Dog and Cat. Second edition, W.B. Saunders, Philadelphia, 1998, pp. 321322.
MONROE (W.E.), AUGUST (J.R.), CHICKERING (W.R.) et SRIRANGANATHAN (N).
: Atypical mycobacterial infections in cats. Comp. Cont. Educ. Pract. Vet., 1988, 10, 10441048.
RASTOGI (N.), LEGRAND (E.) et SOLA (C.) : The mycobacteria: an introduction to
nomenclature and pathogenesis. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz., 2001, 20, 21-54.
ROJAS-ESPINOSA (O.) et LVIK (M.) :Mycobacterium leprae and Mycobacterium
lepraemurium infections in domestic and wild animals. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz., 2001,
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SCHIEFER (H.B.) et MIDDLETON (D.M.) : Experimental transmission of a feline
mycobacterial skin disease (feline leprosy). Vet. Pathol., 1983, 20, 460-471
THOMPSON (E.J.), LITTLE (P.B.) et CORDES (D.O.) : Observations of cat leprosy. N.Z.
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WHITE (S.D.) : Cutaneous mycobacteriosis. In : R.M. KIRK (ed.) : Current veterinary
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WILKINSON (G.T.) : Feline leprosy. In : R.M. KIRK (ed.) : Current veterinary therapy
small animal practice. Volume VI., WB Saunders company, 1977, Philadelphie, 569-571.

Mycobacterium caprae
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Tuberculose Caprina
SINONMIA: Mycobacterium bovis subsp caprae.

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INTRODUO
O gnero Mycobacterium o nico gnero da famlia das Mycobacteriaceae e,
dentro desse gnero esto includas as espcies M. africanum, M. bovis, M. canettii, M.
microti, M. pinnipedii e M. tuberculosis so responsveis pela tuberculose no homem ou
nos animais.
Os estudos de hibridizao de ADN-ADN; de polimorfismo eletrofortico de
isoenzimas; a seqncia dos ARNr 16S e 23S; o sequenciamento das seqncia intergnicas
ADNr 16S - ADNr 23S; o sequenciamento dos genes que codificam a protena do choque
trmico Hsp65; o sequenciamento dos genes rpoB, katG, rpsL, gyrA e dnaJ; eletroforese de
protenas celulares e anlise de fragmentos de restrio obtidos com EcoRI (tcnica RFEL
naqueles fragmentos marcados com

32

P) mostraram que essas quatro espcies constituem

de fato uma nica espcie genmica. Todas as demais deveriam ser consideradas como
subespcie (ou biovar) de uma nica espcie que por razo das regras de prioridade deveria
ser chamada de M. tuberculosis.
Razes ligadas a sua importncia veterinria e mdica (poder patognico e espectro
dos hospedeiros dessas espcies no so idnticas), nenhuma proposio formal foi feita e o
nome de M. africanum, M. bovis, M. microti, M. pinnipedii e M. tuberculosis conservam
seu status dentro da nomenclatura. Essas espcies so denominadas de micobactrias do
complexo M. tuberculosis.
Em 1999, num estudo com 119 amostras de caprinos foi isolada uma amostra de
carneiro e outra de suno, permitindo que Aranaz e colaboradores descrevessem o M.
tuberculosis subsp caprae.

A publicao valida dessa subespcie criou automaticamente

a subespcie M. tuberculosis subsp tuberculosis.


As linhagens do M. tuberculosis subsp caprae possuam as seqncias do ADN
especficas dos bacilos (IS6110, IS1081 e MPB70), a seqncia do ARNr 16S e a
composio dos cidos graxos caractersticos das espcies do complexo M. tuberculosis";
eles reagiram com a sonda Accuprobe (Gen-Probe) complementaria ao ARN ribossomal
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dos bacilos da tuberculose. Como essas cepas foram isoladas principalmente de caprinos,
elas foram etiquetadas como M. bovis. Por outro lado, a tipificao molecular baseada na
deteco das seqncias nucleotdicas repetitivas como a seqncia de insero IS6110, as
seqncias polimorfas repetitivas ricas em guanina e citosinas (PGRS para Polymorphic
G+C-Rich Sequences) e as seqncias repetidas diretas (DR para Direct Repeat)
permitiram diferenciar essas cepas das outras representantes do complexo M. tuberculosis.
O mesmo se deu com a tipagem pelo spoligotyping.
Niemann e colaboradores, em 2001, demonstraram que as caractersticas culturais,
bioqumicas e genticas do M. tuberculosis subsp caprae eram mais prximas das
caractersticas do M. bovis do que as caractersticas do M. tuberculosis. Assim, os autores
propuseram transferir esta subespcie dentro da espcie M. bovis com a nomenclatura de M.
bovis subsp caprae. A validao do Mycobacterium bovis subsp caprae criou
automaticamente a subespcie M. bovis subsp bovis. M. bovis subsp caprae e o M. bovis
subsp bovis partilham caractersticas comuns, permitindo diferenci-las do M. tuberculosis:
suas colnias so disgnicas; so microaerfilas; no reduzem nitratos; do resposta
negativa ao teste da niacina; incapazes de crescer na presena de 1 ou de 2 g/mL de
hidrazida do cido tiofnico-2-carboxlico; apresentam mutao dos genes oxyR (posio
285) e gyrB (posio 756); desprovidos de espaadores 39 a 43 e desprovidos da seqncia
gentica mtp40. Contrariamente ao M. bovis subsp bovis, as cepas do M. bovis subsp
caprae so sensveis pirazinamida (codon 57 do gene pncA code para uma histidina);
desprovidos de espaadores 1, 3-16 e 30-33, as bases 1311 e 1410 do gene gyrB so G e C
(T e T no M. bovis subsp bovis) e produzem uma fosfatase alcalina uma beta-glucosidase e
uma Tween 80 esterase.
Em 2003, Aranaz e colaboradores propuseram elevar o M. bovis subsp caprae ao
nvel de espcie e em 13 de novembro de 2003, os autores validaram a nomenclatura de
Mycobacterium caprae.

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CARACTERSTICAS MORFOTINTORIAIS
O M. caprae apresenta todas as caractersticas do gnero Mycobacterium. As
linhagens dessa espcie so constitudas de bastonetes AAR; no esporulados; imveis;
algumas vezes, agrupados em filamentos alongados e retorcidos (formao de corda).

CARACTERSTICAS BIOQUMICAS
Resposta positiva aos testes de:
Teste da catalase ( temperatura ambiente), hidrlise do Tween 80 (reao fraca
obtida em 10 dias) e sintetiza (galeria API ZYM) uma fosfatase cida; uma fosfatase
alcalina, uma beta-glucosidase e uma esterase.

Resposta negativa aos testes de:


Teste da catalase a 68 C; reduo de nitratos; acmulo de niacina e arilsulfatase.

