TEJIDO LAS CLULAS MADRE ESPECFICAS de

Anlisis Comparativo de Clulas Madre Mesenquimales de Mdula sea,

Sangre del Cordn Umbilical, o tejido adiposo
SUSANNE a KERN, HERMANN un EICHLER, JOHANNES b STOEVE, HARALD KL
de UTER - CAUSE , KAREN un BIEBACK
aInstitute de medicina de transfusin y de la inmunologa, Sangre de la Cruz
Roja Alemana Servicio de Baden-Wu baden-wrttemberg de Hessen,
Mannheim, Alemania; bDepartment de ciruga ortopdica del Hospital
Universitario de Mannheim, Universidad de Heidelberg, Facultad de Medicina
Clnica, Mannheim, Alemania
Palabras Clave. Las clulas madre mesenquimales La mdula sea
sangre de cordn umbilical tejido adiposo anlisis comparativo
diferenciacin multilinaje
RESUMEN
las clulas madre mesenquimales (MSCs) representan una herramienta
prometedora de los CSM tipo derivados de esas fuentes son evidentes.
de nuevo conceptos clnicos de apoyo terapia celular. Se observaron
diferencias en cuanto a la tasa de xito de la mdula sea (BM) fue la
primera fuente inform a contener aislando CSM, que fue de un 100% de BM
y EN, pero slo Microsoft Cluster Server (MSCS). Sin embargo, para el uso
clnico, BM puede ser perjudicial 63% para UCB. La colonia fue el ms bajo
en frecuencia UCB, debido a lo altamente invasiva y el procedimiento de
donacin de- mientras que la ms. Sin embargo, UCB-MSCs podra cline en
MSC nmero y potencial de diferenciacin se cultivaron con ms tiempo y
mostraron la mayor proliferacin aumento de la edad. Ms recientemente,
sangre de cordn umbilical (UCB), la capacidad, mientras que BM-MSCs
poseen el menor cultura nivel de un mtodo menos invasivo, se present
como un perodo y la menor proliferacin capacidad. La mayora strikfuente alternativa para Microsoft Cluster Server (MSCS). Otra fuente
potencial es enorme, UCB MSCs de diferenciacin adipognica no mostraron
ca- tejido adiposo). Hemos comparado MSCs derivadas de estas indemniza,
en contraste con BM- y en Microsoft Cluster Server (MSCS). Ambos UCB y
en las fuentes sobre morfologa, la tasa de xito de aislamiento son
alternativas atractivas de BM en aislar MSC: al CSM, colonia frecuencia,
potencial de expansin, mltiples- contiene MSCs en la ms alta frecuencia
y UCB como parece ferentiation capacidad y fenotipo inmune. No hay que
ser ampliable a nmeros ms altos. LAS CLULAS MADRE 2006 ;24:
las diferencias en cuanto a la morfologa y veh inmune- 1294-1301
INTRODUCCIN aislar Msc [6, 7], y a las de otros grupos lograron iso- clulas
madre mesenquimales (MSC) que se encuentra en muchos tejidos adultos
son cubier MSCs de trmino completo UCB [8 - 12].

una atractiva fuente de clulas madre para la regeneracin de tejido

adiposo (TA) es otra fuente alternativa que pueden ser tejidos en
aplicaciones clnicas porque se caracterizan como obtenido por un mtodo
menos invasivo y en mayores cantidades de clulas indiferenciadas,
capaces de renovarse con una alta proliferativa BM. Se ha demostrado que
las clulas madre en capacidad y mesodrmicas poseen un potencial de
diferenciacin [ 1], que al igual que BM-MSCs, que se denominan
procesados lipoaspirate Aunque mdula sea (BM) ha sido la principal
fuente de (PLA) clulas [ 13]. Estas clulas pueden ser aisladas de la
aislamiento de cosmticos multipotentes MSCs, la cosecha de BM es muy
grasa en grandes cantidades y fcil de cultivar en procedimiento invasivo y
el nmero potencial de diferenciacin, el cultivo de tejidos [ 13]. La
diferenciacin multilinaje y mxima vida til de MSCs de BM disminucintrficas capacidad de PLA clulas se ha confirmado [ 13].
edad [ 2- 4]. Por lo tanto, fuentes alternativas de como BM-MSCs se
caracterizan mejor, le preguntamos si aislar MSCs MSCs son objeto de una
intensa investigacin. procedentes de otras fuentes comparten las
caractersticas de BM-MSCS
Una fuente alternativa es sangre de cordn umbilical (UCB), el objetivo de
nuestro estudio fue comparar MSCs aislado de los tres que se pueden
obtener a travs de un mtodo menos invasivo, sin perjudicar las fuentes
bajo idnticas condiciones in vitro con respecto a la de la madre o el beb
[ 5]. Sin embargo, existe controversia morfologa, frecuencia de las colonias
caractersticas de expansin, mul- si de UCB puede servir como una fuente
de diferenciacin tilineage capacidad aislante, inmunofenotipo y
multipotentes xito MSCs: a pesar de que algunos grupos no tuvo xito en la
tasa de aislamiento de las clulas.
Correspondencia: Karen Bieback, Ph.D. , Instituto de Medicina de transfusin
y de la inmunologa, Sangre de la Cruz Roja Alemana Servicio de Baden-Wu
baden-wrttemberg - Hesse, Universidad de Heidelberg, Facultad de
Medicina Clnica Mannheim, Friedrich-Ebert -Stra e 107, D-68167 Mannheim,
Alemania. Telfono: 49-621 -3706-8216; fax: 49-621 -3706-851; correo
electrnico: k.bieback@itima.blutspende.de recibido 28 de julio de 2005;
aceptado para su publicacin 21 de diciembre de 2005; publicado por
primera vez en clulas madre EXPRESS 12 de enero de 2006. AlphaMed
Press 1066-5099/ 2006/ $20.00 /0 doi: 10,1634 /stemcells.2005-0342
CLULAS MADRE 2006 ;24:1294 -1301 www.StemCells.com

Kern, Eichler, Stoeve et al.

