JSSN 1561--0861

Gencia e Investigacin 8 (2)

Facultad de Farmacia y Bioqumica

UNMSM2005

APLICACIONES DE LAS HALOCINAS PRODUCIDAS POR

ARQUEAS HALFILAS
Inmaculada Meseguer Soria
Dpto. de Produccin Vegetal y Microbiologa. Universidad J\.1iguel Hernndez de Elche
""Avda. de la lJniversidud s/n, Edificiu Turreguitcn. 03202 ELCHE (Alicante) SPAIN
E-mail: meseguerumh.es

BACTERIOCINAS
El trmino bacteriocina se emple inicialmente para
describir protenas producidas por bacterias Gram
negativas con capacidad antibitica frente a organismos filogenticani.ente emparentados con la productora. Se trataba de protenas de peso molecular
relativamente elevado, codificadas en plsmidos
con un espertro de accin reducido, modo de accin
bactericida, unin a receptores especficos, etc 11 l. Estos criterios se extrajeron de los primeros grupos de
bacteriocinas que se descubrieron y estudiaron que
fueron las colicinas producidas por Escherchia culi.
Sin embargo, a medida que aumentaba el nmero
de bacteriocinas estudiadas, corno las producidas
por bacterias Gram positivas, comenzaron a aparecer algunas que no cumplfan tales criterios, as,
algunas tienen un espectro de accin ms amplio~
otras son pplidos de bajo peso 1nolecular como las
microcinas, en muchos casos no necesitan la interaccin con un receptor especfico, sino que su accin
se ve ayudada por la secrecin de otros enzimas
como las lisinas, ele. Estas diferencias han llevado a
<l<.'finir el acrnimo ingls BLIS (bacteriocin like inhibitory substance) para todas aquellas substancias
que cumpl1::.n al menos dos requisitos esenciales:
Que sean protenas o pptidos sintetizados rihosmicamente (para diferenciar de los antibiticos peptdicos) y liberados al exterior celular.
Que su modo de accin sea bactericida.
SIGNIFICADO BIOLGICO
Resulta muy tentador asignar a las bacteriocinas un
papel importante en la regulacin de la dinmica de
poblaciones en eco::;i::;tcmas nticrobianos. Cn dato
que apoya esta hiptesis es el hecho de que las bacteriocinas son ubicuas y prcticamente se han encontrado en todos los grupos procariticos en que
se han buscado.

En la actualidad, no se dispone de resultados fehacientes que demuestren el papel que juegan las
halocinas y en general todas las bacteriocinas en el
medio natural. Todo parece apuntar a que la produccin de estas sustancias es un rr1ccanismo de
competencia territorial, que permite a los microorganismos eliminar posibles competidores por los
nutrientes, la luz, el oxgeno, etc. Este objetivo parece en s mismo suficiente para que los microorganisni.os destinen parle de sus recursos energticos
a la produccin de estas sustancias. As lo piensan
una parle in1portante de los cientficos que trabajan
en este campo. Sin embargo y, a pesar de la lgica
del razona1nicntu, lo::; intentos que se han realizado
hasta la fecha para demostrar su significado biolgico en el medio nah1ral, no han dado resultados
suficien ten1en te con el u yen Les.
Otros autores opinan que en realidad las bactcriodnas tal vez intervengan en algn proceso vital para
las clulas que las producen, es decir, que tienen
una funcin prilnaria distinta a la actividad antibitica que manifiestan sobre otros organismos.
Sea cual fuere el planteamiento que se acepte, lo
cierto es que la capacidad de producir bactcriocinas
proporciona, al menos en teora, ciertas ventajas a
los microorganismos que la poseen.
La presencia de receptores especficos (estructuras
presentes en las clulas sensibles donde se unen las
bacteriocinas) es otra in.cgnita sin resolver. Algunos autoresJ han discutido sobre la "razn de ser"
de estos rPcPplores y sugieren que deben tener seguramente una funcin esencial alternativa para las
i;:lulas. Es indudable desde luegu, que si dicho::; receptores no tuviesen otra funcin que la de permitir
la unin de una bacteriocina, sera absurdo que las
clulas lo conservasen en su propio detrimento.

