Replicacin semidiscontinua DEL ADN

Las micrografas electrnicas del ADN antiparalelo de doble hebra en replicacin sugieren que el proceso
se lleva a cabo en un (o dos) horquillas de replicacin. Se saba que la ADN polimerasa slo puede
extender las hlices en direccin 5 3 Entonces cmo se replica la cadena?
En 1968, Reiji Okazaki realiz el siguiente experimento:
Coloc clulas de Escherichia coli durante 30 segundos en un medio que contena 3H Timina;
posteriormente, centrifug las clulas en un medio bsico y obtuvo fragmentos de cidos nucleicos de 7 y
11S (Svedvergs, unidades de densidad), lo que significaba que contenan entre 1X10 3 y 2X103 nucletidos.
Despus verifico el efecto del tiempo en la incubacin y encontr que el tamao de los fragmentos era
proporcional al tiempo, a estos fragmentos se les denomina fragmentos de Okazaki.
Okazaki interpret la presencia de estos fragmentos en trminos de la replicacin semidiscontinua:

Figura: representacin de la duplicacin semidiscontinua 1

Finalmente, los fragmentos de Okazaki, se unen por la ADN ligasa
Cebadores de ARN
Los cebadores o primers son pequeos segmentos de ARN que se utilizan para iniciar la sntesis
de ADN.
Para crecer la cadena de ADN, la ADN polimerasa requiere del extremo 3-OH terminar de un nucletido,
pero cmo se inicia la sntesis de ADN?
El estudio cuidadoso de los fragmentos de Okazaki, revela que su extremo 5 consiste de segmentos de
ARN que constan de 1 a 60 nucletidos (lo cual depende de la especie) que son complementarios con la
hebra de ADN. En Escherichia coli dos enzimas catalizan este proceso, la ARN polimerasa (es la enzima
encargada de la transcripcin) y la primasa (monmero de 60 kD) que fabrica los fragmentos de Okazaki.
La ARN polimerasa es inhibida por rifampicina (inhibe la sntesis de la hebra lder). In vivo las enzimas son
sinergsticas.
El proceso de la replicacin se puede resumir en los siguientes eventos (con sus respectivas enzimas,
que en conjunto, se denominan replisoma):
1.- ADN girasa
2.- separar el ADN en la horquilla
3.- no permitir la realineacin antes de la replicacin
4.- cebadores de ARN (ARN polimerasa)
5.- ADN polimerasa
6.- quitar cebadores de ARN
7.- unir covalentemente los fragmentos de Okazaki (ADN ligasa)

Figura: representacin de la duplicacin semidiscontinua 2

Las protenas Rep, la helicasa y las protenas de unin a hebra sencilla (SSB) desdoblan al ADN antes de
que avance la horquilla, este proceso necesita de la hidrlisis de ATP.
El monmero Rep (del gen rep) acta sobre la hebra lder (3 5), gasta 2 molculas de ATP por cada par
de base separado. La helicasa, retarda la sntesis de la que crece en direccin 5- 3, esta enzima tambin
es un monmero. Las protenas SSB, no permiten que se unan las hebras ya separadas, son un tetrmero.
Duplicacin del ADN
La vida de los seres vivos es muy variable , por tanto para que esta no se extinga ha de haber un momento en se
reproduzcan, lo cual lleva implcito la formacin de copias del ADN del progenitor o progenitores .
Se dieron muchas hiptesis sobre como se duplicaba el ADN hasta que Watson y Crick propusieron la hiptesis
semiconservativa (posteriormente demostrada por Meselson Y Stahl en 1957), segn la cual, las nuevas molculas de
ADN formadas a partir de otra antigua, tienen una hebra antigua y otra nueva.

del

Hay que recordar que es circular y ocurre en tres etapas:

1 etapa: desenrrollamiento y apertura de la doble hlice.en el punto ori-c.
Intervienen un grupo de enzimas y proteinas, a cuyo conjunto se denomina replisoma
* Primero: intervienen las helicasas que facilitan en desenrrollamiento
* Segundo: actuan las girasas y topoisomerasas que eliminan la tensin generada por la torsin en el desenrrollamiento.
* Tercero: Actuan las proteinas SSBP que se unen a las hebras molde para que no vuelva a enrollarse.

2 etapa. sntesis de dos nuevas hebras de ADN.

* Actuan las ADN polimerasas para sintetizar las nuevas hebras en sentido 5-3, ya que la lectura se hace en el sentido
3-5.
* Intervienen las ADN polimerass I y III, que se encargan de la replicacin y correccin de errores. La que lleva la
mayor parte del trabajo es la ADN polimerasa III
* Actua la ADN polimerasa II, corrigiendo daos causados por agentes fsicos.
La cadena 3-5es leida por la ADN polimerasa III sin ningn tipo de problemas ( cadena conductora). En la cadena 5-3
no puede ser leida directamente, esto se soluciona leyendo pequeos fragmentos ( fragmentos de Okazaki ) que crecen
en el sentido 5-3y que ms tarde se unen . Esta es la hebra retardada,llamada de esta forma porque su sntesis es ms
lenta.

