AREA DE SUSTENTABILIDAD PARA EL DESARROLLO

PROGRAMA ACADEMICO DE QUIMICA

ESPECIALIDAD TECNOLOGIA AMBIENTAL

MATERIA
MICROBIOLOGA AMBIENTAL
PROFESORA
DR. ROSY RICO MATA
ACTIVIDAD
PRESENTAN
FLORES OJEDA EDUARDO EMMANUEL
GONZALEZ MARTINEZ BLANCA FABIOLA
ORNELAS RODRGUEZ NATALY
PEREZ SERNA AIDE SARAHI
TORRES BARCO ALMA VIRIDIANA

GENERACIN: 2014-2016
LEN, GUANAJUATO. 9 DE JUNIO DE 2015

Reporte de diagnstico microbiolgico en sitio alterado Presa Blanca: Puente 1 de

acuerdo a la NMX-AA-042/1-SCFI-2008 y NMX-AA-042-SCFI-1987.

ANTECEDENTES
La Presa Blanca se ubica en el estado mexicano de Guanajuato en el
municipio de Len, localizado en una altura de 1784 metros sobre el nivel del mar.
Tiene una latitud (decimal) de 21.091667 y la longitud en el sistema decimal es 101.699444. En el sistema DMS la latitud es 210530 y la longitud es -1014158.
(Pacheco, Maldonado & Pea, 2005).
En Len se cuenta con una presa de aguas negras y residuales (Presa Blanca)
donde desembocan todo tipo de desechos industriales y domsticos, el agua de
dicha presa se conduce a travs de un canal a cielo abierto, hacia las
Comunidades de Santa Rosa, Plan de Ayala y San Pedro del Monte y su destino
final es para el riego de alfalfa y lechuga, estas aguas estn fuertemente
contaminadas qumica y bacteriolgicamente, al no sufrir ningn tratamiento de
remediacin (Secretaria de Seguridad Publica, 2010).

RELATORIA
PROCEDIMIENTOS
MUESTREO MICROBIOLOGICO EN AGUA Y SUELO
MATERIAL Y REACTIVOS:

5 cajas petri con agar rojo bilis

violeta
10 hisopos estriles
1 esptula estril
3 jeringa
Hielera
Hielos
Bolsa ziploc
Papel absorbente
Marcador permanente
Cinta

Cmara digital
Frascos de vidrio
2 frascos de vidrio boca ancha
500mL para muestra de suelo
2 frascos de vidrio 500 mL
muestra de agua
Barrena
Pala
Guantes
Bata
Botas de seguridad

PROCEDIMIENTO PARA AGUA:

1. la muestra se tomar lo ms lejos posible de la orilla, procurando no
remover el fondo y evitando los remansos o zonas estancadas
2. sujetar el frasco por el fondo en posicin invertida, sumergindolo
completamente y dndole la vuelta en sentido contrario a la corriente del ro
o desplazndolo horizontalmente en direccin de la boca del frasco.
3. Evitar que slidos suspendidos se incorporen a la muestra
4. En todos los casos la muestra no se deber llenar completamente el frasco,
siendo necesario dejar un espacio aproximado de 5 cm, para facilitar su
homogenizacin
PRUEBA INSITU:
1. Tomar una de las cajas petri con el medio estril (agar rojo bilis violeta) y
tomar una alcuota de la muestra de agua usando una jeringa estril, retirar
la jeringa de la misma y usar
2. Vaciar el contenido de la jeringa a la caja petri sujetndola por los bordes y
evitando la contaminacin de la misma por agentes externos
3. Cerrar inmediatamente y preservar a 3C con la ayuda de la hielera.
PROCEDIMIENTO PARA SUELO:

Emplear los envases de vidrio estriles y de boca ancha para recolectar

una muestra de suelo
Tomar 2 muestras a diferentes profundidades como se muestra en imagen
1.

La primera ser superficial apenas pasando los 3 cm, donde ya no haya

presencia de hierbas o zacate.
La segunda ser a los 30 cm de profundidad, para ambos se tomara una
cantidad de 300 g.
Preservar a 4C y cerrar perfectamente el frasco de vidrio.

