ADN

RESUMEN
El presente informe, representa una actividad de extraccin del ADN, que ser de gran utilidad
en muchas aplicaciones de la medicina. Ya que la medicina del futuro es la gentica, y el
estudio de la gentica comienza analizando el genoma, es importante conocer diferentes
mtodos que nos permitan extraerlo para poderlo analizar.
Es objetivo de este informe:

Denotar los diferentes mtodos disponibles para la extraccin del DNA.

Ejemplificar un mtodo que permitir conocer como es que funciona la tcnica en este
tipo de procedimientos.

Aprender la metodologa utilizada para la extraccin del DNA.

Profundizar en la teora para conocer algunos aspectos de aplicaciones clnicas y saber

qu tcnicas nos ofrecen mejor rendimiento.

Obtener DNA con un mximo grado de pureza, basado en la buena aplicacin del
mtodo.

MARCO TERICO
La molcula de ADN (que es la que se va a extraer en este laboratorio) est constituida por dos
largas cadenas de nucletidos unidas entre s formando una doble hlice. Las dos cadenas de
nucletidos que constituyen una molcula de ADN, se mantienen unidas entre s porque se
forman enlaces entre las bases nitrogenadas de ambas cadenas que quedan enfrentadas.
La unin de las bases se realiza mediante puentes de hidrgeno, y este apareamiento est
condicionado qumicamente de forma que la adenina (A) slo se puede unir con la Timina (T) y
la Guanina (G) con la Citosina (C).
La estructura de un determinado ADN est definida por la "secuencia" de las bases
nitrogenadas en la cadena de nucletidos, residiendo precisamente en esta secuencia de
bases la informacin gentica del ADN. El orden en el que aparecen las cuatro bases a lo largo
de una cadena en el ADN es, por tanto, crtico para la clula, ya que este orden es el que
constituye las instrucciones del programa gentico de los organismos.
Conocer esta secuencia de bases, es decir, secuenciar un ADN equivale a descifrar su mensaje
gentico.
La estructura en doble hlice del ADN, con el apareamiento de bases limitado ( A-T; G-C ),
implica que el orden o secuencia de bases de una de las cadenas delimita automticamente el
orden de la otra, por eso se dice que las cadenas son complementarias. Una vez conocida la
secuencia de las bases de una cadena, se deduce inmediatamente la secuencia de bases de la
complementaria.
REPLICACIN DEL ADN
Es la capacidad que tiene el ADN de hacer copias o rplicas de su molcula. Este proceso es
fundamental para la transferencia de la informacin gentica de generacin en generacin.
Las molculas se replican de un modo semiconservativo. La doble hlice se separa y cada una
de las cadenas sirve de molde para la sntesis de una nueva cadena complementaria. El
resultado final son dos molculas idnticas a la original.

