PRIMER PARCIAL IBMC del 19 de mayo de 2012

RESPUESTAS ESPERADAS
ATENCIN: Aqu se encuentran las respuestas esperadas del primer parcial de IBMC 2012 para que les
sirva de gua para comprender las posibles correcciones que reciban. Por supuesto son slo orientativas y
puede haber otras respuestas compatibles con el enunciado y que, debidamente justificadas, tambin sern
consideradas correctas.
PROBLEMA 1
Pregunta 1
a. El transcripto primario, que an no fue procesado por la maquinaria de splicing, incluira a todos los
exones e intrones.
E1+I1+E2+I2+E3+I3+E4= 200+1500+100+2000+150+800+250= 5000 bases o nucletidos (dado que el
RNA transcripto primario es de cadena simple).
La longitud del transcripto primario sera de 5000 nt.
b. En el mRNA maduro fueron eliminados los intrones por splicing.
Puede calcularse como la suma de los exones: E1+E2+E3+E4= 200+100+150+250= 700 nt
o restando las secuencias intrnicas a la longitud del transcripto primario: 5000-1500-2000-800= 700 nt
La longitud del mRNA maduro es de 700 nt + CAP + cola de poliA.
c. Para calcular el PM del polipptido codificado hace falta calcular la longitud de la regin codificante del
mRNA.
Hay varias maneras, y stas son slo dos de ellas:
1) De +1740 a +4809 (inclusive) corresponde a la regin codificante (dado que la base +4810 corresponde
a la primer base del codn STOP), incluyendo las regiones intrnicas.
De +1740 a +4809 hay 3070 nt (4809-1740+1 nt). Restando las secuencias correspondientes a los intrones 2
y 3, queda: 3070-2000-800= 270 nt
2) Calcular regin 5 UTR: El exn 2 comienza en la posicin +1701 (ya que E1+I1= 200+1500= 1700 nt).
De +1701 a +1739 (inclusive) es la regin 5 UTR (del exn 2!) de 39 nt (1739-1701+1 nt). (La regin
5UTR incluye tambin al exn 1!)
Calcular regin 3 UTR: Entre la primer base del codn STOP (+4810) y el final del E4 (+5000) hay 191 nt
(5000-4810+1 nt).
Regin codificante= (E2-5UTR)+E3+(E4-3UTR)= (100-39)+150+(250-191)= 270 nt
Dado que cada aminocido est codificado por 3 nucletidos: 270/3= 90 aa
Dado que el PM promedio de cada aminocido es 110 kDa: 90 x 110= 9900 kDa.
El PM estimado del polipptido codificado (en hgado, donde el E3 se incluye siempre) es de 9900 kDa.
Pregunta 2
Existe un factor de transcripcin que se une al enhancer del gen de la 1 antitripsina utilizado en la
construccin de la Figura 1 y activa la transcripcin del gen. Este factor de transcripcin se expresa (es decir
que est presente) en la lnea heptica y no se expresa (est ausente) en la neuronal.
Pregunta 3
Exp. 1: En el ncleo se transcribe la construccin de la Fig. 1 generando un mRNA que contiene las
secuencias de unin para las protenas PFV y PFR. La unin de ambas protenas a este mRNA genera
fluorescencia amarilla. En el citoplasma, los ribosomas traducen hasta el codn STOP, donde se disocian.
Durante la traduccin, desplazan a la protena PFV pero no a la PFR (que se encuentra ro abajo del codn
STOP), generando fluorescencia roja.

Exp. 2: El tratamiento con cicloheximida inhibe la traduccin. Esto no afecta la fluorescencia amarilla
observada en el ncleo. Sin embargo, en el citoplasma, al estar inhibida la traduccin, los ribosomas no
desplazan a ninguna de las dos protenas, generando fluorescencia amarilla.
Pregunta 4
3
4
5
6

