HIBRIDACIN IN SITU

(o FISH)

DEFINICIN
Nueva tecnologa que utiliza secuencias
de ADN marcadas (sondas) para detectar
o confirmar anomalas gnicas o
cromosmicas que generalmente estn
ms all del poder de resolucin de la
citogentica de rutina.

HIBRIDACIN IN SITU
La Hibridacin es el proceso de unin
de dos hebras complementarias de
cidos nucleicos de origen distinto:
- El ADN diana (monocatenario)
- Un fragmento de nucletidos
denominado sonda (monocatenario)
La tcnica se basa en la hibridacin
de una sonda de ADN marcada con
un compuesto fluorescente, sobre su
secuencia complementaria en el
genoma en metafase o en interfase.

SONDAS EN FISH
Las sondas pueden ser fragmentos de ADN o
de ARN cuya secuencia es complementaria al
ADN diana (blanco).
Las sondas son modificadas qumicamente, ya
sea con sustancias radioactivas (fsforo, tritio)
o flourocromos (rodamina, tintes ciano).

SONDAS EN FISH
Estos fragmentos deben
cubrir una regin de por
lo menos 100Kb para
poder ser detectado al
microscopio.

TIPOS DE SONDAS
Segn el marcador utilizado, las sondas pueden ser:
1. Radioactivas
2. No Radioactivas
Directas: La sonda est marcada con un fluorocromo que
se unen covalentemente al ADN. Los fluorocromos son
molculas que, al ser excitadas por una onda de luz
determinada, emiten los electrones de su ltima rbita, y
se expresa como una seal luminosa
de un color
determinado.
Indirectas: La sonda est marcada con una molcula
detectable mediante una reaccin inmunoqumica.
(mecanismo homlogo al ELISA).

TIPOS DE SONDAS segn su deteccin:

SONDAS QUE DETECTAN CENTRMEROS ESPECFICOS DE
CADA CROMOSOMA
SONDAS QUE RECONOCEN UN CROMOSOMA COMPLETO O
PINTADO CROMOSMICO
SONDAS DE SECUENCIA NICA O DE LOCUS ESPECFICO o
UNILOCUS o GENICAS.

TIPOS DE SONDAS
Esta clasificacin se basa en el lugar cromosmico
que se utiliza.
SONDAS
QUE
DETECTAN
CENTRMEROS
ESPECFICOS DE CADA CROMOSOMA:
Estas secuencias se llaman de ADN satlite, que son
secuencias de ADN que se encuentran en el cromosoma
repetidos en tndem y miden cerca de 171 pb o de
monmeros de 5pb.

TIPOS DE SONDAS
SONDAS QUE RECONOCEN UN CROMOSOMA
COMPLETO O PINTADO CROMOSMICO.
Son una mezcla de sondas que reconoce muchos
fragmentos de ADN (alelos, genes, seudo-genes) a lo
largo de un cromosoma determinado, generalmente
son obtenidos de bibliotecas genmicas.
La tcnica para reproducir el cromosoma se conoce
como: Multiplex FISH.

TIPOS DE SONDAS
SONDAS DE SECUENCIA NICA O DE LOCUS
ESPECFICO o UNILOCUS o GENICAS.
Detectan secuencias que solo se encuentran
una vez o dos veces en el genoma.
Las sondas de este tipo se clonan en
cromosomas artificiales de levadura (YACs) y
pueden medir cientos de pb.

USOS DE LAS SONDAS

Detectar anormalidades
cromosmicas directamente
en una muestra clnica.
LAS SONDAS PUEDEN
SER UTILIZADAS
PARA

Confirmar la identificacin de
un patgeno en un cultivo,
que por otros mtodos
tardara mucho ms.

Para determinar la extensin
de la infeccin mediante el
estudio de muestras de
tejidos de varios rganos.

OBJETIVO DE FISH
Detectar secuencias especficas de cidos
nucleicos
en
cromosomas metafasicos
(divisin celular), o en clulas en interfase, y
en secciones de tejidos morfolgicamente
preservados.
POR LO TANTO, CON BASE EN LA TECNICA
SE DIVIDE EN:
FISH DE METAFASE Y FISH DE INTERFASE

Para ver animacin:

http://www.sciencemuseum.org.uk/exhibitions/genes/158.asp

METODOLOGA O ETAPAS
1 fase
PREPARACIN DE LA SONDA:
Una sonda es un segmento de ADN
marcado con fluorescencia que es
complementario a la regin cromosmica de
inters.

TCNICA FISH
2 fase
DESNATURALIZACIN:
Para realizar la hibridacin entre las dos molculas de ADN, es
necesario desnaturalizar tanto las sonda como el ADN blanco;
que se consigue incrementando la temperatura por abajo del
punto de fusin.

TCNICA FISCH
3ra fase
HIBRIDACIN:
Los cromosomas desnaturalizados, se incuban a 37C
para que las molculas de ADN puedan unirse de manera
complementaria.

Cunto tiempo dura una

hibridizacin?
Para asegurarnos de obtener un
acoplamiento ptimo entre la sonda y
el ADN diana se precisa alrededor de
1-2 horas para sondas biotiniladas o
conjugadas con fluorocromos y hasta
12 horas paras sondas conjugadas
con digoxigenina.

TCNICA FISH
4 fase
Visualizacin:
Tras la hibridacin, se lava y se procede a detectar la
sonda, por ej: por medio de avidina conjugada a
fluorescena, en caso de sonda marcada con biotina, o
se observa directamente cuando la sonda est
marcada con fluorocromo. El anlisis se practica en
microscopio
de
fluorescencia.
Las
seales
fluorescentes indican la presencia de ADN
cromosmico complementario.

EJEMPLOS DE

ondas distintas
En este caso particular, la sonda es una mezcla bicolor de dos ssondas
para el cromosoma 22. La se
seal verde es un control interno situado en 22q13.
Permite identificar r
rpidamente los dos cromosomas 22.
La se
seal roja est
est situada en la regi
regin DiGeorge,
DiGeorge, en 22q11.2. Puesto que
ambos cromosomas 22 tienen la se
seal roja, en esta c
clula no hay
microdeleccion en la regi
regin DiGeorge y este paciente no tendr
tendra el s
sndrome
DiGeorge.
DiGeorge.

Esta metafase se ha hibridado con una sonda

"de pintado" para el cromosoma 4, que hace que el
cromosoma completo emita fluorescencia. Uno de los
cromosomas 4 de este paciente era anormal, pero era
difcil determinar con la citogentica de rutina si tena
una pequea deleccin terminal en 4q o si era el
resultado de una reordenacin ms compleja. Puesto
que ambos cromosomas 4 son fluorescentes en toda su
longitud y no hay material fluorescente en ningn otro
cromosoma, no se detecta anomala.

Esta metafase del mismo paciente anterior se ha hibridado con

una sonda para la parte terminal del cromosoma 4q. Puesto
que slo hay una seal verde, se confirma que en uno de los
cromosomas 4 falta material del extremo terminal del brazo q.
Esto sugiere que la anomala es una deleccin terminal
pequea. Este caso es un buen ejemplo de cmo la citogentica
de rutina y la FISH pueden usarse conjuntamente para
diagnosticar con exactitud anomalas cromosmicas sutiles.

Verde = cro. 13
Rojo = cro. 21

Azul claro = cro. 18

Verde = cro. X
Rojo = cro. Y