Existen varios mtodos para la purificacin del ADN. Por ejemplo, con la extraccin
directamente de 300 ml. de sangre completa se puede utilizar el Kit comercial"Wizard
genomic DNA purification kit" que sirve para purificar material gentico de humanos, clulas
en cultivo, tejidos animales, vegetales, levaduras y bacterias. Para la realizacin de este y otros
mtodos se debe seguir las instrucciones del fabricante, (esta tcnica es la que vamos a utilizar
en este laboratorio para purificar DNA, y se describir posteriormente sus pasos para la
obtencin de dicho material). Con esta tcnica, podemos utilizar posteriormente los anlisis de
DNA tales como amplificacin (PCR), digestin con endonucleasas de restriccin, southern blot
o Dot blot.
Otros mtodos son:
Mtodo comercial InstaGene Matrix: donde tambin se extrae DNA a partir de sangre entera,
diseado para aislar DNA que posteriormente ser utilizado en reacciones de PCR. En un tubo
Eppendorf se agrega solucin de Lysis Buffer (pH: 7.9) y sangre entera. Luego de varios
lavados y centrifugaciones con este buffer, se descarta el sobrenadante y se agrega el
InstaGene Matriz al pellet obtenido. Por ltimo, se realizan dos incubaciones, una a 70C y otra
a 95C. Las muestras son guardadas a -20C hasta la realizacin de la tcnica de PCR,
digestin con endonucleasas de restriccin, southern blot o Dot blot.
Mtodo Salting Out: En este mtodo se utiliza un buffer que contiene Proteinasa K ( Tris-HCl,
pH 8.3,Tween 20, Nonidet P40, Proteinasa K), la cual destruye las membranas nucleares,
liberando a la solucin los cidos nucleicos. El paso siguiente consiste en la precipitacin de los
cidos nucleicos, ya que el DNA presente en soluciones con alta concentracin de sales
acetato de sodio (AcONa) puede precipitarse mediante la adicin de alcohol etlico a dichas
soluciones.
Extraccin de DNA de sangre perifrica con Bromuro de Cetiltrimetilamonio (CTAB): El
fundamento es similar al mtodo anterior, pero en este caso no se utiliza el buffer con
Proteinasa K y, la liberacin de los cidos nucleicos se realiza con una solucin de
homogeinizacin (CTAB, NaCl, b-mercaptoetanol, EDTA, Tris-HCl pH 7.5). El CTAB es una sal
de amonio cuaternario, uno de cuyos grupos alquilo es de gran magnitud molecular, y tiene
propiedades detergentes; se conocen con el nombre de jabones invertidos, debido a que su
actividad superficial se debe a la presencia de un ion positivo y no a uno negativo, como
sucede en los sulfatos de alquilo e hidrgeno, que son los detergentes usuales. Luego se
realiz la extraccin de los cidos nucleicos con cloroformo: alcohol isoamlico, y la posterior
precipitacin del DNA con etanol absoluto primero, y posteriormente con etanol 70%. Esta es
considerada por muchos la una tcnica que rene los requisitos fundamentales para
purificacin del DNA, ya que sirve para amplificacin PCR, mostrando una pureza muy alta del
material que separa.
La purificacin del DNA es importante porque permite:

Identificar mutaciones.

Ver caractersticas propias de los tipos de DNA (Polimorfismo).

Para clonar (Genes especficos, fragmentos de cromosomas o individuos).

Aislar DNA afectado y compararlo con uno bueno.

Detectar en las muestras, la presencia de un largo espectro de agentes patognicos.

Identificar resistencia microbiana.

Evaluar desordenes genticos, neurodegenerativos, neoplsicos, imunolgicos.

Medicina forense para la identificacin de personas.

Para hacer tests de paternidad.

Hay que tener en cuenta que es muy importante la fuente de clulas de las cuales voy a extraer
el DNA , ya que de esto depende la facilidad para la ejecucin del procedimiento, Por ejemplo
la extraccin del DNA de las clulas del cabello es difcil de separar su DNA pero es muy fcil
conseguir el pelo, o la extraccin de DNA de leucocitos es fcil pero para conseguirlos es ms
dificultoso.
CONCEPTOS IMPORTANTES

Heparina: Heteropolisacrido complejo; posee buena cantidad de grupos sulfato y

residuos glucosalina. La heparina inhibe la coagulacin de la sangre por activacin de
la antitrombina III. En cantidades pequeas la heparina no tiene un efecto significativo
en muchas de las determinaciones de laboratorio y se utiliza generalmente como
anticoagulante en las muestras de sangre en los laboratorios clnicos. El citrato, la
heparina y el EDTA entre otros, son anticoagulantes que imposibilitan la disponibilidad
de iones de calcio, que es imprescindible en la coagulacin, y ya sin el calcio, la
muestra de sangre al centrifugarla no se coagular y se podrn separar las molculas
sin problema.

Isopropanol: (CH3 CHOHCH3). Lquido transparente, voltil e incoloro empleado en el

laboratorio qumico para extraer y disolver lpidos y en histologa se usa como
solubilizante de los colorantes de grasas y como agente deshidratante. El isopropanol
precipita el DNA porque compite con este por el agua, deshidratndolo y llevndolo al
fondo del tubo.

Etanol: (CH3CH2OH). Lquido voltil, incoloro, miscible con agua, metanol, ter,
acetona y cloroformo. Se emplea principalmente como solvente en
muchosprocedimientos de laboratorio, como agente deshidratante en histologa como
solvente de algunas sustancias 8tinturas) y como desinfectante.

