Inmunologa. Curso 2009-10.

Tema 10

TEMA 10. Tcnicas inmunolgicas I. Anticuerpos monoclonales y

sus aplicaciones. Reacciones antgeno-anticuerpo in vitro: tipos de
inmunorreacciones. Concepto de sensibilidad y especificidad.
Reacciones cruzadas. Ttulo srico.
OBJETIVOS
Saber qu son y cmo se producen los anticuerpos monoclonales
Conocer las aplicaciones que se ven mejoradas con el empleo de
anticuerpos monoclonales
Comprender y diferenciar los conceptos de sensibilidad y especificidad
Conocer el significado de la especificidad del anticuerpo y los
mecanismos responsables de la reaccin cruzada de los anticuerpos.
Comprender el significado del ttulo de un suero.
OBTENCIN DE ANTICUERPOS PARA LAS TCNICAS INMUNOLGICAS
1. Policlonales (Sueros): por inmunizacin de animales de experimentacin
(conejos, cabras, quidos, etc.) con el antgeno deseado, siguiendo un
protocolo adecuado, tras el que se extrae sangre y se obtiene el suero
donde estarn los anticuerpos dirigidos frente al antgeno con el que se ha
realizado la inmunizacin (frente a todos sus determinantes antignicos) y
frente a otros antgenos a los que se haya enfrentado el animal.
2. Monoclonales (Khler y Milstein, P.N. Medicina 1984): Son los
anticuerpos producidos por un clon, es decir, por un grupo de clulas
derivados de una nica clula y, por lo tanto, con caractersticas idnticas
(todas producen el mismo anticuerpo).
Ac POLICLONALES
Mezcla heterognea
Variacin entre los lotes (impredecibles)
Irrepetibles
Es preferible utilizar Ag puros para su obtencin
Reconocen varios eptopos
Multitud de isotipos (plasticidad funcional y
efectora
Fcil produccin
Baratos

Ac. MONOCLONALES
Qumicamente puros
Invariables (predecibles)
Produccin limitada
No se necesitan Ag puros
Muy especficos (pueden no
reconocer variantes antignicas)
Un solo isotipo
Produccin compleja y larga
Caros

PROTOCOLO PRODUCCIN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES (AcMo)

1. Inmunizar un ratn con el Ag deseado.
2. Tras un tiempo (varias semanas), extraer el bazo y disgregar para obtener
linfocitos B, que tienen una cortsima viabilidad en cultivo.
3. Fusionar los linfocitos B con clulas de mieloma, que tienen la
caracterstica de ser deficientes en la enzima hipoxantina guanina fosfo

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ribosil transferasa, HGPRT), implicada en la sntesis exgena de ADN, por

lo que slo pueden seguir la va endgena.
4. Cultivar los productos de la fusin (hibridomas linfocito-mieloma), en
medio selectivo HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina). La aminopterina
bloquea la va endgena, y slo las clulas que puedan sintetizar cidos
nucleicos por la va exgena (que sean HGPRT+) sobrevivirn. Los
hibridomas formados por la fusin entre un linfocito y una clula de
mieloma son capaces de crecer en este medio.
5. Analizar los pocillos por ELISA.
6. Clonar los pocillos que contengan hbridos productores de anticuerpos de
inters, realizando diluciones para intentar tener una clula por pocillo, por
lo que todas las que se deriven de ella secretarn el mismo anticuerpo.
7. Caracterizar los AcMo
8. Producir en gran escala:
a. Cultivo in vitro: los clones se cultivan en botellas o en biorreactores,
encontrndose los AcMo en el medio de cultivo.
b. Produccin in vivo: los clones se inoculan en la cavidad abdominal de
ratones para producir ascitis en donde se encuentran los AcMo mucho
ms concentrados que en el caso anterior.
Actualmente las grandes empresas obtienen los AcMo por ingeniera gentica

Antgeno (3 epitopos)
Bazo

Mieloma (HGPRT -)
FUSIN

HAT
Clula de Mieloma
Linfocito B
Hibridoma LB/M
ELISA (con epitopo de inters)

- -

EXPANSIN

SELECCIN
ELISA
CLONACIN
-

- -

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APLICACIONES DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES

En principio todo lo que se base en una reaccin antgeno-Anticuerpo:
Sistemas

de deteccin de base inmunolgica

Terapia

frente al cncer?

Falta

de AcMo de origen humano

Estudios

en microbiologa

Etc.

CONCEPTOS Y NATURALEZA DE LA INTERACCIN Ag-Ac

La interaccin Ag-Ac se caracteriza por:
1. Unin reversible por enlaces no covalentes
2. Unin especfica: Interaccin complementaria entre Ag-Ac (en
ocasiones, puede darse reactividad cruzada con otro Ag).

ESPECIFICIDAD: Capacidad del Ac para discriminar e interaccionar

diferencialmente con Ag de estructura similar. Cuando un Ac frente
a un determinado Ag se une a otro Ag diferente pero
estructuralmente relacionado se habla de reaccin cruzada.

3. Formacin de inmunocomplejos Ag-Ac estables

AFINIDAD: Fuerza o intensidad de la unin entre un determinante
antignico y su sitio de unin al Ac
AVIDEZ: Fuerza total de la unin entre Ag-Ac (suma de fuerzas de
atraccin y de repulsin).
CONCEPTO DE TTULO SRCO
Se suele calcular haciendo diluciones del suero y determinando cul es la
mxima dilucin de un suero que da una reaccin positiva por la prueba
evaluada. Es una estimacin de la concentracin de anticuerpos que hay en el
suero.
CONCEPTO DE SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD
Sensibilidad: capacidad de un mtodo para detectar positivos. Permite
que todos los positivos sean detectados.
Especificidad: capacidad para diferenciar positivos de los negativos.
Capacidad para detectar negativos. Evita resultados falsos positivos
(ningn negativo debe considerarse como positivo)

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Para clasificar a los animales en positivos o negativos se establece un

punto de corte. Los individuos cuyos valores sean mayores que el
establecido por el punto de corte se considerarn positivos y los que son
inferiores, negativos.

TIPOS DE TCNICAS INMUNOLGICAS

Las inmunorreacciones se aplican al diagnstico para medir la respuesta
inmune:
- Humoral (anticuerpos y complemento).
- Celular (fagocitos y linfocitos, citoquinas).
DETECCIN DE LA RESPUESTA HUMORAL
TCNICAS SEROLGICAS: detectan la interaccin Ag-Ac in vitro. Pueden
clasificarse en 3 tipos:
1. Pruebas de unin primaria: Miden directamente la unin Ag-Ac.
2. Pruebas de unin secundaria: Miden los cambios fsicos de la
interaccin Ag-Ac tras la formacin del inmunocomplejo.
3. Pruebas terciarias: Miden el efecto protector real de la respuesta
inmune en un animal.
PREGUNTAS
1. Qu es un anticuerpo monoclonal?
2. Por qu las clulas de mieloma empleadas para la obtencin de
hibridomas son HGPRT-?
3. Por qu es necesario clonar?
4. Por qu existen problemas para el empleo de anticuerpos
monoclonales con fines teraputicos en medicina humana y veterinaria?
5. Qu es ms indicativo de la capacidad efectiva de unin de un
anticuerpo a un microorganismo, su afinidad o su avidez?
6. En qu circunstancias se debe aplicar una tcnica que tenga alta
especificidad y baja sensibilidad? Y baja especificidad pero alta
sensibilidad?

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