102

Aplicaciones de las halocinas producidas por arqueas halfilas

MECANISMO DE ACCIN
Una de las caractersticas comunes a las BUS mejor
estudiadas es que actan sobre las clulas suscep
tibies afectando una estructura o funcin concreta
cuyo dao es responsable de la muerte celular. La
forma en que las BUS atacan a las clulas es lo que
se conoce como mecanismo de accin y la estructura
o funcin que atacan es el objetivo primario o diana.
Llegar a conocer el mecanismo de accin y el objetivo primario de una bacteriocina es una tarea ms
compleja de lo que en principio pudiera pensarse ya
que se ha comprobado en numerosos estudios que
existe todo un abanico de posibilidades de intervencin de las BUS. El principal inconveniente es poder diferenciar entre el efecto inmediato producido
por una bacteriocina sobre su objetivo, y los efectos
secundarios que se desencadenan inmediatamente.
En el caso de las bacteriocinas producidas por bacterias, ya se conocen unos cuantos mecanismos de
accin. As hay ciertas colicinas que tienen actividad
RNasa o endonucleasa sobre el DNA, algunas forman canales permeables a los iones en la membrana
citoplasmtica, otras actan sobre la sntesis de macromolculas (protenas, DNA, RNA, peptidoglicano), etc' 1l. Entre las halocinas estudiadas, nicamente se ha llegado a conocer el mecanismo de accin
de la halocina H6 que trataremos ms adelante.

Las halocinas, y en general, las bacteriocinas suelen

poseer un espectro de accin determinado. Esto significa que una bacteriocina es letal frente a determinadas especies pero no frente a otras. Este hecho se
explica por el modo de accin de las bacteriocinas
que normalmente requieren la presencia de un receptor apropiado en la envoltura celular de los organismos susceptibles, por el cual se unen antes de
ejercer su efecto. As, en principio, es posible diferenciar entre dos bacteriocinas si poseen un espectro de accin diferente. Frecuentemente, las cepas
productoras son inmunes a su propia bacteriocina,
pero en ocasiones son sensibles, si bien la sensibilidad que manifiestan suele ser dbil.
El espectro de accin de una halocina se determina ensayando su actividad sobre el mayor nmero
posible de cepas disponibles. Un estudio de estas
caractersticas requiere una coleccin de al menos
40-50 cepas. De este modo, se enfrentan unas a otras
para detectar actividades antagnicas entre ellas. El
procedimiento habitual consiste en inocular la cepa
indicadora en doble capa y sobre sta colocar pequeas gotas (10 microlitros) a partir de suspensiones
acuosas de todas las cepas (figura 1). Tras la incubacin se observan los halos de inhibicin que indican
la presencia de una sustancia antibitica. Se obtiene
as el espectro de sensibilidad de la cepa inoculada

HALOCINAS: ANTAGONISMOS ENTRE ARQUEAS HALFILAS

Las halocinas son sustancias BUS, producidas por
arqueas halfilas. Su descubrimiento tuvo lugar en
1982(3) y, aunque en aquel primer estudio nicamente se detectaron 7 microorganismos productores, posteriormente se ha podido comprobar que los
antagonismos debidos a la produccin de halocinas
es un hecho bastante comn entre las arqueas halfilas, hasta el punto de que prcticamente todas
las que se han estudiado producen algn tipo de
halocinas(4, 5l. Se podra considerar una excepcin,
ya que hasta la fecha no se ha descrito ninguna
halocina producida por especies del gnero Halococcus. Sin embargo, hay que tener presente que el
descubrimiento de una sustancia antibitica precisa
encontrar el microorganismo indicador o sensible,
que ponga de manifiesto tal actividad. En ocasiones
resulta difcil encontrar dicho indicador, por lo que
no se puede descartar su existencia.

Figura 1. Espectro de sensibilidad de Halobacterium salinarum (en doble capa) frente a 18 cepas diferentes. En la
imagen se pueden apreciar tanto las cepas productoras
que han originado halos de inhibicin, corno las no productoras que han crecido sobre la doble capa.

Inmaculada Meseguer Soria

en la doble capa. Se realiza el mismo procedimiento

con cada una de las cepas en estudio hasta haber

ensayado todas contra todas.
Uno de los problemas que se presentan en este tipo
de estudios es que las cepas a enfrentar tengan una
velocidad de crecimiento muy diferente. Normalmente, las halocinas estudiadas suelen producirse
al final de la fase exponencial de crecimiento. As,
si la cepa que inoculanlos en doble capa crece 1ns
rpido que las otras, cuando stas inician la produc-

cin, la doble capa ya ha crecido y no se aprecian

halos de inhibicin. Para estos casos, ser necesario
emplear mtodos alternativos para asegurar la presencia de la halocina antes de que crezca el microorganismo de la doble capa (p.e. cultivar las cepas de
crecimiento lento en medio lquido hasta avanzada
la fase exponencial y utilizar el cultivo en vez de la
suspensin acuosa).