La ADN polimerasa III es incapaz de iniciar la sntesis por s sola, para esto necesita un cebador (ARN) que es
sintetizado por una ARN polimerasa (=primasa). Este cebador es eliminado posteriormente.
3 etapa: correccin de errores.
El enzima principal que acta como comadrona (R. Shapiro) es la ADN polimerasa III, que corrige todos los errores
cometidos en la replicacin o duplicacin. Intervienen otros enzimas como:
* Endonucleasas que cortan el segmento errneo.
* ADN polimerasas I que rellenan correctamente el hueco.
* ADN ligasas que unen los extremos corregidos

DUPLICACIN DEL ADN EN EUCARIONTES

Es similar a la de los procariontes, es decir, semiconservativa y bidireccional. Existe una hebra conductora y una hebra
retardada con fragmentos de Okazaki. Se inicia en la burbujas de replicacin (puede haber unas 100 a la vez)

Intervienen enzimas similares a los que actuan en las clulas procariontes y otros enzimas que han de duplicar las
histonas que forman parte de los nucleosomas. Los nucleosomas viejos permanecen en la hebra conductora.

LA REPLICACIN

Escherichi coli dividindose

Metafase mittica de Vicia faba

Replicacin semiconservativa

.
FUNCIONES QUE DEBE CUMPLIR EL CROMOSOMA: SIGNIFICADO GENTICO DE LA
REPLICACIN

Las principales funciones que debe cumplir un cromosoma son la de replicarse (producir copias de si
mismo), la de transmitirse de una clula a otra y de una generacin a la siguiente y la de expresar la
informacin que contiene.

Bacteria

Bacteria dividindose

Bacterias descendientes

El significado gentico de la replicacin es el de conservar la informacin informacin gentica, de manera

que cuando una bacteria se divide, de lugar a una bacteria hija que contenga la misma informacin
gentica.
En organismos eucariontes el significado de la divisin celular es el mismo, una clula cuando se divide
origina dos clulas hijas idnticas con la misma informacin gentica.

MODELOS DE REPLICACIN PROPUESTOS: SEMICONSERVATIVO, CONSERVATIVO Y DISPERSIVO

Modelo Semiconservativo: Cuando Watson y Crick (1953) propusieron el modelo de la Doble Hlice
indicaron que dicho modelo sugera una forma sencilla de replicacin. El modelo de replicacin propuesto
por Watson y Crick supona que el ADN doble hlice separa sus dos hebras y cada una sirve de molde para
sintetizar una nueva hebra siguiendo las reglas de complementariadad de las bases nitrogenadas. Dicho
modelo recibin el nombre de Semiconservativo, ya que las dos dobles hlices recin sintetizadas poseen
una hebra vieja (una mitad vieja) y otra hebra nueva (mitad nueva).
Frente al modelo Semiconservativo propuesto por Watson y Crick (1953) se postularon otros posibles
modelos de replicacin del ADN, uno de ellos se denomin Modelo Conservativo y otro Modelo Dispersivo.
Modelo Conservativo: cuando el ADN doble hlice se replica se producen dos dobles hlices, una de ellas
tienen las dos hebras viejas (esta intacta, se conserva) y la otra doble hlice posee ambas hebras de nueva
sntesis.
Modelo Dispersivo: Cuando el ADN doble hlice se replica se originan dos dobles hlices, cada una de
ellas con hebras que poseen tramos viejos y tramos de nueva sntesis en diferentes proporciones.
Los siguientes esquemas representan los tres Modelos de Replicacin:
Semiconservativo

Conservativo

Dispersivo

LA REPLICACIN DEL ADN BACTERIANO SE AJUSTA AL MODELO SEMICONSERVATIVO:

EXPERIMENTOS DE MESELSON Y STAHL (1958)
Meselson y Stahl (1957) disearon un experimento para tratar de averiguar la forma en la que se realiza la
replicacin del ADN en E. coli, es decir, la pregunta que se plantearon fue: Qu modelo de replicacin del
ADN sigue E. coli, semiconservativo, conservativo o dispersivo?. Para contestar a esta pregunta, disearon
un experimento en el que marcaban el ADN de la bacteria E. coli con Nitrgeno pesado N15, para ello
hicieron crecer las bacterias durante 14 generaciones sucesivas en un medio que contena como nica

fuente de Nitrgeno N15. Durante estas 14 generaciones el ADN de las bacterias las bacterias se haba
sintetizado con bases nitrogenadas con Nitrgeno pesado (N15). Posteriormente, comprobaron que podan
distinguir el ADN del las bacterias que crecan en un medio normal (con N14) del ADN de las bacterias que
haban crecido durante 14 generaciones en N15. Para ello extrajeron el ADN de ambos tipos de bacterias y
lo centrifugaron en un gradiente de densidad de CsCl. El resultado fue que la densidad del ADN de las
bacterias que haban crecido en presencia de N15 era mayor que el ADN de las bacterias que haban
crecido con N14. Una vez comprobado que eran capaces de distinguir el ADN de ambos tipos de bacterias,
continuaron el experimento de la siguiente forma: Las bacterias que haban estado creciendo en Nitrgeno
pesado (N15) las pasaron a un medio de cultivo que contena N14 (Nitrgeno normal) y a distintos tiempos,
media generacin, una generacin, dos generaciones, tres generaciones de replicacin, tomaban una
muestra del cultivo bacteriano, extraan el ADN y centrifugaban en gradiente de densidad de CsCl.

