Deteccin de virus entricos en muestras de agua

Materiales

NaOH 0.05 M
Compresor (TOOLCRAF )
Tanque Cornelius
Mangueras (Parker Parflex series U 12 mm OD x 2 mm wall, 8.6 Bar).
Porta filtros de 47 mm de dimetro (Millipore)
Membrana electropositiva Virocap de 47 mm
caja petri
eluyente (extracto de carne 1%, glicina 0.5M, Tween 80 0.1M a pH 9)
centrifuga
amortiguador PBS 1X
trizol
cloroformo
Isopropanol
Etanol absoluto
Agua inyectable
bromuro de etidio
agarosa

Metodologa
Muestreo
La muestra se toman a una profundidad de 15 a 30 cm de la superficie del
agua con las manos lavadas con agua y jabn hasta la altura del codo; en
envases estriles de vidrio o plstico que se abrirn hasta sumergirse dentro
del agua y se cerrarn antes de sacarse del agua. Los envases se colocarn en
hielo para mantener la temperatura baja y evitar la reproduccin de bacterias y
se trasladarn a las instalaciones del laboratorio, donde se mantendrn en
refrigeracin (4C 1C) hasta su anlisis.
Cada muestra se filtrara antes de analizar cada punto de la toma de muestra.
Sanitizacin y acoplamiento del sistema de filtracin
Aplicar un flujo de desinfeccin con 500 ml de NaOH 0.05 M y lavar el sistema
con cinco Litros de agua destilada. Los portafiltros (Millipore) y los conectores
metlicos deben ser tratados en autoclave al comienzo de la filtracin (Soto.
2012). El sistema filtracin-captura de manufactura domestica se fabricara
utilizando un compresor (TOOLCRAF ) a un tanque Cornelious mediante
mangueras (Parker Parflex series U 12 mm OD x 2 mm wall, 8.6 Bar). En el otro
extremo de la parte superior del tanque se acoplara a un porta filtros de 47
mm de dimetro (Millipore)
Captura y concentracin viral

Para la captura de partculas virales cada muestra se agitara y se filtrara travs

de una membrana electropositiva Virocap de 47 mm (Scientific Methods) de
acuerdo al procedimiento descrito por Soto, 2012 y Moreno, 2014. El porta filtro
se desacoplara del sistema de filtracin y se pasara la membrana a una caja de
petri. Se agregara un volumen de 15 mL de eluyente (extracto de carne 1%,
glicina 0.5M, Tween 80 0.1M a pH 9) que retenga las partculas. La caja se
sometera a una agitacin por diez min a 60 rpm, para posteriormente ajustar el
pH de 3.5 y se agregaran 0.3g de extracto de carne para precipitar los virus
(Katzenelson, 1976). La suspensin se agitara por 20 min, para pasarlo a tubo
cnico y centrifugarlo a 4C a 12000 rpm por 30 min, posteriormente decantar
y se Resuspender la pastilla con un ml de amortiguador PBS 1X y se congelo a
-0C.
Extraccin de RNA por el mtodo de Trizol
EL concentrado se descongela y se centrifuga a 12, 000 rpm por 5 minutos a
4C, se toman 300 L y se transfirieren a un tubo nuevo. S le agregaran 700
L de trizol y se homogeniza en lapsos de 3 a 5 seg 10 veces. Se deja reposar
en hielo durante 5 min y se le adicionan 200 L de cloroformo. Posteriormente
se homogeniza y se deja reposar en hielo por 3 min para luego centrifugarse a
4 C por 15 minutos a 12,000 rpm. La fase acuosa se transfirie a un tubo nuevo
y se le adiciono 400 L de isopropanol y se dejo toda la noche en congelacin.
Luego se centrifug a 4 C por 15 minutos a 12,000 rpm, se descarta el
sobrenadante, se lava con un ml de etanol absoluto, finalmente se seca en la
campana de flujo laminar por 15 minutos. Se re suspende la pastilla en 20 L
de agua inyectable y se guarda a -20 C. (Chomezynsky y col. 1987).
PCR mltiple para Norovirus y Rotavirus
Para la PCR se agreg 0.5 L de cDNA de Rotavirus con 2.5 de Norovirus a
una mezcla de reaccin (15 L) que contena amortiguador para PCR 1X
(Bioline), MgCl2 (Bioline) a 1.6mM, 0.5M de cebador FW para Rotavirus y 0.75
M de cebador FW para Norovirus (tabla II) ,0.04 mM de Desoxinucleosidos de
trifosfato (dNTP), 25 U de Taq polimerasa (Promega) y agua. Los ciclos se
realizaron de la siguiente forma; 5 min a 94 C para desnaturalizacin inicial,
40 ciclos de 1 min a 94 C, 30 s 40 C y 1 min 72 C; para extensin final 5 min
a 72 C.
Electroforesis en gel de agarosa 1%
Se disolvi 0.6 gr de agarosa en 60 mL de buffer TBE 1X. Se calent para
clarificarlo y al enfriarse se le adiciono 6 L de bromuro de etidio (1 mg/mL). Se
vaci la agarosa en el portagel, se le coloc el peine y se dej polimerizar
alrededor de 30 minutos. La cmara de electroforesis se llen con buffer TBE
1X. Se coloc el gel en la cmara y se carg cada pozo con tres L de muestra
y dos L de buffer de carga 5X. Se corri el gel a 70 volts durante 70 minutos
para finalmente visualizarse en el programa KODAK 1D 3.6.