El resultado de un estudio de este tipo se muestra

en la figura 2, donde las lneas horizontales representan los espectros de accin y las verticales los
espectros de sensibilidad. Este tipo de estudios son
muy interesantes, ya que aportan mucha informacin como los espectros de accin y de sensibilidad,

103

diversidad de halocinas, si se trata de una caracterstica frecuente o no, etc. Pero quizs tanto o ms

importante es el hecho de que abren un gran abanico

de posibilidades de estudio de nuevas halocinas.
Siguiendo con el ejemplo ilustrado en la figura 2,
se aprecia espectros de accin (lfneas horizontales)
muy extensos, por ejemplo los de las cepas n 1 y
2 (margen izquierdo), que producen sendas halocinas capaces dt' inhibir a prcticamt'nte tudas las
cepas. En contraste, las cepas de la mitad inferior

de la imagen, presentan espectros de accin muy

reducidos, ya que apenas inhiben a unas pocas. Del
mismo modo, se puede observar los espectros de
sensibilidad (lneas verticales), donde se observa
cepas sensibles a muchas halocinas, como la cepa n
3 (margen superior) frente a otras que no son sensibles a prcticamente ninguna, como la cepa n 46
(margen superior).

Un aspecto destacable en la figura 2, es que prcticamente todos los microorganismos ensayados

producen halocinas y que adems los espectros de

accin son aparentemente diferentes. Esto equival-

dra a decir que existen tantas halocinas distintas

como cepas se han ensayado, lo cual genera una expectativa casi inagotable de objetivos para futuros
estudios. Sin embargo, antes de iniciar el estudio de
una nueva halocina es importante comprobar que
la actividad inhibitoria es realmente debida a una
halocina y no a otra causa como a la produccin de

enzimas hidrolticas o bacterifagos.

HALOCINAS ESTUDIADAS

En contraste con el gran nmero de halocinas que se

han detectado, el nmero de ellas que han sido estudiadas en profundidad es muy reducido (tabla 1).

' .

Como puede apreciarse en la tabla 1, la mayora de

las halocinas que se han caracterizado hasta el mo60

..
Figura 2. Actividades antagnicas f'nlrP 69 cPpas de haloarqueas, debidas a la produccin de halocinas. Al margen izquierdo se enumeran las cepas como productoras
y en el superior las mismas cepas como indicadoras. (*)
Actividad inhibitoria positiva; (o) actividad inhibitoria
frente a s misma; los espacios en blanco indican ausencia
de actividad.

mento, excepto la 114 y la I 11, son pptidos de bajo

peso molecular, ms comparables a las microcinas
bacterianas. Por ello, resulta ms adecuado referirnos a ellas con el trmino microhalocinas. Adems,
al igual que algunas de las microcinas, stas tambin se sintetizan como un precursor o pre-protena de mayor peso molecular que posteriormente es
procesada por la accin de proteasas para dar lugar
a la forma madura de la halocina.

104

Aplicaciones de las halocinas producidas por arqueas halfilar

Tabla 1. Halodnas caracterizadas hasta la fecha.

HALOCINA

H4

Microorganismo
productor

Peso molecular

Precursor

l. Referencia

Haloferax mediterrane R4 (ATCC

34,9kD

No

Meseguer & Rodriguez-Valera,

1985 (6)

2,SkD

Si

Rdest & Sturm, 1987 (7)

6,2kD

No hay datos

Rdest & Sturm, 1987 (7)

33500)

HalRl

Halobacterium spp.
GN101

HalR2

Halobacterium spp.
TuA4

H6

Haloferax gibbonsi
(ATCC 33959)

2,7kD

Probablemente

Torreblanta et al., 1989 (8)

Hl

Haloferax mediterranei :M.2a

31 kD

No

Platas et al., 1996 (9)

S8

CepaS8a

3,58 kD

Si

Price & Shand, 2000 (1 O)

es

Halobacterium spp.
AS7092

6,3kD

Si

Li et al., 2003 (11)

'

