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3 Evaluacin de Medios de Cultivo 3.

1 INTRODUCCION Un medio de
cultivo es el material nutritivo en el que se pueden recuperar, multiplicar
y aislar a los microorganismos in vitro, as como efectuar pruebas de
susceptibilidad. El desarrollo de las tcnicas de crecimiento de
microorganismos en medios slidos y de obtencin eficaz de cultivos
puros se debi a Koch y Loeffler en 1882, el cual sigue siendo esencial
en todas las reas de la microbiologa. Gran parte de la Microbiologa
depende de la capacidad de cultivar y mantener microorganismos en un
laboratorio a travs de medios especiales de cultivo para aislar e
identificar los microorganismos, evaluar la sensibilidad a los antibiticos,
analizar agua y alimentos, en microbiologa industrial y otras actividades.
Los microorganismos necesitan fuentes de energa y la composicin
precisa de un medio adecuado depender de la especie que se quiere
cultivar, debido a que las necesidades nutricionales varan
considerablemente y pueden ser elementales (para su composicin
celular) energticas (satisfacen las reacciones oxido-reduccin) o
especficas (compuestos que deben ser proporcionados porque no se
encuentran en sus vas sintticas). Adems de los nutrientes los medios
de cultivo deben reunir condiciones fsico-qumicas especficas de
actividad de agua, pH, potencial de oxido-reduccin (E0), condiciones de
isotona. Todos los microorganismos en general, bacterias y hongos en
particular se cultivan sobre sustratos nutritivos para poder estudiar sus
propiedades o la utilizacin de ellas en condiciones controladas. 3.1.1
CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Principalmente se
clasifican en base a los requerimientos nutricionales de los diferentes
microorganismos en: Bsicos o Generales: Contienen los nutrientes
esenciales para promover el desarrollo de microorganismos poco
exigentes nutricionalmente. Tales medios pueden ser: caldo o agar
nutritivo, caldo tioglicolato, caldo triptosa, agar Tripticasena soya.
Enriquecidos: Suplementados con otros nutrientes para promover el
desarrollo de microorganismos exigentes: Ejemplo son agar sangre,
agar chocolate, agar suero, entre otros. De enriquecimiento: Para
aumentar la propagacin de ciertos microorganismos sin favorecer el
desarrollo de otros, utilizados para el aislamiento de enterobacterias:
Ejemplo son caldo selenito de sodio y cistena, caldo tetrationato, agar
yema de huevo mas leche, etc. Selectivos: Se incorporan sustancias
inhibidoras de la propagacin de un grupo de bacterias, pero permiten el
crecimiento de otros grupos. Ejemplo son agar endo, eosina-azul de
metileno y MacConkey.
31. Diferenciales: Permiten identificar con cierta facilidad algunos
gneros o especies bacterianas por el aspecto caracterstico que toman
sus colonias. Ejemplo de estos medios son el agar sangre, MacConkey.
De transporte: se utilizan en el envo de muestras al laboratorio, ms
comunes son: Stuart, caldo tioglicolato, caldo nutritivo y medio CarryBlair. Para el mantenimiento: son medios simples y no deben estimular
un crecimiento abundante. Se pueden emplear: agar nutritivo, medio de
Dorset. Para el estudio de carbohidratos: medio basal OF, de Hugh
Leiffson, medio para MR-VP y los que prueben algn azcar. 3.1.2
CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO El control de
calidad de los medios de cultivo consiste en una evaluacin sistmica

del trabajo para asegurar que el producto final se ajuste a un grado


aceptable a lmites de tolerancia previamente establecidos, donde
finalmente se proporcionen resultados verdicos y permite que se
acepten los registros documentados de los fabricantes y abastecedores
de productos comerciales. La viabilidad de los medios debe probarse
con cultivos tipo de microorganismos de la ATCC (Coleccin Americana
de Cultivos Tipo) u otras cepas certificadas. Para realizar el control de
calidad de los medios de cultivo es necesario considerar los siguientes
puntos bsicos: a) Personal: debe ser capacitado en el rea especfica y
con un entrenamiento prctico. b) Material de vidrio: debe estar limpio,
seco y libre de cualquier tipo de contaminantes, ya que la presencia de
stos puede afectar los resultados. c) Materia prima: debe presentar
caractersticas homogneas en el tamao de partcula, color y no
presentar apelmazamiento. El envase debe ser de tapa de aluminio,
frasco de vidrio mbar, composicin completa en la etiqueta, debe
precisar fecha de caducidad, indicacin clara de la preparacin, as
como el nmero y lote. El control de calidad para los medios de cultivo
debe, en el anlisis final, asegurar que un medio respalde el desarrollo
de los microorganismos, inhibir el desarrollo de microorganismos
comensales, exhibir una respuesta bioqumica tpica, ser estable y tener
un tiempo de conservacin razonable. 3.1.3 PRUEBAS QUE SE
REALIZAN A LOS MEDIOS DE CULTIVO Esterilidad. La frecuencia con
que se realizan las pruebas de control de calidad de medios es
determinada por cada laboratorio y a las instrucciones de los fabricantes
para todos los productos comerciales usados y debe efectuarse con
varios tubos o frascos de cada lote. Se realiza particularmente para
aquellos medios a los que se les adicionan componentes luego de la
esterilizacin, visualmente y por subcultivo. Ciertos medios selectivos
que pueden suprimir suficientemente el crecimiento visible de bacterias;
sin embargo, pueden aparecer microorganismos viables al subcultivar.
Los parmetros a evaluar son aspecto fsico como signos de deterioro,
decoloracin, turbidez, cambios de color o estado de hidratacin.
32. Pruebas de promocin e inhibicin de crecimiento Para determinar la
capacidad del medio para respaldar el desarrollo del microorganismo
inoculado con una concentracin baja que nos permita ver la
funcionalidad del medio, considerando que un error frecuente del control
de calidad es el uso de un inculo concentrado que puede producir un
desarrollo desorientador, para lo cual es necesario estandarizar esta
prueba, mediante el empleo de una tcnica que nos ayude a dicho
propsito como la tcnica de Miles & Misra. Esta tcnica es una de las
ms empleados para medios slidos, la cual consiste en sembrar una
suspensin de un cultivo joven de las cepas sobre la superficie de una
placa, divida en cuadrantes; la suspensin debe ser de 0.02 ml, y
adicionada en cada cuadrante, de cada una de las diluciones del cultivo.
Despus de la incubacin de la caja, se cuenta con el nmero de UFC
que crecen en cada dilucin. 3.1.4 USOS Y LAS APLICACIONES DE
LOS MEDIOS DE CULTIVO Medicina Humana y veterinaria, se efectan
investigaciones microbiolgicas en el diagnstico de infecciones y para
el control de las medidas teraputicas que le siguen. Industria
Farmacutica, la mayor parte de los productos de esta industria deben