MATERIALES Y MTODOS

Recoleccin de BM
BM el material aspirado de 18 pacientes con edades que oscilan entre 68 84 aos se obtuvieron a partir del eje femoral en reemplazo total de cadera
en el servicio de ortopedia del Hospital de la Universidad Mannheim. El
material aspirado BM adicionales fueron obtenidos de tres pacientes con
edades que oscilan entre 44 y 71 aos por puntualmente turing la cresta
ilaca. El BM se ha recibido el material aspirado de conformidad con las
normas ticas del comit tico local.
Aislamiento y cultivo de Clulas Mononucleares de BM
El aspirado se diluye 1:5 con 2 mM ethylenediaminetet- raacetic (EDTA) -de
tampn fosfato salino (PBS) (Merck & Co. , Whitehouse Station, NY,
http://www.merck.com; Nex- ell, Baxter, Unterschleissheim, Alemania,
http://www.baxter.
de). El MNC fraccin fue aislado por gradiente de densidad de centrif
ugation a 435g durante 30 minutos a temperatura ambiente con FicollHypaque -Plus (GE Healthcare BioSciences Corp. , Piscataway, NJ,
http://www.gehealthcare.com) y sembrados a una densidad de 1 6 10 2
clulas por cm en T75 o T175 frascos de cultivo celular (Nunc, Rochester,
NY, http://www.
CO2. La expansin medio se aplic a clulas madre mesenquimales o medio
de crecimiento de balas Kit(MSCGM;Cambrex,Walkersville,
MD,http://www.cambrex. %5 Nuncbrand.com; Greiner Bio-One ,
Frickenhausen, Alemania, http://www.gbo.com). El primer cambio del medio
fue cum- plido dentro de los 3 das de aislamiento. Las clulas adherentes
fibroblastoides resultante se denomina BM derivados de clulas adherentes
fibroblastoides (BM-Codes) y fueron cultivadas a 37 C en una atmsfera
humidificada con
com) o de Dulbecco Eagle modificado medio-bajo de glucosa (DMEM-lg) que
contiene un 10% crecimiento clulas madre mesenquimales suplementos
(MSCGS) (Cambrex). Los cdigos se mantuvieron en MSCGM o DMEM-lg
10% MSCGS hasta llegar a un 70% y un 90% aproximadamente. Las clulas
fueron cosechadas en subconfluence con tripsina (PromoCell, Heidelberg,
Alemania, http://www.
PromoCell.com). Las clulas en el segundo pasaje y despus fueron replated
en una densidad media de 1,3 0,7 3 10 2 /cm .
Generacin de individuales separadas, las colonias denominadas
fibroblastoides fibroblastoides de las unidades formadoras de colonias (CFUF) fue alcanzada por la siembra de la Emn inicialmente en una baja
densidad (1
3 10 4 10 1 a 2 clulas por cm ). CFU-F se seleccionaron y aislarse con
tripsina (PromoCell) o por medio de un raspado de la superficie de la placa
de cultivo con la punta de una pipeta. El cultivo se realiz como se describe
en la BM de FACs.
Coleccin de UCB

UCB unidades (n 59) fueron recogidos del feto placenta de trmino completo
varias entregas en un sistema de bolsa que contiene 17 ml de tampn
citrato fosfato dextrosa (sangre de cordn coleccin Sys- tem; eltest, Bonn,
Alemania) [14, 15] y transformarse en un plazo de 24 horas desde su
recogida. La coleccin se realiz de acuerdo con las normas ticas del
comit tico local.
Aislamiento y cultivo de MNC de UCB
el aislamiento de los CSM se realiza segn lo descrito por BM con unas
pocas excepciones. Antes de que el aislamiento de MNC, la anticoag
epidemiol- sangre del cordn umbilical se haya diluido 1:1 con 2 mM EDTASAF. El MNC fraccin fue inicialmente sembrada en una densidad de 1 6 10

2 1295 www.StemCells.com MNC/cm en suero de feto de ternera (FCS),

placas de cultivo previamente untada (FCS lotes S0113/1038E y
S0113/892E; Biochrom, Berln, Alemania, http://www.biochrom.de) (Falcon,
Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, http://www.bd.com) [ 8].
Las clulas se quintuplicaba retirado 12-18 horas despus de la plat. Las
mismas condiciones de cultivo y los medios de informacin se aplica como
se ha descrito en BM-FACs. Slo las clulas fibroblastoides adherentes- como
CFU-F y se recolectan en subconfluence con tripsina (PromoCell). Las
clulas en el segundo pasaje y despus fueron replated en una densidad
media de 3,5 4,8 3 2 10 /cm .
Coleccin de DE
AT se obtuvo de 18 donantes de edades que oscilaban entre 26 y 57 aos
que fueron sometidos procedimientos para la liposuccin. Lipoaspirates
fueron obtenidos de acuerdo con las normas ticas del comit tico local.
Aislamiento y cultivo de clulas de PLA en
la materia prima lipoaspirate (50 - 100 ml) fue procesado como se describe
anteriormente [ 13]. Para aislar el vasculares estromales (SVF),
lipoaspirates se lavaron intensamente con SAF. A partir de ese momento el
lipoaspirates fueron digeridos con un volumen igual de 0,075 % colagenasa
tipo I ( Sigma-Aldrich , St. Louis, http://www.
sigmaaldrich.com) durante 30 - 60 minutos a 37 C con un suave agitaciones. La actividad de la colagenasa fue neutralizado con DMEM-lg que
contiene 10% FCS Para obtener el de alta densidad SVF pellet, digerida la
lipoaspirate se centrifugaron a 1.200 g durante 10 minutos. El precipitado
fue resuspendido en MSCGM o DMEM-lg que contiene el 10% MSCGS y
filtrada a travs de una 100 m de nylon filtro celular (Falcon). La direccin
se filtran las clulas- fuged a 1.200 g durante 10 minutos. Las clulas fueron
resuspendidas chapado en CONTRIBUCIONES VOLUNTARIAS a una densidad
de 1 106 2 /cm en T75 o T175 frascos de cultivo. Quintuplicaba las Clulas
se quitaron 12-18 horas despus de la primera siembra de lavado
intensamente las placas. Los fibroblas- toid clulas adherentes fueron