Los genes que codifican halocinas, estudiados hasta

el momento, se han localizado en plsmidos. sta
tambin es una caracterstica muy tpica de las bacteriodnas bacterianas.
Un tema tambin .interesante es el de la inmunidad. En Ja figura 2, se observa como algunas cepas
manifiestan cierta sensibilidad a su propia halodna, aunque lo normal es que los microorganismos
productores sean inmunes a su propio inhibidor.
En bacterias, este efecto se ha identificado con la
produccin simultnea de protenas responsables
de la inmunidad, que impiden la actividad de la
bacteriocina. Entre las halocinas, nicamente se ha
descrito un caso, el de Halobacterium spp. AS7092
que produce HalC8 (halocina CS) y Hall (protena
responsable de la inmunidad) ambas codific.adas en
el mismo gen112\
A continuacin, se describen las halocinas H4 y H6,
por ser las ms estudiadas con relacin al mecanismo de accin.
HalocinaH4
La halodna H4, la primera que se descbri, fue
estudiada y caracterizada en primera instancia por

nuestro grupoi6' y, con posterioridad, el gen fue clonado y secuenciado por otro grupol13', H4 se obtiene
del sobrenadante de cultivos de Hfx. mediterrane.
La mxima actividad se alcanza al final de la fase
estacionaria, momento en el cual se eliminan las clulas para proceder a la extraccin y purificacin de
la halodna. Se trata de una protena que se sintetiza como una pre-protena de 39.6 kD que luego es
procesada para dar lugar a la forma madura de 34.9
kD. Es una protena sal-dependiente y posee una regin hidrofbica de 32 residuos de aminocidos en
el centro de la secuencia peptdico. H4 posee un espectro de accin bastante amplo"'. En contacto con
las clulas sensibles, se adsorbe y produce la muerte
celular, hinchando y deformando las clulas. Estudios realizados para determinar el mecanismo de
accin, mostraron que produce inhibicin tanto del
transporte de aminocidos como del retomo pasivo de protones al medio intracelularll<>. Las clulas
tratadas con H4, sufren un aumento del volumen
intracelular y se lsan. Tales efectos sugieren que el
objetivo primario de esta halocina se encuentra loca-J
liza do en la membrana citoplasmtica y concuerdan
con la presencia de Ja mencionada regin hid:rof-,
bica de la molcula. La H4 se unira a la membraru
alterando su permeabildad y equilibrio inico, pro
<luciendo finalmente la muerte celular.

Inmaculada Meseguer Soria

Halocina H6
La halocina H6 es, sin duda, la de mayor inters desde el punto de vista biotecnolgico. Fue la segunda
halocina estudiada por nuestro grupo y sigue siendo, todava en la actualidad, objeto de nuestras investigaciones a nivel molecular y de aplicaciones.
H6 se obtiene a partir de cultivos de Hfx. gibbonsii al
final de la fase exponencial de crecimiento (8). Tras
eliminar las clulas, el sobrenadante se concentra
por ultrafiltracin tangencial utilizando membranas

filtrantes de tienen un tamao de poro inferior al tamao de la protena. Una propiedad curiosa de esta
halocina es que empleando mtodos poco agresivos
para la purificacin se obtiene una protena activa
de 32 kD (determinado por HPLC}; sin embargo,
cuando se utilizan mtodos ms agresivos para la
clarificacin o limpieza de la muestra, tales corno la
precipitacin con acelona, la H6, que pern1anece en

solucin, se identifica en realidad con un pptido de

2-3 kD de peso molecular (determinado por SDSP AGE) que tiene la misma actividad que la protena
de 32 kD (resultados no publicados). Todava no estn aclarados estos hechos, pero una hiptesis plausible es que el pptido de bajo peso molecular forma
un agregado con otra molcula protica que le sirve
de trasporte pero, al tratar con acetona se disgregan
y, mientras el pptido se queda en el sobrenadante, la protena mayor tamao se precipita junto con
otras protenas. Tambin es posible, que del mismo
modo que sucede con otras microhalocinas, inicialmente se sintetice como una pre-protena de 32 kD,
que despus es procesada por proteasas para dar
la forma madura y activa de 2,7 kD. Pero una vez
formada, en lug\1-r de separarse completamente, la
microhalocina permanece unida al resto de ]a mo-

105

lcula por uniones dbiles (puentes de hidrgeno,

cargas, etc.) aunque, en conjunto, lo suficientemente
fuertes como para que requiera un tratamiento relativamente agresivo para su separacin.
El aspecto ms importante de la halocina H6, que
sugiere su potencial aplicado, es su mecanismo de
accin. La halocina H6 es 11n inhibidor especfico del
intercambiador Na+ /H+ o NHE, (acrnimo del ingls: sodium proton exchanger)( 14l. Las haloarqueas
viven en un ambiente donde la concentracin de

