APOSTILA DE AULAS PRTICAS

BIOQUMICA SDE 0024

Material referente s aulas prticas da

disciplina de Bioqumica SDE 0024
Profa: MSc. Milena Bellei Cherene

CAMPOS DOS GOYTACAZES 2015

Sumrio
AULA 1
Procedimento De Trabalho No Laboratrio
Segurana no Laboratrio
Equipamentos bsicos de Laboratrio
AULA 2
Reao da ninhidrina
AULA 3
Mtodo do Biureto
AULA 4
Desnaturao de Protenas
AULA 5
Salting in / Salting out
AULA 6
Efeito do pH na atividade enzimtica
AULA 7
Efeito da temperatura na atividade enzimtica
AULA 8
Efeito da concentrao de substrato na atividade enzimtica
AULA 9
Identificao de carboidratos Benedict, Seliwanoff e Lugol
AULA 10
Identificao de lipdeos (esteroides)
AULA 11
Fermentao alcolica

Universidade Estcio de S
Aluno (a):

Curso:

Disciplina: SDE 0024 Bioqumica

Data: ___/___/___

AULA 1 Esta aula atende aos objetivos do

Plano de Aula 257203 (semana 3) da disciplina

Perodo:

PROCEDIMENTO DE TRABALHO NO LABORATRIO

Uma parte de nossas aulas de Bioqumica se desenvolve no laboratrio, local
adequado para o trabalho de identificao, separao e determinao da quantidade
de substncias bem como, da preparao e obteno de novas substncias. Resultados
tais que podem ser utilizados para uma srie de estudos, entre estes, para a pesquisa
de uma doena. Assim, faz-se necessrio que tenhamos pelo menos uma idia de
como um laboratrio, como nele trabalhamos, os cuidados que devemos ter e a
aparelhagem bsica nele existente.

SEGURANA NO LABORATRIO.
O laboratrio um recinto construdo especialmente para a execuo de
experincias. Ele deve apresentar instalaes de gua, gs e eletricidade e deve ser
muito bem ventilado e iluminado. A palavra laboratrio provm da unio de duas
palavras latinas: labor = trabalho + oratorium = lugar de reflexo. Assim, o laboratrio
um local de muito trabalho e muita concentrao. Um laboratrio pode tornar-se um
lugar muito perigoso, devido ao uso inadequado dos materiais e equipamentos nele
existentes. Por isso, importante que se conhea algumas normas de segurana. A
maior parte dos acidentes que podem ocorrer em um laboratrio provocada pelo
desconhecimento das seguintes regras bsicas de segurana:
a) no colocar livros, sacolas, ferramentas, etc., sobre as bancadas ou bancos;
b) no comer, beber ou fumar; lave bem as mos ao deixar o recinto.
c) no correr; manter os acessos desimpedidos;
d) manter o local sempre limpo e organizado;
e) fechar gavetas e armrios logo aps o uso.
f) usar sempre um avental (jaleco) longo e de mangas longas, feito de algodo, pois
fibras sintticas so altamente inflamveis. No use saias, bermudas ou calados
abertos. Pessoas que tenham cabelos longos devem mant-los presos enquanto
estiverem no laboratrio. Quando for necessrio proteger os olhos, conveniente usar
culos de proteo. Para proteo das mos, ao trabalhar com produtos corrosivos,
devem-se usar luvas de borracha.
muito perigoso o manuseio de alguns produtos qumicos, como inflamveis
(ter, lcool), cancergenos (benzeno), txicos (amnia) e venenosos (cianeto de
potssio, sulfato cprico). Para alertar as pessoas que trabalham nos laboratrios,
conveniente que os produtos contenham smbolos de identificao que seguem
normas mundiais. O manuseio de produtos qumicos deve ser sempre muito cuidadoso
e, para maior segurana, devem-se seguir algumas regras:
a) no pegue produtos qumicos com as mos;