cumplir con una especificacin microbiolgica establecida de acuerdo a


la Farmacopea respectiva. En consecuencia, el control de calidad
microbiolgico es una fase importante en el proceso de produccin.
Industria Cosmtica, debido que casi todos estos productos contienen
sustancias biolgicas activas y por ello pueden contener
microorganismos patgenos. Industria Lctea, la leche cruda es un
medio de cultivo ideal para numerosos microorganismos. Industria
Crnica, en los mataderos es donde se procede a investigaciones
microbiolgicas y para la deteccin de residuos de antibiticos, si un
animal ha estado tratado con antibiticos antes del sacrificio. Industria
Alimentaria y de Bebidas, productos naturales pueden deteriorarse
debido a la presencia de microorganismos. Su tratamiento est sometido
a reglamentaciones particularmente estrictas.
33. 3.2 OBJETIVO GENERAL Al finalizar la prctica el alumno deber:
Evaluar medios de cultivo, por medio de la promocin e inhibicin de
crecimiento microbiano para determinar si los medios de cultivo son
viables. 3.2.1 OBJETIVOS PARTICULARES Aplicar la tcnica de Miles &
Misra, por medio de la inoculacin de cepas ATCC (Coleccin Americana
de Cultivos Tipo) en los medios de cultivo a utilizar y determinar si los
medios de cultivo son viables. Comprobar si la morfologa colonial
obtenida en cada uno de los medios de cultivo es especfica de los
microorganismos tipo empleados.
34. 3.3 METODO EXPERIMENTAL 3.3.1 MATERIAL 4.3.1.1 EQUIPO
Microscopio ptico Estufa de Incubacin Vortex Asa bacteriolgicas
calibradas de 0.01 y 0.001 ml Mecheros Bunsen 3.3.1.2 MATERIAL DE
VIDRIO Tubos de ensaye de fondo plano Pipetas graduadas de 1.5 y 10
ml Porta objetos planos Cubre objetos Tubo 0.5 del Nefelmetro de Mac
Farland 3.3.1.3 MEDIOS DE CULTIVO (por equipo) Agar Sangre (AS)
Agar Chocolate (ACh) Agar Eosina-Azul de Metileno (EMB) Agar
Cetrimida (AC) Agar sales Manitol (ASM) Agar McConkey (AMc) Agar
Dextrosa Saboraund (ADS) Agar Salmonella-Shigella (SS) 3.3.1.4
CEPAS ATCC # COLECCION Salmonella enteritidis Enterobacter
aerogenes Staphylococcus aureus Pseudomonas aureginosa Cndida
albicans Streptococcus -hemoltico grupo A Escherichia coli Shigella
3.3.1.5 PRUEBAS BIOQUIMICAS OF Nitratos MR VP KIA SIM Urea
Citratos MIO Arginina Malonatos LIA 3.3.1.6 REACTIVOS Glicerol Cristal
Violeta Alcohol etlico al 70 y 90% Acetona Lugol
35. Safranina Aceite de inmersin Solucin Salina Fisiolgica (estril)
3.3.2 METODO EXPERIMENTAL 3.3.2.1 DETERMINACION DE LA
DILUCION PARA LA TECNICA a) Sembrar las cepas de los diferentes
microorganismos con un asa bacteriolgica 24 horas antes de la
experimentacin. b) Dividir en cuatro partes las cajas petri, y
posteriormente colocarlas durante menos de una hora en la estufa de
incubacin a 37 C. c) Rotular la serie de tubos de ensaye para cada
microorganismo del 1 al 5 respectivamente, y agregar 4.5 ml de SSF
(estril). d) Preparar una suspensin de la cepa del microorganismo
igualando la turbidez con el tubo nmero 0.5 del Nefelmetro de
McFarland el cual equivale a 1.5 x 108 UFC / ml e) Tomar de la solucin
anterior un volumen de 500 l con una micro pipeta y adicionarlo a un
tubo que contenga SSF (Tubo 1 de dilucin 10-1) f) Homogenizar la

solucin en el vortex g) Tomar del tubo 1 un volumen de 500 l con una


micro pipeta y adicionarlos a otro tubo con SSF (Tubo 2 de dilucin 10-2)
h) Homogenizar la solucin obtenida en el Vortex. i) Realizar los pasos
hasta el tubo 5. 3.3.2.2 PROMOCION E INHIBICION DE CRECIMIENTO
a) Agregar 10 l de la dilucin para la tcnica de Control de Calidad en
los diferentes medios de cultivo a evaluar y distribuir uniformemente.
Para realizar esta tcnica se debe emplear segn sea el medio de
cultivo: un microorganismo que debe crecer (Cuadrante I), uno que debe
diferenciarse del anterior (Cuadrante II) y por ltimo otro que no debe
crecer (Cuadrante III) y el ltimo cuadrante se emplea como rea de
esterilidad. b) Esperar a que la solucin anterior se difunda en el medio
de cultivo, posteriormente realizar un barrido y/o estriado con una asa
bacteriolgica y se incuba las cajas petri con los medios de cultivo en la
estufa de incubacin a 37 C / 24 hrs. c) Realizar la lectura de las cajas
petri (conteo manual), en donde el nmero de colonias debe oscilar
entre 20-30 por cuadrante. d) Realizar el ensayo al mismo tiempo en un
medio de referencia para asegurar el crecimiento del microorganismo,
empleando la misma dilucin para cada una de las cepas de
microorganismos empleados para comparacin de la recuperacin
bacteriana en los medios de cultivo evaluados y de referencia. NOTA: A
continuacin se presenta un diagrama de flujo con base al diseo
experimental.
36. 3.4 DIAGRAMA DE FLUJO
37. 3.5 RESULTADOS
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO.
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN.
LABORATORIO DE MICROBIOLOGA FARMACETICA. NOMBRE DE
LA PRCTICA CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO.
Fecha de la Prctica No. de Prctica NOMBRE DE LOS ANALISTAS
Nombre de la bacteria/Levadura Gram Catalasa Oxidasa O/F Otra
prueba especificar CUENTA VIABLE. Dilucin Morfologa Colonial Tipo
de Agar: _________________________________ UFC/mL 10-1 10-2
10-3 10-4
38. NOMBRE DEL AGAR MODO DE ACCIN CONTROL DE
CALIDAD. Parmetros a evaluar Bacteria/Levadura Morfologa Colonial
UFC/mL Promocin (--) Promocin (+) Inhibicin Esterilidad PRUEBAS
BIOQUMICAS. PRUEBA Microorganismo usado Cumple
39. 3.6 CONCLUSIONES
__________________________________________________________
___________________________
__________________________________________________________
___________. FIRMA DE REVISIN
40. 4.7 BIBLIOGRAFIA BOLAOS, Carlos Alberto y ANACORETA,
Inocencia Vargas. Tesis. Evaluacin de la Estabilidad de diferentes
Medios de Cultivo preparados en condiciones estndar. FESC, 1999.
COLLARD, Patrick. El desarrollo de la Microbiologa. Editorial Reverte.
Barcelona, Espaa. 1990. COLLINS, C.H. Mtodos Microbiolgicos. 5
ed. Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa. 1990. HERNNDEZ,
Guadalupe. Tesis. Manual de Prcticas del Laboratorio de
Bacteriologa. FESC, 2000. KONEMAN, MD. Diagnstico

Microbiolgico. 5 ed. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires,


Argentina. 1999 MANUAL DE RECOMENDACIONES GENERALES
PARA LA PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO. Secretara de
Salud. Direccin General de Epidemiologa. Instituto Nacional de
Diagnstico y Referencia Epidemiolgicos Dr. Manuel Martnez Bez.
Mxico DF, 1989. NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM-065-SSA1-1993.
Especificaciones Sanitarias de los Medios de Cultivo. PRESCOTT,
Lasing. Microbiologa. 4 ed. Editorial McGraw-Hill Interamericana.
Espaa, 1999.
41. PRCTICA No. 4 CONSERVACIN DE CEPAS INTRODUCCIN
Los sistemas de Validacin son los procesos que se requieren para
asegurar que los parmetros de funcionamiento de los test, tanto
comerciales como los de uso domsticos, son los esperados y las
pruebas pueden ser utilizadas como mtodos de diagnstico en el
laboratorio. La mayora de los procedimientos en Microbiologa,
dependen de que los microorganismos viables en el cultivo sean
capaces de mantener sus caractersticas morfolgicas, fisiolgicas y que
sean tpicas y reproducibles. Para ayudar en este control, las Cepas
Estndar de Control de Calidad, son un componente esencial de un
proceso de validacin. Existen varias colecciones de cepas utilizables
para el control de calidad. Algunos ejemplos son: ATCC : American Type
Culture Collection- Rockville, USA NCIC : National Collection of Industrial
Bacteria- Survey, Inglaterra JFCC: Japanese Federation of Culture
Collection of Microorganism- Japn CCTM : Coleccin Nacional Lille,
Francia RIA: USSR Reseach Institute for Antibiotics- Mosc, Rusia.
NCIB : Coleccin Nacional industrial Aberdeen, Escocia DSM :
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Gottinger, Alemania. As, la
E. coli ATCC 25922 es igual a la DSM 1103 y a la NCIB 12210. Los
organismos que han de ser utilizados en el control de equipos o
sistemas de identificacin, generalmente son estipulados por los
fabricantes o bien escogidos por el usuario. Generalmente se utilizan
cepas de referencia como las ATCC y si son cepas domsticas, es
necesario tener un historial del organismo que incluye nombre, rea de
aislamiento, reacciones bioqumicas y patrn de sensibilidad a los
antibiticos, forma de almacenaje, fecha de ltimo pase. En todo caso,
las cepas de referencia deben tener requisitos especficos:
Caractersticas tpicas. Caractersticas estables. Reproducibilidad.
42. MTODOS DE CONSERVACIN DE CEPAS BACTERIANAS. Los
mtodos de conservacin de las cepas estndar de control de calidad,
deben asegurar que las mismas mantengan sus caractersticas tpicas y
que puedan ser reproducidas despus. El medio utilizado para su
conservacin debe mantener un mnimo de mutaciones. Estas
mutaciones pueden evitarse permitiendo tambin el mnimo crecimiento
del microorganismo y aportando ptimas condiciones ambientales para
su sobrevivencia, con el menor nmero de subcultivos. Para una mejor
clasificacin de los mtodos de conservacin de cepas, los dividiremos
en tres categoras: Cultivos Stock, Semistock y Cultivos de Trabajo
diario. CULTIVOS STOCK: Estos representan el verdadero " Banco de
Cultivos". Estos son mantenidos en un sistema cerrado de conservacin,
minimizando su actividad gentica y fisiolgica, para evitar su potencial