PRUEBA INSITU:

Tomar un hisopo estril para realizar el frotis

en el suelo e inmediatamente sembrar en la
caja petri con el medio de cultivo rojo bilis
violeta.
Sembrar en la caja petri empleando el
mtodo del sic zac, empezando de arriba
hacia abajo en forma de estras cubriendo
toda la zona
Girar hacia el sentido de las manecillas del reloj 90 y repetir la misma
accin, hasta completar 3 giros de 90como se muestra en la imagen 2
Preservar la muestra a 4C y resguardar en la hielera.
Imagen 2.
Tecnica de sembrado por estrias

Primera muestra de suelo. 3

cm de profundidad, tomar
con hisopo y sembrar
inmediatamente en caja petri.

30 cm
Segunda muestra de suelo. 30
cm de profundidad, tomar
con hisopo y sembrar
inmediatamente en caja petri.

Imagen 1. Distribucin de los puntos de muestreo del suelo

en funcin de la profundidad deseada.

PRUEBA PRESUNTIVA PARA COLIFORMES TOTALES POR EL MTODO DE

NMP
MATERIAL EQUIPOS Y REACTIVOS:

18 Tubos de cultivo
2 Pipeta 10 mL
2 Agitador
1 Esptula
2 Matraz Erlenmeyer
1 Vidrio de reloj
1 Balanza analtica
3 Soportes universal
1 Olla de presin
Guantes de asbesto
1 Gradilla
2 mecheros Fisher
1 Incubadora
Caldo lactosado Bd bioxon

Composicin del medio caldo lactosado:

Caldo lactosado
Extracto de carne
4,5 g
Peptona de gelatina
7,5 g
Lactosa
7,5 g
Agua destilada
1000,0 ml
Preparacin del medio caldo lactosado utilizando el polvo deshidratado de Bd
bioxon
Doble concentracin (si pusimos una abreviacin):
Para la preparacin del caldo lactosado a doble concentracin se disolvieron 1.82
g de caldo lactosado en 70 mL de agua destilada, siguiendo las especificaciones
del fabricante.
Simple concentracin:
Para la preparacin del caldo lactosado a doble concentracin se disolvieron 1.69
g de caldo lactosado en 130 mL de agua destilada, siguiendo las especificaciones
del fabricante.

Procedimiento para llevar a cabo la prueba:

1. Se realiz los clculos correspondientes para la preparacion del caldo
lactosado Bd bioxon
2. Se pesa el cado lactosado Bd bioxon para la concentracin doble y simple
3. Se vierte a un matraz erlenmeyer y se le agregan los militros de agua destilada
correspondientes.
4. Se agita hasta que el caldo sea homogneo.
5. Se le pone un capucho de algodn y aluminio a los tubos de cultivo y a los
matraces que contienen el caldo lactosado.
6. Se estirilizan los matraces que contienen el caldo lactosado y los tubos de
cultivo.
7. Transferir volmenes de 10 ml de muestra a cada uno de 5 tubos con 20 ml de
caldo lactosado de mayor concentracin y 1,0 ml y 0,1 ml de muestra a cada
uno de los tubos de las series de 5 respectivamente con 10 ml de caldo
lactosado de concentracin sencilla o caldo laurilsulfato triptosa con prpura de
bromocresol.
8. Incubacin. Incubar los tubos a 35 C. Examinar a las 24 2 h y observar si
hay formacin de gas o la formacin de gas no se observa en este tiempo,
incubar por 48 2 h.
Fundamento
En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de
sodio el cual permite la recuperacin de los microorganismos daados que se
encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa
como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de
cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el
desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares
como el verde brillante.

PRUEBA CONFIRMATIVA ORGANISMOS COLIFORMES TOTALES

MATERIAL EQUIPOS Y REACTIVOS:

Tubos de cultivo
Campanas Durham
Incubadora

Caldo lactosa
brillante

bilis

verde

PREPARACIN
Caldo lactosa bilis verde brillante(Caldo para la produccin de gas).
Peptona
10 g
Lactosa
10 g
Bilis Ox deshidratada
20 g
Verde brillante (solucin acuosa 1 13 mL
% masa)
Agua destilada
1000 mL
Disuelva la peptona en 500 mL de agua destilada Agregue los 20 g de bilis ox
deshidratada en 200 mL de agua destilada. Esta solucin debe tener un pH entre
7,0 y 7,5. Complete a aproximadamente 975 mL con agua destilada. Agregue la
lactosa y ajuste el pH a 7,4. Agregue la solucin verde-brillante y complete a 1000
mL con agua destilada. Distribuya volmenes de 5 mL en tubos de prueba
conteniendo un tubo de Durham invertido y esterilice a 115 C por 10 min.
PROCEDIMIENTO:

Para confirmar la presencia de organismos coliformes:

1. incube un tubo de lactosa bilis verde brillante ya sea a 35 C o a 37 C
2. examine la produccin de gas en un periodo de 48 horas.
EXPRESIN DE RESULTADOS
Con el nmero de tubos del medio de aislamiento
y las pruebas confirmatorias que hayan dado
reacciones positivas, calcule el nmero ms
probable en 100 ml de muestra de organismos
coliformes.

Fundamento
La determinacin de microorganismos coliformes totales por el mtodo del
Nmero ms Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo
microbiano de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas al incubarlos a
35C 1C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales
biliares. Esta determinacin consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase
confirmativa.

Prueba confirmativa E. COLI PRESUNTIVA

MATERIALES

Pipeta
Perilla
Tubos
Papel de estraza
Plumn indeleble
Guantes de ltex
Guantes de asbesto
Campana para manipulacin de equipos estriles
Esptula
Laminillas de peso
Agitador
Algodn
Gasas
Matraz Erlenmeyer

EQUIPOS

Incubadora
Autoclave
Balanza analtica

REACTIVOS

Triptona
Kovacs
Alcohol

PREPARACIN DE REACTIVOS Y SOLUCIONES

Agua de triptona
Ciertas peptonas que dan resultados satisfactorios en la prueba a 35 C o 37 C
no son satisfactorias para la prueba de indol a 44 C. La Triptona ha sido
encontrada satisfactoria y es recomendada.
Triptona

20 g

Cloruro de sodio

5g

Agua destilada

1000 mL

Disuelva los ingredientes y distribuya en volmenes convenientes. Esterilice en

autoclave a 121 C 1 C por 15 min. El pH final debe ser 7,0 0,1.

Reactivo de Kovacs
Para-dimetil-amino-Benzaldehdo............................. 1 g
Alcohol amlico butlico......................................... 80 mL
Acido clorhdrico qumicamente puro...................... 20 mL
PREPARACIN:
1. Disolver el para-dimetil-amino-benzaldehdo en alcohol butlico amlico.
2. Aadir el cido clorhdrico.
3. Conservar en un frasco mbar con tapn de vidrio, en sitio oscuro.
4. tambin se sugiere que esta solucin se refrigere.
PROCEDIMIENTO:
a) Incuba un tubo de agua de triptona para formacin
de indol, a 44 C por 24 horas.
b) Adicionar de 0,2 mL a 0,3 mL de reactivo de Kovacs
al tubo de agua de triptona
c) Se confirma cuando al agitar el tubo de manera
suave se desarrolla un color rojo esto denota la Imagen A. E. Coli en Agua de Triptona,
presencia de indol. (Imagen A).
prueba positiva (derecha)

Fundamento
La concentracin de Escherichia coli (o bien de coliformes termotolerantes) se
mide, por lo general, en muestras de 100 ml de agua. Para ello existen diversos
procedimientos relativamente sencillos basados en la produccin de cido y gas a
partir de la lactosa o en la produccin de la enzima -glucuronidasa. Los
procedimientos incluyen la filtracin del agua con una membrana que despus se
incuba en medios selectivos a 4445 C; transcurridas 24 h, se realiza un recuento
de colonias. Otros posibles mtodos son los procedimientos de nmero ms
probable, en los que se utilizan tubos de ensayo o placas de microvaloracin y
pruebas de P/A, algunas con volmenes de agua mayores que 100 ml. Existen
equipos de anlisis para uso sobre el terreno.