Esquema Experimentos Meselson y Stahl (1958)

Cuando extraan el ADN de la bacterias que llevaban una generacin creciendo en N14 y centrifugaban en
CsCl, obtenan una sola banda de densidad intermedia (N14-15)entre la del ADN N14 y el ADN N15. Si extraan
el ADN de las bacterias que llevaban dos generaciones creciendo en N14 y centrifugaban en gradiente de
CsCl obtenan dos bandas, una correspondiente al ADN N14 y otra de densidad intermedia (N14-15) entre la
del ADN N14 y el ADN N15. La absorbancia a 260 nm es directamente proporcional a la cantidad de ADN
que contiene una banda, de manera que al medir la absorbancia de las dos bandas obtenidas en la
segunda generacin, obtenan que ambas contenan igual cantidad de ADN (1:1). Al extraer y centrifugar en
CsCl el ADN de las bacterias que llevaban tres generaciones creciendo en N14, obtenan dos bandas, una

correspondiente al ADN N14 y otra de densidad intermedia (N14-15) entre la del ADN N14 y el ADN N15. La
cantidad de ADN que contena la banda correspondiente al ADN N14 era tres veces mayor que la
encontrada en la banda de densidad intermedia (N14-15), proporcin (3:1).
Los resultados obtenidos por Meselson y Stahl (1958) se ajustaban a un modelo de replicacin
semiconservativo. Para asegurarse, aislaron la banda de ADN de densidad intermedia (N14-15) obtenida a
partir de las bacterias que llevaban una generacin en N14, desnaturalizaron el ADN de la banda mediante
calor para separar sus dos hlices y, mantenindolas desnaturalizadas, centrifugaron en CsCl. Si la
replicacin de E. coli se ajustaba al modelo semiconservativo, una de las hlices debera estar construida
con N15 (la vieja) y la otra hlice con N14 (la nueva) y, al centrifugar en gradiente de densidad esperaramos
obtener dos bandas una ms densa correspondiente a la hlice construida con N15 y otra menos densa
sintetizada con N14. El resultado obtenido por Meselson y Stahl (1958) fue precisamente el esperado para
una replicacin semiconservativa.

Resultados centrifugacin CsCl

Matthew Meselson y Franklin W. Stahl

Si la replicacin del ADN de E. coli se ajustar al modelo Conservativo al centrifugar el ADN de las
bacterias despus de un generacin en medio con N14, hubieran obtenido dos bandas una de densidad
correspondiente al N14 y otra de densidad correspondiente al N15. Nunca habran observado, en este caso,
una banda de ADN de densidad intermedia (N14-15).

EL ADN BACTERIANO ES CIRCULAR: EXPERIMENTO DE CAIRNS (1963)

Cairns en 1963, llev a cabo otro experimento en la bacteria E. coli que adems de demostrar que la
replicacin de su ADN se ajustaba al modelo Semiconservativo propuesto por Watson y Crick (1953),
tambin demostraba que el ADN de E. coli es circular. Se trata se la primera evidencia citolgica (mediante
observacin al microscopio) de la circularidad del cromosoma bacteriano, ya que mediante tcnicas de
construccin de mapas de conjugacin, ya se haba demostrado previamente por Jacob y Wollman (1958)
que el ADN bacteriano tena un mapa circular.
El experimento que realiz Cairns (1963) consisti en mantener un cultivo de E. coli creciendo durante dos
generaciones sucesivas en un medio que contena Timidina tritiada (TH3), es decir, utilizaron un nucletido
(la Timina) marcado con un istopo radiactivo (tritio, H3). Por tanto, cuando las bacterias sintetizaban su
ADN empleaban dicho nucletido marcado. Adems, Cairns (1963) desarroll un sistema para extraer el
ADN de E. coli sin romperlo (intacto) y extenderlo sobre un portaobjetos para posteriormente realizar una
autorradiografa, revelarla y observar los resultados al microscopio. Para realizar la autorradiografa,
empleaba una emulsin fotogrfica que colocaba en contacto directo con la preparacin, de forma que en
aquel lugar de la preparacin en que exista TH3, las partculas b del tritio impresionaban la emulsin
fotogrfica y al revelarla apareca una macha o punto en ese lugar. Las autorradiografas correspondientes
a la primera generacin de replicacin presentaban imgenes de puntos formando un crculo. En las
autorradiografas correspondientes a la segunda generacin de replicacin se observaban imgenes de
puntos en forma de la letra griega q pero que mostraban una regin del interior con doble cantidad de
puntos.

Cairns (1963) interpret que el cromosoma de E. coli era circular, que se replicada de modo
semiconservativo, que exista un punto de inicio de la replicacin, un origen, y un punto de crecimiento
(PC). Sin embargo, esta interpretacin fue errnea, ya que en E. coli existe un solo punto de iniciacin de la
Replicacin (Ori C) pero existen dos puntos de crecimiento (PC), ya que la replicacin en E. coli, como
veremos ms adelante es bidireccional.

Autorradiografa de la 2 generacin de Replicacin

con TH3

J. Cairns

LA DIVISIN CELULAR EN EUCARIONTES: MITOSIS Y CITOCINESIS.