mutacin. Los dos mtodos ms importantes para conservacin en


Stock, son la Liofilizacin y el ultracongelamiento. LIOFILIZACIN: Se
hace una suspensin fuerte de un cultivo puro y joven en leche estril o
similar, y se coloca en tubos con tapn de rosca y se siguen las
instrucciones del aparato liofilizador, que puede ser tan sencillo como un
simple bomba de vaco, hasta un sofisticado sistema. Durante este
proceso evitar que el cultivo se derrame dentro el aparato liofilizador y la
formacin de aerosoles. Este sistema tiene la ventaja de ser el que
permite la sobrevivencia por un mayor periodo de tiempo y mayores
facilidades para el transporte de las cepas. ULTRACONGELAMIENTO:
Hacer una suspensin fuerte de la colonia pura en caldo Brucella
conteniendo 15% de glicerol o sustituto. Dispensar en porciones de 0.5
ml en pequeos tubos con rosca y coloque en lo profundo del
congelador a -45C. Tambin se puede utilizar la modificacin de
Ultracongelamiento en Nitrgeno lquido, que consiste en colocar en una
ampolla especial dentro de un aparato especficamente designado para
el mantenimiento de cepas en nitrgeno lquido. Ambos sistemas
preservan las bacterias por largos periodos de tiempo. CULTIVOS
SEMISTOCK: Este trmino se refiere al mantenimiento de cultivos por
un periodo intermedio entre el relativamente permanente cultivo en
Stock y el cultivo de cepas control para el trabajo diario. De las 5
tcnicas listadas a continuacin, solo la de congelamiento es utilizable
para el mantenimiento de cepas de anaerobios. Los congeladores
convencionales pueden mantener una temperatura entre -10 a -25C.
Los cultivos se preparan de la misma manera como en el caso de la
ultracongelacin y
43. son colocados en el congelador. El mtodo permite la sobrevivencia
de bacterias y levaduras en algunos casos por aos y en la mayora de
las veces por al menos de 6 a 12 meses. CONGELAMIENTO EN
CONGELADOR CONVENCIONAL: Se preparan tubos con tapn de
rosca conteniendo agar soya tripticasa-cistena. Inocular el cultivo puro y
jven e incube por 18 a 24 horas para obtener un crecimiento moderado,
afloje la tapa y mantenga a temperatura ambiente o preferiblemente en
refrigeracin, si es posible en la oscuridad. Microorganismos menos
delicados sobreviven bien por un ao y los fastidiosos por 6 meses.
CULTIVO EN CTA: Este mtodo es conocido tambin como mtodo
Stamp en honor de su creador. Corte pequeos crculos de papel
encerado y colquelo en una caja Petri de vidrio. Esterilice en autoclave
por 15 minutos a 15 libras de presin. Prepare una suspensin de caldo
nutritivo con 10% de gelatina en polvo ( Peso por Volumen ) y 0.25% de
cido ascrbico ( P x V ) y dispense en tubos con rosca y esterilice en
autoclave. Haga una suspensin fuerte de un cultivo puro y jven y
coloque una gota del mismo con una pipeta estril sobre uno de los
discos de papel acerado estril en una caja Petri. Con una pinza estril,
transfiera el disco a un desecador de vaco conteniendo Pentaxido de
fsforo. Evacue el desecador con la bomba de vaco. Cuando el disco
est seco, aspticamente introducir en un tubo estril con tapa de rosca
y colocar en el refrigerador. Para hacer un subcultivo del disco,
aspticamente retire un crculo de papel con las colonias y colocarlo en
un tubo conteniendo un caldo de cultivo e incubar por 24 horas a 35C y

luego inocular en agar sangre e incubar nuevamente. SECADO EN


DISCOS CON GELATINA: Es un mtodo especialmente utilizado para
hongos, pero es til tambin para algunas bacterias. En el caso de los
hongos, se utiliza un cultivo jven y bien desarrollado en un medio de
cultivo inclinado, tal como agar de Sabouraud-dextrosa. Cubrir
completamente con aceite mineral estril. El aceite debe ser esterilizado
a 15 libras de presin por 45 minutos, para asegurar su esterilidad
absoluta. Para reactivar la cepa, colocar la boca del tubo cerca de la
llama de un mechero o incinerador y remueva una porcin visible de
crecimiento con una asa estril larga o una aguja. Este mtodo permite
la sobrevivencia por muchos aos.
44. Si el mtodo se va a utilizar para conservar bacterias, se utiliza Agar
de Cerebro-Corazn o agar Mueller-Hinton suplementados con
hemoglobina al 2% e Isovitalex al 1%. Los medios se sirven en tubos
con tapn de rosca. Se esterilizan y luego se les hace solidificar en
forma inclinada. Las bacterias son inoculadas en el medio e incubadas a
35C por 24 horas, tomando en cuenta sus requerimientos de oxgeno.
Luego las cepas son cubiertas con aceite mineral estril, hasta 1 cm por
encima del final del inclinado. Los cultivos son viables por 2 aos a
temperatura ambiente. CONSERVACIN EN MEDIO DE CULTIVO
INCLINADO CON ACEITE MINERAL: MANTENIMIENTO EN TIERRA
ESTRIL: Es utilizado primeramente para hongos y bacterias
esporuladas. Esterilice en autoclave tierra suelta en tubos con rosca a
15 libras de presin por 1 hora. Haga una suspensin fuerte del
microorganismo jven y esporulado y colquelo en el tubo con tierra
estril. Deje secar y colocarlo en un refrigerador. CULTIVOS DE
TRABAJO DIARIO: Los cultivos control para el trabajo diario, son una
forma conveniente para realizar el control de calidad de pruebas de uso
frecuente y que requieren una lectura comparativa al momento de su
lectura. Tal es el caso de las pruebas de coagulasa y oxidasa, entre
otras. Para ste propsito se utilizan cultivos de 24 horas y son pasados
diariamente. BACTERIAS RESISTENTES: Tal es el caso de
Estafilococos y Enterobacterias. Se transfiere una colonia jven de un
cultivo en Stock o semistock y se transfiere a un tubo con agar nutritivo
inclinado e incubar por un mnimo de tiempo tal que haya crecimiento.
Guardar en refrigerador. Los cultivos para trabajo diario, son transferidos
a otros tubos de agar inclinado cada mes por un intervalo de 6 meses.
Despus de ste tiempo, se debe volver a hacer otro pase del cultivo
stock. BACTERIAS DELICADAS : Los cultivos de trabajo diario de
organismos delicados como N. Meningitidis, N. Gonorrhoeae, S.
pneumoniae y algunos menos delicados como el S. pyogenes, son
preparados a partir del stock e incubados por 24 horas en medios
apropiados como agar chocolate en ambiente de CO2 , para luego ser
colocados en refrigeracin. Despus de una serie de 6 pases
consecutivos, se debe preparar otro cultivo para uso diario a partir de la
cepa en stock.
45. BACTERIAS ANAERBICAS: Los cultivos para trabajo diario de la
mayora de las bacterias anaerbicas, pueden ser mantenidos en medio
de carne cocida o en Tioglicolato con 0.5% de carbonato de sodio
adicionado despus de esterilizar por autoclave. Los cultivos se incuban