Solvatacin: Interaccin estabilizadora de un solvente con un soluto o de un solvente

con grupos funcionales en la superficie de un material insoluble.

MATERIALES Y REACTIVOS
Tubos vacutainer con EDTA, heparina o citrato
Tubos eppendorf estriles de 1.5 ml
Micropipetas
Puntas
Vortex
Microcentrfuga para viales de 1.5 ml
Guantes
Agua deionizada grado I (MQ) estril (H2Odd)
Bao de agua a 37C
Isopropanol
Etanol 70 %
METODOLOGA

1. 900 l de Cell Lysis Solution en tubo eppendorf de 1.5 ml.

2. Transferir 300 l de sangre venosa perifrica anticoagulada mezclar por inversin 5 veces.
3. Incubar 10 minutos e invertir tubo 3 veces para lisar los eritrocitos
4. Centrifugar a 16.000 x g/1 minuto/temperatura ambiente.
5. Remover sobrenadante, sin resuspender el botn de leucocitos.
6. Colocar tubo en vortex fuerte 15 segundos hasta resuspender completamente los leucocitos
7. Adicionar 300 l de Nuclei Lysis Solution y resuspender 6 veces con pipeta
8. Adicionar 1.5 l de RNase Solution, mezclar, invertir 25 veces e incubar a 37C/15 minutos.
9. Adicionar 100 l de Protein Precipitation Solution y colocar en vortex fuerte por 20 segundos
10. Centrifugar a 16.000 x g/3 minutos/temperatura ambiente.
11. Transferir sobrenadante a tubo eppendorf de 1.5 ml nuevo, que tiene 300 l de isopropanol.
12. Mezclar por inversin hasta que el DNA se haga visible
13. Centrifugar a 16.000 x g/1 minuto/temperatura ambiente.
14. Remover el sobrenadante y adicionar 300 l de etanol al 70% a temperatura ambiente.
Invertir el tubo varias veces para lavar el botn con el DNA.
15. Centrifugar a 16.000 x g/1 minuto/temperatura ambiente
16. .Aspirar cuidadosamente el etanol con una pipeta Pasteur o con puntas para
secuenciamiento. En este punto se puede perder muy fcilmente el DNA.
17. Invertir el tubo sobre una servilleta y deje secar al aire por 15 minutos.
PROCEDIMIENTO Y ANLISIS
El proceso efectuado en el laboratorio para la purificacin del DNA a partir de leucocitos
humanos, se bas en la aplicacin del mtodo "Wizard Genomic Purification Kit" como ya lo
habamos mencionado anteriormente.
1. Partiendo de una muestra de 300 ml de sangre humana (sacada con una micropipeta
graduada previamente y limpiada luego con fluhidrxido de sodio para aumentar el ph y destruir
la contaminacin biolgica que probablemente adquiri) previamente tratada con heparina que
es un anticoagulante, se procedi a mezclar con el tampn de cloruro de magnesio (Cell Lysis
Solution y el cual tena una cantidad de 900 ml) que entra en las clulas y genera una
desestabilizacin osmtica, haciendo que las clulas se hinchen y se estallen sus membranas
celulares. Todo esto se logra en un tiempo de incubacin de 10 minutos a 37c para favorecer
la reaccin. Luego procedemos a centrifugar para ayudar con el rompimiento de la membrana y
a la vez para sedimentar los ncleos de leucocitos, quedando un sobrenadante compuesto por
restos de membrana, organelas celulares, protoplasma y restos de hemoglobina que le da un
color rojo con tendencia a oscuro.
2. Se procedi a la extraccin del sobrenadante con la micropipeta varias veces para sacar la
mayor cantidad posible, evitando succionar los ncleos de los leucocitos. Esta cantidad de
ncleos sedimentados es llevada al vrtex por 15 segundos para resuspenderlos y facilitar el
mismo proceso.
3. Se agregaron 300ml de Nuclei Lysis Solution la cual es bsica (NONIDET P4O) que acta
selectivamente en la membrana nuclear con el objetivo de romperla y liberar los cidos

nucleicos ejerciendo as su funcin detergente. Luego de mezclar la solucin con la pipeta, se

