DETERMINACION DE

COLIFORMES Y
ESCHERICHIA COLI
Microbiologa de los Alimentos Laboratorio N4

Andrea Rosales
Cmpora Carolina
vila Letelier
Universidad
Iberoamrica de

ndice
Objetivos........................................................................................................ 2
Antecedentes Bibliogrficos...........................................................................2
Materiales y Mtodos..................................................................................... 2
Muestras..................................................................................................... 3
Procedimiento............................................................................................. 4
Datos Experimentales................................................................................. 7
Resultados...................................................................................................... 7
Discusin...................................................................................................... 11
Conclusin.................................................................................................... 12
Bibliografa................................................................................................... 13
Anexos.......................................................................................................... 14

Objetivos

Determinar el nmero de grmenes coliformes en alimentos mediante ensayos presuntivo y

confirmativo.
Diferenciar las distintas especies de coliformes de acuerdo a ensayos bioqumicos.

Antecedentes Bibliogrficos
Existen diversos mtodos para cuantificar el nmero de
microorganismos presentes en muestras lquidas y slidas. Dentro de
las tcnicas ms comunes se encuentra el recuento directo por microscopia
de fluorescencia, as como los procedimientos basados en diluciones en
serie, haciendo crecer microorganismos en medios de cultivo sintticos
slidos o lquidos, como el recuento en placa de Unidades Formadoras de
Colonias
(UFC) o la estimacin por el mtodo del Nmero Ms Probable (NMP).
El mtodo del nmero ms probable fue descrito por McCrady en 1915 y
actualmente sigue siendo ampliamente utilizado. En un principio este
mtodo fue empleado para estimar el nmero de microorganismos en
muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se ha demostrado que
tambin puede ser aplicado para la determinacin de microorganismos
aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos y suelos contaminados,
por tanto este mtodo es aplicable para estimar el nmero de
microorganismos en muestras de suelo y agua, tanto
para bacterias aerobias como anaerobias.
Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales, capaces
de fermentar la lactosa a 44 C en vez de 37c como lo hacen los totales.
Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en heces
estn formados por Escherichia coli y ciertas especies de Klebsiella. Ya que
los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de
los animales de sangre caliente, se considera que reflejan mejor la
presencia de contaminacin fecal. stos ltimos se denominan
termotolerantes por su capacidad de soportar temperaturas ms elevadas.
Esta es la caracterstica que diferencia a Coliformes Totales y Fecales. La
capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de
los animales homeotrmicos es favorecida por la existencia de condiciones
adecuadas de materia orgnica, pH, humedad. Desde hace
mucho tiempo se han utilizado como indicador ideal de contaminacin fecal.
Su presencia se interpreta como una indicacin de que los organismos
patgenos pueden estar presentes y su ausencia indica que el agua o el
alimento estudiado se hallan exentos de organismos productores
de enfermedades.

L. ORTIZ, M. (2003) Material didctico de Microbiologa de Alimentos

Materiales y Mtodos
-Bao termorregulador con circulacin de agua
-Termmetro
-Incubador
-Balanza semianaltica
-Homogeneizador con jarra
-Pipetas de 1 y 10 mL estriles
-Esptula
-Frascos para dilucin
-Cuenta colonias Quebec
-pH metro
-Caldo bilis lactosa verde brillante (BGLB)
-Caldo lauril sulfato triptosa (LST)
-Caldo EC
-Agar eosina azul de metileno de levine (L-EMB)
-Caldo triptona (triptfano)
-Caldo RM-VP
-Agar citrato de Simmons
-Agar para recuento en placa (PCA)
-Tampn fosfato para dilucin o equivalente
-Reactivo de Kovacs
-Reactivos Voges-Proskauer
-Reactivos de tincin de Gram
-Indicador Rojo Metilo