b) utilize uma esptula limpa para retirar produtos qumicos slidos dos frascos; lave a
esptula e guarde-a imediatamente aps utiliz-la; retirar dos frascos apenas a
quantidade exata de reagente que ir utilizar; feche os frascos imediatamente aps o
uso; cuide para no trocar as rolhas dos frascos dos reagentes.;
c) no prove o "sabor" de nenhum produto qumico, a no ser que haja orientao
para isso;
d) Feche com cuidado as torneiras de gs, evitando o seu escapamento.
e) No deixe o bico de Bunsen acesso com a chama forte, quando no estiver em uso.
f) No trabalhar com substncias inflamveis prximo a bico de gs aceso.
g) Certificar-se que a pipeta que est limpa, antes de utiliz-la; Nunca pipete lquidos
com a boca. Para a suco de lquidos utilize bulbos de borracha.
h) no pegue com as mos equipamentos ou vidrarias que foram submetidos a um
aquecimento e que ainda podem estar quentes; caso isto seja necessrio, o faa com
luvas de isolamento trmico.
i) no use aparelhos de vidro quebrados ou rachados;
j) limpe quaisquer respingos imediatamente, caso ocorram;
l) lave as mos logo aps cada experincia;
m) em caso de acidentes, procure o responsvel pelo laboratrio.
n) Limpe seu local de trabalho ao finalizar a prtica.
o) Ao ser designado para trabalhar em um determinado laboratrio, imprescindvel o
conhecimento da localizao dos acessrios de segurana.
Acessrios de segurana
Quando estiver trabalhando em
um laboratrio, voc deve:
1. Localizar os extintores de
incndio e, verificar a que tipo
pertencem e que tipo de fogo podem
apagar.
2. Localizar as sadas de
emergncia.
3. Localizar a caixa de primeiros
socorros a verificar os tipos de
medicamentos
existentes a sua utilizao.
4. Localizar a chave geral de
eletricidade do laboratrio e aprender
a deslig-la.
5. Localizar o cobertor antifogo.
6. Localizar o lava-olhos mais
prximo a verificar se est funcionando
Adequadamente.
7. Localizar o chuveiro a verificar se
este est funcionando adequadamente.

ACIDENTES

Qualquer acidente dever ser comunicado imediatamente ao professor, que

orientar o melhor procedimento para resolver o problema. Os acidentes mais comuns
esto listados abaixo, acompanhados da melhor forma como encaminha-los:
1. Corte ou ferimento, mesmo leve, dever ser lavado a desinfetado.
2. Queimadura pequena, produzida por fogo ou material quente, dever ser
tratada com pomada apropriada (picrato de butesin), com vaselina ou com cido
pcrico.
3. Queimadura com cidos dever ser lavada com muita gua e em seguida
com soluo diluda de bicarbonato de sdio.
4. Queimadura com lcali (bases) dever ser lavada com muita gua e em
seguida com soluo diluda de acido actico (vinagre).
5. Ingesto de cidos - tomar leite de magnsia e procurar um mdico.
6. Intoxicao com gases ou vapores - respirar profundamente ao ar livre e
procurar um mdico.
7. Em qualquer situao, PROCURE MANTER A CALMA.

EQUIPAMENTOS BSICOS DE LABORATRIO

As atividades de laboratrio exigem por parte dos alunos e professores no s
o conhecimento das peas e aparelhos utilizados como tambm o emprego correto de
cada um deles. Portanto, antes de mais nada, necessrio que se observe bem cada
uma das peas, memorize sua forma e conhea sua utilidade.
Apresentamos a seguir o desenho e a funo dos equipamentos mais utilizados no
curso de bioqumica:
1) Tubo de ensaio: utilizado
principalmente para efetuar reaes
qumicas em pequena
escala.

2) Pipeta: equipamento calibrado para

medida precisa de volume de lquidos.
Existem dois tipos de pipeta: pipeta
graduada e volumtrica. A primeira
utilizada para escoar volumes variveis
e a segunda para escoar volumes fixos
de lquidos.