por 24 a 48 horas y guardados a temperatura ambiente. HONGOS: Los


cultivos de uso diario de hongos, son mantenidos en tubos con agar
Sabouraud o sustituto. Los cultivos se incuban a temperatura ambiente
hasta que haya crecimiento, y ocurra la esporulacin, para luego ser
colocados en refrigeracin. Los cultivos de trabajo deben ser
transferidos cada 2 meses. Pasado ste tiempo se debe preparar otro
cultivo de trabajo a partir de la cepa en stock. CULTIVOS DE TRABAJO
COMERCIALES: Son preparados por casas comerciales utilizando
cepas conocidas como la ATCC. Estas son estables en refrigeracin por
un ao. Tal es el caso de Bact-Chek de Roche Diagnostics, Bactrol Disk
de Difco, entre otras. Para reactivar las cepas se colocan en un caldo
nutritivo como el caldo soya tripticasa e incubados por 24 horas a 35C.
Luego se hace un pase a un medio de enriquecimiento o agar sangre.
Se debe tener especial cuidado en el mantenimiento del cepario, ya que
el mismo constituye una ayuda importante en la validacin de equipos,
materiales, reactivos y habilidad del personal. Debe existir un programa
metdico de pase de cepas , archivo de cada uno de los cultivos con sus
caractersticas bioqumicas, sensibilidad a los antibiticos, origen de la
cepa, mtodo de identificacin, fecha de siembra y prximo pase.
46. OBJETIVO Conocer y aplicar las tcnicas de mantenimiento de un
cepario bacteriano y de hongos, por medio de metodologa establecida
en la literatura, para ser utilizados en el control de equipos o sistemas de
identificacin. MATERIAL Medios de cultivo y reactivos Cajas de agar
soya tripticasa Cajas de agar sal y manitol Cajas de agar MacConkey
Cajas de agar cetrimida Cajas de agar dextrosa Sabourou Tubos de
OF Tubos de citratos Tubos de MR-VP Tubos de KIA Tubos de LIA
Tubos de MIO Tubos de arginina Tubos de malonato Tubos de
nitratos Tubos de urea Tubos con caldo nutritivo Tubos de
carbohidratos Tubos con agua estril Tubos de dilucin con 5 ml de
SSF estril Tubos de dilucin con agar base sangre inclinados Tubos
de dilucin con 5 ml de caldo BHI+1% de sacarosa+1% de leche
descremada Plasma de conejo Suero humano Perxido de
hidrgeno Reactivo para oxidasa Reactivo de Erlich -naftol naftilamina KOH 40% cido sulfanlico Aceite de inmersin
47. Aceite mineral estril Cristal violeta Lugol Alcohol/acetona
Safranina Vidriera y diversos Pipetas graduadas estriles de 1 ml
Pipetas graduadas estriles de 10 ml Tubo 0.5 del Nefelometro de
MacFarland Microscopio compuesto Mechero/tablita Palillos
estriles Asas bacteriolgicas Portaobjetos Cubreobjetos Plastilina
Estufa bacteriolgica Refrigerador Congelador Material Biolgico
Escherichia coli Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus saprophyticus Streptococcus faecalis Salmonella
Typhi Pseudomonas aeuroginosa Enterobacter cloacae
Enterobacter aerogenes Citrobacter freundii Klebsiella pneumoneae
Candida albicans
48. DIAGRAMA DE TRABAJO No.1. Identificacin y conservacin de
cepas. Cepa desconocida Realizar pruebas bioqumicas primarias
Sembrar por dilucin Agar Soya Tripticasena Medios selectivos
y diferenciales OFGram MotilidadCatalasa Incubar 24 hrs/37C
Incubar Oxidasa 24hrs/37 Realizar pruebas bioqumicas secundarias

C Preparar suspensin bacteriana igualada al tubo 0.5 del NMF.


Registrar e interpretar resultados Registrar e interpretar resultados.
Registrar e interpretar resultados Colocar 1 ml. en caldo BHI
con 1% de sacarosa y 1% de leche descremada.
Inocular con una asada 2 tubos con agar base sangre inclinados
Incubar 812 hrs/37C y conservar A un tubo inclinado
agregar hasta cubrir aceite mineral estril y mantener a 2025C
A un tubo inclinado agregar hasta cubrir aceite mineral estril
y refrigerar a 8C El caldo BHI se congela a 10C
49. DIAGRAMA DE TRABAJO No.2. Recuperacin e identificacin de
cepas. Cepa conservada Realizar pruebas bioqumicas primarias
Gram Catalasa Oxidasa Motilidad OF
Dividir en tres los medios selectivos y
diferenciales e inocular en cada tercio las cepas recuperadas
Dividir en tres una caja de agar soya tripticasena e inocular en
cada tercio las cepas recuperadas Realizar pruebas
bioqumicas secundarias Incubar 24 hrs/37C Crecimiento en medios
diferenciales y selectivos Registrar e interpretar resultados.
Registrar e interpretar resultados Registrar e interpretar resultados
Eliminar el aceite mineral estril al tubo inclinado
incubado a temperatura ambiente Ambientar y eliminar el
aceite mineral estril al tubo inclinado refrigerado
Descongelar el caldo BHI colocndolo a temperatura ambiente
Crecimiento en agar soya tripticasa
50. 7 ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUA 7.1 INTRODUCCION El
agua empleada en la Industria Farmacutica, ya sea como aditivo en las
diferentes formas farmacuticas o en las operaciones de limpieza de los
equipos y reas, que participan en los procesos de produccin
farmacuticos, debe cumplir ciertas especificaciones dependiendo el tipo
de agua que se emplea y en los procesos de produccin que se utiliza.
Se debe contar con un sistema de control que asegure y mantenga la
calidad del agua desde que se recibe para su proceso de purificacin
hasta su uso. La FEUM (Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos)
describe las especificaciones y los usos del agua. La siguiente tabla
muestra el agua usada en la industria farmacutica: 1 tipo de agua uso
especificaciones Agua Purificada El agua purificada es usada como un
excipiente en la produccin de preparaciones oficiales, para limpieza de
equipo y preparaciones de algunas soluciones farmacuticas. El agua
purificada tiene requerimiento fsico, qumico y microbiolgico. Para
obtener agua purificada se utiliza agua comnmente de la red municipal
que es sometida a varias operaciones unitarias, como desionizacin,
destilacin, intercambio inico, osmosis inversa, filtracin u otro proceso
de purificacin. pH: entre 5 y 7 Determinar los siguientes compuestos:
Cloruros: 0.5 mg/l Sulfatos* Amonio: <0.03 ppm Calcio* Dixido de
Carbono* Metales pesados* Sustancias oxidables* Nitratos: <0.2 ppm
Slidos totales: <0.001% Carbono orgnico total: 500 ppb
Conductividad* Lmites Microbianos No ms de 100 UFC/ml de
mesfilos aerobios y ausencia de patgenos. Agua Purificada Estril Se
usa en las preparaciones farmacuticas no parenterales. Esta agua no
debe contener agentes antimicrobianos y debe estar envasada

apropiadamente. Cumplir con todos los requisitos de agua purificada y


pruebas de esterilidad. Agua para la Fabricacin de Inyectables Se usa
como aditivo para la fabricacin de inyectables y para la limpieza de los
equipos. Es producida a partir de agua potable y se purifica por
destilacin u osmosis . Cumple con los requisitos de todas las pruebas
indicadas en Agua Purificada y: Endotoxinas. Libre de endotoxinas.
Lmites microbianos. Ausencia de patgenos
51. inversa. El agua es un excelente vehculo para la transportacin de
los organismos patgenos, especialmente los que existen en las aguas
negras cuando ests no han sido bien tratadas. Los estragos causados
por la proliferacin de estos grmenes hicieron que se tomaran medidas
como la cloracin de los suministros de agua. Es preciso analizar el
agua para determinar si es potable; el anlisis microbiolgico del agua
es un procedimiento diseado para comprobar si una muestra de agua
ha sufrido contaminacin de aguas negras, materia fecal; y por lo tanto,
si contiene microorganismos patgenos al humano y/o animales. Los
organismos en el agua estn generalmente diluidos a tal grado que la
pequea muestra de agua a analizar estar muchas veces libre de todo
patgeno. En este tipo de anlisis se trata de detectar aquellos
microorganismos que son provenientes de aguas negras, materia fecal;
los llamados coliformes.3 Las bacterias patgenas que causan ciertas
enfermedades pueden sobrevivir al caer en el agua y ser transportadas,
usando el agua como vehculo, de una persona a otra. La presencia de
estos microorganismos en el agua origina una contaminacin de la
misma y la hace impropia e insegura para su consumo. El grupo de los
microorganismos Coliformes es el ms ampliamente utilizado en la
microbiologa de los alimentos y en la industria farmacutica como
indicador de prcticas higinicas inadecuadas. El uso de los Coliformes
como indicador sanitario puede aplicarse para: La deteccin de
prcticas sanitarias deficientes en el manejo y en la fabricacin de los
alimentos. La evaluacin de la calidad microbiolgica de un producto,
aunque su presencia no necesariamente implica un riesgo sanitario.
Evaluacin de la eficiencia de prcticas sanitarias e higinicas del
equipo. La demostracin y la cuenta de microorganismos Coliformes,
puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivos lquidos o
slidos con caractersticas selectivas o diferenciales.5 7.1 METODOS
DE ANALISIS 7.1.1 METODO DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP)
Mtodo del Nmero Ms Probable (NMP) se emplea para la
determinacin de nmero de microorganismos viables, un procedimiento
estadstico en el cual se elaboran diluciones especficas para alcanzar
un punto de extincin. Generalmente se emplean rplicas, usualmente 3
a 10 de cada dilucin y se registra el patrn positivo o negativo. Para
determinar en NMP de microorganismos presentes en la muestra
original se emplea una tabla estadstica basada en la distribucin de
Poisson.
52. En los diferentes procedimientos del NMP se emplean criterios
variados para establecer las marcas positivas o negativas. En muchos
procedimientos, un tubo se marca positivo cuando hay crecimiento
visible (como aumento en la turbidez). Otros procedimientos emplean
criterios ms cuantitativos, tales como un incremento en la