CARACTERSTICAS CULTURAIS
O Crescimento estimulado pelo piruvato de sdio; colnias tornam-se visveis
aps 4 a 6 semanas de incubao a 36 C. Aps os subcultivos, o crescimento mais rpido
(3 a 4 semanas a 36 C), mas elas no so observadas temperatura de incubao a 25, a 30
ou a 43 C.
Em meios slidos, as colnias so lisas e no pigmentadas.
No meio 7H10, o cultivo inibido com 5% de NaCl; 1g/mL de hidrazida do cido
tiofnico-2-carboxlico, por 50 g/mL de pirazinamida; por 0,2 % de cido pcrico; por 500
g/mL de hidroxilamina; por 500 g/mL de p-nitrobenzoato e por 250 g/mL de cido
olico.

HABITAT E PATOGENICIDADE

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As primeiras amostras do M. caprae foram isoladas, na Espanha, por Aranaz e


colaboradores, em 1999, de linfonodos e dos pulmes de cabras com tuberculose. Pouco
tempo depois o agente foi isolado e a infeco documentada em diferentes pases e em
diversas espcies animais. Na ustria, em 2002, Prodinger e colaboradores descreveram as
infeces do M. caprae em bovinos, homem e cervo vermelho (Cervus elaphus). Em 2002,
na Repblica Checa, Pavlik e colaboradores registraram a patogenicidade do M. caprae em
bovinos e sunos domsticos. Em 2003, na Alemanha, Kubica e colaboradores confirmaram
em pacientes alemes e que 69% dos casos de tuberculose bovina eram causados pelo M.
bovis enquanto que 31% dos isolados foram identificados como M. caprae. Em 2004 e
2006, na Crocia, Erler e colaboradores e Cvetnik e colaboradores descreveram casos da
doena em bovinos e em bovinos e sunos respectivamente.
A especificidade para um hospedeiro, como acontece com outras espcies do
complexo M. tuberculosis no total. As amostras do M. caprae foram isoladas de
sudeos, ovinos, bovinos e de cervdeos (Cervus elaphus). Varias linhagens (pelo menos 3
na Espanha e pelo menos 12 na Alemanha) foram isoladas do homem. As cepas humanas
isoladas na Espanha foram provenientes de um empregado de matadouro (magarefe), um
veterinrio trabalhando com cabras e um habitante vivendo em uma regio ou propriedade
caprina tecnificada. Esses fatos demonstram a possibilidade de transmisso ao homem a
partir de animais, especialmente pequenos ruminantes.
As cepas do M. bovis sensveis pirazinamida possuem um spoligotype original
(ausncia dos espaadores 3 a 16 e dos espaadores 18 43) isolados por Niemann e
colaboradores poderiam pertencer a espcie M. caprae.

DIAGNSTICO BACTERIOLGICO
As tcnicas utilizadas por Aranaz e colaboradores, em 1999, para isolamento e
identificao desse agente foram os seguintes:
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1-Trituramento do tecido com gua destilada e descontaminao, atravs da tcnica


do lauril sulfato de sdio; atravs do mtodo do cloreto de cetil-piridinio.
2-Centrifugao por 30 minutos a 1.068 X G, inoculao no meio de Coletsos e no
meio de Lwenstein-Jensen enriquecido com 0,2 % de piruvato de sdio e incubao a
36C.
3-As colnias suspeitas foram cultivadas no meio de Coletsos a 36C, durante 4
semanas e, posteriormente submetidas ao testes preconizados por Lvy-Frbault e Portaels
(1992).
O diagnstico do gnero fcil, mas o diagnstico de espcie nem todos os
laboratrios realizam. A linhagem suspeita dever ser enviada a um laboratrio
especializado em micobactrias e mais particularmente no estudo dos bacilos tuberculosos.
importante considerar o M. caprae como agente de uma zoonose e esta espcie
ser provavelmente colocada na categoria de agentes que apresentam um nvel de risco 3, o
que faz necessrio o envio da amostra a um laboratrio de referncia.

TSA
A amostra ou linhagem tpica sensvel a isoniazida (0,2 g/mL); rifampicina (1
g/mL); etambutol (5 g/mL); estreptomicina (2 g/mL); p-aminosalicilato (2g/mL);
ofloxacina (2,5 g/mL); a cicloserina (30 g/mL) e 50 g/mL de pirazinamida (1 % de
colnias resistentes).

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Mycobacterium avium subsp paratuberculosis (Map)


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Paratuberculoses
Doena de Johne
Doena de Crohn
TAXONOMIA ATUAL
Em 1990, Thorel e colaboradores, tendo como base a relao gentica prxima entre
o Mycobacterium avium, M. paratuberculosis e do M. silvaticum, propuseram que estas
espcies fossem agrupadas juntas como Mycobacterium avium e separadas pelas
designaes de subespcie. Desde ento o agente da paratuberculose foi oficialmente
substitudo pelo Mycobacterium avium subsp paratuberculosis (Map)

IMPORTNCIA ECONMICA
A compreenso dos eventos associados aos prejuzos econmicos fundamental e
d suporte na tomada de deciso quanto a abordagem da doena local e/ou global.
Os prejuzos econmicos na pecuria leiteira so bem maiores do que nos animais de corte
(Barkema et al 2010). O impacto econmico da paratuberculose pode inclui perdas antes da
eliminao e durante a eliminao, antes das medidas de controle e preveno; as perdas
com o estabelecimeno das medidas de controle e preveno e os custos do controle e
preveno. Nos Estados Unidos, essas perdas foram estimadas em mais de 1,5 bilhes por
ano, segundo Jones (1989).
A maioria dos casos de paratuberculose subclnica e com isso, as estimativas no
so muito precisas o que torna difcil avaliar as perdas econmicas (National Research
Council, 2003). Merkal e colaboradores, em 1975, reportaram que 22,6% dos animais
infectados pelo Map foram descartados por mastite quando comparadas com 3,6% das
vacas no infectadas. Wilson e colaboradores, em 1995, relataram uma associao inversa
entre mastite e os reagentes para a infeco pelo Map.
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Benedictus e colaboradores, em 1987, estimaram que no ano da eliminao de uma