3) Erlenmeyer: frasco utilizado para

aquecer lquidos ou para efetuar
titulaes.

4) Bquer ou Becher: recipiente com

ou sem graduao, utilizado para o
preparo de solues, aquecimento de
lquidos, dissolues de substncias e
medidas grosseiras de volume.

5) Cilindro graduado ou proveta: frasco

com graduaes, destinado a medidas
aproximadas de volume de lquidos.

6) Balo volumtrico: So usados para

medir com preciso um determinado
volume de lquido. Cada um desses
bales apresenta uma graduao
definida.

7) Almofariz e pistilo: Utilizados para a

triturao de diferentes materiais.

8) Basto de vidro: usado para agitao

e transferncia de lquidos.

9) Suporte ou estante: para tubos de

ensaio

10) Pina de madeira: utilizada para

segurar tubos de ensaio,
principalmente durante o aquecimento.

11) Kitasato: utilizado no processo de

filtrao a vcuo.

12) Suporte universal: usado para

sustentao de peas.

13) Argola: usada como suporte para

funil de vidro ou tela metlica. Prendese ao suporte atravs de uma mufa.

14) Mufa: usada para prender outras

peas ao suporte.

15) Funil: utilizado para transferncia

de lquidos de um frasco para outro ou
para efetuar filtraes simples.

16) Funil de Bchner: Acoplado ao

kitasato e provido de papel de filtro,
utilizado em filtraes a vcuo.

17) Garra: presa ao suporte atravs da

mufa: serve pare segurar vrias outras
peas.

18) Pr-pipete, pra, embolo de

borracha.

19) 1. Bico de Bunsen: fonte de calor

destinada ao aquecimento de materiais

no inflamveis. 2. Tela de amianto:

tela metlica contendo amianto,

utilizada para distribuir uniformemente

o calor durante o aquecimento de
recipientes de vidro. 3. Trip: Usado
como suporte, principalmente de telas
de amianto.

20) Placa de aquecimento e agitao:

Utilizada para aquecimento e/ou
agitao de lquidos.

21) Esptula: usada comumente para

transferir slidos de pequenas
quantidades.
22) Pipeta Pasteur: usada
comumente para transferir lquidos de
pequenas quantidades.

23) Pipetador automtico: usado

comumente para transferir de forma
precisa, volumes pequenos de lquidos.

24) Centrfuga: Utilizada para

separao de substncias baseadas em
sua densidade.

25) Pissete: Utilizado para armazenar

diferentes lquidos.

MEDIDAS DE VOLUME:
Nas aulas prticas do curso de bioqumica os equipamentos mais utilizados para
medidas de volume de lquidos so: pipeta e proveta. Em qualquer dos equipamentos,
a medida de volume feita comparando-se o nvel do liquido com os traos marcados
na superfcie dos recipientes. A leitura do nvel dos lquidos transparentes deve ser
feita na parte inferior do menisco, estando a linha de viso do observador
perpendicular escala graduada, para evitar erro.

TCNICA DE UTILIZAO DE PIPETAS:

As pipetas so equipamentos que fornecem medidas precisas de volume, a 20 C, e so
utilizadas para lquidos no txicos, no volteis e no corrosivos. Nunca pipete um
lquido com a boca!!! Existem equipamentos (bulbos de borracha) que auxiliam na
transferncia de lquidos com a pipeta.

Universidade Estcio de S
Aluno (a):

Curso:

Disciplina: SDE 0024 Bioqumica

Data: ___/___/___

AULA 2 Esta aula atende aos objetivos do

Plano de Aula 257203 (semana 3) da disciplina

Perodo:

REAO DA NINHIDRINA
Propriedades e Identificao de Aminocidos
A ninhidrina (2,2-diidroxi-hidrindeno-1,3-diona) um produto qumico utilizado para a
deteco e quantificao de aminas primrias, particularmente de aminocidos.
Aminocidos quando so aquecidos com ninhidrina reagem e geram um produto de
cor azul escura ou roxa, conhecida como prpura de Ruhemann. A prolina, que tem
grupo amino substitudo (grupo imino) forma um produto de cor amarela. Protenas e
peptdeos do tambm, teste positivo quando submetidos s mesmas condies.