empez a observar de consistencia muy viscosa.
4. Adicionamos 1,5 ml de RNase solution y mezclamos invirtiendo el tubo 25 veces para luego
proceder a incubar la muestra a 37c y por un tiempo de 15 minutos. Este procedimiento se
hace con el fin de desintegrar el RNA, quedando as el DNA y varios tipos de protenas.
5. Pasados los 15 minutos de incubacin agregamos 100ml de Protein precipitation solution
(proteinasa K) y colocamos en el vrtex por 20 segundos. La solucin de precipitacin de
protena que es bsicamente cloruro de sodio, solvata las protenas e inicia su precipitacin.
Centrifugamos por 3 minutos para agilizar este proceso de precipitacin.
6. Terminado el proceso de centrifugacin, se pudo observar una pequea porcin sedimentada
de color rojo oscuro que contiene las protenas y con ellas la presencia de hemoglobina con su
color rojo caracterstico. El sobrenadante es de color transparente y contiene el DNA, aunque
an no visible.
7. Retiramos el sobrenadante y lo mezclamos con 300ml de isopropanol. Luego de haber
invertido esta varias veces, buscando la buena interaccin de los componentes, pudimos
observar el DNA como unas pequeas fibras de algodn color blanco y esto se logr gracias a
que el isopropanol deshidrata el DNA e inicia su sedimentacin.
8. Centrifugamos para sedimentar el DNA y sacar la mayor parte posible de isopropanol y le
agregamos al DNA sedimentado 300ml de etanol al 70% para rehidratarlo y luego centrifugar
por 1 minuto para sedimentar el DNA ya hidratado.
9. Aspiramos cuidadosamente el etanol con la pipeta, e invirtiendo el tubo sobre una servilleta
se puede sacar el exceso de etanol quedando el DNA en el tubo. Teniendo as el DNA se debe
posteriormente dejar al aire 15 minutos y para conservarlo se agregan 100ml de DNA
Rehydration solution e incubar a 65c/1 hora y luego incubar la solucin a 4c
APLICACIONES CLNICAS
1. Test de paternidad
La muestra biolgica (sangre, uas, hisopados o cualquier otro tejido que contenga clulas
humanas con ncleo) se somete a la accin de detergentes, que disuelven los lpidos; y
enzimas proteolticas, que cortan las protenas, es decir, se est utilizando un kit cualquiera
para este procedimiento.
Luego de incubar la mezcla una noche a 60 grados centgrados, se produce la ruptura de la
estructura celular liberando todo su contenido a la solucin.
La mezcla se limpia mediante sucesivos lavados con solventes orgnicos (fenol, cloroformo),
que coagulan protenas y extraen los lpidos, y finalmente el ADN se separa por precipitacin
con alcohol en medio salino.
Eventualmente, en los casos de manchas antiguas o huesos, se realizan purificaciones
posteriores por dilisis o adsorcin a soportes slidos.
Existen mtodos alternativos en los cuales la muestra sangunea se deposita sobre un papel
especial, que la mantiene inalterada por aos a temperatura ambiente. Previo al anlisis, se
cortan con un sacabocados pequeos fragmentos del papel (alrededor de 1 mm.) y se extraen
las impurezas mediante lavados. El papel as procesado, con el ADN adherido, se analiza
directamente colocndolo en la mezcla de amplificacin.
Analizando el DNA existen dos metodologas diferentes:
a) Corte con enzimas de restriccin, corrimiento electrofortico en geles de agarosa,
transferencia a una membrana de nylon o celulosa y tratamiento con sondas de locus mltiple o
de locus especfico. Estas tcnicas han cado en desuso, por lo cual no sern tratadas aqu. De