vaca com DJ houve uma reduo na produo de leite de 19,5% e na ltima lactao desse
mesmo animal houve uma perda estimada em 5%, pois no houve o consumo do
concentrado durante toda a lactao, mas a animal no utilizou eficientemente o alimento.
Portanto, calculou-se que a perda lquida devido a perdas de produo foi de 209 libras /
caso de DJ. As estimativas das perdas na produo de leite so variveis ou contraditrias.
Alguns estudos detectaram produo de leite equivalente ou mesmo superiores aos animais
no infectados pelo Map (McNab et al. 1991; Johnson et al, 2001). Outros evidenciaram
perdas na produo de leite nos animais reagentes de at 19,5% de 0 a 305 dias de produo
(Benedictus et al. 1987; Wilson et al. 1993; Sweeney et al. 1994; Kudahl et al, 2004).
Entretanto, quando foi utilizado um modelo simulatrio, a mdia global de perda anual foi
35 dlares por vaca, aumentando para 72 dlares/vaca/ano, aps 20 anos, em um rebanho
leiteiro, tpico americano, com 100 animais em mdia (Groenendaal e Galligan, 2003). Stott
e colaboradores, em 2005, na Esccia, consideraram que a DJ justificava o ajuste da
poltica de abate, sob a constante pressupostos bioeconmica, reduziu a renda esperada da
produo de leite no mbito da poltica de substituio ideal de cerca de 10 por cento (27
libras /vaca/ ano). Ott e colaboradores, em 1999, nos Estados Unidos, num estudo
envolvendo o servio nacional de sade animal estimaram que as perdas econmicas em
rebanhos positivos para paratuberculose bovina era cerca de 100 dlares / vaca quando
comparado com rebanhos negativos pela reduo na produo e aumento dos custos de
reposio. Em rebanhos positivos houve pelo menos 10% de vacas eliminadas com a forma
clinica da doena com custos superiores a 200 dlares. Nos rebanhos com alta prevalncia
houve uma reduo de mais de 700 kg de leite / vaca; eliminao de mais vacas; menores
receitas com as vacas descartadas e aumento da mortalidade em vacas quando comparadas
aos rebanhos negativos. A mdia dos custos com a reduo da produo da indstria de
laticnios americana com a DJ de todos os rebanhos varia de 22 a 27 dlares / vaca ou 200 a
250 milhes de dlares anuais. Lombard e colaboradores, em 2005, publicaram os
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resultados obtidos sobre o efeito da infeco pelo Map e a produo de leite individual de
7.879 vacas de 38 rebanhos leiteiros provenientes de 16 estados. Concluram que vacas com
teste (Elisa) fortemente positivo produziram significativamente menos leite, tanto na
lactao equivalente quanto na lactao mxima (305 dias). No houve diferenas
significativas observadas na lactao de 305 dias para o percentual de gordura, protenas
idade, lactao e contagem celular somtica entre vacas com forte resultado positivo ou
resultado negativo.
Merkal e colaboradores, em 1975, quantificaram a associao entre infertilidade e
descarte de vacas. Obtiveram que 68,8% das vacas infectadas foram eliminadas por
infertilidade quando comparados com as 60,2% das no infectadas.
Abbas e colaboradores, em 1983, na Califrnia compararam o intervalo entre partos
entre infectados e no infectados. O intervalo entrepartos foi de 15,2 meses nos animais
infectados pelo Map e 13,5 meses entre os no infectados. Essa associao no foi
verificada pelos estudos de McNab e colaboradores, em 1991, no Canad.
Fallah e colaboradores, em 2010, no Iran, estudaram os efeitos da infeco pelo
Map sobre um rebanho leiteiro. Concluram que h associao entre os casos clnicos e o
baixo desempenho reprodutivo, incluindo absoro fetal, abortos e reduo da produo de
leite.
O valor da carcaa reduzido em pelo menos 30% (em casos extremos a carcaa
perde valor). Entretanto o peso reduzido pode significar diminuio da ingesta de alimento,
gerando um fator de correo. Benedictus e colaboradores, em 1987, contabilizaram o
prejuizo com a reduo de peso no matadouro em 129 libras.
Mais importante do que prejuzos diretos, a reduo no preo do leite de rebanhos
infectados pode resultar em preocupao dos consumidores sobre o potencial zoontico de
paratuberculose. O papel potencial do Map na patognese da doena de Crohn no homem
ainda no foi resolvido (European Commission, 2000; Food Safety Authority of Ireland,
2000; Chacon et al, 2004). Se o Map estiver implicado, ento o leite seria o veculo de
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transmisso possvel do organismo para os seres humanos, pois o Map tem sido detectado
em leite cru e pode no ser eficazmente inativado pelos processos de tratamento trmico
(pasteurizao) industrial (Sweeney et al.1992; Streeter et al, 1995; Grant et al. 1996; Grant
et al. 1999; Grant et al, 2002a,b).
Juste, em 1997, na Espanha, calculou os prejuizos econmicos com cada caso da
forma clinica da paratuberculose ovina. Estimou em 120 euros /caso clinico para os ovinos
leiteiros e 60 euros/ caso para os animais d ecorte.
Brett, em 1998, na Nova Zelndia avaliou os prejuzos de uma vaca leiteira com DJ
em 1.616 dlares; de ovinos da raa Merino em 48 dlares e ovinos de duplo propsito em
42 dlares, considerando o impacto econmico de 1 nico animal com DJ / ano. Caldow e
Gunn, em 2000, na Inglaterra, estimaram os prejuzos econmicos em ovinos,
especialmente pelas mortes inesperadas causada pela paratuberculose. Eles estimaram um
valor entre 24 a 94 libras.

CARACTERSTICAS GERAIS DO AGENTE


O M. avium subsp paratuberculosis (Map) um bastonete pequeno com 0,5 m de
largura e 1,5 m de comprimento. Gram positivo. Parasita intracelular obrigatrio. Nas
fezes e tecidos, aparecem agrupados (apinhados) que um forte indicativo de sua
identificao. fortemente A.A.R.; encontrado dentro dos macrfagos e clulas gigantes.
A principal caracterstica dessa espcie a sua dependncia a micobactina exgena para
crescimento in vitro.
Micobactina um agente quelante do ferro produzidos por todas as micobactrias e,
por razes desconhecidas o Map no a produz ou produz em quantidade insuficiente para
seu crescimento in vitro A dependncia micobactina pode ser resolvida pela adio de
ferro no meio de cultivo. As colnias caractersticas so pequenas, lisas-rugosas, firmes,
brilhosas, brancas de 1 a 5 mm de tamanho no meio; pode haver variao com a

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pigmentao colonial com cepas produtoras de pigmento amarelo ou laranja. As cepas com
pigmentao amarela ou laranja, primariamente so isoladas de ovinos.

CARACTERSTICAS CULTURAIS
O Map cresce muito lentamente com uma necessidade de micobactina P ou J
(agente quelante do ferro). Est muito mais relacionado com o M. avium.
Aps 9-16 semanas, as colnias (1 a 2 mm) podem ser visualizadas. O meio de
Herrold ou Dubos-Smith com 0,4% de piruvato de sdio promove o seu crescimento. As
amostras de fezes e contedo intestinal destinada ao isolamento podem ser tratadas com
cloreto de hexadecilpiridnio (HPC), cloreto de benzalcnio e/ou 5% de cido oxlico.

LEVANTAMENTOS EPIDEMIOLGICOS
Num levantamento realizado em 1983, ao nvel de abatedouro, em Wisconsin
demonstrou que 11% das leses eram compatveis com paratuberculose. Outro
levantamento semelhante detectou 18% quando o exame histopatolgico foi associado ao
cultivo bacteriolgico.
Testes sorolgicos de ELISA em bovinos no estado da Flrida indicaram amplo
contato dos animais com o agente sendo estimado em 8,6% de bovinos de corte positivos e
17,1% de bovinos leiteiros.