El ciclo celular consta esencialmente de dos fases que habitualmente se alternan, La interfase y la divisin
celular. A su vez la Interfase de subdivide en periodo G1, periodo de sntesis S y periodo G2. La duracin
relativa de G1, S y G2 vara de un organismo a otro y dentro del mismo organismo segn el tejido. La
divisin celular comprende a su vez dos fenmenos diferentes e independientes que son la mitosis o
cariocinesis (reparto del material nuclear) y la citocinesis (reparto del citoplasma). Habitualmente, despus
de una mitosis se produce una citocinesis. En G1 los cromosomas estn constituidos por un solo cromatidio
procedente de la segregacin anafsica anterior. Para que una clula somtica vuelva a entrar en divisin
es necesario que antes se replique el material hereditario, por tanto, las clulas que entran en mitosis han
pasado previamente por un perodo S de sntesis de ADN. De forma que cuando las clulas entran en
mitosis, los cromosomas estn en estado de dos cromatidios.
La Mitosis o Cariocinesis (reparto del material nuclear) consta de laza siguientes fases: Profase, Metafase,
Anafase y Telofase. Cuando una clula somtica con 2n cromosomas entra en mitosis, todos sus
cromosomas estn en estado de dos cromatidios. Los dos cromatidios hermanos de cada cromosoma son
idnticos, contienen la misma informacin gentica ya que se han originado a partir de doble hlice de ADN
mediante replicacin semiconservativa.
En la Interfase el material nuclear, la cromatina, se encuentra descondensada y se observa el nucleolo.

Profase: la cromatina se va contrayendo gradualmente y al final de la profase desaparece la

membrana nuclear y el nucleolo y los cromosomas comienzan a dirigirse al centro de la clula al
ecuador.
Metafase: los cromosomas alcanzan su mximo grado de condensacin presentando sus bordes
ntidos y se sitan en la placa ecuatorial (centro de la clula). Tiene lugar la insercin de los
microtbulos (fibras) del huso acromtico en los cinetocoros centromricos. En la placa ecuatorial
hay 2n cromosomas constituidos por dos cromatidios.

Anafase: segregacin o separacin de los cromatidios hermanos de cada cromosoma y emigracin

a polos opuestos. Este tipo de segregacin se denomina Anfitlica, los dos cromatidios de un
cromosoma se separan y viajan a polos anafsicos opuestos. A cada polo viajan 2n cromatidios.

Telofase: Termina la emigracin a polos opuestos se descondensan los cromatidios se reconstruye

la membrana nuclear y se reorganiza el nucleolo. Finalmente aparecen dos ncleos hijos idnticos
que cada uno contiene 2n cromatidios.

Despus la citocinesis reparte el material citoplasmtico y aparecen dos clulas hijas idnticas. La
citocinesis en clulas vegetales se produce por coalescencia de vesculas del aparto de Golgi que dan
lugar al fragmoplasto figura en forma de tonel que adquiere el huso acromtico, al ser empujadas sus fibras
hacia fuera, el crecimiento de dicho tabique se produce del interior hacia el exterior de la clula. En las
clulas animales la citocinesis tiene lugar por estrangulamiento de fuera hacia dentro.
Fases del ciclo celular : meristemo radicular de cebolla
Interfase

Profase

Metafase

Anafase Temprana

Anafase Tarda

Telofase temprana

Telofase tarda

Dos clulas

10

LA REPRODUCCIN CROMATDICA SE AJUSTA AL MODELO SEMICONSERVATIVO: EXPERIMENTO

DE TAYLOR Y Col. (1957).
Taylor y colaboradores (1957) realizaron un experimento con clulas del meristemo radicular de Vicia faba
(juda) para tratar de averiguar como tiene lugar la replicacin de los cromatidios en esta especie
eucarionte. El experimento consisti en someter a las races durante un periodo de Sntesis (periodo S) a la
accin de la Timidina tritiada (TH3) y, posteriormente observar el patrn de marcaje radiactivo de los
cromosomas en la primera metafase mittica despus de la incorporacin del istopo y en la segunda
metafase mittica. Para ello, despus de la incorporacin del istopo cortaron las races las aplastaron
sobre un portaobjetos y despus realizaron una autorradiografa.
Las autorradiografas obtenidas ponan de manifiesto que las clulas de la primera metafase mittica
despus de la incorporacin del istopo tenan todos sus cromosomas marcados en sus dos cromatidios
con timidina tritiada (TH3). Sin embargo, las clulas de la segunda metafase mittica despus de la
incorporacin del istopo tenan todos sus cromosomas marcados pero solamente en uno de sus dos
cromatidios.

La explicacin que dieron a estos resultados fue que el cromatidio se comportaba como si fuera una doble
hlice de ADN y que se replicaba de forma semiconservativa. Para poder distinguir las clulas del
meristemo radicular de Vicia faba de la 1 Metafase mittica de las clulas de la 2 Metafase mittica,
trataron las raices con colchicina durante la primera divisin mittica. La colchicina inhibe la formacin de
las fibras del huso acromtico y, como consecuencia, se impide la anafase o separacin de los cromatidos
hermanos a polos opuestos apareciendo clulas con doble cantidad de cromosoma (poliploides). Por tanto,
las clulas de la 2 Metafase tenan doble nmero de cromosomas que las clulas de la 1 Metafase.
El siguiente esquema pone de manifiesto que si se supone que el cromatidio es una doble hlice de ADN
que se replica de forma semiconservativa, se obtienen los resultados observador por Taylor y
colaboradores, es decir, todos los cromosomas de la clula estn marcados en sus dos cromatidios en la 1
Metafase y todos los cromosomas de la clula estn marcados en un solo cromatidio en la 2 Metafase.

