TRABAJO PRCTICO

ENSAYO DE PERMEABILIDAD DE FRMACOS

PAMPA
(Parallel Artificial Membrane Permeability Assay)
Los ensayos que predicen la absorcin pasiva de frmacos se han hecho cada vez ms importantes
en el proceso de descubrimiento de stos. La capacidad de una molcula para ser absorbida, es
uno de los aspectos ms importantes en la decisin si la molcula es un potencial candidato a ser
frmaco. Ensayos celulares, como aqullos usando HeLa y/o Caco-2, comnmente son usados
como un modelo para la absorcin de frmacos; sin embargo, la tcnica emplea mucha mano de
obra y a menudo es realizada tarde en el proceso de descubrimiento de stas. Existen diferentes
opciones de ensayos in vitro disponibles para predecir la absorcin de frmacos, incluyendo el
ensayo de permeabilidad, que usa una membrana de hexadecano como una barrera lipoflica, y un
mtodo conocido como PAMPA (Parallel Artificial Membrane Permeability Assay), que usa una
membrana lipdica para simular la bicapa lpidica de distintos tipos de clulas, incluyendo el
sistema nervioso central (SNC). Este ensayo de permeabilidad no celular es relativamente rpido
(4-24 horas) y de bajo costo. En general, son usados cada vez con mayor frecuencia para
determinar las propiedades de permeabilidad pasiva transcelular de compuestos potencialmente
medicinales. La mayora de los frmacos entran en la circulacin sangunea por difusin pasiva a
travs del epitelio intestinal. Por consiguiente, los ensayos de permeabilidad miden el transporte
pasivo por barreras lipoflicas, stos tienen correlacin con los valores de absorcin en humanos o
con provenientes de mtodos publicados.
El anlisis se realiza en una placa PAMPA MultiScreen-IP en donde se mide la capacidad de un
compuesto de difundir desde un compartimiento donor a uno aceptor separados por un filtro
impregnado con una solucin de fosfatidilcolina en dodecano (figura 1).
Placa aceptora

Placa donora

Figura 1 Placa de Pampa compuesta por placas aceptora y donora, separada por membrana
artificial de fosfolpido.

Figura 2 Ampliacin de 1 pocillo de la placa de Pampa y su comparacin con la mucosa

intestinal.

Trabajo Practico
En el ensayo se utilizarn TIOPENTAL SDICO y Azul de Evans como molculas de estudio de
permeabilidad:

Materiales
Pipeta aforada de 2 mL
Pipeta automtica 1000 L
Pipeta automtica 200 L
Tubos Eppendorf 2 mL
Tubos de ensayo 10 mL
Cubetas de cuarzo (1 cm paso ptico)
Placas para PAMPA
Disolucin de PBS (Buffer Fosfato, pH 7.4) 1L.

Disoluciones de Tiopental
PAMPA: 200 g/ml (2ml)
Stock: 80 g/mL (8ml)
Disolucin de Azul de Evans
PAMPA: 200 g/ml (2ml)
Stock: 80 g/mL (8ml)
Curvas de Calibracin
TIOPENTAL
(g/ml)
Blanco
40
20
10
5
2,5
Azul de
Evans
(g/ml)
Blanco
40
20
10
5
2,5

S.
Stock

40
g/ml

20
g/ml

10
g/ml

5
g/ml

2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
S.
Stock

40
g/ml

20
g/ml

10
g/ml

5
g/ml

2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml

PBS

V final

4 ml
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml

4 ml
4 ml
4 ml
4 ml
4 ml
4 ml

MES

V final

4 ml
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml

4 ml
4 ml
4 ml
4 ml
4 ml
4 ml

Abs
288
nm
-

Abs
570
nm
-

Ensayo PAMPA
De la disolucin del fosfatidilcolina en dodecano (20 mg/ml) tomar 4 L y ponerlos sobre la
membrana de PVDF, esperar aproximadamente 5 minutos para evaporacin del dodecano.
Poner 300 L de PBS en la placa aceptora (TIOPENTAL o Azul de Evans respectivamente).
De los tubos eppendorf rotulados como PAMPA tomar 300 L y ponerlos en la placa dadora,
se ensamblan las placas y se deja en agitacin a 250 rpm durante 2 horas.
Para determinar la concentracin a T0: se ponen 200 L de la disolucin PAMPA de cada
frmaco en un eppendorf de 2 ml (FD = 8) y se agregan 1.4 ml de PBS (segn sea el caso),
luego se lee al UV.

Para determinar la concentracin a T2h: Una vez transcurridas las 2 horas de ensayo, se toman
200 L de cada pocillo (dador y aceptor) y se agregan 1.4 ml de PBS (segn sea el caso) (FD =
8), luego leer al UV.
Con los valores de concentracin obtenidos mediante la interpolacin de las absorbancias
obtenidas en la curva de calibracin se procede a calcular el % de los frmacos en cada
compartimento.

Figura 3: Ensamblaje de las placas utilizadas para el ensayo PAMPA.

Frmula utilizada para el clculo de la permeabilidad efectiva en el ensayo PAMPA:

Donde:
t = Tiempo de medicin en horas.
CA = Concentracin del compuesto en la placa aceptora a tiempo t.
CD = Concentracin del compuesto en la placa donora a tiempo cero.

Resultados del ensayo PAMPA.

Compuesto

Abs. t0

Abs. tt

TIOPENTAL
Azul de Evans

**Permeabilidad efectiva de cada compuesto.

Conc. a t0

Conc. a tt

% de
Permeabilidad

PE **
(cm/s)