llamados A adher fibroblastoides derivado de clulas- (FACs). En los cdigos

fueron cultivadas en las mismas condiciones que las descritas para BMFACs. EN terreno se har- investidos de subconfluence con tripsina
(PromoCell). Las clulas en el segundo pasaje y despus fueron replated en
una densidad media de 1,8 3,1 3 2 10 /cm .
La generacin de un solo separados CFU-F fue alcanzado por
2, la siembra de la SVF clulas en una baja densidad (1 10 a 1
3 10 2 clulas por cm ). CFU-F se seleccionaron y aislados de mencionar
para BM-UFC-F. Subcultivo de las Clulas se form como se describe en el
caso de la FACs.
Los fibroblastos drmicos como Principal
Principal controles normales los fibroblastos drmicos (PromoCell) sirve
como controles negativos en la diferenciacin. Las clulas fueron cultivadas
en un 10% completado media crecimiento de fibroblastos (PromoCell).
Caractersticas de Expansin
las clulas fibroblastoides de BM, UCB, y se recolectan en subconfluence
como se describi en los prrafos anteriores. Las culturas se han
abandonado tan pronto como se mostraron un fenotipo senescente
definidos en funcin de dos criterios: 1) cuando al menos el 90% de las
Clulas aprobado morfologa semejante a una alteracin de las clulas
senescentes 3- 4 semanas despus se realizarn subcultivos (Fig. 1E- 1G); y
2) al haber dejado proliferacin. El proceso de senescencia proporcin se
determin hasta paso 2 calcular la proporcin de muestras

1296
Figura 1. Morfologa de clulas adherentes despus de la siembra y en la
senectud. (A-C): fibroblastoides clulas adherentes despus de la primera
siembra de clulas adherentes el fibroblastoides (FAC) monocapa de BM en
el da 14 (A), de la UCB-fibroblastoides de las unidades formadoras de
colonias (CFU-F) en el da 16 (B), y de la monocapa de FAC en da 8 (C). (EG):
las clulas senescentes de la FAC monocapa de BM en paso 2 (E), de la UCBCFU-F en el pasaje 4 (F), y de la monocapa de FAC en paso 6 (G) se
identifican mediante un morfologa alterada. Todo representante se
muestran ejemplos con una ampliacin de 100. (D): valores promedio de la
poblacin acumulativa doblajes. Duplicaciones de poblacin se determina
en cada subcultivo; valores promedio de BM-mesenchy- mal las Clulas
madre (CSM) se muestran en negro; valores promedio de UCB-CSM son

mostrados en gris; valores promedio de MSCs se muestran por barras

abiertas.
p7, n 1. , P .05. Abreviaturas: ;2 p5 y p6, n ;5 p4, n ;6 p9, n 1. EN: p3, n ;4 p6
- 8, n ;7 p5, n ;9 p6, n 1. UCB: p4, n ;7 p4 y p5, n ;9 La muestra de partida
nmero 2 en el pasaje en el diagrama. Las muestras fueron sometidas a
senescencia, el nmero de muestras en los conductos procedimiento; el
nmero de muestras en diferentes pasajes dio lugar a los siguientes valores
promedio. BM: p3, n
, tejido adiposo; BM, en la mdula sea; P, de paso, UCB, sangre de cordn
umbilical
adoptar un fenotipo senescente y el nmero total de muestras cultivadas.
Doblajes poblacin acumulada se calcula usando la frmula x [log10 (NH)
log10 (N1) ] /log10 (2) [ 16], donde N1 es el inculo nmero de mvil y NH la
celda nmero cosecha. El rendimiento acumulado de duplicacin, la
duplicacin de la poblacin para cada paso se calcul y, a continuacin, se
aaden a la duplicacin de la poblacin los niveles de la anterior los
conductos. Como el nmero de clulas de clulas fibroblastoides de los tres
tejidos podran ser deter- minada por primera vez en el pasaje 1, duplicando
el nmero total se calcul en primer lugar para el paso 2.

La diferenciacin in Vitro de fibroblastos drmicos humanos normales

(PromoCell) sirve como controles negativos en los tres estudios
diferenciacin.
Diferenciacin osteognico
Diferenciacin de cada una de las muestras se realiz en define pas- de la
siguiente manera: BM-FACs, pasajes 0 y 5 (n 7); BM-CFU-F, en el que se
comparan MSCs de tejidos diferentes
pasajes 2- 6 (n 14); UCB-CFU-F, pasajes 1-7 (n 8); DE FACs, pasajes 0 y 5 (n
14); DE CFU-F, pasajes 2- 6 (nO 28). Diferenciacin osteognico a fin de
promover, las clulas fueron
3 sembrada en una densidad de 3.1 10 2 clulas por cm en ocho- cmara de
diapositivas (Nunc) y cultivadas en MSCGM o DMEM-lg 10% MSCGS hasta
que alcanzaron el 70 %- 80% confluencia. Tan pronto como se alcanza
subconfluence osteognico, diferenciacin de las clulas fue inducida
mediante la alimentacin de 2,5 semanas, dos veces a la semana, con
induccin medio que consta de 100 nm la dexametasona, 10 mM
-glicerofosfato, 0,2 mM ascorbato, y 10% FCS en medio basal osteognico
(Cambrex). Para el control negativo, las clulas se mantuvieron en MSCGM
o DMEM-lg 10% MSCGS. Diferenciaci osteog ica fue confirmada por el
aumento de la fosfatasa alcalina (AP) expresin de histo- manchas qumicas
siguiendo las instrucciones del fabricante (fosfatasa alcalina kit 85L-3R;
Sigma-Aldrich ).
Ms tarde se detectaron diferencias etapas por la von Kossa mancha,
demostrando la deposicin de un matriz hidroxiapatita.