concentracin de protenas o criterios diferenciales, como la produccin


de cidos a partir carbohidratos o produccin de dixido de carbono, y
de clorofila son tambin utilizadas para establecer una marca positiva en
procedimientos para bacterias y algas respectivamente utilizando este
mtodo. 7 7.1.2 CUENTA EN PLACA Cuando se requiere investigar el
contenido de microorganismos viables en un alimento, la tcnica
comnmente utilizada es la cuenta en placa. En realidad esta tcnica no
pretende poner en evidencia todos los microorganismos presentes. La
variedad de especies y tipos diferenciables por sus necesidades
nutricionales, temperatura requerida para su crecimiento, oxgeno
disponible, etc., hacen que el nmero de colonias contadas constituyan
una estimacin de la cifra realmente presente y la misma refleja si el
manejo sanitario del producto ha sido el adecuado. Por otra parte, el
recuento de termoflicos, psicroflicos y psicotrficos es importante para
predecir la estabilidad del producto bajo diferentes condiciones de
almacenamiento. Esta tcnica puede aplicarse para la estimacin de
microorganismos viables en una amplia variedad de alimentos y
productos farmacuticos.8 7.2 MUESTREO DEL AGUA En el anlisis
microbiolgico, la adecuada seleccin de la muestra, la toma correcta,
los medios de conservacin y su transporte al laboratorio, son de
primordial importancia para obtener resultados significativos y
confiables. Esto implica precisar el objetivo del estudio, la naturaleza de
las muestras y la cantidad, el tamao o el volumen, en lo posible, sean
representativos del producto y del lote o partida de donde provienen. La
recoleccin de la muestra se debe efectuar evitando toda contaminacin
externa, tanto ambiental como humana, para asegurar la integridad de la
misma. Se requiere consignar en el informe con que se entrega la
muestra todos los datos pertinentes que pudieran afectar la prueba o el
significado del resultado, a fin de que el laboratorio lo tome en
consideracin. Las condiciones de conservacin y transporte, tiempo
comprendido entre la recoleccin de la muestra, su entrega al
laboratorio, as como la realizacin del anlisis influyen notoriamente en
los resultados obtenidos, ya que la poblacin microbiana puede sufrir
cambios cualitativos y cuantitativos. 7.3 TECNICA ENZIMATICA
53. 7.3.1 Ready cult: La identificacin bacteriana se realiza
determinando la actividad enzimtica especfica, se evidencia por un
cambio de color o emisin de fluorescencia en un medio de cultivo
especifico. SUSTRATOS CROMOGENICOS ENZIMAS X - GAL - D Galactosidasa MUG - D - Glucoronidasa Para la determinacin de los
Coliformes totales la enzima - D Galactosidasa degrada al sustrato
X-GAL produciendo una coloracin azul-verde, para determinacin de
Coliformes fecales la enzima - D Glucoronidasa degrada al sustrato
MUG produciendo fluorescencia.
54. 7.4 OBJETIVOS EL ALUMNO IDENTIFICARA LOS PRINCIPALES
MICROORGANISMOS OBJETABLES PRESENTES EN UNA MUESTRA
DE AGUA PARA EL CONTROL MICROBIOLOGICO, POR LA TECNICA
DEL NMP Y LA TECNICA ENZIMATICA DE READY CULT. EFECTUAR
LA TOMA DE MUESTRA, SU PREPARACION Y ANALISIS
MICROBIOLOGICO PARA LA IDENTIFICACION Y RECUENTO DE
MICROORGANISMOS EN UNA MUESTRA DE AGUA. 7.5 MATERIAL

7.5.1 EQUIPO Bao Mara Autoclave Estufa de Incubacin Refrigerador


Microscopio ptico 7.5.2 MATERIAL DE VIDRIO Pipetas graduadas de 1
ml (estriles) Pipetas graduadas de 10 ml (estriles) Cajas de petri
(estriles) 7.5.3 MEDIOS DE CULTIVO 1 Agar Mc Conkey (AMc) Agar
Cuenta Estndar 1 Agar Cetrimida (AC) 6 tubos con Caldo rojo de fenol
Lactosado concentracin simple (CRFL) 3 tubos con Caldo rojo de fenol
Lactosado concentracin doble 4 tubos con Caldo Lactosado bilis verde
brillante (CBVB) 1 tubo con Caldo Soya Tripticasena 1 Citratos 1 SIM 1
Rojo de metilo 1 Vogues Proskauer 2 Medio O/F 7.5.4 REACTIVOS Kit
paraTincin de Gram Rojo de metilo Reactivo de Kovac -Naftol 5%
Perxido de Hidrgeno Agua destilada KOH
55. 7.6 METODOLOGA
56. MESOFILOS AEROBICOS DETERMINACION DE Pseudomonas Se
colocan 4 cajas petri estriles Agregar 1 mL de la muestra en cada caja.
Agregar 25 mL de Agar Cuenta Estndar Homogeneizar. 6 vueltas a la
derecha y 6 a la izquierda 2 cajas se incuban 37C /24-48 hrs
Determinar el NMP En un tubo con 5 mL de Caldo Nutritivo se agregan 5
mL de la muestra de agua Incubar de 24-48 hrs a 37C Si el tubo esta
turbio se siembra en Agar Cetrimida Se realizan pruebas bioqumicas
para Identificar Pseudomonas MUESTRA DE AGUA 2 cajas se incuban
25C /24-48 hrs
57. 7.7 RESULTADOS UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE
MXICO. FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN.
LABORATORIO DE MICROBIOLOGA FARMACETICA. NOMBRE DE
LA PRCTICA ANALISIS BACTERIOLGICO DELAGUA Fecha de la
Prctica No. de Prctica NOMBRE Y FIRMA DE LOS ANALISTAS
IDENTIFICACIN DE LA MUESTRA MUESTRA TOMADA EN:
Fecha/Lugar de la toma. APARIENCIA MESFILOS AEROBIOS
UFC/mL UFC/mL Promedio. Caja 01 Caja 02 NUMERO MS
PROBABLE NMP Cambios despus de la Incubacin No. de Serie 24
hrs 48 hrs 72 hrs 01 02 03
58. Pseudomonas spp. Medio de Cultivo Morfologa colonial Ready Cult
Turbidez y cambio de color Fluourescencia Prueba del Indol
CONCLUSIONES.
__________________________________________________________
_______________________________
__________________________________________________________
_______________________________
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_______________________________
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_________________ FIRMA DE REVISIN
59. ESPECIFICACIONES Prueba LIMITES PERMISIBLES Mesfilos
aerbicos Menor a 100 UFC/Ml Coliformes Totales Menor a 2 UFC/mL
de agua Coliformes Fecales Ausentes Determinacin de Pseudomonas
Ausentes
60. BIBILOGRAFIA: 1 FARMACOPEA DE LOS ESTADOS UNIDOS
MEXICANOS. 7 ed. Secretara de Salud. Mxico, 2000 3 BRADSHAW,
Jack. Microbiologa de Laboratorio. Editorial El Manual Moderno.
Mxico, DF. 1990 4 MANUAL DE TRATAMIENTO DE AGUAS.

Departamento de Sanidad del Estado de Nueva York, Albany. 8 ed.


