25.

Perfil lipdico
1

Isaac Tnez Fiana , Aurora Galvn Cejudo

Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Avda. Menndez Pidal s/n, 140712

Crdoba, Campus de Rabanales, Edif. Severo Ochoa 14071-Crdoba

RESUMEN
La cuantificacin de colesterol y triglicridos en suero es un
procedimiento analtico bsico en el diagnstico y seguimiento de
enfermedades metablicas, primarias o secundarias. Altos niveles de
colesterol se asocian
a
riesgo
de
padecer
enfermedades
cardiovasculares. En esta prctica se realizar la determinacin en suero
de colesterol total, colesterol-HDL y triglicridos.
Palabras claves: colesterol, lipoprotenas, triglicridos
Abreviaturas: 4-AP: 4-amino fenazona, CHE: colesterol estearasa, CHOD:
colesterol oxidasa, GK: Glicerol Kinasa, GPOD: Glicerolfosfato oxidasa, HDL:
lipoprotenas de alta densidad, LDL: lipoprotenas de baja densidad, POD:
peroxidasa, VLDL: liproprotenas de muy baja densidad
1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS
El perfil lipdico lo constituye la cuantificacin analtica de una serie de
lpidos que son transportados en la sangre por los diferentes tipos de
lipoprotenas plasmticas. La determinacin de estos parmetros es un
procedimiento analtico bsico para el diagnstico y seguimiento de
enfermedades metablicas, primarias o secundarias. Entre estos parmetros
analticos que se pueden determinar estn: el colesterol total, el colesterol
transportado por las LDL, el colesterol transportado por las HDL, los
triglicridos totales, ciertas apoprotenas particulares etc.
Altos niveles de colesterol se asocian a riesgo de padecer enfermedades
cardiovasculares, en especial aquel unido a las LDL (colesterol malo). El
colesterol de las HDL (colesterol bueno), puesto que representa aquella
fraccin de colesterol que se transporta al hgado para su metabilizacin y
excrecin por va biliar, no se asocia con riesgo de enfermedad.
Los objetivos de la prctica son la determinacin en suero de colesterol
total, HDL-Colesterol y triglicridos, para lo que se utilizarn kits comerciales.
1.1. Determinacin de colesterol total

Para la determinacin de colesterol total se utilizan reactivos comerciales

que incluyen las enzimas y sustratos necesarios para la cuantificacin de todas
las formas de colesterol presentes en el suero (Kit comercial de
LinearChemicals). Las reacciones que tienen lugar son:
Esteres de colesterol + H2O

CHE

Colesterol + O2 + H2O

CHOD
Colestenona + H2O2

H2O2 + Fenol + 4-AP

POD
Quinona + H2O

Colesterol +

Ac. Grasos

1. Una colesterol estearasa (CHE) hidroliza los steres de colesterol a

colesterol mas cidos grasos libre.
2. A continuacin una colesterol oxidasa (CHOD) oxida todo el colesterol a
colestenona y perxido de hidrgeno.
3. El perxido de hidrgeno es sustrato de una peroxidasa (POD) que
junto con 4-amino fenazona (4-AP) da lugar a la formacin de una
quinona roja.
La quinona formada es proporcional a la concentracin de colesterol en
la muestra.
1.2. Determinacin de HDL-colesterol
Para la determinacin del colesterol presente en las principales lipoprotenas
que lo contienen como HDL (lipoprotenas de alta densidad) y LDL
(lipoprotenas de baja densidad), es necesario:
Primero, la separacin selectiva de la lipoprotena correspondiente con
agentes precipitantes.
Segundo, la cuantificacin del colesterol presente en dicha lipoprotena
como se indic anteriormente.
Entre estos reactivos precipitantes estn el cido fosfotungstico y magnesio
que precipitan a las LDL y VLDL (lipoprotenas de muy baja densidad) mientras
que las HDL permanecen en solucin.
1.3. Determinacin de triglicridos
Para la determinacin de triglicridos en suero se utilizan reactivos
comerciales (Kit comercial de LinearChemicals) que incluyen las enzimas y
sustratos necesarios para la cuantificacin por espectrofotometra visible.
Las reacciones que tienen lugar son:
Triglicridos + H2O

Lipasa

Glicerol +

Ac. Grasos

Glicerol + ATP

GK

Glicerol-3-P + ADP

Glicerol-3-P + O2

GPOD

Dihidroxiacetona + H2O2

H2O2 + p-clorofenol + 4-AP

POD
Quinona + H2O

1. Una lipasa hidroliza los triglicridos dando glicerol mas cidos grasos
libre.
2. El glicerol formado es sustrato de una glicerol quinasa que en presencia
de ATP lo fosforila a glicerol 3P.
3. El glicerol 3P es oxidado a dihidroxiacetona por una glicerol fosfato
oxidasa dando tambin perxido de hidrgeno.
4. El perxido de hidrgeno junto con los cromgenos p-clorofenol y 4-AP
son sustrato de una peroxidasa para formar una quinona roja
cuantificable a 505 nm. La quinona formada es proporcional a la
concentracin de triglicridos presente en la muestra.
2. LISTADO DE MATERIAL NECESARIO
Tubos de ensayo
Pipetas automticas
Espectrofotmetro
Suero
Estndar de colesterol (200 mg/dl)
Reactivo de trabajo para el colesterol
Reactivo precipitante
Estndar de triglicridos (200 mg/dl)
Reactivo de trabajo para triglicridos
3. PROTOCOLOS A REALIZAR
3.1. Determinacin de colesterol total
Disponer de tubos de ensayo rotulados como blanco, estandar y muestra. La
muestra se refiere al suero a valorar y se colocan tantos tubos muestras
como sueros se quieran valorar.
Pipetear los componentes indicados en la Tabla I, aadiendo en ltimo lugar
el reactivo de trabajo de colesterol.
Tabla I. Protocolo para la cuantificacin de colesterol total
Etandar de
colesterol
Suero
React. de trabajo

Blanco
-

Estandar
20 l

Muestra
-

2 ml

2 ml

20 l
2 ml

Mezclar e Incubar 5 min a 37C ( 10 min a temperatura ambiente).