TRANSMISSO
--H penetrao do Map no epitlio do leo e clon---fagocitado pelo
macrfago (sobrevive semanas) ---multiplicao na mucosa----resposta
granulomatosa leo-cecal---leso intestinal (espessamento) ---proliferao de
massas epiteliais na mucosa e submucosa---diarria intermitente---caquexia

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(edema ventral, intermandibular) ---morte (no h tubrculo no h necrose).\ou --epitlio intacto (gnglios mesentricos s/alter.).
---macrfagos para o fgado? o bao? o tero? o bere? os rgos reprodutores?
Pode ser transmitida pela ingesto de gua e alimentos contaminados por fezes de
animais infectados os quais podem excretar o agente 15 a 18 meses antes de apresentar
sinais clnicos. O agente pode estar presente no smen e prepcio de touros contaminados
podendo ocorrer infeco por esta via.
A taxa de infeco fetal pelo Map em vacas com sinais clnicos da doena varia
muito, mas ela est entre 37% e de 8,6% em vacas sem sinais clnicos. O microrganismo
pode ser cultivado do leite de vacas com sinais clnicos
INFECO
A infeco ocorre pela transmisso oral-fecal, principalmente da vaca para a usa
descendncia, durante os primeiros dias de vida.
Outras formas de transmisso so registradas especialmente a intra-uterina, pelo
alimento, pela gua e pelo smen. Grande parte dos animais infectados mostra sinais
clnicos aps um perodo de 3-4 anos da infeco. Porem antes desse perodo pode estar
eliminando o agente, atravs das fezes (disseminadores) aos seus susceptveis.
Os animais jovens so mais susceptveis infeco do que os adultos, entretanto
dose mais alta mesmo os animais adultos podem tornar-se infectados. A infeco ocorre
seguindo a ingesto do leite, gua e alimento contaminado pelo agente. A infeco pode
ocorrer via intra-uterina particularmente, durante a ltima fase da infeco quando a
bactria se dissemina e muitos rgos so infectados. O terneiro ou terneira nascido de me
infectada que se alimenta regularmente de sua me tem uma grande chance de infectar-se
porque o agente secretado pelo leite de animais infectados. No gado leiteiro, onde os
animais so individualmente, manejados com leite integral ou substituto do leite est
associado com rpida disseminao da infeco de um rebanho.

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SUSCETIBILIDADE
Bovinos jovens so mais sensveis infeco embora as manifestaes clnicas
sejam tardias. Terneiros alimentados com leite de me com a doena possuem maior risco
de tornarem-se infectados. Machos so mais suscetveis, pois a incidncia maior em
touros. A doena manifesta-se, geralmente entre animais de dois a trs anos e raramente
com mais de cinco anos.
RESISTNCIA
O Map assim como outros membros do gnero possui parede celular rica em
lipdios; resistente a influencias fsica, tais como mudanas de pH e temperatura,
(acessibilidade de gua e nutrientes). Pode sobreviver em solos e fezes, durante 8 meses
mas provavelmente anos. Resiste aos cidos e bases, permanecendo viveis nas fezes por
15 semanas a -70C. sensvel a luz solar sua sobrevivncia reduzida por contato
constante com fezes e urina no ambiente. Em esterqueiras e pode sobreviver de 98 a 287
dias. Pode sobreviver nos solos e nas fezes por mais de um ano e mais tempo na gua.
destrudo pelo aquecimento moderado, por 5% de formol e lisol.

ETIOPATOGENIA
A infeco ocorre pela ingesto do leite, gua e alimento contaminado pelo agente.
A infeco pode ocorrer via intra-uterina particularmente, durante a ltima fase da doena
quando a bactria se dissemina, atingindo mltiplos rgos.
Bezerros nascidos de mes infectadas que se alimentam regularmente de sua me
tm uma grande chance de infectar-se porque o agente secretado pelo leite de animais
infectados. No gado leiteiro, onde os animais so individualmente, manejados com leite
integral est associado com rpida difuso da infeco num rebanho.
A paratuberculose progride e se difunde lentamente, podendo levar anos at que o
rebanho seja reconhecido como infectado. A percentagem media de animais infectados de
38-42% por rebanho. Rebanhos com boas prticas de manejo podem ter uma prevalncia de
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infeco menor enquanto que aqueles com pior manejo tm uma taxa de infeco maior.
Ocasionalmente podem ser detectados rebanhos em que todos os animais esto infectados
pelo Map.
As perdas anuais com mortes dentro de um rebanho variam de 3-10% dos animais
adultos. O perodo de incubao pode variar de 6 meses a 15 anos. Entretanto a maioria dos
casos ocorre entre trs a cinco anos de idade. A doena em animais jovens rara, ocorrendo
em propriedades com alta taxa de infeco, associada ao manejo deficiente. A doena
clnica tem sido observada em animais, variando de 4 meses a 15 anos. A doena clnica o
estgio terminal de uma infeco subclnica crnica, podendo ser precipitada por fatores
estressantes. O parto, a desnutrio, a grande produo leiteira, as infeces parasitrias, as
deficincias minerais e a permanncia em ambientes baixos e midos tm sido
incriminados como fatores precipitantes.
O primeiro sinal clnico observado a falha na teraputica contra a diarria crnica
e persistente. H perodos de remisso que podem levar semana e meses. A diarria,
geralmente ocorre durante a prenhez, retornando mais severa, aps o parto. Associado
diarria, h uma fraqueza generalizada, pelo sem brilho, perda de peso. O pelo pode ficar
descolorido, especialmente em raas leiteiras inglesas ou animais de pelagem vermelha.
Essa mudana de colorao representa o esforo compensatrio dos precursores da
vitamina A (carotenos) para outras necessidades metablicas. H febre intermitente, mas o
apetite permanece bom. No estgio terminal o apetite suspenso, sendo observadas fezes
diarreicas contendo sangue franco. H edema ventral, caquexia debilitao e morte.
O curso clnico pode variar de trs a seis meses ou mais longo. Alguns animais
parecem recuperar-se, mas os sinais recidivam posteriormente.
Animais com os sinais clnicos tornam o seu reconhecimento mais simples pelo
dono ou tratador, especialmente se a enfermidade j havia sido diagnosticada neste rebanho
e, sinais sutis da enfermidade tais como tosse, pelo sem brilho e diminuio na produo
leiteira, possam ser observadas. Nenhuns dos sinais clnicos mencionados so nicos na DJ,
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havendo, portanto o risco de supervalorizao dos sinais clnicos se aplicados de forma no