Materiais e Mtodos
Materiais:
1.
2.
3.
4.
5.

Soluo de Ninhidrina
Soluo de Alanina
Soluo de Prolina
Salina Fisiolgica
Banho Maria, tubos de ensaio e pipetas

Procedimentos:

Em trs tubos de ensaio marcados (A), (B) e (Branco), colocar:

1.
2.
3.
4.
5.
6.

Colocar nos trs tubos - 2,0 ml da soluo de ninhidrina

Em (A) - 2,0 ml da soluo de alanina;
Em (B) - 2,0 ml da soluo de prolina;
Em (Branco) 2,0 ml da salina fisiolgica (NaCL 0,8%)
Colocar os trs tubos em banho fervente durante 5 minutos
Comparar os trs tubos e anotar e explicar os resultados

Universidade Estcio de S
Aluno (a):

Curso:

Disciplina: SDE 0024 Bioqumica

Data: ___/___/___

AULA 3 Esta aula atende aos objetivos do

Plano de Aula 257203 (semana 3) da disciplina

Perodo:

MTODO DO BIURETO
Propriedades e Identificao de Protenas
Existem numerosos mtodos na literatura que se prestam para a dosagem de
protenas em materiais biolgicos, sendo que a convenincia de utilizao de cada um
deles deve ser avaliada para cada amostra em questo. Citaremos aqui apenas o
mtodo de biureto o qual simples e bastante utilizados nas dosagens de rotina.
Reao do Biureto
O Biureto o composto formado pelo aquecimento da uria 180C.

Quando o Biureto colocado em presena de CuSO4 em soluo alcalina, obtm-se um

composto de colorao azul:

Este mesmo tipo de reao colorida ocorre com:

Substncias que contenham duas carbonilas ligadas diretamente ou atravs de
um tomo de nitrognio ou carbono.
Peptdios que contenham no mnimo duas ligaes peptdicas
Protenas em geral.

A formao de complexos corados em presena de CuSO4 em soluo alcalina

conservou o nome de Reao de Biureto.
bem verdade que, dependendo da complexidade da protena e do peptdeo em
questo, a cor do produto de reao na presena do reagente do Biureto varia
substancialmente: protenas do colorao violeta, peptdeos do colorao rosa. As
estruturas cristalinas dos compostos formados so complexas, sendo que algumas j
foram identificadas. Nas protenas, acredita-se que haja a formao de um complexo
de coordenao dos ons cpricos com os eltrons desemparelhados do nitrognio da
ligao peptdica.
A reao do Biureto pode ser utilizada para demonstrar a presena de protenas em
materiais biolgicos, como tambm para quantific-las, uma vez que o complexo Cuprotena apresenta uma absoro mxima a 545 nm; a intensidade da cor depende
exclusivamente da concentrao de protena, j que as ligaes peptdicas aparecem
com a mesma freqncia por grama do material a ser analisado. Apesar de no ser um
teste muito sensvel (1 a 10 mg de protena), a reao do Biureto largamente
utilizada em dosagens rotineiras, pois est menos sujeita a interferncia de
contaminantes normalmente presentes nas amostras biolgicas.
Materiais necessrios
Carne de frango, bovina e clara de ovo
Soluo salina (NaCl 0,9%), 500 mL
Reagente de Biureto
Soluo de alanina
Almofariz e pistilo
Funil, estante e papel de filtro
03 Bequers com capacidade volumtrica de 250mL e 03 Beckers com capacidade
volumtrica de 100mL
03 tubos de ensaio
01 pipeta graduada de 5 mL, 03 pipetas graduadas de 1 mL e 04 pr-pipetes
Estante para tubos de ensaio com nove tubos de capacidade volumtrica de cerca de
15mL.
Procedimentos
-PREPARO DO BIURETO
Para preparar o reativo de biureto, dissolver seqencialmente em gua quente, 6,0g
.

de tartarato duplo de Na e K 4H2O; 1,5g de CuSO4 5H2O; 1,25g de KI e 30g de NaOH.