11

Existen mtodos de tincin ms recientes que permiten comprobar sin necesidad de realizar un marcaje
radiactivo que la replicacin de los cromatidios se ajusta al modelo semiconservativo. Las clulas pasan por
dos periodos de sntesis sucesivos en presencia de bromodesoxiuridina (BUdR). Posteriormente se tien
los cromosomas con Giemsa y con un colorante fluorescente. La bromodesoxiuridina es un anlogo de la
Timina y la sustituye durante la replicacin. Los cromatidios constituidos por dos cadenas con BUdR se
tien de color ms claro que los cromatidios que tienen una hlice original y otra con BUdR que se tien de
color oscuro. Este tipo de tincin origina los que se denomina cromosomas en arlequn, y es especialmente
adecuado para distinguir intercambios entre cromtidas hermanas.

2 Metafase (cromosomas en arlequn)

ALTERACIONES DEL CICLO CELULAR
Lo habitual es que despus de un perodo S de sntesis se produzca una mitosis o cariocinesis seguida de
una citocinesis. Sin embargo, en ocasiones en algunos tipos de clulas animales o vegetales de forma
natural o bien mediante tratamientos con determinados compuestos, es posible obtener variaciones en el
ciclo de divisin.
Las principales variaciones en el proceso de divisin celular se han resumido en la siguiente tabla:
VARIACIONES EN EL CICLO DE DIVISIN CELULAR
Endorreduplicacin: Varios perodos S sucesivos sin entrar en mitosis.
Variaciones en la
Cuadruplocromosomas. Politenia (cromosomas gigantes de Drosophila
Replicacin y reparto melanogaster).
del material hereditario
Haplocromosomas: Dos mitosis sucesivas sin perodo S entre ambas.
Variaciones que
Endomitosis: No desaparece la membrana nuclear, mitosis dentro del
afectan a los estados ncleo. Aparecen clulas poliploides.
mitticos
Variaciones en la anafase: inhibicin de la formacin del huso acromtico.
Con colchicina (c-mitosis) mediante anoxia (a-mitosis). Se duplica el nmero
de cromosomas y aparece una clula poliploide.

12

No reorganizacin del nucleolo: por mutaciones en la ARN Polimerasa I

Cariocinesis sin Citocinesis: La cafena inhibe la citocinesis, aparecen
clulas binucleadas (con dos ncleos)
Variaciones que afectan Citocinesis sin Cariocinesis: el bromuro de etidio provoca que las clulas se
a la citocinesis en
paren en profase y se reparta el citoplasma (citocinesis) sin haberse repartido
relacin con la
el material del ncleo.
cariocinesis
Citocinesis en clulas anucleadas: en algunos organismos en
determinados momentos se observa que clulas sin ncleo reparten su
citoplasma.

CARACTERSTICAS DE LA REPLICACIN EN BACTERIAS: NICO PUNTO DE ORIGEN, REPLICN

Como ya hemos visto la replicacin en bacterias se ajusta al modelo semiconservativo. En las bacterias
existe un solo origen de replicacin, denominado Ori C y, a partir de este nico punto de origen, la
replicacin progresa en dos direcciones, de manera que existen dos puntos de crecimiento (PC) u
horquillas de replicacin. El cromosoma bacteriano ser una unidad de replicacin se le denomina replicn.

El origen de replicacin en E. coli es una secuencia de 245 pb que contiene una secuencia de 13 pb
repetida tres veces en tndem. Adems esta regin contiene cuatro zonas de unin a la protena Dna A que
se encarga de separar las hlices para comenzar la replicacin.

13

Cuando las molculas de ADN circular se replican se observan lo que se denominan "ojos o burbujas" de
replicacin. La forma que adoptan los intermediarios de la replicacin se parece a de la letra griega .

Burbuja

Forma

EUCARIONTES: MUCHOS ORGENES DE REPLICACIN. MLTIPLES REPLICONES.

La principal diferencia de la replicacin de virus y bacterias con la replicacin de eucariontes radica en que
los eucariontes poseen muchos orgenes de replicacin, probablemente debido a la enorme cantidad de
ADN que poseen y a que su material hereditario en la inmensa mayora de los casos esta repartido en
varias molculas de ADN distintas o varios cromosomas. Por tanto, los eucariontes tienen en cada
cromosoma muchos orgenes de replicacin, y como consecuencia, muchos replicones (unidades de
replicacin).

Esquema con mltiples orgenes de replicacin

Muchos orgenes de replicacin en

D. Melanogaster

DIRECCIN DE SNTESIS 5' - 3', BIDIRECCIONAL

Las ADN polimerasas de E.coli (las enzimas encargadas de sintetizar ADN) solamente saben sintetizar
ADN en la direccin 5' - 3'. Es decir, solamente son capaces de aadir nucletidos al extremo 3' OH de otro
nucletido trifosfato. Las ADN polimerasas necesitan un extremo 3' OH al que aadir nucletidos trifosfato
para comenzar la sntesis de ADN.
La replicacin del ADN en E. coli es bidireccional, ya que a partir de un punto de origen progresa en dos
direcciones opuestas, existiendo dos puntos de crecimiento (PC) u horquillas de replicacin. Cuando se
mira solamente una de las horquillas de replicacin, una de las hlices se sintetiza de forma continua, la
hlice conductora (tambin llamada hlice lder), mientras que la otra hlice se sintetiza de manera
discontinua, hlice retardada (tambin llamada hlice retrasada), a base de fragmentos cortos. Si se
observan simultneamente las dos horquillas de replicacin, a un lado del origen la hlice de nueva sntesis
se polimeriza de forma continua, mientras que al otro lado del origen se polimeriza de forma discontinua.