Editorial Limusa. Mxico, DF. 1990 5 NORMA OFICIAL MEXICANA.
NOM-113-SSA1-1994. Mtodo para la cuenta de microorganismos
Coliformes totales en placa. 6 NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-112SSA1-1994. Determinacin de bacterias Coliformes. Tcnica del
nmero ms probable. 7 RHEINHEIMER, Gerhard. Microbiologa de
las Aguas. Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa. 1990. 8 NORMA 7
OFICIAL MEXICANA. NOM-092-SSA1-1994. Mtodo para la cuenta de
bacterias aerobias en placa.
61. Productos Farmacuticos No Estriles. Objetivo. Conocer y manejar
los procedimientos establecidos en la Farmacopea de los Estados
Unidos Mexicanos a travs de su ensayo en productos farmacuticos no
estriles para asegurar la calidad de estos. Introduccin. Los productos
farmacuticos considerados como no estriles que se fabrican son:
tabletas, grageas, cpsulas, comprimidos, supositorios, vulos, jarabes,
elixires, emulsiones, suspensiones, cremas, geles, pomadas, ungentos,
soluciones, y deben de cumplir con las buenas prcticas de fabricacin.
La presencia de una gran variedad de levaduras, hongos y bacterias en
productos farmacuticos pueden ocasionar una serie de problemas
como: la descomposicin del principio activo, ruptura de la emulsin,
cambios en el color, olor y consistencia, y daos al paciente. Cada
materia prima presenta caractersticas independientes y dependiendo de
su origen (animal, vegetal y/o sinttico) son aprovechadas por los
microorganismos como sustratos. En estas materias primas las
bacterias, hongos y levaduras pueden: Mantenerse viables.
Desarrollarse. Ha de saberse que cada una de las materias primas
presenta diferentes lmites microbianos, tal y como se demuestra en la
farmacopea indicada. Por otra parte los anlisis microbiolgicos debern
de ser minuciosos y brindar una cuantificacin del estatus microbiano de
la muestra obtenida. La importancia de la presencia de microorganismos
en los productos no estriles debe ser evaluada en trminos de uso y de
la naturaleza del medicamento. La USP sugiere que cierta categora de
productos sean analizados de rutina para determinar cuenta total
microbiana y contaminantes microbiolgicos especficos. Las formas
farmacuticas no estriles deben de cumplir con normas oficiales NOM059 -SSA1-1994, NOM-073-SSA1-1993; respecto a la cantidad y tipo de
microorganismos que puedan contener. Los requisitos generales de
calidad microbiolgica son los siguientes:
62. Cuenta Total de Bacterias mesfilas aerobias Cuenta Total de
Bacterias anaerobias Cuenta Total de Hongos y Levaduras Identificacin
de Microorganismos Patgenos Objetables Materiales. Equipo: Bao
Maria Estufa bacteriolgica Refrigerador Autoclave Microscopio ptico
Instrumentos de vidrio Pipeta graduadas de 1 y 10 ml estriles. Probeta
graduada de 100 ml estril Porta objetos y cubre objetos Medios de
cultivo Botella de dilucin con 90 ml de caldo soya tripticasena Botella
de dilucin con 90 ml de caldo tioglicolato Agar soya tripticasena Agar
dextrosa Saboraud Agar Sales Manitol Agar MacConkey Agar Cetrimida
Agar Letheen Reactivos Safranina Lugol Cristal violeta Aceite de
inmersin Azul de algodn Agua destilada Buffer de fosfatos pH= 7.2
Solucin salina fisiolgica

63. Diagrama de trabajo Dilucin de la -muestra. Muestra Revisar estado


Fsico Muestras viscosas calentar en bao mara a 45 C Pesar o medir
el equivalente a 10 g o 10 m. Colocar una muestra en cada uno de los
caldos: soya tripticasena y Tioglicolato. Identificar cada uno de los
caldos Reservar el caldo soya tripticasena Incubar 37 C por un periodo
de 24-72 h Revisar cada 24 h y registrar cambios
64. Mesfilos aerobios, Hongos y Levaduras; Microorganismos
Objetables. Botella de Dilucin Caldo Soya Tripticasena Hongos y
Levaduras Mesfilos aerobios Microorganismos objetables Tomar 0.1 de
la muestra y estriar en cada uno de los medios Tomar 4 ml del caldo
soya tripticasena Tomar 4 ml del caldo soya tripticasena Adicionar de
20 a 25 ml de medio dextrosa- Saboraud fluido (45 C) Colocar cada 1 en
cada una de las 4 cajas petri estriles Agar Sales-Manitol Agar
MacConkey Agar Cetrimida Agar Salmonella-Shigella Colocar cada 1 en
cada una de las 4 cajas petri estriles Rotular cajas petri e incubar: 37
C/24-48 h Adicionar de 20 a 25 ml de medio Cuenta Estndar fluido (45
C) Homogeneizar la muestra, Dejar gelificar Homogeneizar la muestra,
Dejar gelificar Si existe crecimiento: Identificar colonias y realizar
pruebas bioqumicas primarias y secundarias.Rotular cajas petri e
incubar: 2 cajas a 37 C/24 h 2 cajas a 25C/1 semana Rotular cajas petri
e incubar: 2 cajas a 37 C/24 h 2 cajas a 25C/24 h Realizar conteo,
obtener promedios Realizar conteo, obtener promedios
65. UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO. FACULTAD
DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN. LABORATORIO DE
MICROBIOLOGA FARMACETICA. NOMBRE DE LA PRCTICA
PRODUCTOS FARMACETICOS NO ESTRILES Fecha de la Prctica
No. de Prctica NOMBRE DE LOS ANALISTAS IDENTIFICACIN DE
LA MUESTRA NOMBRE LOTE CODIGO FECHA DE RECEPCIN
AISLAMIENTO TIPO DE MEDIO 24 48 72 96 CALDO SOYATRIPTICASENA CALDO TIOGLICOLATO MESFILOS AEROBIOS
UFC/mL UFC/mL Promedio. Caja 01 Caja 02 HONGOS Y LEVADURAS
UFC/mL UFC/mL Promedio. Caja 01 Caja 02 PRUEBAS BIOQUMICAS
PRIMARIAS GRAM INDOL ( NITRITOS ( ) LISINA (
66. ) ) O/F ( ) RM ( ) NITRATOS ( ) ORNITINA ( ) CATALASA ( ) VP ( )
H2S ( ) ARGININA ( ) OXIDASA ( ) CITRATOS ( ) GAS ( )
FENILALANINA ( ) MOTILIDAD ( ) MALONATOS ( ) UREA ( ) NOMBRE
DE LA PRCTICA PRODUCTOS FARMACETICOS NO ESTRILES.
COAGULASA ( ) NOV 5g ( ) BACITRACINA 0.04 UI ( ) BILIS
ESCULINA ( ) HIPURATO ( ) NaCl 6.5% ( ) CAMP ( ) OTRAS PRUEBAS
Carbohidratos GLU ( ) SAC ( ) FRUC ( ) LAC ( ) MAN ( ) RAM ( ) TRE ( )
XIL ( ) ARA ( ) ADO ( ) MEL ( ) SOR ( ) DUL ( ) MNL ( ) RAF ( ) SAL ( )
Otros carbohidratos: MICROORGANISMO IDENTIFICADO.
67. CONCLUSIONES.
__________________________________________________________
_________________________________________
__________________________________________________________
________________________________________ FIRMA DE REVISIN
68. 9 PRODUCTOS FARMACUTICOS ESTRILES 9.1
INTRODUCCIN Un producto farmacutico estril es el que se
encuentra libre de microorganismos y pirgenos, y cuando es

administrado no ocasiona una respuesta adversa por contaminacin


microbiolgica. En este tipo de productos se eliminan todas las formas
viables de microorganismos, por la realizacin de un proceso de
esterilizacin en el cual las clulas microbianas o sus componentes se
remueven o destruyen, de tal modo que ya no son detectables en
medios de cultivo adecuados para su proliferacin. Un requisito
fundamental para todo producto estril es que tenga la mxima calidad y
ofrezca la mejor seguridad al paciente. Los productos farmacuticos
estriles son diversos como: inyectables (sueros, soluciones, nutritivas,
ampolletas, intramusculares, subcutnea, intravenosa), slidos estriles
(polvos liofilizados para inyectables), ungentos (ticos y oftlmicos),
lquidos (oftlmicos), etc. 1 La Norma Oficial Mexicana 056-SSA1-1993,
establece una serie de caractersticas sanitarias que un rea de proceso
para productos farmacuticos debe cumplir, tales caractersticas son:
superficie adecuada (espacio suficiente para trabajar y limpiar
cmodamente), acabados sanitarios (superficies lisas, eliminando
ngulos de 45 y que resistan la accin de los sanitizantes), ventilacin
apropiada (aire filtrado por filtros absolutos de ser requerido), extraccin
eficiente (donde se genere calor, gases y/o vapores) e iluminacin
suficiente (natural o artificial).2,3 Las guas de la FDA (Federal Drug
Administration) describen el procesamiento asptico como un proceso
en que el producto, contenedor y tapones son sujetos a procesos de
esterilizacin, sin embargo, al ser estas operaciones separadas, tienen
sus correspondientes consecuencias (como riesgo de contaminacin)
debido a que no hay cercana entre un proceso y otro para mantener la
esterilidad del producto y en contenedor final. El trmino de rea
asptica se define de manera sencilla como: Zona comprendida dentro
de un rea limpia, diseada y construida para minimizar la
contaminacin por partculas viables y no viables, mantenindola dentro
de lmites preestablecidos4 . Esta rea cuenta con un ambiente
microbiolgico controlado, y est diseada de tal forma que permita una
limpieza fcil y eficiente. 1 TESIS. Auditorias Tcnicas en la Industria
Farmacutica. Alejandra Manzano Montiel. FESC, 2004 2 NORMA
OFICIAL MEXICANA, NOM-059-SSA1-1993. Buenas Prcticas de
Fabricacin para Establecimientos de la Industria Qumico Farmacutica
dedicados a la Fabricacin de Medicamentos. 3 GUIA DE PRCTICAS
ADECUADAS DE MANUFACTURA PARA CUARTOS LIMPIOS. CIPAM.
Monografa Tcnica No. 1. Mxico DF, 1989. 4 NORMA OFICIAL
MEXICANA, NOM-059-SSA1-1993. Buenas Prcticas de Fabricacin
para Establecimientos de la Industria Qumico Farmacutica dedicados a
la Fabricacin de Medicamentos.
69. 9.1.1 CLASIFICACIN DE LAS REAS ASPTICAS Las reas
aspticas se clasifican en grado A, B, C y D de acuerdo con las
caractersticas requeridas del aire. sta clasificacin se representa en la
Tabla 9-1 Tabla 9-1 Clasificacin de los tipos de rea asptica usadas en
la fabricacin de productos farmacuticos estriles. Para controlar el
nivel de contaminacin microbiana de las distintas zonas de
funcionamiento, deben monitorizarse las reas (Ver prctica Monitoreo
Ambiental). Cuando se realicen operaciones aspticas, la
monitorizacin debe ser frecuente utilizando mtodos como placas de