Esperar esfriar e completar o volume at 1000 mL com gua destilada. Obs. Soluo
preparada previamente
- PREPAO DAS SOLUES DE PROTENAS
Pesar 5g de carne de frango, carne de boi e clara de ovo.

 Macerar a carne de boi e de frango em almofariz e pistilo.

Solubilizar este material em 100 mL de soluo salina (NaCl 0,9%) separadamente,
para criar a soluo de ovo, de carne de boi e de frango
Filtrar e coletar, as respectivas solues, em beckers de capacidade volumtrica de
250 mL.
-TCNICA DO BIURETO
. Em 03 tubos de ensaio marcados (A), (B) e (Branco), colocar:
- nos 03 tubos 1,0ml do reagente de Biureto
Em (A) 1,0 ml de alanina
Em (B) 1,0 ml de soluo de protenas (escolha uma delas)
Em (branco) 1,0ml de salina fisiolgica
Agite e compare a intensidade da cor violcea entre os tubos e, tire as suas
concluses.

Universidade Estcio de S
Aluno (a):

Curso:

Disciplina: SDE 0024 Bioqumica

Data: ___/___/___

AULA 4 Esta aula atende aos objetivos do

Plano de Aula 257205 (semana 5) da disciplina

Perodo:

PROPRIEDADES PROTICAS - DESNATURAO DE PROTENAS

A maior parte das protenas em seu estado nativo apresenta-se dobrada em
estruturas tridimensionais definidas. Umas tm a estrutura compacta e globular como
a mioglobina, ribonuclease, lisosima; noutras, a estrutura nativa do tipo basto (ex.
queratina) e ainda em outras a estrutura consiste de pores bastes e globulares
como o caso da miosina. A desnaturao seria ento uma mudana na estrutura
original ordenada nativa sem alterao da sequncia de aminocidos, isto , sem
alterao da estrutura primria da protena. A extenso desta mudana no sempre
bem definida. O conceito de desnaturao, portanto, no absoluto e aplicvel
apenas a protenas cuja estrutura nativa seja ordenada. A desnaturao pode ser
causada por uma srie de agentes fsicos (ex: temperatura) e agentes qumicos (ex:
cidos e bases fortes, solues concentradas de uria, sais de guanidina, de salicilato,
de picrato e detergentes). O grau de mudana que cada um desses agentes pode
causar na conformao da protena pode ser diferente para as diferentes protenas. A
conformao especfica e ativa de uma protena o resultado de um grande nmero
de interaes que tm uma natureza cooperativa. Quando as condies do meio se
alteram de modo que, em certos locais da molcula, algumas dessas interaes fiquem
debilitadas ou mesmo desapaream pode, como consequncia, ocorrer modificao de
uma grande parte da estrutura. A desnaturao pode ser ou no um processo
reversvel; tudo vai depender do grau de alterao que ocorreu na estrutura da
protena. Certos tipos de alteraes, como por exemplo, ruptura de ligaes
covalentes (por exemplo S-S) so consideradas como um processo irreversvel.
No se pode estabelecer ainda com preciso os mecanismos de atuao dos
diferentes agentes desnaturantes, mas simplificadamente estes poderiam ser
explicados da seguinte maneira:
Temperatura
O efeito da temperatura seria promover a destruio de pontes de hidrognio e
interaes hidrofbicos o que levaria a um desenovelamento da molcula; em geral,
h coagulao da protena. A coagulao e precipitao por aquecimento o meio
mais comum de desproteinizar fluidos biolgicos e extratos de tecidos. No entanto, a
coagulao um fenmeno secundrio desnaturao j que depende tambm de
fatores como pH, fora inica, constante dieltrica do meio e da natureza dos ons
presentes. A coagulao trmica ocorre bem prximo ao pI e o resultado da
agregao molecular que acontece devido exposio (ao meio externo) de grupos
hidrofbicos e SH que estavam mascarados na estrutura nativa.
cidos e bases fortes