criteriosa.
Os fatores associados mudana do estgio assintomtico para o estgio
sintomtico no so bem conhecidos, mas a idade e a poca da infeco esto bem
conhecidas. A dose inicial influenciada pelo manejo da propriedade; das condies
higinicas; da prevalncia da infeco no rebanho e da presena da forma clinica da
doena. Animais com os sinais clnicos de paratuberculose podem eliminar concentraes
acima de 108 bactrias / g de fezes.
Fatores estressantes, incluindo parto e alta produo leiteira pode resultar num
aumento de incidncia da doena clinica logo aps o parto, embora os resultados de
infeces experimentais no confirmem este ponto de vista. H sugestes sobre a
concentrao de ferro e vitamina D da dieta poderia modular o curso da doena, mas os
estudos experimentais so contraditrios. Estudo experimental comparativo entre a
vitamina D e o hormnio do crescimento e prolactina parece influenciar a ingesto pelos
macrofagos bovinos e subseqentemente a destruio da bactria mais pronunciadamente.
comum nas regies temperadas e climas midos, existindo evidncias que
bovinos mantidos em solos alcalinos so menos suscetveis a DJ.
A maioria dos animais com exposio moderada ao Map torna-se infectados, mas
com imunidade protetora e, poucos, desenvolvem a doena (1 de cada 20 infectados). A
resposta protetora est relacionada com a resposta imune mediada por clulas (imunidade
celular).

DIAGNSTICO DIFERENCIAL
O diagnstico diferencial inclui peritonite crnica, fasciolose, abscesso de fgado,
infeces parasitrias, disenteria de inverno, pielonefrite e salmonelose crnica. A DJ nos
outros ruminantes mais conhecida pelo quadro de caquexia e cronicidade do que aqueles
acompanhados de diarria e, por isso, o diagnstico clinico sozinho difcil.
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Nos caprinos e ovinos, geralmente no h diarria ou ela limitada a fezes


peletizadas amolecidas. Perda de peso crnica e enfraquecimento generalizado podem ser
os nicos sinais clnicos nesses animais. O curso da doena clnica pode progredir mais
rapidamente nos caprinos e ovinos. A paratuberculose de ovinos e caprinos deve
diferenciada de enfermidades que cursem com perda de estado corporal.

SINAIS CLNICOS
A enfermidade caracterizada por alteraes intestinais graves, envolvendo o
intestino delgado (jejuno, leo), o ceco, os vasos linfticos (intestinais e mesentricos) e
linfonodos (ilacos e mesentricos). O processo inflamatrio causa uma enterite crnica e
granulomatosa que por sua vez provoca a sndroma de m absoro nos doentes e que e
traduzido clinicamente, pela perda de peso acentuada, enfraquecimento geral progressivo,
diarria intermitente, desidratao e queda brusca na produo leiteira. O curso clinico da
paratuberculose tem poucos meses de durao, culminando com diarria severa, debilidade
geral, edema ventral, caquexia e morte.
A paratuberculose mais comum no gado leiteiro, em ovinos e caprinos. Tem sido
relatado em animais silvestres criados livremente, podendo tornar-se um problema
importante para a criao de animais silvestres ou para os animais de zoolgicos,
particularmente quando diversas espcies so criadas no mesmo ambiente. A
paratuberculose pode ser um problema importante em fazendas de criao de veados e alces
assim como nos cameldeos tais como lhamas e alpacas. Infeces espordicas em sunos,
eqinos, pres, primatas e no homem.

DIAGNSTICO LABORATORIAL
O cultivo do Map em amostras de tecido o mtodo mais seguro para a deteco de
animais com DJ. O procedimento demorado, requerendo entre 8-16 semanas de
incubao em meios especiais (Herrold egg yolk agar com e sem micobactina) para cultivo
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do agente. O uso de BACTEC 12B, contendo nutrientes diversos e, em especial um


radioistopo ligado a uma fonte nutriente (14CO2-

palmitato)

encurtou o resultado, quando

positivo, em 3-4 semanas.


O diagnstico da doena de Johne prejudicado pelo crescimento lento do Map e
pela resposta imune complexa que montada pelo hospedeiro frente ao agente.
O hospedeiro monta uma resposta celular, durante o inicio da fase subclnica,
caracterizada por uma forte reao de hipersensibilidade retardada do tipo IV com
proliferao de linfcitos aos antgenos do agente e produo de linfocinas estimuladas por
linfcitos T sensibilizados. Com a progresso da enfermidade, h uma diminuio da
resposta imune celular, predominando uma resposta humoral forte. A presena de anticorpo
no protege o hospedeiro contra a doena. Durante o estgio final da doena, h perda de
resposta celular especifica, permitindo a rpida disseminao da infeco no hospedeiro.
A confirmao do diagnostico clinico da doena de Johne em bovinos o
isolamento ou pode ser realizada atravs do teste imunoenzimtico (ELISA), utilizando a
amostra absorvida. O teste rpido, possui acurcia e barato. Um teste positivo
invariavelmente correto. Entretanto 15% dos bovinos com sinais clnicos da doena no so
positivos na prova.
O teste de imunodifuso (AGIDT) menos sensvel e o teste de fixao do
complemento (FC) menos especfico.
O exame bacterioscpico com colorao de esfregaos de amostras pelo ZiehlNeelsen outra tcnica rpida para diagnostico confirmao do diagnstico clinico. Esta
tcnica requer um pouco mais de experincia sendo menos sensvel e especfica do que o
teste de ELISA.
A sonda de DNA para o agente est disponvel comercialmente, mas mesmo mais
rpida e com especificidade semelhante ao cultivo fecal ela menos sensvel e de maior
custo.

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Bovinos com sinais clnicos de doena; de Johne possuem marcado espessamento


do leo. O Exame histopatolgico, utilizando a colorao AAR do leo e linfonodos
mesentricos definitivo no diagnostico da doena de Johne. O diagnostico nos estgio
preclinico da infeco um desafio por causa do perodo entre a infeco e a eliminao do
agente pelas fezes ou resposta sorolgica.
O isolamento atravs do cultivo em amostras fecais o mais amplamente utilizado,
mas tem suas desvantagens por ser caro e muito lento na sua resposta, pois pode necessitar
de at 16 semanas para finalizar o seu resultado.
A sorologia pela ELISA absorvido mais rpido mais barato, mas menos sensvel
que o cultivo fecal.
Deteco de rebanhos infectados assim com animais individualmente a forma de
controle mais importante no controle de difuso da doena entre rebanhos. O teste de
ELISA absorvido possui sensibilidade melhor ao nvel de rebanho.
O diagnstico da paratuberculose subclnica apresenta muitos problemas,
especialmente no controle da enfermidade. Ensaios imunolgicos tais como: ELISA,
AGIDT e FC, todos, detectando anticorpos sorolgicos para o Map. Entretanto, a maioria
dos animais infectados no produz anticorpos mensurveis at atingirem o estgio final da
doena; estes testes so ineficazes na deteco da infeco subclnica dos animais,
conforme Colgrove e colaboradores, em 1989.
O principal problema a variedade de antgenos utilizados no desenvolvimento
desses testes, tornando a comparao entre laboratrios dificil subclinica especialmente em
conjunto com o cultivo fecal. A sensibilidade desses testes varia entre 15-57% para animais
subclinicamente infectados eliminado pequena carga organismos atraves das fezes; ela est
em torno de 88% para bovinos com a forma clinica da doenca e eliminando uma grande
quantidade de agente pelas fezes A especificidade desses kits comerciais est em torno de
99% ou mais.