de tiosulfato sdico ( Sigma-Aldrich ) durante 5 minutos. Pyrogallol %5

(Merck) y, despus, se fija con %1 nitrato de plata ( Sigma-Aldrich ). La
mancha fue desarrollado incu- arrastraba las clulas en %5 El von Kossa
mancha se realiz de acuerdo al protocolo descrito anteriormente [ 17] con
algunas modificaciones. Las clulas fueron fijadas con formol al 10%
( Sigma-Aldrich ) durante 15 minutos a temperatura ambiente y se tie para
10 a 15 minutos con
diferenciacin adipognica
Diferenciacin de cada una de las muestras se realiz en define pas- de la
siguiente manera: BM-FACs, pasajes 0 y 5 (n 9); BM-CFU-F, pasajes 2- 6 (n
14); UCB-CFU-F, pasajes 1-7 (n 11); DE FACs, pasajes 0 -5 (n 16); DE CFU-F,
pasajes 2- 6 (nO 28). Para inducir diferenciacin adipognica, las clulas se
sembraron a una densidad de 2.1 4 10 2 clulas por cm en ocho
portaobjetos con cmara (Nunc) y cultivadas en MSCGM o DMEM-lg 10
MSCGS hasta llegar al 100% confluencia o postconfluence.
A continuacin, las clulas fueron inducidos por tres ciclos de induccin y
mantenimiento [ 1] usando induccin preadipociticos medio compuesto de 1
mM la dexametasona, 0,5 mm 3-isobutil-1-metil-xan- tus, 10 g/ml insulina
humana recombinante, 100 mM indometh de acin, y el 10% FCS (Cambrex)
y con preadipociticos- municada medio compuesto nicamente de 10 g/ml
insulina humana recombinante y el 10% FCS (Cambrex). Despus de
completar los tres ciclos de induccin y de mantenimiento, el inducido
clulas fueron incubadas durante otros 7 das en medio de mantenimiento
adipognica. Las clulas control noninduced fueron alimentados slo con
preadipociticos medio de mantenimiento. Diferenciacin adipognica fue
confirmado por la formacin de vacuolas de lpidos neutros mancha de
aceite con rojo ( Sigma-Aldrich ). Para el aceite rojo O manchas, las clulas
fueron fijadas con formol al 10% ( Sigma-Aldrich ), lavado y teido con una
solucin de trabajo de 0,18 % de aceite rojo O durante 5 minutos. Los
ncleos son contrastados con Mayer la hema toxylin solucin ( SigmaAldrich ).

Diferenciacin diferenciacin condrognica de cada muestra y CFU-F fue

definido en los conductos de la siguiente manera: BM-FACs, pasajes 0 -5 (n
8); BM-CFU-F, pasajes 2- 6 (n 14); UCB-CFU-F, pasajes 1-7 (n 15); DE FACs,
pasajes 0 -5 (n 18); DE CFU-F, pasajes 2- 6 (nO 28). Diferenciacin
condrognica de clulas,
5 fueron cultivados en micromasa cultura. Por lo tanto 2,5 10 clulas

Kern, Eichler, Stoeve et al.

se centrifugaron en un 15-ml tubo de polipropileno (Greiner) a 150g para

formar un precipitado. Sin perturbar el precipitado, que las clulas se
cultivaron durante 4 semanas en 0,5 ml de medio completo diferenciacin
condrognica (Cambrex) incluyendo a 10 ng/ml TGF- -3 (Strathmann Biotec
AG, Hamburgo, Alemania, http://www.
strathman-biotec-ag.de). Las clulas fueron alimentados dos veces a la
semana. Despus del perodo de cultivo, criosecciones fueron analizados
por Safranina O mancha. Para las manchas, las secciones fueron fijados con
acetona fra de hielo ( Sigma-Aldrich ) y tie con 0,1 % acuosa Safra- nen O
durante 5 minutos y los ncleos fueron contrastados con de hematoxilina
frrica de Weigert ( Sigma-Aldrich ).
Inmunofenot anlisis
de caracterizacin, antgeno de superficie celular se realiz la prueba
fenotpica en BM-MSCs en los pasajes 0 y 7, de UCB-MSCs en los pasajes 37, y de MSCS en los pasajes 1-5. La siguiente superficie celular de eptopos
fueron marcados con anti-anticuerpos humanos:
CD14-isotiocianato de fluorescena (FITC), CD34-ficoeritrina (PE), CD73-PE,
CD90-Cy5 (Becton Dickinson), CD29-PE, CD44-FITC, CD45-Peridium-clorofila
complejo proteico (PerCP), el HLA de clase I-FITC, el HLA de clase II-FITC
(Beckman Coulter, Fullerton, CA, http://www.beckmancoulter.com), CD133PE (Miltenyi biotec, Bergisch Gladbach, Alemania,
http://www.miltenyibiotec.com), CD105-FITC, y CD106-PE (Immunokontakt;
AMS La biotecnologa, Wiesbaden, Alemania, http://www.immunok.com).
Isotipo anticuerpos ratn sirve como control (Becton Dickinson; Beckman
Coulter). 10.000 Clulas marcadas fueron adquiridos y analizados por
medio de un flujo FACScan cytom- eter CellQuest ejecuta software (Becton
Dickinson).
Anlisis estadstico
Los datos se presentan como promedios desviacin estndar. UNA de dos
caras, nonpaired prueba t se utiliz para analizar la citometra de flujo y la
duplicacin de datos acumulados. La prueba U de Mann-Whitney se utiliz
para comparar la eficacia de aislamiento CFU-F derivado de UCB, BM, y en.
UN 2 se aplic la prueba de comparar la renciarse- capacidad de las clulas
aisladas de los diferentes tejidos y la proporcin de muestras con un
fenotipo senescente. Las diferencias se consideraron significativas para p .
05. El programa SPSS (versin 12.0; SPSS Inc. , Chicago,
http://www.spss.com) fue utilizado para las pruebas estadsticas.
RESULTADOS
aislamiento de clulas adherentes de Morfologa fibroblastoides de BM, UCB,
y a partir de las
6 en una densidad de siembra inicial 1 2 clulas por 10 cm , tanto BM- y en
derivados de clulas fibroblastoides una monocapa 4 y 5 das despus de la
primera y se denomin FACs. A diferencia de BM, UCB derivado de clulas
fibroblastoides CFU-F y se puede detectar en primer lugar 2 a 4 semanas
despus de cuando se aplica la misma densidad de siembra inicial. A
diferencia de UCB, para la generacin de CFU-F de BM y a menor densidad

