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Universidad Nacional Mayor de San Marcos

Facultad de Farmacia y Bioqumica


E.A.P. Farmacia y Bioqumica
Departamento Acadmico de Microbiologa y Parasitologa Bsica y Aplicada

MICROBIOLOGA GENERAL

ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA:
MTODOS CUALITATIVOS Y
CUANTITATIVOS
Q.F. JULIO REYNALDO RUIZ QUIROZ
LIMA AGOSTO 2012

INTRODUCCIN
ENFERMEDADES INFECCIOSAS

Bacterias
Hongos
Virus
Parsitos

Problemas de
Salud Pblica

Investigacin de nuevos antimicrobianos es


necesario
Productos naturales son la mayor fuente de
agentes teraputicos innovadores

INTRODUCCIN
INVESTIGACIN ACTUAL: PLANTAS
COMPLEJIDAD QUIMICA
NO DISPONIBILIDAD DE
CULTIVOS ESTANDARIZADOS

DISMINUCIN INTERES
INDUSTRIA
FARMACUTICA

ROL DE LAS INSTITUCIONES PBLICAS Y


ACADMICAS EN LA EXPLOTACIN Y EVALUACIN
DE PRODUCTOS NATURALES
USO DEL CONOCIMIENTO ETNOBOTNICO

INTRODUCCIN
VALIDACIN Y SELECCIN DE ENSAYOS DE
SCREENING PRIMARIOS
Rpidos
Muestras grandes
Bajo costo

HITS compuestos o extractos con actividad


especfica a dosis no txicas
LEADS bioensayos in-vitro secundarios o
especializados y en modelos animales
PROOF-OF-CONCEPT y DEVELOPMENT
CANDIDATE Estudios cinticos y toxicolgicos
BUENAS PRCTICAS DE BIOENSAYOS

SELECCIN DEL BIOENSAYO


APROPIADO

Journal of Ethnopharmacology 106 (2006) 290302

ENSAYOS A CLULA ENTERA

TIENE VENTAJAS
ES EL GOLD STANDARD
M.O. FCILES DE CULTIVAR
IMPORTANTE DISCRIMINAR ACCIN DE EFECTOS
TXICOS
Evaluacin de citotoxicidad
Inclusin de un panel de m.o. (bacterias, hongos,
virus y parsitos)

MODELOS ANIMALES SON INDISPENSABLES


PARA CONFIRMAR ACTIVIDAD

ACTIVIDAD SELECTIVA PARA SCREENING IN VITRO


La estandarizacin a travs de los diferentes bioensayos
Mxima eficiencia
Minimizar costos
Adquisicin de datos: fciles y reproducibles
Esto incluye el uso de una correcta implementacin e
interpretacin de diversos modelos de laboratorio

Clasificacin mtodos : 3 grandes grupos


Difusin
Dilucin
Bioautogrficos

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA:
Mtodos cualitativos y Cuantitativos
MTODOS CUALITATIVOS
Difusin
Bioautografa
MTODOS CUANTITATIVOS
Dilucin
El gran inconveniente es que no existe a la fecha ningn
organismo que haya estandarizado la metodologa para el uso
de productos naturales.
Por esta razn se toma como base las tcnicas desarrolladas
para compuestos antimicrobianos puros de las siguientes
organizaciones
CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute)
EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing)
ISO

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos


http://www.clsi.org/

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos


http://www.clsi.org/ pgina web del CLSI
http://www.clsi.org/source/orders/categories.cfm?section=Microbiology1&CAT=MI

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos


Para el mtodo de
Disco difusin

Para los mtodos de dilucin:


- Macrodilucin
- Microdilucin
- Dilucin en agar

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos


http://www.eucast.org/

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos


http://www.iso.org/

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos

METODO DE DIFUSIN EN AGAR


DEFINICIN: Difusin del antibitico (producto
natural) de discos, pozos o cilindros en medios
de cultivo slidos inoculados que da lugar a
zonas de inhibicin
Dependiendo del reservorio se clasifican en:
Disco difusin (disk diffusion)
Excavacin placa cultivo (agar well diffusion)

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos

METODO DE DIFUSIN EN AGAR


Medios para el estudio de la sensibilidad

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos

METODO DE DIFUSIN EN AGAR: Disco Difusin

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos

METODO DE DIFUSIN EN AGAR: Disco Difusin

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos

METODO DE DIFUSIN EN AGAR: Disco Difusin

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos

METODO DE DIFUSIN EN AGAR: Disco Difusin

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METODO DE DIFUSIN EN AGAR: Disco Difusin