PROCEDIMIENTO PARA LA PRUEBA DE INDOL

MATERIAL

Agitador
Pipeta volumtrica de 5 mL
Parrilla
Tubos
Tubos de fermentacin ( Durhan)
Autoclave

REACTIVOS
Triptona
Cloruro de sodio (NaCl) 5.0 g
Agua para aforar a 1000 ml
Fosfato dibsico de potasio (K2HPO4) 2.75 g
Fosfato monobsico de potasio (KH2PO4) 2.75 g
Lauril sulfato de sodio (NaCl12 H25 SO4) 0.1 g
L (-) triptfano 0.2 g
Manitol 5.0 g
PROCEDIMIENTO:
1. Disolver los componentes de agua y ajustar a pH 7.5. distribuir en
volmenes de 5 mL y colocar en autoclave a 1150C durante 10 minutos.
2. Aadir la triptosa, el cloruro de sodio, el manitol, los fosfatos y el tiptona al
agua y calentar para disolver.
3. Anadir el sulfato de sodio y mezclar suavemente para evitar la formacin de
espuma.
4. Ajustar a pH de 6.8 + 0.2.
5. Hacer distribucin en volmenes de 5 mL en tubos conteniendo un tubo de
fermentacin invertido(Durham) colocar en autoclave a 115 0C durante 10
minutos
RECOLECCIN, PRESERVACIN Y ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS
El anlisis bacteriolgico debe efectuarse inmediatamente despus de su
recoleccin, se recomienda que de no efectuarse as el anlisis se incide dentro
de las 6 horas prximas a la recoleccin de la muestra y en ningn caso, este
lapso debe exceder de 24 horas, se debe conservar la muestra a 4 0C.

Fundamento
Evala la presencia en las bacterias de la enzima triptofanasa, mediante la
cual, ocurre la hidrlisis y desaminacin oxidativa del triptfano, con formacin
de indol. El indol se evidencia al aadir el revelador: reactivo de Kovacs (pdimetilamino benzaldehdo) que al condensarse con el indol, forma un anillo de
color rojo o fucsia. (Rodrguez,2012)

PRUEBA DE OXIDASA
Material
Cajas de Petri
Papel filtro
Asa bacteriolgica
Agitador de vidrio
Reactivos

Reactivo de oxidasa

Preparacin de reactivos
Reactivo de oxidasa
Clorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina................... 0.1 g
Agua destilada................................................... cbp 1000 mL
PREPARACIN:
1. Disolver el reactivo en el agua destilada.
NOTA:
Este reactivo no es estable y por consiguiente debe prepararse para utilizarlo en
pequeas cantidades cada vez que se necesite.
Las bacterias que se encuentran en el agua pueden conforman los organismos
coliformes, estos son capaces de producir gas a partir de lactosa solo a
temperaturas abajo de 37 C. Dan resultados negativos en las pruebas
confirmativas de rutina para organismos coliformes, y su presencia en agua no es
considerada como significativa. Las especies de Aeromonas, las cuales es natural
que estn presentes en agua, interfieren con la determinacin slo a temperatura
de 37 C o menor, se requiere la prueba confirmativa de la oxidasa solo cuando se
estn determinando coliformes totales.

PROCEDIMIENTO:
La prueba de la oxidasa se lleva a cabo con subcultivos puros de organismos
fermentadores de lactosa, desarrollados en medio de agar nutritivo, de la siguiente
manera:
1. Coloque dos o tres gotas de reactivo de oxidasa en un papel filtro colocado
sobre una caja Petri.
2. Con una varilla de vidrio o asa metlica de platino de punta redonda, unte
una pequea porcin del crecimiento sobre el papel filtro preparado.
3. Dara como resultado un color azul-morado profundo en 10 segundos como
una reaccin positiva.
4. Cada ocasin en que se utilice el reactivo de oxidasa, deben realizarse
pruebas control con cultivos de organismos que se sabe dan reaccin
positiva (Pseudomona aeruginosa) y una reaccin negativa (E. coli).

Fundamento
La catalasa es una enzima que descompone el peroxido de Hidrogeno (H2O2)
en agua y oxgeno. El peroxido de Hidrogeno se forma como uno de los
productos finales del metabolismo aerobio de los hidratos de carbono. Si se
permite que se acumule resulta letal para la clula bacteriana.
La prueba de la catalasa se usa con mucha frecuencia para diferenciar
miembros de la familia Micrococaceae de miembros de la familia
Streptococcaceae.