Muestras

Lechuga Escarola

Pan Ave Mayo

Procedimiento
Examen presuntivo para coliformes
1. Pesar 50 g de alimento en una jarra estril de picadora. Agregar 450 mL
de tampn fosfato y homogeneizar por 2 minutos. Si es necesario, la
muestra para anlisis puede ser de 25 - 50 g, dependiendo de la
disponibilidad de muestra.
2. Preparar diluciones decimales con 90 ml de agua de dilucin estril ms
10 mL de la dilucin previa. El nmero de diluciones a preparar depender
de la densidad de coliformes esperada. Agitar todas las suspensiones 25
veces en un arco de 29 cm por 7 seg. No usar pipetas para distribuir menos
del 10% de su volumen total. Transferir porciones de 1 mL a 3 tubos LST
para cada dilucin para 3 diluciones consecutivas. No deben transcurrir ms
de 15 minutos desde que se homogeneiz la muestra hasta que todas las
diluciones estn en un medio apropiado.
3. Incubar los tubos por 48 +- 2 h a 35C. Examinar los tubos a las 24 2 h
para apreciar la formacin de gas. Re incubar los tubos negativos por 24 h
adicionales. Examinar por segunda vez la produccin de gas. Realizar un
anlisis confirmativo para todos los tubos positivos presuntivos (que
formaron gas).
Anlisis confirmativo para coliformes
1. Agitar suavemente cada tubo LST positivo para gas y transferir una asada
de suspensin a un tubo de caldo BGLB. Para esto, colocar el tubo LST en
ngulo e introducir el asa evitando transferir la pelcula superficial (si est
presente).
2. Incubar los tubos BGLB por 48 2h a 35C. Examinar la produccin de gas
y registrar el dato.
3. Calcular el nmero ms probable (NMP) de coliformes basndose en la
proporcin de tubos LST gases positivos para 3 diluciones consecutivas.
Mtodo de caldo EC para coliformes fecales y test confirmativo
para E. coli.

1. Agitar suavemente cada tubo LST positivo para gas y transferir una asada
de cada suspensin a un tubo de caldo EC. Incubar los tubos 48 2 h a 45,5
+- 0,2C.
2. Examinar la produccin de gas a las 24 +- 2 h; si es negativa, examinar
nuevamente a las 48 +- 2 h. Usar los resultados de este test para calcular el
NMP de coliformes fecales.
3. Estriar una asada de suspensin de cada tubo gas positivo en agar LEMB. Incubar 18-24 h a 35C. Examinar las placas en busca de colonias
sospechosas de ser E. coli, planas y de centro oscuro, con o sin brillo verde
metlico.
4. Transferir 2 colonias sospechosas de cada placa L-EMB a agar PC tendido
para anlisis morfolgico y bioqumico. Incubar los tubos de agar tendido
18-24 h a 35C. Si no hay colonias tpicas presentes, transferir una o ms
colonias lo ms parecidas a E. coli. Sacar una colonia de cada placa.
5. Interpretacin. Todos los cultivos que (a) fermentan lactosa con
produccin de gas dentro de 48 h a 35C, (b) aparezcan como bacilos cortos
Gram negativos no formadores de esporas, y (c) dan el patrn IMViC ++-(biotipo 1) o -+-- (biotipo 2) son considerados E. coli. Calcular el NMP de E.
coli basndose en la proporcin de tubos EC en 3 diluciones sucesivas que
contengan E. coli. Para convertir el NMP/g de la columna de la tabla seguir
este procedimiento: si los inoculados fueron 0,1, 0,01 y 0,001 para cada 3
tubos (10-1,10-2,10-3), y el resultado es 3, 1,0, la tabla da 4,27 como
NMP/g. Al multiplicar por 10 se hallaran los inoculados de la tabla (1, 0,1 y
0,01), por lo tanto, el NMP/g es 42,7. (se comenz con dilucin 0,1 o 1/10).