sedimentacin, muestreo volumtrico del aire y de superficies (por


ejemplo, hisopos y placas de contactos). Los resultados del monitoreo
deben estudiarse al revisar la documentacin del lote para la liberacin
del producto terminado. Las superficies y el personal deben supervisarse
tras las operaciones crticas. Tambin es necesario realizar un monitoreo
microbiolgico despus de la validacin de sistemas, limpieza y
desinfeccin, etc. Este monitoreo es adicional y distinto al que se lleva
de rutina en la produccin 9.1.2 AREAS DE FABRICACIN DE
MEDICAMENTOS La fabricacin de medicamentos est sujeta a
requisitos especiales para minimizar los riesgos de contaminacin
microbiana, de partculas y de pirgenos. La garanta de calidad reviste
una importancia especial y esta fabricacin debe seguir estrictamente
mtodos de preparacin y procedimientos establecidos y validados
cuidadosamente. La confianza en la esterilidad u otros aspectos de la
calidad no debe basarse exclusivamente en un proceso final o en los
ensayos sobre un producto terminado. Las diversas operaciones de
preparacin de los componentes, preparacin del producto y llenado
debern realizarse en zonas separadas dentro de la zona limpia. Las
operaciones de fabricacin se clasifican en dos categoras: aquellas en
que el producto se esteriliza al final y aquellas que se realizan
aspticamente en todas o alguna de sus partes.
70. 9.2 PRUEBAS MICROBIOLGICAS 9.2.1 PRUEBAS DE
IRRITABILIDAD 9.2.1.1 Pruebas de Irritabilidad para Medicamentos de
Uso Oftlmico. Los productos oftlmicos son preparados estriles de
acuerdo a las buenas prcticas de manufactura para garantizar su
seguridad y efectividad por lo que deben cumplir con la prueba de
irritabilidad. Esta prueba se debe realizar no solo a colirios y pomadas
oftlmicas sino tambin, a aquellos medicamentos de uso tpico que
accidentalmente puedan introducirse al ojo (ungentos, cremas o
soluciones que se apliquen en la cara). Se basa en la evaluacin de las
reacciones oculares observadas despus de la administracin del
producto oftlmico. Para la realizacin de la prueba se utilizan conejos
albinos, adultos, sanos, de cepa adecuada y cuyo peso debe estar entre
1 a 3 Kg. Se deben mantener en jaulas individuales y aisladas, en
condiciones de ventilacin, temperatura, iluminacin controlada. Los
animales se deben emplear con una frecuencia no mayor de dos veces
por semana, separando los ensayos consecutivos por un mnimo de tres
das. Se aplican en el ojo derecho de cada uno de los conejos, 3 o 4
gotas del producto oftlmico en estudio y en el ojo izquierdo, el cual se
toma como control, se aplica solucin isotnica de cloruro de sodio
estril. Se observa la reaccin del ojo a los 5 minutos y a las 24 horas,
despus de la aplicacin de unas gotas de fluorescena en los dos ojos,
detectando la respuesta con la ayuda de una lmpara de luz ultravioleta
5 . Adems de estas pruebas realizadas in-vivo se pueden realizar
tcnicas in vitro en huevos fertilizados (se mide la irritacin de la
membrana corinica despus de administrar el medicamento), y existe la
medicin de la irritacin de la cornea en ojos de ternera recin
sacrificada. Todas estas tcnicas se encuentran en la NOM-039-SSA11993 Aunado a la tcnica realizada en conejos, se puede realizar
pruebas de irritabilidad en piel de cobayos, e incluso se encuentran

pruebas realizadas en piel de humano (prueba del parche)6 . 9.2.1.2


Prueba de esterilidad. Las pruebas de esterilidad tal como estn
descritas en la farmacopea, son adecuadas para revelar la presencia de
formas viables de bacterias, hongos y levaduras. No contempla la
realizacin de pruebas especficas para detectar virus, ya que estas
tcnicas, para su cultivo son muy complicadas y estn limitadas a la
deteccin de algunas especies. Todos los lotes de productos inyectables
en sus envases finales deben probarse en cuanto a su esterilidad. La
USP XXV describe los requerimientos oficiales que se deben cumplir. La
FDA usa esos requerimientos como gua para probar productos estriles
no oficiales. La prueba oficial principal se realiza por el mtodo de la
filtracin, pero se utiliza transferencia directa si la filtracin por
membrana es inadecuada. Esta prueba no pretende ser una evaluacin
definitiva para un producto sometido a un proceso de esterilidad de
eficacia desconocida, sino que est concebida en mayor medida como 5
NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM-039-SSA1-1993. Determinacin de
los ndices de Irritacin Ocular, Primaria Drmica y Sensibilizacin
71. una prueba para verificar la probabilidad de que un procedimiento de
esterilizacin convalidado con anterioridad se haya repetido, o para
asegurar la continuidad de su eficiencia. Al realizar la prueba de
esterilidad a un determinado nmero de unidades de un lote, si los
resultados obtenidos son negativos, indican que la probabilidad de
encontrar unidades contaminadas en la parte no analizada, es menor al
nivel detectable sealado en los planes de muestreo utilizados. Ningn
plan de muestreo puede asegurar que todas las unidades del lote se
encuentren libres de microorganismos, por lo que la garanta de que el
producto sea estril, se logra mediante la validacin del proceso de
esterilizacin. La sensibilidad de esta prueba se ve afectada por la
naturaleza del medio de crecimiento, por lo tanto debe realizarse
utilizando medios de cultivo altamente nutritivos para que favorezcan el
desarrollo de todos los microorganismos y esporas presentes en la
muestra. Estos medio deben ser segn la USP de caldo tioglicolato,
apropiado para bacterias y el digerido de soya Tripticasena para hongos
y levaduras. Durante el desarrollo de la prueba esterilidad se deben
tener las precauciones necesarias que eviten la contaminacin de la
muestra para que esta mantenga sus caractersticas microbiolgicas
originales. Una vez preparados y esterilizados los medios de cultivo y
antes de ser utilizados, tienen que ser sometidos a un proceso de control
de calidad para confirmar que realmente hayan quedado estriles y que
no pierdan su capacidad de promover el crecimiento bacteriano. Si
despus de incubar los tubos de tioglicolato a 30-35 C y los de digerido
de soya Tripticasena a 20-25 C durante un perodo de 7 das, no
presenta turbidez, se comprueba la esterilidad de los medios. La prueba
de esterilidad es aplicable a medicamentos, materias primas, materiales
de curacin y productos de uso clnico. Los medicamentos que deben
ser estriles cuando el paciente adquiere son los parenterales, los
oftlmicos y los ticos. La calidad microbiolgica de esos productos
farmacuticos por dos tcnicas: 9.2.1.3 Mtodo de siembra directa Se
aplica a productos que no contengan inhibidores del desarrollo
bacteriano y todos aquellos que permitan apreciar fcilmente el

crecimiento microbiano en los tubos, despus del perodo de incubacin.