Leer la absorbancia a 505 nm.
Calcula la concentracin de colesterol total de cada una de las muestras de
suero del suguiente modo:
mg/dl =

Amuestra

x Conc. estandard

Aestandard

3.2. Determinacin de HDL-colesterol

1. Mezclar 1 ml del suero con 0,1 ml del reactivo precipitante. Incubar 10 min a
temperatura ambiente y centrifugar durante 20 min a 4000 rpm ( 2 min a
12000 rpm).
2. La determinacin de HDL-colesterol se realiza con 40 l del sobrenadante
como se indica en la Tabla II y utilizando el reactivo indicado en la
determinacin de colesterol total
3. Pipetear los componentes indicados en la Tabla II, aadiendo en ltimo
lugar el reactivo de trabajo de colesterol.
Tabla II. Protocolo para la cuantificacin de colesterol de las HDL
Etandar
Sobrenadante
H2O
React. de trabajo

Blanco
40 l
2 ml

Estandar
20 l
20 l
2 ml

Muestra
40 l
2 ml

Mezclar e Incubar 5 min a 37C ( 10 min a temperatura ambiente).

Leer la absorbancia a 505 nm.
Calcula la concentracin de colesterol de las HDL del siguiente modo:
Abs. Muestra x 320 = mg/dl HDL-colesterol (505 nm)

3.2. Determinacin de triglicridos

Disponer de tubos de ensayo rotulados como blanco, estandar y muestra. La

muestra se refiere al suero a valorar y se colocan tantos tubos muestras
como sueros se quieran valorar.
Pipetear los componentes indicados en la Tabla III, aadiendo en ltimo
lugar el reactivo de trabajo de triglicridos.

Etandar
Muestra
React. de trabajo

Blanco
2 ml

Estandar
20 l
2 ml

Muestra
20 l
2 ml

Mezclar e Incubar a 37C 4 min ( 10 min a temperatura ambiente). Leer la

absorbancia a 505 nm.
Clculos
Amuestra
mg/dl =

x Conc. estandard
Aestandard

4. RESULTADOS ESPERADOS
Los resultados esperados son aquellos que se indican a continuacin y se
corresponden con los valores de referencia encontrados en la poblacin sana y
que varan segn sexo y edad
4.1. Colesterol total
Hasta 30 aos: 120-215 mg/dl
30- 39 aos: 135-240 mg/dl
40-49 aos: 140-280 mg/dl
50- 59 aos: 145-295 mg/dl
4.2. Colesterol-HDL
Hombre > 55 mg/dl
Mujer > 65 mg/dl
4.3. Triglicridos
36-165 mg/dl
5. DISCUSIN Y COMENTARIOS
Adems de la cuantificacin de estos tres parmetros en la prctica el alumno
deber presentar un esquema de:
- Las principales lipoprotenas.

Principales dislipemias (tipos, causas, parmetros bioqumicas y

riesgos).
Qu otras determinacines analticas se pueden realizar para valoracin
de las dislipemias.

6. BIBLIOGRAFA
DOcon Navaza C, Garca-Saavedra MJ, Vicente Garca JC (1999):
Fundamentos y Tcnicas de Anlisis Bioqumico, Anlisis de Muestras
Biolgicas. Editorial Paraninfo, Madrid.
Gonzlez de Buitrago JM, Arilla Ferreiro E, Rodrguez-Sedade M, Snchez
Pozo A (1998): Bioqumica Clnica . Editorial McGraw-Hill.-Interamericana,
Madrid.
Informacin detallada a cerca de los productos analticos de Linear Chemical
SL lo encontrar en htp:// www.linear.es
ANEXO
SOLUCIONES
Estndar de colesterol: 200 mg/dl
Reactivo de trabajo de colesterol que se prepara segn las indicaciones
del fabricante y que contiene: 300 U/l de colesterol estearasa, 300 U/l de
colesterol oxidasa, 1250 U/l de peroxidasa, 0,4 mmol/l de 4-AP, 26 mmol/l de
fenol en tampn pipes 90 mM, pH 6,9
Reactivo precipitante: 14 mmol/l ac. fosfotungstico y 2 mmol/l MgCl2
Estndar de triglicridos: 200 mg/dl
Reactivo de trabajo de triglicridos que se prepara segn las indicaciones
del fabricante y que contiene: 150000 U/l de lipasa, 500 U/l de GK, 2500 U/l de
GPO, 440 U/l de peroxidasa, 0,1 mmol/l de 4-AP, 0,126 mmol/l de fenol en t
mmol/l de ATP, 2 mmol/l de p-clorofenol en tampn 50 mM pH 7,5.
MATERIAL BIOLGICO
Suero, estable 6 das a 2-8C.