Tabla 1. Para 3 tubos cada uno con 0.1, 0.01, y 0.001 g de inculo, los
NMPs por gramo e intervalos de confianza del 95 por ciento.
Tubos positivos NMP/g

Lmite Tubos positivos NMP/g Lmite

confianza
confianza

0.10 0.01 0.001

Bajo Alto 0.10 0.01 0.001

<3.0

Bajo Alto

--

9.5

21

4.5

42

3.0 0.15

9.6

28

8.7

94

3.0 0.15

11

35

8.7

94

6.1

1.2

18

29

8.7

94

6.2

1.2

18

36

8.7

94

9.4

3.6

38

23

4.6

94

3.6 0.17

18

38

8.7

110

7.2

1.3

18

64

17

180

11

3.6

38

43

180

7.4

1.3

20

75

17

200

11

3.6

38

120

37

420

11

3.6

42

160

40

420

15

4.5

42

93

18

420

16

4.5

42

150

37

420

9.2

1.4

38

210

40

430

14

3.6

42

290

90 1,000

20

4.5

42

240

42 1,000

15

3.7

42

460

90 2,000

20

4.5

42

27

8.7

94

1100 180 4,100

>1100 420

--

Datos Experimentales

Resultados
De los tubos se obtuvo los siguientes resultados (a las 24 horas) para coliformes totales

Dilucin

10-1 d1

10-1 d2

10-1 d3

10-2 d1

10-2 d2

10-2 d3

10-3 d1

10-3 d2

10-3 d3

Para realizar la prueba confirmativa se sembr en agar MacConkey, luego de la incubacin por 24 horas,
se obtuvo los siguientes resultados:

Disolucion 10-1 Lechuga

Disolucion 10-1 Lechuga

Metodo caldo EC

Tubos con solucion BVB

Disolucion 10-2 Lechuga

Tubos Con Caldo

Peptonado

Discusin

El empleo de este medio de cultivo(Caldo EC, Caldo Bilis Verde

Brillante)ahorra tambin energa; pues se requiere de una incubacin a
37C durante solo 24 h, comparada con varias incubaciones de 1 a 2 das
(incluyendo una a 44.5 C), utilizadas en la tcnica tradicional. Adems, al
detectarse simultneamente los organismos Coliformes y E. Coli se reduce a
casi una tercera parte la cristalera empleada por el mtodo tradicional

Conclusin

Se puede concluir con respecto a los objetivos antes relacionados que la

determinacin de bacterias Coliformes y E. Coli, pueden estar presentes
tanto en los alimentos como en los sistemas de agua potable, ya que estos
microorganismos se pueden transmitir a travs de las heces fecales.
La mayora de los enterococos, estreptococos y dems grupos o gneros
microbianos son algunos patgenos y no patgenos, de estos se pueden
preparar fermentaciones, que mediante un largo proceso, llegan a ser
elaboradas en productos comestibles, garantizando al consumidor la mayor
seguridad al consumir ese producto fermentado.

Bibliografa

THATCHER, F. S. y D. S., CLARK (1993) Anlisis Microbiolgico de los

Alimentos. Edit. Acribia. Zaragoza.

MICROBIOLOGIA APLICADA: Manual de Laboratorio (2006) Coliformes

totales y Fecales en agua de consumo humano. Obtenido el 07 de
febrero de 2008 en
http://www.ine.gob.mx/publicaciones/libros/509/analisis2.pdf.

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS (1989). Medios de Cultivo

en Microbiologa: Manual de Laboratorio. Editora Tricelm S.A. 3 Edic.
Lima.

Anexos

Cuenta Colonias: Un contador de colonias es un instrumento utilizado

para contar colonias de bacterias o de otros microorganismos que crecen en
una placa de agar.
Ejemplos de determinacin de NMP en series de 3 tubos
Ejemplo
NMP

Cantidad

muestra

0,1

0 ,01

A
930

3/3

3/3

B
9300

3/3

(g. o mL.)

0,001

0,0001

2/3

0/3

Lectura
0,00001
0/3

3/3

3/3

2/3

0/3

320
320

C
30

0/3

0/3

1/3

0/3

0/3

010

D
2100

3/3

3/3

2/3

1/3

1/3

322

E
>110000

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

Nmero de tubos positivos / Nmero de tubos inoculados

333