PCR

Polimerasa Chain Reaction.

Es una de las herramientas tecnolgicas ms innovadoras para el estudio de
los cidos nucleicos. Se caracteriza por ser una tcnica de alta sensibilidad,
reproducibilidad y eficiencia, que genera
resultados confiables en poco tiempo y fciles de
analizar. Por ello, se ha convertido en el mtodo
de eleccin de muchos investigadores para los
estudios genticos y de biologa molecular.
Antecedentes histricos.
A mediados de la dcada ochenta se usaba el
"clonado molecular" para aislar y obtener ms
cantidad de ADN. Este procedimiento se basa en
la introduccin de fragmentos de ADN, uno de
los cuales contendr el gen de inters, en
vectores. stos son molculas de ADN
(plsmidos o ADN de bacterifagos) capaces
tanto de transportar fragmentos ajenos a su estructura original como de
multiplicarlos dentro de bacterias.
En 1985, Kary Mullis,(Ganador de premio noble de qumica) un investigador de
la Corporacin Cetus, invent un mtodo para lograr la multiplicacin in vitro
de fragmentos definidos de ADN sin necesidad de recurrir a los vectores y su
replicacin en bacterias. Este mtodo revolucionara en corto tiempo el
conjunto de tcnicas de la biologa molecular. Su uso se extendi rpidamente
a miles de laboratorios, no slo de investigacin bsica, sino tambin de
diagnstico clnico. Se trata de la reaccin en cadena de la polimerasa. Fue su
creatividad ms que nada, ya que la idea de multiplicar una solo hebra DNA
millones de veces la tuvo en 1983, pero sus colegas no estaban convencidos
de ese argumento tan atrevido, por lo que Millus lo hizo por s mismo para
demostrar que era posible.
Al principio su tcnica "orignial" fue un fracaso ya que como Polimerasa se
usaba la de la bcteria E. Coli, pero esta enzima resulta desactivada debido a la
alta temperatura requerida para desnaturalizar la doble cadena del ADN; Millus
no se dio por vencido y consigui su propsito, aplicando una enzima
polimerasa llamada Taq procedente de Thermus aquaticus, una bacteria gram
negativa termfila que habita en manantiales de agua caliente (50C y 80C).
Esta tcnica se us principalmente para la amplificacin del gen de la de la bglobina humana(Mullis y cols., 1986; Mullis y Faloona., 1987).

El Dr. Millus bas sus estudios en la replicacin del DNA en eucariotas realizada
por la DNA-polimerasa. Estas enzimas realizan la sntesis de una cadena
complementaria de DNA en el sentido 5 a 3 usando un molde de cadena
sencilla, pero a partir de una regin de doble cadena. Para crear esta regin de
doble cadena se usan los denominados cebadores (primers). Son una pareja de
oligonucletidos (secuencia corta de ADN o ARN, con cincuenta pares
de bases o menos) sintetizados de manera que sean complementarios a cada
uno de los extremos 3 del fragmento de DNA que se desea amplificar. El
segmento de ADN que sirve de molde no requiere estar necesariamente en
estado puro, sino que puede ser parte de mezclas complejas.
Por un tiempo el problema brillaba en el proceso, ya que el el "mix" (la Taq
polimerasa, primer, nucleotidos y el ADN madre) deba estar sometido a ciclos
rigurosos a altas temperaturas. En 1985, Cetus se asoci con la corporacin
Perkin-Elmer e introdujo la DNA Termal Cycler. De esta manera es posible
mezclar todos los componentes de la PCR al comenzar el primer ciclo y la
reaccin en cadena puede llevarse a cabo mediante equipos automatizados
que realizarn los ciclos trmicos programados. En 1989, Cetus anunci un
acuerdo de colaborar con Hoffman-LaRoche en el desarrollo y la
comercializacin de productos de diagnstico humanos in vitro y de servicios
basados en tecnologa de PCR. En 1990, los cientficos alcanzan la primera
amplificacin y deteccin simultnea de las secuencias especficas de DNA
usando un colorante fluorescente, poniendo el fundamento para la PCR en
tiempo real o PCR "cintico" (pruebas TaqMan).
FUNDAMENTOS DE PCR.