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METODO DE DIFUSIN EN AGAR: Disco Difusin

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METODO DE DIFUSIN EN AGAR: Disco Difusin

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METODO DE DIFUSIN EN AGAR: Disco Difusin

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METODO DE DIFUSIN EN AGAR: Disco Difusin

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos

METODO DE DIFUSIN EN AGAR: Disco Difusin

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METODO DE DIFUSIN EN AGAR: Disco Difusin

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METODO DE DIFUSIN EN AGAR: Disco Difusin

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METODO DE DIFUSIN EN AGAR: Disco Difusin

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos

METODO DE DIFUSIN EN AGAR: Disco Difusin

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METODO DE DIFUSIN EN AGAR: Disco Difusin

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METODO DE DIFUSIN EN AGAR: Disco Difusin

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METODO DE DIFUSIN EN AGAR: Disco Difusin

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos

METODO DE DIFUSIN EN AGAR: Excavacin placa cultivo


CONSIDERACIONES:
En general se sigue el mismo procedimiento explicado
para la tcnica de disco difusin.
Los cambios a tener en cuenta son:
El reservorio, son pozos, hechos con un sacabocado
estril (puede ser de 11 mm de dimetro)
Se agrega un volumen de muestra de 100 l (esto vara
si el pozo tiene menor dimetro)
El inculo, se puede agregar de dos maneras:
Similar al de disco difusin
Por incorporacin (se aade una cierto volumen del
inculo al medio de cultivo esterilizado y enfriado a
45 C 50 C)
Generalemente se deja difundir de 30 60 min. antes
de la incubacin (algunos autores consideran refrigerar para
mejorar la difusin )

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos

METODO DE DIFUSIN EN AGAR

SCREENING METHODS TO DETERMINE ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF NATURAL PRODUCTS Brazilian Journal of Microbiology (2007) 38:369-380

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos

METODO DE DIFUSIN EN AGAR: Excavacin placa cultivo


Bacterias:

Gram positivas
Staphylococcus aureus ATCC 25933
Staphylococcus epidermidis cepa clnica
Bacillus subtillis cepa clnica
Gram negativas
Escherichia coli cepa clnica
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Inculo: 1 x 104 UFC/mL
Muestra: 100 uL (25 mg/mL)
Controles:
Oxacilina ( 1 g/disco)
Positivos Cloranfenicol ( 30 g/disco)
Norfloxacino (10 g/disco)
Negativo Etanol 95
Incubacin: 24 h a 37 C
Interpretacin: positiva halo de inh.
> 18 mm

Medio de cultivo:
Agar Mueller Hinton

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos

METODOS BIOAUTOGRFICOS
Este mtodo consiste en incluir los cromatogramas obtenidos por
cromatografa en capa fina en un medio de cultivo.

Para ello se utilizan placas cromatogrficas de silica gel 60 F254 de


Merck o de celulosa las cuales se colocan en las placas petri
correspondientes.
Previamente se procede a eliminar el disolvente para evitar falsas
bandas de inhibicin.

La bioautografa ha sido considerada como el ensayo ms eficiente


para la deteccin de compuestos antimicrobianos, porque esta
permite la localizacin de la actividad en un complejo matriz y por lo
tanto permite un directo aislamiento de los constituyentes activos.
Slo son aplicables a m.o. que crecen fcilmente en placas de C.C.F.

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos

METODOS BIOAUTOGRFICOS
El ensayo de bioautografa puede dividirse en 3 tipos:
a. BIOAUTOGRAFA DIRECTA: Donde los
microorganismos crecen directamente sobre la
capa fina cromatogrfica.
b. BIOAUTOGRAFA DE CONTACTO: Donde los
componentes antimicrobiales son transferidos de
la fina capa cromatogrfica y son inoculados en
una placa de agar a travs de contacto directo.

c. BIOAUTOGRAFA CUBIERTA DE AGAR O


INMERSIN DE BIOAUTOGRAFA: Es donde el
medio de agar sembrado es aplicado encima de la
fina capa cromatogrfica.