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A preabsoro do soro com o M. phlei, aumenta a especificidade do ELISA. A


incorporao de antgenos mais especficos tem resultado no aumento de sensibilidade de
deteco e concomitantemente diminuio na especificidade. O CF o teste mais utilizado
na importao e exportao de bovinos, entretanto possui baixa sensibilidade para a sua
utilizao ou propsito. Sua especificidade menor que o IDGA e ELISA.
Diversos testes de ELISA esto disponveis comercialmente para diagnstico desta
enfermidade. Esse teste detecta aproximadamente 60% dos animais que excretam o agente
atravs das fezes. A especificidade de 99%. Comparado com outros testes para deteco
de animais infectados subclinicamente o teste comercial mais confivel sendo melhor
que o padro de fixao de complemento e o tempo necessrio para se efetuar o teste de 2
horas.
A resposta celular forte, na fase preclnica permitiu o desenvolvimento de um teste
que mede a liberao de interferon gama (IFN)- quando estimuladas por antgenos de
micobactrias. A vantagem do teste poder detectar um nmero maior de animais
subclinicamente infectados no rebanho, permitindo a implantao rpida das medidas
sanitrias eficazes tais como manejo, segregao ou eliminao.
Outros mtodos para deteco da infeco tm sido recentemente desenvolvidos
utilizando sondas de cidos nuclicos combinados com a reao da polimerase em cadeias,
conhecida como PCR A primeira sonda de ADN para o M. a. paratuberculosis em fezes,
perdeu especificidade, pois tambm hibridizava com o M. avium. Posteriormente, outra
sonda mais especifica foram desenvolvidas, tendo como base a sequencia parcial de um
elemento de insero do Map denominado IS900. Estudos comparativos com a sonda de
ADN e trs diferentes procedimentos no isolamento do agente demonstraram que 60% dos
animais com cultivo positivo podiam ser detectados tambem pela sonda de ADN.
Entretanto o teste mesmo com especificidade alta foi incapaz de detectar bovinos infectados
eliminadores de pequeno nmero de organismos infecciosos. Outra sonda especfica na
deteco do Map o clone F57 que atualmente est sendo utilizado por muitos laboratrios.
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Uma recente modificao do PCR, incluindo duas reaes de ampliao, utilizando nested
primers possibilitou o aumento da sensibilidade do teste, possibilitando detectar cerca de 50
organismos/g de fezes contra 104organismos/g fezes do kit comercial.

TRATAMENTO
Estudos in vivo e in vitro tm sido realizados nestes ltimos 30 anos para
avaliar a eficcia de diferentes drogas administradas sozinhas ou combinadas para controle
da infeco causada pelo Map ou doena de Johne, nos ruminantes. A eficcia do
tratamento pela combinao da rifampicina, pirazinamida e estreptomicina no tratamento
da infeco pelo Map foi previamente avaliada em bezerros experimentalmente infectados.
Essa combinao tem sido aplicada com sucesso para tratamento da tuberculose no homem.
As diferentes aes, isto , na ao intracelular (rifampicina e pirazinamida) e extracelular
(rifampicina e estreptomicina) resultou em sinergia. Entretanto esses frmacos no
mostraram efeito bloqueador na eliminao fecal das micobactrias noa animais com a
forma clnica natural. Durante a terapia e por um perodo de tempo posterior ao tratamento
no foram observados organismos alcool-acidos nas amostras coradas pelo ZN. Entretanto
as amostras cultivadas permaneceram positivas para o Map.

IMUNIZAO/VACINAO
A vacinao contra a doena de Johne foi primeiramente descrita por Vallee e
Ringjard, na Frana, em 1926, aps observaes de que a inoculao subcutnea de
amostras vivas e no atenuadas do Map no resultaram em infeco.
Desde ento, um nmero significativo de vacinas e bacterinas, utilizando cepas
tanto atenuadas e no atenuadas tem sido utilizadas mortas pelo calor e de cepas rompidas a
fragmentos foram avaliadas.
A imunidade da paratuberculose ocorre em algum estagio aps a hipersensibilidade
e, aparece desenvolver de maneira semelhante a outras infeces por micobactrias. As
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vacinas que provocam uma aprecivel hipersensibilidade tanto com organismos mortos ou
vivos e resduos extrados pelo metanol so efetivas agentes imunizantes enquanto que os
resduos extrados pelo lcool e fraes protoplasmticas causam pouco ou nenhuma
hipersensibilidade e no funcionam como vacinas efetivas.
A vacinao, geralmente reduz o nmero de animais com a enfermidade clinica,
diminuindo o nmero de animais eliminadores, atraves das fezes e reduzindo o nmero de
animais com infeces intestinais detectveis. A vacinao no confere imunidade absoluta.
Os animais vacinados podem desenvolver a doena e/ou eliminar o agente. A vacina pode
proteger o animal da doena clinica ou apenas retardar o seu aparecimento. Esse atraso no
aparecimento pode ser vantajoso, postergando a doena para alem do perodo produtivo.
Animais vacinados respondem positivamente aos testes diagnsticos e, desse modo, s
podem ser detectados, atravs do cultivo das fezes. Os vacinados no devem ser
considerados como livres de paratuberculose. O manejo e medidas de controle so
indispensveis para a obteno de benefcios mximos.
A desvantagem da vacinao o desenvolvimento no local de inoculao de um
processo inflamatrio e desenvolvimento posterior de ndulo fibrocaseoso, geralmente com
32 a 42 mm de dimetro. Esses ndulos podem tornar-se muito grandes (250 X 127 mm)
particularmente com a revacinao.
A vacinao com agente vivo provoca a recuperao de microrganismos viveis no
ndulo de inoculao mesmo aps 6 anos de inoculao. H o desenvolvimento seguido da
imunizao de uma forte e persistente sensibilidade a tuberculina aviria e mamfera,
segundo imuneros autores. As vacinas contra paratuberculose aumentaram em cerca de 8
vezes a sensibilidade tuberculina. Essa sensibilizao cruzada interfere com os programas
de erradicao tuberculose. Animais tuberculosos podem ser diferenciados dos vacinados
pelo teste cervical comparativo.
A vacinao com cepa viva do Map tem sido utilizada na Europa enquanto que nos
EU ela fundamentalmente uma bacterina preparada com a cepa 18 (conhecida agora como
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M. avium) morta pelo calor e suspensa em leo mineral. Embora ambas sejam capazes de
estimular a imunidade celular e humoral, segundo os ensaios diagnsticos, elas no so
capazes de produzir niveis bons de proteo.
A vacina indicada para controlar a doena em rebanhos endemicamente infectados
e no est indicada como medida profiltica em rebanhos livres da doena. Distribuio e
uso esto limitados aos veterinrios, especialmente treinados pelos perigos e possveis
efeitos irreversveis da inoculao acidental no homem. A vacina deve ser inoculada
subcutaneamente na regio do peito e, administrada entre 1-35 dias de idade, onde h
formao posterior de um ndulo. A imunidade dura aproximadamente 18 meses. A
revacinao no recomendada. Vrios estudos tm demonstrado uma queda na resistncia
aps a revacinao. Estudos efetuados com a bacterina e conduzidos em alguns desses
rebanhos demostraram que houve reduo em 90% dos casos clinicos e reduo em 50% no
nmero de animais infectados. Entretanto, esses resultados devem ser interpretados com o
conhecimento das necessidades da propriedade necessrio para qualificar a vacinao.
As propriedades devem instituir praticas de manejo consistente com aquelas
recomendadas para controle e erradicao dessa doena como parte no programa de
vacinao. Essa pratica de manejo se propriamente institudas podem efetivamente
controlar a doena. A bacterina, em essncia usada como incentivo para donos de
rebanhos para instituir programas de manejo. Ela portando difcil de determinar se efeito
benfico da vacinao com o resultado da bacterina ou as prticas de manejo visto que o
manejo sozinho pode produzir resultados semelhantes.

