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1.4.1
El principal problema que est tcnica presenta es quiz la formacin de artefactos, que
son productos adicionales que interfieren con la adecuada interpretacin de los
resultados y como consecuencia, en la asignacin de alelos de una muestra (Viljoen et
al., 2005).
1.4.1.1
Los stutters son artefactos que presentan una unidad de repeticin menos que el alelo
verdadero. Una revisin detenida de los electroferogramas expone a las bandas
tartamudas como picos pequeos con algunas bases menos que el alelo en cuestin
(figura 1.4) (Butler, 2005).
Katherine Apunte
Figura 1. 1: Alelos STR de los marcadores D8S1179, D21S11 y D18S51 con bandas
tartamudas o stutters.
El principal mecanismo que se ha descrito, explica mejor la existencia de stutters es el
deslizamiento de la enzima polimerasa durante la amplificacin. En este modelo,
conocido como hebra deslizada-dispareja, una regin del complejo primer-templado
permanece libre durante la elongacin, causando el deslizamiento ya sea del primer o
del templado, de manera que se forma un bucle no apareado en una unidad de repeticin
(figura 1.5). Como consecuencia de este evento se genera un producto de PCR acortado
que difiere del alelo verdadero por una sola unidad de repeticin (Butler, 2005) (Abu.
2008) (Gonzlez, 2006).
Se ha visto que la presencia de stutters puede verse reducida utilizando STRs con
unidades de repeticin largas, (ej. Penta D y Penta E) y con polimerasas de rpida
capacidad de procesamiento. En este ltimo caso, se ha visto un incremento de estos
artefactos cuando la polimerasa es lenta (Walsh et al., 1996).
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Figura 1. 2: Ilustracin del modelo Hebra deslizada-dispareja que origina los stutters.
a) Proceso de replicacin normal, cada unidad repetitiva se aparea con su respectiva secuencia
complementaria. b) Insercin causada por deslizamiento del primer, en este caso el producto final ser
una unidad de repeticin ms larga que el alelo verdadero. c) Delecin causada por deslizamiento del
templado, que es el mecanismo de formacin de los stutters (Butler, 2005).
cortas
(dinucleotdicas
>
trinucleotdicas
>
tetranucleotdicas
>
pentanucleotdicas).
La cantidad de stutters es mayor para los alelos grandes de un locus.
1.4.1.2
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denominan split peaks, donde el segundo pico se muestra una posicin menos que el
alelo real. En la segunda, los picos presentan una especie de hombro en el lado
izquierdo, a estos ltimos se les llama shoulder peaks (MacLaren et al., 2008) (figura
1.6).
En trminos generales, estos artefactos se evidencian como picos con una base ms
corta que el alelo verdadero debido a la falta de adenilacin terminal. La cantidad de
estos productos depende en gran parte al exceso de ADN en la reaccin, motivo por el
que la literatura recomienda 0.5-2ng como medida adecuada para la amplificacin de
STRs (Abu, 2008).
1.4.1.3
Pull-up
Los pull-up son picos que representan un fallo en el anlisis para discriminar entre los
distintos colores utilizados por el software para la generacin de datos. La presencia de
estos picos se ha relacionado con grandes cantidades de ADN en las muestras. Esta
sobresaturacin causa que los picos altos pertenecientes a un panel de un color
determinado, se levanten o se reflejen en otro color. En un electroferograma pueden ser
vistos como picos ubicados en la misma posicin en los diferentes paneles (Michaelis et
al., 2011). En la figura 1.7 se muestra a la izquierda los reflejos en el panel azul,
producto del exceso de ADN en el pico verde. Del mismo modo se observa un reflejo en
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el panel verde debido al pico en el color negro. A la derecha, datos unificados de todos
los colores en un electroferograma donde se puede evidenciar los reflejos del pico
original en los dems colores.
1.4.1.4
Off-ladder
Un off-ladder es una variante inusual que no est incluida en el lder allico y que se
presenta en un eletroferograma a manera de un pico etiquetado como OL. A pesar de
que los picos off-ladder pueden llegar a ser alelos verdaderos que por eventos
mutacionales poseen un nmero de repeticiones inusual, es importante saber diferenciar
de aquellos que nicamente son artefactos por lo que el conocimiento de parmetros de
operacin como los lmites PDT son de gran utilidad (Michaelis et al., 2011).
Resulta frecuente encontrar cierto ruido en los electroferogramas, que son picos
localizados por debajo de este nivel. No as, existen productos de la PCR que son
significativamente ms intensos y presentan un patrn allico poco comn, por lo que la
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mquina los detecta fcilmente como OL (off-ladder) (figura 1.8). Por este motivo, la
identificacin correcta de alelos es crucial en el laboratorio (Michaelis et al., 2011).
1.4.1.5
Spikes
Los spikes son picos estrechos cuyo origen se atribuye a la fluctuacin del voltaje o a la
presencia de burbujas en el capilar. Para sobrellevar este inconveniente se puede correr
la muestra nuevamente ya que estos artefactos no son reproducibles (figura 1.9) (Moira,
2013).
Aunque muchos artefactos son claramente identificables, las normas para determinar si
un pico es verdadero o no, suelen ser bastante subjetivas creando discrepancias entre las
opiniones de los expertos.
Sin embargo, no solo los artefactos pueden dificultar el anlisis de los perfiles genticos
ya que los productos de la PCR tambin estn expuestos a procesos de degradacin,
complicando ms la identificacin de los alelos.
1.4.1.6 Productos degradados
Ocurre cuando una muestra no est correctamente preservada y los fragmentos ms
largos de ADN empiezan a degradarse, siendo consecuencia directa, la amplificacin
baja o nula de los mismos. El efecto que causa en un perfil gentico se conoce como
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pista de esqu, donde los alelos del lado derecho son notablemente ms pequeos en
altura que los ubicados al lado izquierdo, generando un patrn diferencial de
amplificacin que asemeja una pista de esqu (Moira, 2013). En la figura 1.10 se puede
observar que los productos de mayor peso molecular se amplifican con menos eficiencia
que los de menor peso molecular, generando un patrn descendente de amplificacin
que asemeja una pista de esqu.
Hoy por hoy, el anlisis molecular se ha convertido en una prctica comn a nivel
mundial, no solo por las facilidades que la tecnologa ofrece sino por el contenido de
informacin que se puede obtener de un componente tan pequeo pero de tanta
trascendencia biolgica como es el ADN.
Este es el cdigo de la vida, el papiro sobre el cual se escribe el destino de todo ser
viviente sobre el planeta, y aunque por aos ha sido estudiado y ha revelado muchas de
las formas como acta sobre los caracteres humanos, an guarda en su interior los ms
interesantes y maravillosos secretos de todo cuanto somos como individuos, como
especie y como poblacin.
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