de siembra inicial fue necesario. El nmero de UFC-F calculado en base a 1 6

10 chapado en inicialmente fue mayor para las clulas EN (557 673),
seguido de BM (83 61); que fue la ms baja de UCB (0.002 0.004 ) (p .001).
La tasa de xito de aislar FACs y CFU-F de BM (n 21) y EN (n 18) fue del 100
%, En contraste, la tasa de xito de UCB (n 59) fue slo el 29% de todas las
unidades
www.StemCells.com
1297
Tabla 1. La senescencia y la mxima relacin potencial de expansin de
clulas madre mesenquimales (MSCs) derivados de BM, UCB y
senescencia en relacin al conducto de paso mximo 2
BM (n 21) 23,6 % (P 7 (9,5 %) UCB (n 26) 34,6 % P 10 (3,9 %) A (n 18) 5,6 %
P 8 (5,6 %) p b .02
Los datos representan la relacin entre el nmero de muestras que
envejecer temprano hasta el segundo pasaje y muestras que podran ser
cultivadas hasta el mximo paso hasta que en senescencia. La senescencia
proporciones se determina calculando el nmero de muestras adoptar una
morfologa alterada (Fig. 1E y 1G) y cesar proliferacin en el nmero total de
muestras cultivadas.
ala cultura pueden ser cultivadas como mnimo hasta el paso, ya que se
tuvo que descartar debido a contaminaciones.
bSignificant las diferencias de la senescencia se observaron relacin entre
AL y UCB.
Abreviaturas: A, y el tejido adiposo; BM, la Mdula sea, UCB, sangre de
cordn umbilical
. La tasa podra ser mayor a 63% de FCS precoat- y teniendo en cuenta
nicamente las unidades de calidad ptima [ 8].
Sin embargo, no existen diferencias en lo que respecta a la morfologa de
las clulas adherentes procedentes de los tres tejidos eran evidentes (Fig.
1A y 1C).
Caractersticas de Expansin
capacidades Anlisis de la proliferacin de los CSM derivados de las tres
fuentes pone de manifiesto que BM-MSCs poseen el menor duplicacin de la
poblacin los nmeros a travs de los conductos 4 - 6, siguie- por MSCs de
despus de pasar 3 (Fig. 1D). Sin embargo, UCB-MSCs los ms altos
nmeros de duplicar todos los conductos analizados.
Durante el cultivo in vitro, MSCs poseen una vida til limitada y finalmente
someterse a senescencia replicativa se indica por la prdida de proproliferacin y morfologa alterada. Anlisis de la senescencia tasas
potenciales y la mxima expansin de BM-MSCs (n 21, gobernadores), de
UCB-MSCs (n 26 CFU-F, UCB 16 unidades), y de MSCs (n 18 donantes)

demostraron que UCB contiene la mayor proporcin de MSCs en

senescencia a los pasajes, seguida de BM-MSCs (Fig. 1E- 1G) (Tabla 1). La
relacin ms baja en senescencia temprana muestra pasajes en Microsoft
Cluster Server (MSCS). A pesar de las muchas colonias llegando a la
senescencia en las primeras etapas, otros UCB-MSCs puede ser cultivada
ms largo, seguido por al-MSCs, mientras que BM-MSCs mostr el menor
perodo de cultivo (Cuadro 1).
Potencial de diferenciacin multilinaje
para demostrar el aislamiento de clulas madre mesenquimales y de
investigar su potencial de diferenciacin, el fibroblastoides las clulas que
se derivan de las tres fuentes se orientaron hacia la osteog ica,
adipognica y linajes condrognica en los respectivos pasajes. Fibro- blastos
sirvi como controles negativos.
Diferenciaci osteog ica Capacidad
diferenciacin osteognico fue confirmado por la deteccin de un fenotipo
osteognico que consta de un incremento en la expresin de la AP y de la
deposicin de un matriz mineralizada teidas con plata.