CONTROLE E PREVENO
Atualmente, no h qualquer sinalizao dos rgos federais na criao de um
Programa Nacional de Controle da Paratuberculose. A cada ano acumulam-se casos
clnicos bem documentados em bovinos e bubalinos leiteiros, alguns deles, com isolamento
do agente, caracterizao molecular e exames anatomopatolgicos slidos. Precisamos com
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urgncia de laboratrios com experincia e pessoal nessa rea e os raros conhecidos esto
em Minas Gerais, Rio de Janeiro e Rio Grande do Sul. H uma grande carncia de
laboratrios prximos as bacias leiteiras (novas ou em expanso) como Amazonas, Par,
Pernambuco, Bahia, Gois, So Paulo, Paran etc. Infelizmente, no vislumbramos
mudanas num curto, mdio e no longo prazo.
A paratuberculose possui difcil controle, especialmente pelo longo perodo de
incubao, ausncia de sinais clnicos nos estgios iniciais da enfermidade, durante o qual
os animais podem ser disseminadores, atravs das fezes sem apresentar sinais clnicos;
testes diagnsticos com baixa sensibilidade (ELISA adsorvido e cultivo em HEY);
tratamento da amostra com HPC (fezes, tecido, leite); uso de micobactina como fator de
crescimento e uma variedade de metodologias.
fundamental conhecer e estimar a prevalncia da doena tanto do rebanho quanto
individual, especialmente na tomada de deciso se uma doena infecciosa importante ou
no e quais as medidas aplicveis. Assim podemos pensar e aplicar medidas de erradicao
em reas de baixa prevalncia; medidas de controle em reas de alta prevalncia e
monitoramento em reas onde no h histrico da enfermidade.
As estimativas de prevalncia so necessrias quando modelam e simulam a difuso
da doena. Entretanto as estimativas obtidas so influenciadas pela acurcia dos testes
diagnsticos aplicados e pela comparao entre estudos que precisam ser ajustados para
melhor estimar a prevalncia verdadeira.
No estudo epidemiolgico da paratuberculose no Brasil h passos que poderamos
economizar muito trabalho, muito tempo e muitos recursos econmicos. O esquema
simplificado, mas importante:
1-Detectar os rebanhos-leiteiro alvo (>3anos) suspeito (bovino, bubalino, ovino,
caprino, silvestres etc) com um teste de Elisa adsorvido como teste de triagem
(probabilidades)

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2-Associar a pesquisa dos sinais clnicos, histrico do rebanho compatvel com a DJ


no excluindo doenas concomitantes (fasciolose, salmonelose, perotonite, tuberculose etc)
3-Isolar, identificar, caracterizar, e guardar o Map (tecidos, fezes, leite, lcteos) de
animais reagentes na triagem.
4-Aplicar medidas higinicas no rebanho positivo (parto, instalaes, ordenha)
5- Mudar manejo dos rebanhos positivos (me-filho, colostro, alimento, gua)
6- Medidas de qualificao da produo do leite.
7-Teste-abate nos rebanhos (identificar / classificar positivos, abater os mais
infectados; classificao de rebanhos como negativos e positivos)
8-Programa de ressarcimento pelos animais doentes ou sorologicamente positivos
9-Registrar dados e monitorar o rebanho (Elisa) todos os anos
10-Prepara-se para o futuro (-ITF, vacinas)
Precisaramos que os casos suspeitos fossem comunicados s autoridades sanitrias oficiais
que imediatamente isolaria o animal suspeito e se confirmado, seria eliminado custa do
recurso pblico. Os animais importados deveriam ser provenientes de rebanho livres de
Map com controle emitido pelo governo federal do pas que exporta, evitando assim a
entrada de animais infectados/doentes e protegendo nossas populaes animais.
O agente persiste sem multiplicao nas pastagens por longos perodos e estas
pastagens so infectantes por mais de um ano.
Medidas de controle da doena no rebanho podem ser tomadas para reduzir ou
eliminar a exposio de terneiros que so os mais sensveis ao agente. Animais suspeitos
devem ser isolados e o diagnstico feito atravs de exames bacteriolgicos das fezes. Casos
confirmados precisam ser abatidos imediatamente. Quando possvel, os terneiros devem ser
separados imediatamente das mes aps o nascimento e postos em reas livres de
paratuberculose. Colostro e leite devem ser de origem conhecida e de preferencia usar
substitutivos de leite sempre que possvel. Alimentao e gua devem ser higinicas livres

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de contaminaes fecais. As pastagens destes animais devem ser diferentes das dos animais
adultos.