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Para demostrar que la replicacin es bidireccional se pueden realizar experimentos que se denominan de
pulso y caza, en los que la clula es expuesta durante un breve periodo de tiempo en un medio con timidina
tritiada TH3 (pulso) y despus se pasa a un medio con timidina no radiactiva (fra) en exceso (caza).
Posteriormente se extiende el ADN se un portaobjetos y despus se realiza una autorradiografa.

SEMIDISCONTINUA, FRAGMENTOS DE OKAZAKI

Debido al antiparalelismo de las dos hlices del ADN y a que las ADN polimerasas solamente saben
sintetiza ADN en la direccin 5'P - 3'OH, la sntesis de una de las hebras se puede realizar de forma
continua, mientras que la otra hlice para poder sintetizarla al mismo tiempo se necesita polimerizarla a
base de ir aadiendo pequeos fragmentos (fragmentos o piezas de Okazaki). Como una hlice se sintetiza
de forma continua y la otra lo hace de forma discontinua, se dice que la Replicacin es Semidiscontinua.

INICIACIN MEDIANTE ARN CEBADOR

Como ya hemos dicho anteriormente, las ADN polimerasas solamente saben sintetizar ADN en la direccin
5' - 3' aadiendo nucletidos al extremo 3' OH de otro nucletido. Para que puedan iniciar la sntesis de
ADN necesitan un extremo 3' OH al que ir aadiendo nucletidos, y ese extremo 3' OH lo suministra un
ARN de pequeo tamao alrededor de 25 a 30 ribonucletidos que se denomina ARN cebador o "primer".
La sntesis de ADN comienza, por tanto, sintetizando un corto segmento de ARN denominado cebador,
dicho cebador lo sintetiza un enzima denominado Primasa. La Primasa es una ARN polimerasa que utiliza

15

como molde ADN. Todos los fragmentos de Okazaki comienzan por un Cebador. Posteriormente, la
Holoenzima de ADN polimerasa III lleva a cabo la sntesis del fragmento de ADN correspondiente hasta
llegar al siguiente cebador. En ese momento, la ADN polimerasa I sustituye a la Holoenzima de ADN
polimerasa III. La ADN polimerasa I se encarga de retirar el ARN cebador mediante su actividad
exonuetdica 5'P - 3' OH y al mismo tiempo rellena el hueco sintetizando ADN.

Por ltimo, los dos fragmentos de Okazaki tienen que unirse, es necesario enlazar el extremo 3'OH de un
fragmento con el 5'P del siguiente fragmento. Dicha labor de sellado y unin de los sucesivos fragmentos la
realiza la Ligasa.

CRCULO RODADOR
Los mecanismos de replicacin en virus y bacterias dependen de la propia estructura del material
hereditario o cromosoma de la especie procarionte estudiada. Por tanto, el mecanismo de replicacin vara
segn se trata de molculas de ADN circulares doble hlice (E. coli, parvovirus), ADN circular de una hlice
(fX174), ADN doble hlice lineal con redundancia Terminal (fago T7) o ADN doble hlice lineal con extremos
cohesivos (fago l). El mecanismo de replicacin puede adoptar la forma q (E. coli, plasmidios), el modelo
del circulo rodador (fX174, Fago l) o el Lazo de desplazamiento o lazo D (ADN mitocondrial).
En el modelo del crculo rodador una endonucleasa corta una de las hlices (hlice externa en el esquema)
y el extremo 5' se fija a la membrana. El extremo 3'OH producido por el corte lo utiliza la ADN polimerasa
como cebador para ir aadiendo nucletidos y copiando la otra hlice (hlice interna en el esquema). Por el
otro extremo de la hlice cortada (el extremo 5') tambin se va sintetizando una nueva hebra. Lo que se
supone que sucede es que la hlice interna girara de forma continua en el sentido indicado haciendo que
cada vez saliera ms cantidad de la hlice inicialmente cortada por la endonucleasa. La hlice interna
seguira dando vueltas de forma que sera copiada varias veces al igual que la hlice que emerge por el
lado derecho, formndose una molcula ADN doble hlice muy larga que contienen varias copias sucesivas
del ADN del fago. Estas molculas reciben el nombre de multmeros o concatmeros. El caso del fago l,
posteriormente una endonucleasa denominada ter reconoce la secuencia de doce pares de bases de los
extremos cohesivos del fago y produce un corte asimtrico para liberar copias independientes del ADN
doble hlice lineal del fago.

16

Esquema Circulo rodador

Circulo rodador

REPLICACIN DE LOS TELMEROS

Las molculas ADN doble hlice lineal tienen problemas para replicar sus extremos, ya que las ADN
polimerasas necesitan un extremo 3' OH al que ir aadiendo nucletidos. Uno de los extremos de cada
hlice (el extremo 5') se puede copiar sin problemas debido a que viene cebado desde atrs, sin embargo,
el extremo contrario (extremo 3') no podra replicarse ya que no puede ser cebado desde atrs. Como
consecuencia quedara un corto segmento al final sin copiarse y se ira acortando el ADN por ese extremo
en cada ronda de replicacin.