todos modos, si desea informacin sobre el tema, puede consultar la "Tesis Doctoral", al final
del presente resumen.
b) Amplificacin mediante PCR o reaccin en cadena de la polimerasa: es un proceso que
consiste en imitar una actividad normal de la clula: la copia de ADN, aunque en este caso
limitado a pequeos fragmentos, en los cuales estn ubicadas las regiones variables.
Para ello, se coloca en cada tubo una porcin del ADN extrado de cada persona y una mezcla
que contiene nucletidos, sales, una enzima que "copia" ADN (denominada polimerasa) y los
"primers" que reconocen la zona variable.
La mezcla se somete a variaciones de temperatura en un ciclador trmico, que produce
sucesivamente tres temperaturas diferentes: una que desnaturaliza o separa las cadenas del
ADN, otra que facilita que los "primers" reconozcan y se adhieran a la regin a copiar, y la
tercera que permite la extensin de la cadena copiada, mediante la unin de los nucletidos
que se encuentran en la solucin, con la ayuda de la polimerasa.
Luego, los amplificados se someten a un campo elctrico en el interior de un soporte
semislido o gel (electroforesis). Como el ADN est cargado negativamente, se dirige hacia el
polo positivo, los fragmentos pequeos ms rpido que los grandes, produciendo su
separacin.
Finalmente, los fragmentos separados se visualizan mediante diferentes mtodos:
- Radiactivos: si uno de los nucletidos estaba marcado radiactivamente, basta poner el gel en
contacto con una pelcula radiogrfica, que se revela para observar las variantes.
- Tincin con plata: se trata el gel con sales de plata, que por su carga positiva son atradas por
la carga negativa de los fragmentos de ADN, y se revela de modo similar a una fotografa.
Tanto los mtodos radiactivos como los de tincin con plata estn cayendo en desuso, y en la
actualidad son empleados solamente por laboratorios que poseen un escaso volumen de
trabajo.
- Sistemas automatizados: son los de ltima generacin, en los cuales al proceso de
electroforesis lo efecta un secuenciador automtico, que lee mediante un rayo lser los
"primers", marcados con un fluorocromo, adheridos a las zonas variables. Una computadora
permite determinar qu variantes son las que se encuentran en cada muestra.
2. Extraccin del DNA de la bacteria que produce la enfermedad de chagas.
Usando el mtodo Extraccin de DNA de sangre perifrica con Bromuro de Cetiltrimetilamonio
(CTAB), se dej listo el DNA para ser analizado mediante el mtodo de amplificacin PCR, en
el siguiente caso:
La Enfermedad de Chagas es la infeccin de mamferos y de triatomineos, producida por un
protozoo flagelado, el Trypanosoma cruzi, protozoo mastigforo que pertenece a la familia
Trypanosomatidae, en cuyo ciclo biolgico intervienen mamferos y un insecto vector. Los
huspedes mamferos pueden ser el hombre y algunos animales domsticos o silvestres. Este
parsito se presenta bajo tres aspectos morfolgicos fundamentales: Tripomastigoto,
Epimastigoto y Amastigoto.
Esta enfermedad se puede diferenciar en tres etapas: perodo agudo, perodo latente o
indeterminado y perodo crnico.
La metodologa de PCR (Polymerase Chain Reaction), permitir realizar la extraccin del DNA
del parsito para su posterior correlacin con los resultados obtenidos en individuos chagsicos
mediante las tcnicas convencionales de serologa y xenodiagnstico, a fin de poder evaluar la
efectividad del tratamiento, ya que la respuesta humoral contra los antgenos de Trypanosoma
cruzi puede permanecer a travs de los aos, aunque el parsito no sea demostrable por
xenodiagnstico o cultivo (Brito y cols. 1995); es decir que si se realiza un estudio serolgico es

este momento, seguramente dar un resultado positivo, por la denominada "cicatriz serolgica",
a diferencia de la PCR que permite realizar una deteccin directa del DNA del parsito,
indicando efectivamente su presencia y actividad. Por esta razn, la PCR podra en un futuro
reemplazar el xenodiagnstico para la evaluacin de la parasitemia en pacientes chagsicos
tanto agudos como crnicos.
Los porcentajes de sensibilidad de la PCR varan de 96% al 100%, como se puede observar,
siempre son mayores que los obtenidos con los exmenes de xenodiagnstico, los cuales
tienen una sensibilidad de aproximadamente 50%.
CONCLUSIN
El mtodo utilizado para la extraccin de DNA, permite purificar en un grado relativamente alto
(porque depende con la precisin de la toma de muestras y de procedimiento su xito) y
pudimos determinar que es factible utilizarlo en posteriores ocasiones ya que es muy fcil de
utilizar y se presta para varias aplicaciones clnicas.
AUTOR
Julin Esteban Londoo