1298
Despus de 2,5 semanas de induccin, no hubo diferencias significativas en
la capacidad osteog ica se detectaron diferencias (p .4), ya que el 100%
(ocho de ocho) de la UCB muestras, 71,4 % (cinco de siete) de la BM
muestras y 78,8 % (11 de 14) de las muestras mostraron un fenotipo
osteognico (Fig. 2B, 2D, 2I, 2K, 2P, 2R). No se ha observado fenotipo
osteognico de 28,6 % (dos de los siete) del BM o muestras de 21,4 % (3 de
14), en la que se
comparaba MSCs de distintos tipos de tejidos
La Figura 2. Diferenciacin multilinaje calificacio- de clulas madre
mesenquimales. Las clulas en los pasajes 1- 4 derivado del fibroblas- toid
monocapas de clulas adherentes de BM (A-G) o EN (O-U) y de UCBfibroblastoides de las unidades formadoras de colonias (H-N) se alcanza
valores de multilinaje in vitro la absti- inicio capacidad. Osteognesis qued
plasmado mediante el aumento de la actividad de la fosfatasa alcalina, que
se muestra en (B), (I) y (P) (A, H, O, noninduced controles), y por la
precipitacin de una matriz mineralizada sealada por von Kossa mancha,
se muestra en (D), (K) y (R) (C, J, Q, noninduced controles). Ad- ipogenesis
fue detectado por la formacin de vacuolas lipdicas tincin positiva neutral
con aceite rojo O, como se demostr en el caso de BM- y que se encuentran
en clulas derivadas, que se muestra en (F) y (T) (E, S, nonin presenta

controles), mientras que UCB-clulas derivadas no pueden ser diferenciadas

en este lin- eage, como se muestra en (M) (L, noninduced control).
Condrognesis fue indicado por Safranina O tincin de criosecciones de las
tres fuentes (G, N, U). Todo representante examen- fa se muestran con una
ampliacin de 100.
Abreviaturas: A, y el tejido adiposo; BM, la Mdula sea, UCB, sangre del
cordn umbilical
de la muestras, ya que slo un aumento de la expresin de AP y no
deposicin de una matriz. No osteognico tipo veh- fue inducida en los
fibroblastos (no se muestra).
Diferenciacin adipognica Capacidad
diferenciacin adipognica se puso de manifiesto con la acumulacin de
punto muerto vacuolas lipdicas indicado por el aceite rojo O mancha.

Kern, Eichler, Stoeve et al.

Despus induccin preadipociticos, 100% (nueve de nueve) de los BM las
muestras y el 94% (15 de 16) de las muestras poseen clulas con un
fenotipo preadipociticos (Fig. 2F, 2T). Sin embargo, ninguno de los UCBderivados CFU-F muestra un fenotipo preadipociticos diferenciacin en
condiciones estndar. Incluso despus de aplicar un protocolo diferenciacin
fortificado en el que las clulas fueron inducidos por 5 semanas en
induccin preadipociticos medio solo, no eran detectables adipocitos (Fig.
2M). Por lo tanto, un nmero significativamente mayor de BM y muestras
de UCB que incluy una diferenciacin adipognica capacidad (p .01). No
preadipociticos fenotipo fue inducida en los fibroblastos (no se muestra).
Diferenciacin condrognica
diferenciacin condrognica Capacidad fue confirmada por la formacin de
una esfera en la micromasa cultura y la secrecin de los cartlagos de los
proteoglicanos tincin positiva con safranina O. Todas las muestras
estudiadas, independientemente de su origen, as como los fibroblastos,
demostr un cartlago de condrocitos con fenotipo de lagunas (Fig. 2G, 2N,
2U; fibroblastos no se muestra).
Comparacin de diferenciacin multilinaje Capacidad
comparando la diferenciacin multilinaje capacidad, se analiz slo las
muestras para que los resultados de las tres diferentes capacidades
diferenciacin se obtuvieron. Diferenciacin las capacidades en los tres
linajes se demostr de 71,4 % de BM y muestras (cinco de los siete; 10 de

14). Todos (seis de seis) UCB- CFU-F analizado slo podra dirigirse hacia
dos linajes, debido a la diferenciacin adipognica capacidad no detectable.
UNA de dos linajes diferenciacin capacidad slo se observ en sig- menos
BM y amplifica en muestras de muestras para UCB (BM, 28,6 % [dos de los
siete]; A, 28,6 [4 de 14]; p .008); todos BM y casi todos en las muestras
mostraron un adipo gasta capacidad de diferenciacin condrognica. Slo
una muestra de un osteo-diferenciacin condrognica capacidad.
Capacidad de diferenciacin multilinaje BM- y CFU-F
desde UCB MSCs de diferenciacin adipognica no se ca- pacity, en
contraste con EN- y BM-MSCs, presumimos que podra estar relacionada con
el UFC-F-origen de UCB de Microsoft Cluster Server (MSCS). BM- y de los
CAA se origin a partir de una monocapa, que podra contener una mezcla
heterognea de ms clulas precursoras en contraste con UFC-F. Por lo
tanto, CFU-F se genera tambin a partir de BM y EN y se analizan para su
diferenciacin.
La diferenciacin capacidad de CFU-F de ambos tejidos no se limita: la
diferenciacin de capacidad hacia los tres linajes poda observarse en 28,6
% (4 de 14) de BM-CFU-F y de 89,3 % (25 de 28) de la CFU-F (p .001). Una
diferenciacin en dos linajes slo fue observado al 64,2 % (9 de 14) de BMCFU-F y de 7,1 % (2 de 28) de CFU-F (p .001): todos los DE CFU-F y casi
todos los BM-CFU-F
mostr un adipo gasta capacidad de diferenciacin condrognica, puesto
que una BM-CFU-F posea un osteo-diferenciacin condrognica de
capacidad. Un BM- y a partir de CFU-F puede ser dif radiologa mdica hacia
uno slo, el linaje condrognica.
Inmunofenotipo Linfocitario Caracterizacin
de caracterizacin de los CSM, protena de superficie- bertad de CSM de
nueve BM los donantes en los pasajes 0 y 7, de 13 UCB-CFU-F (8 unidades
UCB) en los pasajes 3-5, y de nueve a
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1299
Tabla 2. Comparacin de la expresin de protenas que se encuentran en la
superficie de las clulas madre mesenquimales procedentes de BM, UCB, y
en tal y como lo ha analizado por citometra de flujo BM ( %) UCB ( %) EN
( %) anticuerpo (n 9) (nO 10) (n 9),
CD44 97,5 5,1 99,7 0,5 99,8 0,2 CD73 90,0 20,0 99,3 1,3 99,6 0,5 CD90
99,1 2,5 97,8 7,1 99,9 0,2 CD14 1.2 1.1 0.8 0.9 2.4 5.0 CD34 1.6 1.4 1.2 1.5
5.0 5.1 CD45 5.2 3.7 3.8 3.6 3.8 5.1
un CD105 88,1 7,4 72,4 20,0 90,4 5,9 CD133 1.3 1.1 2.9 5.5 2.9 3.5 CD29
99,0 1,5 99,8 0,4 99,5 1,3 HLA I 95,2 6,0 94,3 6,8 98,8 2,8
b CD106 66,3 22,7 70,0 23,6 30,3 18,6 EL HLA II 4,2 6,1 0,8 1,2 4,4 6,2 4,5
9,3 CD144 2,4 4,0 2,4 2,5