Problemas de replicacin de los extremos

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Algunos virus resuelven este problema de una manera sencilla. Por ejemplo, el fago l cuyo material
hereditario es ADN doble hlice lineal con extremos cohesivos, lo primero que hace cuando infecta a E. coli
y va a replicar su ADN es convertirse en ADN doble hlice circular a travs de los extremos cohesivos. De
este manera, ya han desaparecido los problemas de replicacin de los extremos lineales.
Otros virus, como los Adenovirus resuelven el problema gracias a la existencia de una protena que se une
al extremo 5' y que contiene un residuo de serina unido a un nucletido CTP que suministra el extremo 3'
necesario para que la ADN polimerasa pueda cebarse y copiar el extremo. La protena que forma un
complejo con la ADN polimerasa tiene 80 Kd, sin embargo, la protena que aparece en el interior de las
partculas virales maduras tiene solamente 55 Kd. Por tanto, durante la maduracin del virus debe ser
procesada y pasar de 80 Kd a 55 Kd. El virus f29 tambin tiene protenas unidas al extremo 5' implicadas
en la replicacin y algunos virus ARN como el virus de la polio poseen protenas de bajo peso molecular
(Vpg) con solo 22 aminocidos estn unidas al extremo 5' .

Replicacin de los extremos en Adenovirus

La replicacin de los extremos de los cromosomas eucariticos tambin supone un problema, ya que los
cromatidios son molculas de ADN doble hlice lineal y se iran acortando en las sucesivas replicaciones.
La manera de solventar este problema consiste en disponer de secuencias repetidas en los extremos, los
telmeros eucariticos contienen una secuencia corta rica en Guanina repetida cientos de veces ( por
ejemplo la secuencia 5' TTGGGG 3' en el ciliado Tetrahymena). Adems, los telmeros poseen extremos 3'
monocatenarios que pueden autoaprearse y suministrar un extremo 3' para replicar los extremos
cromosmicos.

Un enzima denominado Telomerasa aade estas secuencias a los extremos cromosmicos. La Telomerasa
lleva una corta secuencia de ARN (por ejemplo AACCCC) que sirve de molde para sintetiza la secuencia
repetida de los extremos (TTGGGG). La telomerasa, es una transcriptasa inversa, ya que tomando como
molde ARN sintetiza ADN. La adicin de estas secuencias cortas que lleva a cabo la Telomerasa
contrarresta la tendencia al acortamiento de los telmeros durante la replicacin normal.

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La telomerasa tiene un pequeo fragmento de ARN

LAS ADN POLIMERASAS DE E. Coli.

En la bacteria E. coli Arthur Kornberg encontr tres ADN polimerasas diferentes, la ADN Pol I, ADN Pol II y
ADN Pol III. Por sus estudios sobre la replicacin del ADN y las polimerasas le concedieron el Premio
Nobel en 1959.
Las principales etapas de la sntesis de ADN son:

Sntesis de los desoxirribonucletidos monofosfato (dNMPs): dAMP, dTMP, dGMP y dCMP.

Fosforilacin mediante Quinasas de los dNMP, para convertirlos en desoxirribonucletidostrifosfato
dNTPs: dATP, dTTP, dGTP y dCTP.

Polimerizacin o sntesis del ADN: seleccin de los dNTPs complementarios a las de la cadena
molde y formacin del enlace fosfodister entre el extremo 3' del nucletido (dNTP) anteriormente
incorporado y el extremo 5'P del siguiente dNTP.

Las ADN Polimerasas de E. coli solamente saben sintetizar (polimerizar) ADN en la direccin 5'P - 3'OH.
Las principales caractersticas de las ADN Polimerasas de E.coli, se pueden resumir en la siguiente tabla:
ADN Pol I

ADN Pol II

ADN Pol III

109.000

90.000

900.000

Monmero

Monmero

Multmero asimtrico

400

Desconocido

10-20

Polimerasa 5'-3' /Elongacin

SI

SI

SI

Exonucleasa 3'-5'/Correctora

SI

SI

SI

Exonucleasa 5'-3'/Reparacin

SI

NO

NO

Estructura
PM (dalton)
Constitucin
N Polimerasas/clula
Actividad/Funcin

La ADN Pol III y la ADN Pol I son las enzimas que intervienen directamente en la replicacin del ADN de E.
coli. La ADN Pol I tiene un papel reparador, retira los cebadores con su actividad exonucleasa 5'- 3' y
rellena el hueco con su actividad polimerasa 5'- 3'.
A la ADN Pol II se la asigna exclusivamente una funcin reparadora, pero la muchas de sus caractersticas
y el papel que juega en la replicacin del ADN, si es que juega alguno, son desconocidas.
La ADN Pol III es la enzima que realiza la mayora de la replicacin del ADN, el corazn cataltico del
enzima lo constituyen las subunidades a (encargada de la polimerizacin), e (realiza la funcin correctora
de pruebas) y q (ensamblaje de las subunidades?). Realmente, el complejo enzimtico que lleva a cabo la

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replicacin es un multmero denominado Holoenzima de ADN Pol III que posee muchas cadenas o
subunidades polipeptdicas. Este multmero es realmente un dmero asimtrico, una mitad del dmero se
encarga de sintetizar la hlice retardada y la otra mitad sintetiza la hlice conductora. La subunidad t
interviene en la unin del dmero, el complejo g-d produce la unin al ADN molde y la subunidad b sujeta el
enzima al ADN.