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos

METODOS BIOAUTOGRFICOS
Cromatografa de Capa Fina (CCF)
Los extractos etanlico y de acetato de etilo se analizaron para CCF.
El volumen de inyeccin de ambos extractos se fij en 3l (20 mg / ml)
Se us placas cromatogrficas de silica gel 60 F254 (Merck).
Para detectar los flavonoides tres diferentes
sistemas de solventes se utilizaron:
acetato de etilo: cido frmico: metil etil
acetona: agua (5:1:3:1)
acetato de etilo: cido frmico: agua: metanol
(10:2:2:1)
etanol: cloroformo (1:3).

Las manchas se visualizaron con luz UV.

Para la deteccin de sapogeninas,


cloroformo: metanol: agua (70:30:4)
butanol: cido actico: agua (4:1:1)
cloroformo: metanol: agua (65:35:10)

El revelador fue una mezcla de 5%


de azufre en etanol, 1% de la
vainillina en etanol y calor.

3l de rutina, quercetina, cido oleanlico y -amirina fueron


utilizados como estndares.
Las placas de CCF se secaron durante la noche en una sala estril
para completar la eliminacin de disolvente.
ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF EXTRACTS OF ACACIA AROMA AGAINST METHICILLIN-RESISTANT AND
METHICILLIN-SENSITIVE STAPHYLOCOCCUS Brazilian Journal of Microbiology (2010) 41: 581-587

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos

METODOS BIOAUTOGRFICOS
Bioautografa
Las placas desarrolladas de CCF se cubrieron con una capa de 1-2
mm del medio suave (agar BHI 0,6%) conteniendo 0,1% (w / v) de
cloruro de 2,3,5 trifeniltetrazolio (rojo tetrazolio) y una suspensin
de S. aureus a una concentracin final de 107 UFC / ml.
Las placas se colocan en una bandeja estril sellada para evitar que
la delgada capa de agar se seque, y se incuba a 37 C durante 24 h.

Cuando el crecimiento bacteriano ha sido inhibido, una zona sin


color se puede ver en el fondo de color rosa oscuro y rojo.
Las placas fueron por duplicado.

ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF EXTRACTS OF ACACIA AROMA AGAINST METHICILLIN-RESISTANT AND


METHICILLIN-SENSITIVE STAPHYLOCOCCUS Brazilian Journal of Microbiology (2010) 41: 581-587

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos

METODOS BIOAUTOGRFICOS

CFC del extracto de acetato de etilo de Acacia aroma


(A) Apariencia Visual; (B) bioautografa de Staphylococcus aureus (ATCC 43300)
Las flechas indican las regiones de inhibicin de crecimiento visualizados con tetrazolio rojo.

(1) extracto de acetato de etilo crudo, (2) rutina (estndar flavonoides)


ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF EXTRACTS OF ACACIA AROMA AGAINST METHICILLIN-RESISTANT AND
METHICILLIN-SENSITIVE STAPHYLOCOCCUS Brazilian Journal of Microbiology (2010) 41: 581-587

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos

MTODOS DE DILUCIN
Se dividen en 2
- Dilucin en caldo
- Dilucin en agar
DILUCIN EN CALDO es una tcnica en la que los contenedores estn
llenos con volmenes iguales de caldo inoculado e idnticas volmenes de
una solucin de antibiticos, pero con un aumento de las concentraciones
forma incremental (por lo general geomtrica) del antibitico, y un inculo
definido.
El
objetivo de este mtodo es la determinacin de la ms baja
concentracin que inhibe el crecimiento bacteriano Concentracin Mnima
Inhibitoria (CMI)
El mtodo de dilucin en caldo puede ser realizado por macrodilucin o
microdilucin
MACRODILUCIN: Esto denota la ejecucin del mtodo en tubos que
contengan un mnimo de 2 ml

MICRODILUCIN: Esto denota la ejecucin del mtodo en placas de


microtitulacin
con
una
capacidad

500
ul
por
pozo

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos

MTODOS DE DILUCIN
PROCEDIMIENTO MACRODILUCIN

Etiquetar los tubos de prueba estriles de 13 100 mm del 1 a 11:


a) Pipetear 0,5 ml de caldo de Mueller-Hinton en tubos del 2 al 11.
b) Pipetear 0,5 ml de una sol. antibitica (prod. natural) en los tubos 1 y 2.
c) Transferir 0,5 mL del tubo 2 al tubo 3 y continuar a travs del tubo 9.
Asegrese de cambiar las pipetas entre los tubos para evitar el arrastre de
los antibiticos.
d) Descartar 0,5 mL del tubo 9. El tubo dcimo, que sirve como control, no
recibe ningn antibitico.
e) Seleccione 4-5 colonias aisladas de una cultivo fresco y se diluye en el
caldo a un turbidez comparable a la de un patrn de turbidez 0,5 de
McFarland (aprox. 1,0 108 UFC / mL). Esta suspensin se diluye 1:100
(106 UFC / mL) con agua estril, solucin salina al 0,85%, o caldo. Dentro
de los 15 minutos de la preparacin de este inculo agregar 0,5 ml de
suspensin de caldo de las bacterias a cada tubo, excepto al undcimo
tubo, que es el tubo de control caldo. Se alcanza La concentracin del
inculo final de 105 UFC / ml.

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos

MTODOS DE DILUCIN
PROCEDIMIENTO MACRODILUCIN

Tenga en cuenta que la concentracin final del antibitico es ahora la


mitad de la concentracin original en cada tubo.
Si hay un retraso inevitable en la inoculacin, el inculo se puede
almacenar a 4 C durante un mximo de 2 h.

Extender un 10 l asa de suspensin del tubo de control del


crecimiento sobre una placa de agar sangre de carnero (u otro medio
adecuado) e incubar durante la noche para comprobar la pureza del
aislado ensayado y corregir la densidad de inculo.
La presencia de aproximadamente 50 colonias indicara una
densidad de inculo de 5 105 UFC / mL.

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos

MTODOS DE DILUCIN
PROCEDIMIENTO MACRODILUCIN
0,5 ml sol.
Producto
natural

Descartar 0,5 ml
Una vez terminada
La dilucin

0,5 ml del tubo 2

Tubo
Control
Crec.

Tubo
Control
Esterilidad

El proced. Se
Repite hasta
el tubo 9

Homogenizar

0,5 ml MH caldo
Tubos 2 al 11

INCUBAR
Toda la noche
A 35-37 C
0,5 ml del inculo
(1,0 x 106 UFC/ml)
LECTURA: La ms baja concentracin de agente antibitico que inhiba el crecimiento del
m.o. ensayado, detectado por la prdidad de la visualidad de la turbidez, pareado con el
Control negativo, es conocido como la CMI.

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos

MTODOS DE DILUCIN
PROCEDIMIENTO MACRODILUCIN

Determinacin de la Concentracin Mnima Bactericida (CMB)


La Concentracin Mnima Bactericida (CMB) es definida como la ms
baja concentracin de antibitico que mata a la mayora (99,9 %) de un
inculo bacteriano
METODO
Siguiendo la prueba de macrodilucin para determinar la CMI, de cada
tubo que no muestra crecimiento, remover 50 ul de la suspensin y
sembrar en una placa de agar sangre de carnero u otro medio apropiado.
Incubara las placas toda la noche a 37C
El nmero de colonias crecidas de cada uno de los tubos de prueba es
contado y el nmero de colonias correspondiente a una reduccin de 1000
veces ( comparado al conteo del inculo inicial) es registrado como la
CMB

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos

MTODOS DE DILUCIN
Microdilucin

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos


MUESTRAS

MTODOS DE DILUCIN
CONTROL
NEG.
DROGAS
DE
REFERENCIA

CONTROL
POSITIVO

Esquinas no son usadas


Control negativo
Control positivo
Drogas de referencia

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos

MTODOS DE DILUCIN: Dilucin en agar


Medio: agar Meller Hinton
M.O. exigentes usarlo suplementado con
sangre desfibrinada al 5%
Inculo: 104 UFC/ml
Incubacin: 35-37 C x 18 h
Lectura de resultados: La CMI es la ms baja
concentracin del agente que inhibe el
crecimiento visible

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos

MTODOS DE DILUCIN: Dilucin en agar

Determination of minimum inhibitory concentrations (MICs) of antibacterial agents by agar dilution Clinical
Microbiology and Infection, 2000; 6 (9): 509-515

ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA: Mtodos cualitativos y Cuantitativos

MTODOS DE DILUCIN
Dilucin en agar: deteccin del CMI es visual
Dilucin en caldo
turbidez
VISUAL
ESPECTROFOTOMTRICO

indicadores redox: MTT, rezasurina

Se puede evaluar si son ... tticos o ...cidas


CMI

Es apropiado para evaluar extractos o


compuestos polares y no polares

CMB

GRACIAS POR SU ATENCIN

julioruizquiroz@gmail.com

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