La tabla muestra los valores del porcentaje de clulas positivas desviacin

estndar y el nmero total de clulas analizadas.
una se observan diferencias entre UCB en comparacin con el BM y EN (p .
05).
bSignificant se observaron diferencias en comparacin con el BM y UCB (p .
05).
Abreviaturas: A, y el tejido adiposo; BM, la Mdula sea, UCB, sangre de
cordn umbilical, en el que
los donantes en los pasajes 2-5 fueron examinados por citometra de flujo.
Cada muestra fue analizada en un conducto (Tabla 2).
sin embargo, ninguno de los MSCs expres HLA II. CD105 fue expresada por
un porcentaje significativamente menor de UCB de MSCs en comparacin
con BM- o DE MSCs (UCB en comparacin con el BM, p .02; UCB en
comparacin con, p .008) (Fig. 3). ;I MSCs derivados de las tres fuentes no
muestra- laciones de marcadores hematopoy (CD14, CD34, CD45), de la
clula de vstago marcador CD133, o el marcador de clulas endoteliales
CD144. Ms del 90% de MSCs derivadas de las tres fuentes expresaron el
tpico MSC protenas marcadoras DEL CD73 y CD44, CD29, CD90. Sin
embargo, la intensidad de la expresin de CD90 de UCB de MSCs es muy
inferior a la de los otros tejidos (media intensidad de la fluorescencia: UCB,
738 715.9; BM, 1.512,1 754.9; EN, 2.200,6 896.9; UCB en comparacin con
el BM, p .02; UCB en comparacin con AL, p .001) (Fig. 3). Ms del 90% de
los CSM derivados de las tres fuentes expresaron HLA
significativamente ms UCB y BM-MSCs expresaron CD106 de MSCs (UCB en
comparacin con AL, p .008; BM en comparacin con AL, p .002) (Fig. 3). Lo
mismo se observ para la intensidad de la expresin de esta molcula, que
fue significativamente ms alto en UCB y BM-MSCs en comparacin con
MSCs (BM, 28,37 plantilla 21.18 ; UCB, 41,90 31.81; EN 8,26 4,77 ; en
comparacin con el BM, p .02; en comparacin con UCB, p .001) (Fig. 3).
DISCUSIN
hemos comparado MSCs de BM y dos fuentes alternativas, a saber, UCB y
en cuanto a caractersticas bsicas MSC. Todas las clulas aisladas de estas
tres fuentes exhiben caractersticas tpicas MSC: un fibroblastoides
morfologa, la formacin de CFU-F, un codiciadas diferenciacin
capacidad, y la expresin de un conjunto tpico de protenas que se
encuentran en la superficie.

1300 Mientras que

la figura 3. Inmunofenotipo anlisis de clulas madre mesenquimales (MSC)