Los ungentos o lquidos oleosos, debern esparcirse y los slidos
debern disolverse en diluyentes estriles que no inhiban el desarrollo
bacteriano y con esta solucin se realizan los inculos correspondientes.
La prueba de esterilidad para gasa, algodn, y otros implementos
quirrgicos, debe realizarse lavando el material con solucin isotnica
estril la cual despus de arrastrar los microorganismos, se siembra en
los medios especificados. La cantidad del inculo y de medio depender
del contenido del envase, pero nunca ser inferior a 1 ml y 15 ml
respectivamente. Los tubos de tioglicolato inoculados se incuban
durante 14 das a 30-35 C y los de digerido de soya Tripticasena a 2025 C6 . 6 PRADEU. Anlisis Qumicos Farmacuticos de
Medicamentos. Editorial Limusa. Mxico DF.1998
72. 9.2.1.4 MTODO DE FILTRACIN POR MEMBRANA La prueba de
esterilidad realizada por la tcnica de filtracin por membrana, es
aplicable a aquellos productos estriles que pueden inhibir el desarrollo
bacteriano, a los polvos insolubles, a las presentaciones parenterales de
grandes volmenes y prcticamente a cualquier tipo de muestra. El
equipo de filtracin soporta una membrana, la cual debe tener una
porosidad de 0.45 micras, en la cual quedarn retenidas todas las
formas viables y esporuladas de microorganismos, una vez que la
muestra pase a travs de ella. La unidad completa deber esterilizarse
en autoclave antes de ser utilizada; se conecta a un sistema de vaco
para facilitar el paso de la muestra. Para el desarrollo de la tcnica se
requiere agua destilada estril para disolver la muestra y solucin de
enjuague del artculo o muestra problema; generalmente se utiliza
solucin peptonada al 1% o solucin salina isotnica de NaCl. Para
muestras de lquidos miscibles en agua, la prueba se llevar a cabo
vaciando dentro del recipiente de filtracin de una manera asptica, el
contenido de los envases, aplicando vaco para favorecer el paso del
lquido a travs de la membrana. Si la solucin contiene inhibidores del
desarrollo bacteriano, se enjuaga el filtro con varias porciones de
peptona al 1 % para eliminar cualquier residuo que pudiera permanecer
en la membrana y afectar el resultado de la prueba. Ya drenado el
lquido, se separa la membrana y sostenindola con pinzas estriles
especiales se corta en dos, introduciendo cada una de las mitades en
los tubos del medio Caldo de tioglicolato y en digerido de soya
Tripticasena, respectivamente. Los tubos se incuban a 30-35 C y a 2025 C durante un perodo de tiempo no inferior a 7 das. 9.2.1.5 Prueba
de Pirgenos Los pirgenos son productos del metabolismo celular
presentes en artculos farmacuticos que han estado en contacto con
algn tipo de contaminacin microbiana, los cuales al entrar al torrente
sanguneo pueden provocar reacciones febriles. De acuerdo a la
capacidad inherente de producir pirgenos, las bacterias se han
clasificado en cuatro grupos: I Aquellas cuyos productos metablicos no
tienen efecto en la temperatura II. Las que causan fiebre ligera durante
un tiempo corto III. Las que causan un incremento marcado en la
temperatura durante varias horas IV. Las que matan a los conejos o les
producen colapso Los pirgenos ms potentes son los producidos por
las bacterias coliformes de los gneros Salmonella y Pseudomonas. El

proceso de esterilizacin por calor usado (cuando sea el caso) en la


fabricacin de medicamentos estriles no elimina la presencia de
pirgenos en las soluciones parenterales, deben seguirse las buenas
prcticas de manufactura durante la fabricacin de los productos, para
asegurar que cumplan con los requisitos de calidad establecidos para
este ensayo. La prueba de pirgenos oficial est diseada para
mantener un nivel aceptable de riesgo de reaccin febril en los
productos farmacuticos; se efecta en conejos, en la cual se evala la
elevacin de la temperatura
73. corporal, despus que se les ha administrado por va intravenosa, la
dosis especificada de acuerdo en la norma de cada producto. La
temperatura corporal del conejo ser determinada por va rectal
introduciendo un termmetro o termopar; no se debern usar conejos
que tengan una temperatura basal superior a 39.8 C y que presenten
una variacin entre ellos de ms de 1 C. La temperatura basal control
de cada uno de los tres conejos utilizados, debe registrarse 30 minutos
antes de la administracin de la dosis problema en la vena marginal de
la oreja del conejo, y debe ser verificada a la primera, segunda y tercera
hora despus de la inyeccin. El producto cumple con la prueba de
ausencia de pirgenos si ninguno de los conejos muestra un incremento
individual igual o superior a 0.6 C respecto a su temperatura control y si
la suma de los tres incrementos individuales ms altos, no excede de 1.4
C. 9.2.1.6 PRUEBA DE Amebocitus de Limulus Para asegurar que las
soluciones parenterales sean apirognicas, las compaas
farmacuticas han utilizado por ms de 40 aos, la prueba oficial de
pirgenos que marca la FEUM. En los ltimos aos se han desarrollado
una prueba de pirgenos in Vitro por medio del reactivo de Lisado de
Amebocitos de Limulus (LAL), la cual permite estimar con gran
sensibilidad y rapidez, la concentracin de endotoxinas procedentes de
la pared celular de bacterias G (-) en un producto farmacutico. Esta
determinacin ha demostrado ser 10 veces ms sensible que la obtenida
por reaccin febril del conejo. La prueba de LAL est basada en la
aglutinacin producida cuando las endotoxinas bacterianas se combinan
con un preparado que contiene el lisado. Para la realizacin de la prueba
de LAL se deben de combinar cantidades especficas de la solucin del
ensayo y del Lisado diluido de Amebocitos (1:1 con buffer de fosfatos
pH=7.2), incubando la mezcla a 37 C durante una hora. Si la solucin
contiene endotoxinas, se produce un gel o aumento de viscosidad en la
mezcla. La velocidad de reaccin entre el Lisado y la endotoxina
depende de la concentracin, de la temperatura y del pH6 .
74. 9.3 OBJETIVOS 9.3.1 GENERAL Evaluar a los productos
farmacuticos considerados como estriles, mediante mtodos oficiales,
para determinar si cumplen con la normatividad vigente. 9.3.2
PARTICULARES Realizar las pruebas oficiales para productos
farmacuticos estriles para consumo humano y/o animal. Determinar
si los productos evaluados estn libres de agentes patgenos.
Identificar los puntos crticos de riesgo que puedan ser fuente de
contaminacin en la fabricacin de los productos considerados como
estriles.

75. 9.4 DESARROLLO EXPERIMENTAL 9.4.1 MATERIAL DE VIDRIO


Portaobjetos planos Cubreobjetos Tubos de ensaye grandes Pipetas
graduadas de 1, 5, 10 ml Botellas de dilucin (leche) 9.4.2 MATERIAL
DIVERSO Gradilla para tubos de ensaye Pinzas de diseccin (estril)
9.4.3 EQUIPO Autoclave Estufa de incubacin Refrigerador Filtracin
con membrana 9.4.4 MEDIOS DE CULTIVO EN TUBO O BOTELLA (por
equipo) Caldo Tioglicolato (CT) ( 10 tubos o 4 botellas por equipo) Caldo
Soya Tripticasena (CST) (10 tubos o 4 botellas por equipo) 9.4.5
REACTIVOS Solucin Salina Fisiolgica (estril) Todos los necesarios
para pruebas bioqumicas secundarias. 9.4.6 MUESTRAS Formas
Farmacuticas estriles (indicadas por los profesores)
76. DIAGRAMA DE TRABAJO EXPERIMENTAL 9.4.6.1 PRUEBA DE
ESTERILIDAD POR SIEMBRA DIRECTA Sembrar en medios
diferenciales y selectivos
77. 9.4.6.2 PRUEBA DE ESTERILIDAD POR MEMBRANA Sembrar en
medios diferenciales y selectivos
78. 9.5 RESULTADOS UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE
MXICO. FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN.
LABORATORIO DE MICROBIOLOGA FARMACETICA. NOMBRE DE
LA PRCTICA PRODUCTOS FARMACETICOS ESTRILES. Fecha
de la Prctica No. de Prctica NOMBRE DE LOS ANALISTAS
CRECIMIENTO CST (hrs) PRUEBA 24 48 72 96 120 144 168 192 384
ESTERILIDAD POR SIEMBRA DIRECTA ESTERILIAD POR
MEMBRANA CRECIMIENTO CT (hrs) PRUEBA 24 48 72 96 120 144
168 192 384 ESTERILIDAD POR SIEMBRA DIRECTA ESTERILIAD
POR MEMBRANA MEDIO DE CULTIVO COLONIAS OBSERVACIONES
(CAMBIO DE COLOR, COAGULACIN, ETC) INTERPRETACIN
79. BIOQUIMICAS (SI ES EL CASO) MICROORGANISMO(S)
IDENTIFICADO(S). CONCLUSIONES.
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