TICA
Proprietrios de rebanhos infectados, assim como clnicos veterinrios e autoridades
oficiais devem estar atentos ao processo de responsabilidade na venda de um rebanho ou
animal infectado. As vendas de animais so disciplinadas pelas mesmas leis de garantia
legal que regem outros bens no comrcio e, desse modo, a responsabilidade civil tem base
na lei de fraude, negligncia ou no contrato de garantia. Fazendeiros podem ser
responsabilizados no somente pelo valor particular de um animal, mas tambm por todas
as avarias que tiveram conseqncias ao comprador e subsequente compradores.
A venda de um animal conhecido como infectado pelo Map constitui a falsa
interpretao de um produto e o vendedor responsvel por danos, tendo como base a lei de
fraude. O proprietrio que vende um animal aparentemente saudvel de um rebanho
conhecido como infectado pelo Map pode ser responsabilizado tendo como base a
negligncia. Os animais de uma propriedade infectada foram todos expostos doena e
como tal, podem estar infectado. Se um animal aparentemente saudvel, mas no exposto
encontrado infectado depois, a responsabilidade pelos danos podem advir na falha do
vendedor em cuidar na preveno de alteraes a outro, isto negligencia. Mesmo a venda
de um animal infectado de um rebanho na qual no se conhea paratuberculose pode
sujeitar o fazendeiro ao direito baseado na implicao de garantia.
Produtos podem ser vendidos sobre uma cobertura do cdigo comercial que
estabelece que produtos sejam indicados para os seus propsitos. Uma vez que a
paratuberculose subclnica e portadores assintomticos do Map no podem ser detectados, a
venda de um animal, aps a inspeo por outro no limita a responsabilidade do vendedor.
Assim, mesmo um fazendeiro, sem saber, vende um animal infectado, pode ser
responsabilizado por leso baseada na garantia expandida.
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PERSPECTIVAS
H pouca dvida que a paratuberculose seja um problema importante no Brasil
assim como em outros pases. Muito esforo travado na tentativa de deter a doena e
progressos tm sido alcanados.
No Brasil, no h um programa de controle oficial. Rara propriedade tem mostrado
algum interesse o controle, mas ele absolutamente voluntrio e limitado a um pequeno
nmero de rebanho; que na sua abrangncia essencialmente ineficaz no controle desta
enfermidade. Temos uma tendncia a pensar que a doena de Johne uma doena de
bovinos, ignorando outras categorias animais.
Doena de Johne no uma doena limitada a bovinos; ela causa problemas em
bubalinos, ovinos, caprinos, animais silvestre, exticos e ainda risco a Sade Pblica. A
pecuria o principal foco de ateno porque ela a principal atividade pecuria e, alm
disso, a maioria do conhecimento est baseada nesta espcie, por que o manejo de fcil
controle e modificao ou porque a industria tem interesse.
Existe uma imensa carncia com relao aos estudos nacionais sobre a
paratuberculose, envolvendo o ambiente, o agente e os diferentes hospedeiros. A
paratuberculose bovina nos bovinos leiteiros mais outro desafio sanitrio brasileiro.
Atualmente, no Brasil, no h nenhum estudo slido sobre essa enfermidade em outros
ruminantes domsticos (ovinos e caprinos) ou silvestres, alem de muitas outras espcies
susceptveis infeco causada pelo Map. Existe uma gama de novas e grandes
oportunidades, abrangendo o ensino a pesquisa e a extenso sobre doena de Johne, no
Brasil.

SADE PBLICA / ZOONOSE


H um ponto de interrogao sobre uma possvel ligao entre o Map e a doena de
Crohn no homem. A literatura disponvel sobre o papel do Map na etiologia da Doena de
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Crohn (DC) rica, numerosa e contraditria. DC uma leo-colite granulomatosa crnica


do homem sugerindo que o Map estivesse incriminado como etiologia e o agente foi
isolado em alguns casos.
Em 1901, Thomas K. Dalziel, um cirurgio escocs trabalhando em Glasgow
operou um colega com inflamao crnica do intestino. Ele estava familiarizado com a
recente descrio de doena de Johne e, da subsequente pesquisa pelo agente bacteriano
envolvido. Ele reuniu outros casos e publicou suas observaes com o nome de Enterite
Intersticial Crnica, no British Medical Journal, em 1913. Ele descreveu que o aspecto
histolgico da DC era to semelhante Doena de Johne que justificou a proposio que a
doena poderia ser a mesma. O dilema de Dalziel fora que no foi possvel a visualizao
de micobactrias AAR no intestino de pessoas com a doena (citado em Hermon-Taylor et
al., 1998). Desde l, o Map tem sido relacionado com a DC, tendo como base, as
semelhanas entre essas duas enfermidades.
O Map tem sido implicado como envolvido na patogenia da DC e, alguns
pesquisadores consideram a paratuberculose como uma zoonose potencial.
Os alimentos como leite, lcteos e possivelmente a carne podem tornar-se fontes de
infeco e, desse modo, a doena tem ganhado ateno sob o ponto de vista de segurana
alimentar. A Food Standards Agency reviu as evidncias ligando Map doena de Crohn
(Rubery 2001). O Comit Cientfico da Unio Europia tambm examinou as evidncias,
ligando o Map e a doena de Crohn, publicando o seu parecer em Maro de 2000. Esses 2
estudos concluram que nenhuma ligao conclusiva foi ainda estabelecida. O recente
resultado da pesquisa publicada por pesquisadores do St George's Hospital Medical
School (Bull et al. 2003), investigou a incidncia do Map, em 37 pacientes com
diagnstico de doena de Crohn e 34 pacientes diagnosticados como no portadores de
doena inflamatria intestinal. Eles concluram que a taxa de deteco do Map em
indivduos com doena de Crohn bastante significativo o que implica esse agente
intestinal patognico causa da doena. O potencial de risco tem que ser considerado, em
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particular luz da nova atitude para com as zoonoses causadas pelos alimentos na era psBSE. Os relatrios da Food Standards Agency e o da Unio Europia indicaram a
necessidade de realizar a vigilncia para o Map. A FSA estabeleceu um programa de
vigilncia com o propsito de determinar os nveis de Map no leite cru e tambm para
determinar se o Mapa sobrevive aos tratamentos trmicos atualmente empregados em
fbricas de laticnios de pasteurizao de leite lquido. Este trabalho concluiu que vivel o
Map ser isolado ocasionalmente no leite de vaca pasteurizado e comercializado no RU. H
um nmero de opes possveis para o controle de Map quando pasteurizao. Uma opo
alterar o tempo / temperatura utilizada na pasteurizao, incluindo o ponto de inativao
da peroxidase. Isto resultaria na destruio de algumas propriedades funcionais do leite. A
separao dos grumos formados pelos Map antes do processo de pasteurizao pode ser
uma opo importante j que a o processo de aderncia uns aos outros confere proteo
trmica. No entanto, a fora de cisalhamento e a velocidade de reagregao, se houver, so
desconhecidas.
A literatura sobre o envolvimento do Map na etiologia da DC contraditria. O uso
de sondas genticas e a tcnica da PCR aplicadas em vrios estudos tm indicado a
presena de micobactrias e, entre elas, a presena do Map. Entretanto outros estudos no
foram capazes de confirmarem esses resultados. Dados conflitantes tm sido publicados,
utilizando tcnicas sorolgicas. O isolamento do Map em amostras de tecidos lesionados de
pacientes com DC provou ser extremamente difcil, especialmente pela baixa freqncia ou
pela presena de formas bacterianas alteradas ou esferoblastos. O envolvimento etiolgico
do Map na DC tem sido extensivamente revisado por vrios autores nas ultimas dcadas e,
essas revises refletem que uma resposta definitiva ainda no h.

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