Esquema de la formacin y composicin del Holoenzima de ADN Pol III

El proceso de sntesis de ADN tiene que producir dos molculas exactamente iguales, ya que cualquier
error que se cometa durante la replicacin, si no se repara, se convertir en una mutacin. Por tanto, Las
ADN polimerasas deben ser bastante fieles copiando el ADN. Para ello poseen una funcin correctora de
pruebas que retira el ltimo nucletido que la polimerasa haya introducido de forma incorrecta, dicha
funcin, se denomina funcin exonucleasa 3' - 5' y la lleva a cabo la subunidad e de la ADN Pol III.

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En el siguiente esquema se indica como la subunidad e de la ADN Pol III retira la Adenina introducida de
forma incorrecta mediante la funcin exonucleasa 3' - 5'.

LAS ADN POLIMERASAS EUCARITICAS

Las ADN polimerasas eucariticas tienen una diferencia interesante con las ADN polimerasas de E. coli, ya
que se utilizan dos polimerasas diferentes una para sintetizar la hlice conductora y otra para producir la
hlice retardada. La ADN polimerasa sintetiza la hlice retardada mientras que la ADN polimerasa
sintetiza la hlice conductora. En la siguiente tabla se resumen las polimerasas de mamferos:
ENZIMA

FUNCIN

ADN Pol

Sntesis Hlice retardada. Sntesis del cebador: 10 bases de ADN y 25 de ARN.

ADN Pol

Sntesis de la Hlice conductora.

ADN Pol

Polimerizacin de las Piezas de Okazaki.

ADN Pol

Unin de los fragmentos de Okazaki ( de aproximadamente 250 pb).

ADN Pol

Sntesis ADN mitocondrial.

REPLICACIN DEL ADN MITOCONDRIAL: LAZOS D

La replicacin del ADN mitocondrial en mamferos se ajusta al modelo del Lazo de Desplazamiento o lazo
D. Las dos hlices del ADN mitocondrial se pueden diferenciar en base a su densidad, existiendo una
hlice Ligera (L) y otra hlice pesad (H). En primer lugar, se inicia la replicacin o sntesis de la nueva
Hlice Ligera (L), sin que se comience la replicacin de la nueva hlice pesada. El origen de replicacin de
la hlice ligera (L) es diferente al de la hlice pesada (H), de forma que existen dos orgenes de replicacin
diferentes para cada una. Adems, una vez iniciada la replicacin de la nueva hlice ligera (L), la sntesis
es unidireccional, tienen lugar en una sola direccin y avanza desplazando a la otra hebra. Cuando se ha
sintetizado, aproximadamente, 2/3 de la nueva hlice ligera, comienza la sntesis de la nueva hlice pesada
(H), en una sola direccin opuesta a la de sntesis de la hlice ligera L. Por consiguiente, la sntesis de la
nueva hlice L termina antes que la de la nueva hlice H. Como se puede ver, la replicacin del ADN

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mitocondrial es diferente a la del cromosoma de E. coli, existen dos orgenes de replicacin diferentes para
cada hlice y la replicacin es unidireccional.

Replicacin ADN mitocondrial

ADN mitocondrial

OTRAS ENZIMAS QUE INTERVIENEN EN LA REPLICACIN: LIGASAS, GIRASAS,

TOPOISOMERASAS, ETC.
Adems de las ADN polimerasas I y III, de la ARN-Polimerasa o Primasa que sintetiza el cebador y de las
Ligasas que unen las piezas de Okazaki, en la replicacin del ADN intervienen otras enzimas. Algunas de
estas enzimas son las siguientes:

Helicasas: son enzimas que rompen los puentes de hidrgeno que mantienen unidas las dos
cadenas de la doble hlice. Entre las helicasas de E. coli se encuentran las protenas Dna B y Rep.
La protena Rep parece ayudar a desenrollar la doble hlice por delante de la polimerasa.
La protena SSB: se une al ADN de hlice sencilla y lo estabiliza retrasando la regeneracin de la
doble hlice.

La accin de las Helicasas durante la replicacin genera retorcimientos que deben ser eliminados. El ADN
circular puede sufrir enrollamientos y retorcimientos, dichos superenrollamientos se generan y eliminan por
enzimas denominadas Topoisomerasas.

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Topoisomerasas: pueden producir o eliminar nudos o enlaces en una hlice. existen

toposiomerasas de la clase I que cortan solamente una de las dos hlices y topoisomerasas de la
clase II que cortan ambas cadenas. En E. coli, las enzimas Topi I i Topo III pertenecen a la clase I,
mientras que la la Girasa es de la clase II. Cuando se separan las dos hlices durante el avance de
la horquilla de replicacin se producen superenrollamientos positivos en otras regiones que relajan
la tensin. La Girasase necesita para eliminar los superenrollamientos positivos que se generan por
delante de la horquilla de replicacin.

Retorcimientos y enrollamientos del ADN circular

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Superenrrolamiento en ADN doble hlice circular.

Autor: Csar Benito Jimnez, Profesor Titular de Gentica, Departamento de Gentica, U.C.M.

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ENSEANZA Y EL APRENDIZAJE
DE ESTAS DISCIPLINAS CIENTFICAS.

Comit asesor de
publicaciones.
Facultad de
Medicina, UNAM

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