Na alcanza valores de saturacin (3-4 molar). Sin

embargo, la concentracin de Na+ en el medio intracelular, oscila entre valores de 0,5 a 3 dependiendo
de las especies y, por encima de stos valores, comienza a ser perjudicial para la actividad celular.
Para contrarrestar la entrada de Na+, estos microorganismos disponen de un NHE unidireccional activado por la fuerza protn motriz, que se encarga
de extraer este catin del citoplasma en contra de su
gradiente. Si el NHE deja de funcionar, la concentracin de Na+ intracelular aumenta rpidamente,
provocando un desajuste osmtico. El agua comienza a entrar, las clulas se hinchan progresivamente
y finalmente se lisan (Figura 3).
As pues, el mecanismo de accin de la halocina H6,
realmente es un procedimiento tremendamente eficaz para destruir clulas de arqueas halfilas.
APUCACIONFS DF LAS HAIDCINAS
El espectro de accin de la halocina H6 frente a otras
haloarqueas, no es muy amplio, pero en contraste,
su actividad no se restringe a las arqueas halfilas
sino que sorprendentemente es capaz de inhibir el

Figura 3. Cambios morfolgicos de clulas de H. salinarum tratadas con halocina H6. Las barras representan 1 m. (a) Clulas no tratadas; (b) despus de 5 horas de iniciar el tratamiento; (c) a las 24 horas de iniciar el tratamiento.

106

Aplicaciones de las halocinas producidas por arqueas halfila.

NHE de clulas eucariotas. Este es el primer caso en

que uoa bacteriocina o BLIS ejerce su efecto sobre
organismos tan distantes filogenticamente del productor. Sin embargo, este hecho no hace ms que
aportar una nueva evidencia de la relacin entre
arqueas y eucariotas. Adems, esto es realmente lo
que ms importa desde el punto de vista aplicado
de esta halocina, ya que el l'\HE es uo mecanismo
presente en todas las clulas conocidas, tanto procariotas como eucariotas. En todas ellas, es bidireccional (excepto en las arqueas halfilas), y tiene fuociones tan importantes como la regulacin del pH
y el volumen intracelular. De hecho, en mamferos
algw1os estadut-J patolgicos provocan la hiperactividad del NIIE que causa daos irreversibles en las
clulas que las conduce a la muerte. Tales estados
patolgicos son, por ejemplo, situaciones de isquemia como las que se producen en el infarto de miocardio o el cerebral. Si en esos procesos patolgicos
se pudiera administrar un inhibidor del NHE, muchas clulas podran sobrevivir. Y esto es realmente

lo que ocurre. Ensayos realizados en animales de

experimentacin han puesto de manifiesto un gran
efecto protector del miocardio al suministrar halocina H6 intravenosa a los animales durante el infarto.
En dichos experimentos tambin se demostr uoa
importante reduccin de arritmias y de la hipertensin arterial (15). Asimismo se ha demostrado in
vitro que la H6 es activa sobre el NHE de clulas
humanas en cultivo (15).

Estos resultados, que han sido objeto de uoa patente (15), permiten pensar en la utilizacin de la
halocina H6 para la fabricacin de frmacos para
el tratamiento de procesos patolgicos provoc;idos
por uoa hiperactividad del NHE. En la actualidad,
existen alguoos inhibidores del NHE, como ciertos
derivados del amiloritle, que estn siendo objeto de
estudio para su aplicaci11 farmacolgica. Sin em-

bargo, frente a la especificidad de accin de la halocina H6, estas otras sustancias son menos especficas por lo que afectan otros mecanismos y producen

efectqs secundarios no deseables.

_Otro caso de posible aplicacin de las halocinas se
refiere a su capacidad para inhibir el crecimiento de

otras arqueas halfilas. Durante el procedimiento

del curtido de pieles se utiliza la sal como conservante. Sin embargo, alguoos microorganismos halfilos extremos presentes en dicha sal, pueden crecer
sobre la piel y deteriorarla. Alguoos autores han sugerido que el empleo de microorganismos productores de halocinas o de extractos de halocina, puede

ser de utilidad para prevenir el crecimiento de las

halobacterias y evitar as las alteraciones que stas
ocasionan durante el curtido de la piel (16).

Con todo, lo que aqu se ha expuesto, es a duras

penas, la punta del iceberg. Si se considera el gran
nmero de halocinas que pueden existir y en laposibilidad de que tras cada una de ellas se esconda
algn tipo de aplicacin, es evidente que se tendra
uo extenso campo por explorar con enormes posibilidades biotecnolgicas.
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