de BM (lnea discontinua), UCB (lnea gruesa), y en (lnea de luz).
MSCs de nueve BM los donantes en los pasajes 0-7, 13 UCB-fibroblastoides
de las unidades formadoras de colonias en los pasajes 3-5, y nueve de los
donantes en los pasajes 2-5 se trypsinized, etiquetados con anticuerpos
contra el antgeno, y analizados por citometra de flujo. Slo algunos
ejemplos representativos de importante expresin de antgenos diferentes
se muestran los perfiles.
Abreviaturas: A, tejido adiposo; BM, la Mdula sea, FITC, fluores- cein
isotiocianato; PE, ficoeritrina; PerCP, Peridium-clorofila complejo proteico,
UCB, sangre del cordn umbilical.
MSCs derivadas de las tres fuentes expresan protenas marcadoras MSC
clsicos, pero le faltaban hematopoyticas y marcadores endoteliales, se
observaron diferencias significativas en cuanto a la expresin de CD90,
CD105, CD106. Estas molculas son descritos para ser asociado con
hematopoyesis y la migracin celular [18 - 20]. Es necesario que se
investig adems si estas molculas son funcionalmente importantes de
estroma y homing capacidades. En una primera aproximacin, hemos
creado un amplio perfil de expresin de la protena undifferenti- tizaciones
UCB-CSM, que se extender a BM- y MSCs y, a continuacin, correlacionados
con propiedades funcionales [ 21].
Dado que la relevancia de las diferencias observadas de expresin de
marcadores no ha sido investigado de manera adecuada y sin embargo,
existen diferencias en lo que respecta a capacidad diferenciacin parece ser
ms relevante para MSC calidad en la actualidad. Hemos demostrado una
capacidad de diferenciacin multilinaje BM- y Microsoft Cluster Server
(MSCS). Inters- tente, UCB-MSCs no pudieron ser diferenciados
preadipociticos hacia el linaje, que no estaba relacionada con la CFU-F
origen. En realidad, hay datos contradictorios sobre la capacidad de
diferenciacin adipognica UCB-MSCs [9 -12, 22, 23]. Sin embargo,
suponemos que UCB-CSM son menos- sarrollar hacia la diferenciacin
adipognica (apoyado por los resultados de Chang et al. [ 22]) que podra
estar relacionada con la edad ontogentico de estas clulas. Esto se
corrobora por el hecho de que resida en adipocitos humanos adultos BM y
EN pero estn ausentes en la vida del feto BM y por la observacin de una
mayor adipognesis correlacionadas con la edad [ 24]. Genmica
comparativa ms o se necesitan enfoques protemicos para evaluar la
susceptibilidad hacia adipognesis de Microsoft Cluster Server (MSCS).
Ninguno de nuestros UCB-MSCs mostr diferenciacin adipognica
capacidad diferenciada, pero todos en el condro y so teogenic linajes. En
contraste, un tri-diferenciacin potencial calificacio- fue observado para la
mayora de las muestras pero slo para unos pocos BM muestras. Una
muestra de BM y se observ que en
la comparacin de distintos tipos de tejidos MSCs
slo someterse a la va condrognica. De acuerdo con esto, una estructura
jerrquica o incluso limitado potencial de diferenciacin de los CSM se ha
informado [1, 13, 25].

En nuestro estudio, las investigaciones se limitan a los mesoder

diferenciacin capacidad de mal. Basndose en informes recientes, sin
embargo, el espectro de diferenciacin de MSCs no parece limitarse a este
linaje. MSCs derivadas de los tres tejidos han demostrado que ms
diferencian en meso- cutnea y linajes en endo y linajes ectodrmica, as
[ 10-13, 26- 33]. Experimentos comparativos deben llevarse a cabo para
evaluar la respuesta hacia cardiomyogenic, endotelial, hepticos, neuronas,
y diferenciacin pancretica.
Un alto impacto en los contextos clnicos explotacin podra estar
relacionada con la abundancia y ampliacin de la capacidad de Microsoft
Cluster Server (MSCS). Con base en nuestros resultados, tanto BM y son
fuentes fiables para aislar y csm en el autotrasplante de que todos los
preparativos dieron lugar a Microsoft Cluster Server (MSCS). UCB, en
cambio, haba un aislamiento eficacia de un mximo de 63% [ 8]. Se
atribuyen estas diferencias a el hecho de que MSCS estn circulando en el
organismo prenatal y residen en los tejidos de los adultos [ 9]. A pesar de la
baja frecuencia de UCB-MSCs, el potencial de expansin fue ms alto en
comparacin con otras fuentes celulares. Considerando las aplicaciones
clnicas, el resultado de nmeros celulares pueden ser similares a los de BM
y, que pueden obtenerse en las frecuencias ms altas. Uno de los
argumentos en contra de la disponibilidad limitada en algunos pacientes.
Sin embargo, creemos que debido a la alta frecuencia de MSCs, tambin a
los pequeos depsitos grasa podra ser suficiente para MSC aislamiento.
BM ha sido la principal fuente de aplicacin clnica de los CSM, tales como el
tratamiento de la osteognesis imperfecta, injerto contra husped- y el
infarto agudo de miocardio [ 34- 36]. Como la cantidad, la frecuencia y la
diferenciacin capacidad de BM-MSCs correlaciona negativamente con la
edad, pueden ser clnicamente ineficaz cuando se obtiene de los pacientes
de edad avanzada. En ese caso, el trasplante alognico noc- sera necesario.
En el caso de es necesario, BM o HLA idntico al de sus hermanos, haploidntico parientes, o HLA-proyect los donantes podran ser mejor opcin.
Especular sobre un "off-the-shelf" producto que requiera produccin en
masa, podran ser una slida base de partida debido a la abundancia y
relativamente fcil cosecha, MSCs y alta frecuencia.
Trasplante de Clulas Madre Mesenquimales es actualmente una
procedimiento experimental, de manera parecida a los comienzos de
trasplante de clulas madre hematopoyticas. En este ltimo, el BM ha sido
reemplazada gradualmente por clulas progenitoras de sangre perifrica y
sangre de cordn umbilical. Asimismo, en la esfera de los CSM, las fuentes
alternativas son intensamente investigado, y un da estas nuevas fuentes
podr sustituir BM. Teniendo en cuenta todas las ventajas y desventajaszaciones de las tres fuentes mencionadas anteriormente, en funcin de las
indicaciones teraputicas, las aplicaciones clnicas pueden estar basadas en
la diferenciacin, pero ms probable de la abundancia, fre- cuencia, y
posibilidades de expansin de las clulas.
AGRADECIMIENTOS
agradecemos los colaboradores en el departamento de obstetricia del St.
Hedwigsklinik en Mannheim, Alemania, el Hospital St. Rochus en Dieburg,
Alemania, y especialmente Dudi Vutay (Departamento de Obstetricia y

permite c?lculo- cology, el Hospital de la Universidad Mannheim), y de la

Klinik am Lui senpark para el suministro de material la liposuccin. Muchas
gracias Daniela Griffiths para la edicin del manuscrito. Este trabajo fue

Kern, Eichler, Stoeve et al.

apoyo de Forschungsfonds der fakultat fur Klinische Medizin Mannheim y
por la Deutsche Jos Carreras Leu- kamie-Stiftung eingetragener Verein.
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