act D
tRNA supr.
miRNA PFR
exclusin E3

NO
SI
SI
SI

AMARILLO
VERDE
ROJO

NO
NO
NO
SI

ROJO

Exp. 3: En ausencia de transcripcin, no se genera mRNA a partir de la construccin, por lo que no hay
fluorescencia ni en el ncleo ni en el citoplasma.
Exp. 4: El tRNA supresor reconoce el codn STOP e incorpora un aminocido en esta posicin, por lo que
los ribosomas continan traduciendo ms all del codn STOP, desplazando tambin a la PFR. Dado que
ambas protenas son desplazadas en el citoplasma por los ribosomas, no se observa fluorescencia.
La expresin del tRNA supresor no afecta la transcripcin ni la unin de las protenas al mRNA en el ncleo,
mantenindose la fluorescencia amarilla.
Este resultado se observara en el caso de una supresin total. Si la supresin fuese parcial, se observara en
el citoplasma un cierto nivel de fluorescencia roja, resultado de la traduccin normal del mRNA (donde no se
desplaza a la PFR).
Exp. 5: El miRNA inhibe la traduccin del mRNA que codifica para PFR, por lo que PFR estar ausente en
estas clulas. En el ncleo slo se unir la PFV a su secuencia blanco en el mRNA, dando fluorescencia
verde. En el citoplasma, el ribosoma desplaza a la PFV y, al no haber PFR, no se observa fluorescencia.
Exp. 6: El sitio de unin para la PFV se encuentra en el exn 3. Al eliminarse este exn por splicing, la
fluorescencia en el ncleo estar dada nicamente por la unin de la PFR a su secuencia blanco en el mRNA.
(Podra detectarse quizs un cierto nivel de fluorescencia amarilla por la unin de ambas protenas al premRNA.)
En el citoplasma, la eliminacin de la secuencia blanco de PFV no afecta el resultado ya que esta protena era
de todos modos desplazada por los ribosomas. Se observa fluorescencia roja.
Pregunta 5
1. La construccin tiene promotor y enhancer eucariticos que no son reconocidos por la maquinaria
transcripcional procaritica de E. coli y por lo tanto no son funcionales. No hay transcripcin de la
construccin y por lo tanto no se detecta fluorescencia.
2. La construccin se transcribe a partir del promotor procaritico, generando un mRNA que incluye a las
secuencias intrnicas, ya que no hay maquinaria de splicing en E. coli. Debido a esto, el cambio de la
secuencia rayada al intrn 2 es irrelevante.
Al no tener secuencia S-D, el mRNA no ser traducido y las protenas que se unan al mismo no sern
desplazadas por los ribosomas.
El mRNA generado contiene entonces las dos secuencias blanco y al ser reconocidas por las protenas PFV y
PFR se observar fluorescencia amarilla (en toda la clula, ya que E. coli no tiene ncleo!).

PROBLEMA 2
Pregunta 1
El dato de 701 kDa es consistente con ambos modelos, que tienen la misma composicin de unidades.
Sin embargo, el modelo correcto es el modelo A. Esto se deduce de 2 datos del enunciado:

1) La enzima reconstituda omitiendo la subunidad mantiene su fidelidad como polimerasa, es decir que
incluye a la subunidad . Esto no es compatible con el modelo B, ya que en este modelo la subunidad se
une al complejo a travs de la subunidad y no quedara includa en el oligmero.
2) La enzima reconstituda tiene un PM de 206 kDa. Este dato es compatible con el modelo A (+++=
132+37+27+10= 206 kDa) y no con el modelo B, que dara un oligmero mucho ms pesado.
Pregunta 2
El tratamiento con urea (que afecta nicamente uniones dbiles de tipo puente de hidrgeno) disocia
completamente a la holoenzima obtenindose los 10 tipos de subunidades que la conforman. Las subunidades
de la holoenzima de E. coli estn entonces asociadas entre s nicamente por uniones dbiles. No hay
uniones disulfuro entre subunidades ya que no hubo necesidad de utilizar un agente reductor para disociarlas.
Pregunta 3
La replicacin del DNA in vivo requiere helicasa (para facilitar la apertura de la doble hlice de DNA) y
rNTPs (para la sntesis, por la primasa, de los primers necesarios para la DNA polimerasa).
En la reaccin de replicacin del DNA in vitro del experimento se utiliza un molde de DNA de cadena
simple (no requiere helicasa) y un primer (no requiere rNTPs).
Pregunta 4
La duplicacin del DNA in vivo implica la duplicacin, en cada direccin, de las dos hebras de la doble
hlice de DNA por un complejo que contenga dos subunidades . En la horquilla de replicacin, cada
subunidad copia una de las dos hebras de DNA (la hebra lder o contnua o leading strand y la hebra
retrasada o discontnua o lagging strand).
Pregunta 5
La subunidad de E. coli no tiene actividad 3-5 exonucleasea (proofreading), o si la tiene, es
despreciable comparada con la de la subunidad . Esto es dato del enunciado y se deduce de la frecuencia de
error de la tabla (10-4).
La subunidad de Pfu tiene actividad proofreading en el mismo polipptido. En la tabla se muestra que
tiene una frecuencia de error mucho menor (10-6) que aumenta dos rdenes de magnitud (10-4) cuando se
muta un aminocido de la subunidad .
La subunidad de Taq no tiene actividad proofreading ya que su tasa de error es elevada (10-4).
La actividad 3-5 exonucleasea es importante porque corrige posibles errores de la actividad polimerasa
propiamente dicha durante la replicacin. Su ausencia generara un alto nmero de mutaciones que, de
ocurrir en genes esenciales, seran letales para la clula.
Pregunta 6
De los resultados de la tabla se deduce que existen puentes disulfuro intracatenarios (es una nica
subunidad) que no son necesarios ni para la actividad polimerasa ni para la actividad 3-5 exonucleasea
(ninguna de esas dos actividades se ve afectada por el tratamiento con -mercaptoetanol), pero que son
necesarios para la termorresistencia de la enzima Pfu, indispensable en el ensayo de PCR.
Pregunta 7
Un cultivo de E.coli knockout para el gen que codifica a la subunidad no sera viable ya que la clula
necesita absolutamente replicar su DNA antes de cada divisin celular. En ausencia de la subunidad , las
consecuencias seran serias: se generaran muchas mutaciones que podran resultar letales. En las bacterias
que no sufrieran alguna mutacin letal se iran acumulando mutaciones en genes no esenciales.