O tratamento com cidos e bases fortes leva alterao da carga lquida da

protena. Em determinados valores de pH onde haja excesso de cargas positivas ou
negativas, as repulses coulombianas correspondentes concorrem para desestabilizar
a estrutura compacta da protena. A conformao nativa das protenas estvel
apenas numa faixa estreita de valores de pH.
Solventes orgnicos
A ao desses solventes vai depender da sua maior ou menor polaridade e, portanto,
da sua capacidade de interagir com certos grupos laterais das protenas (atravs de
pontes de hidrognio ou promovendo ruptura de ligaes hidrofbicas). O efeito
desnaturante desses solventes pode ser diminudo utilizando-se temperaturas baixas,
o que no entanto favorece a insolubilidade da molcula protica; essa uma das
tcnicas usadas na precipitao de protenas.

Materiais necessrios
Solues de carne de frango, bovina e clara de ovo
Soluo salina (NaCl 0,9%)
Tubos de ensaio e estante para tubos
Pipetas graduadas com pras ou pipetadores automticos
Banho-Maria
Solues de NaOH (base forte), HCl (cido forte) e TCA ( cido fraco), todas estas em
uma concentrao de 1,0N.
Solventes acetona, ter e etanol.
Procedimentos
Identifique 8 tubos de ensaio e pipete 2ml de soluo de protenas (escolher uma
delas) em cada tubo.
Coloque o primeiro tubo em banho-Maria fervente por 5 minutos (desnaturao
trmica).
Adicione 2 ml das seguintes substncias aos seguintes tubos:
Tubo 2 soluo de NaOH
Tubo 3 soluo de HCl
Tubo 4 soluo de TCA
Tubo 5 acetona
Tubo 6 ter
Tubo 7 etanol
Tubo 8 salina fisiolgica (controle)
Observe durante este procedimento, a ocorrncia de possveis alteraes nas solues
de protenas e conclua.

Universidade Estcio de S
Aluno (a):

Curso:

Disciplina: SDE 0024 Bioqumica

Data: ___/___/___

AULA 5 Esta aula atende aos objetivos do

Plano de Aula 257205 (semana 5) da disciplina

Perodo:

PROPRIEDADES DAS PROTENAS SALTING IN / SALTING OUT

Materiais usados:
Soluo salina rica em protena de clara de ovo
Soluo saturada de sulfato de amnio (SAS)
Reagente de Biureto
Tubos de ensaio e estante
Pipetas graduadas ou pipetadores automticos
Centrfuga
Metodologia:
- Salting out
Em um tubo de centrfuga adicione 2ml de soluo de clara de ovo e 2ml de soluo saturada
de sulfato de amnio.
Centrifugue por 10 minutos na velocidade mxima.
- Salting in
Retire o sobrenadante com cuidado e descarte. Ao precipitado adicione 4ml de gua destilada
e agite. Anote as observaes.

Caso no ocorra solubilizao, lave novamente com salina, descarte o sobrenadante e

adicione novamente 4,0 ml de salina ao precipitado.
Ao sobrenadante, faa o teste do biureto. Anote suas observaes.

Universidade Estcio de S
Aluno (a):

Curso:

Disciplina: SDE 0024 Bioqumica

Data: ___/___/___

AULA 6 Esta aula atende aos objetivos do

Plano de Aula 257205 (semana 5) da disciplina

Perodo:

CINTICA ENZIMTICA EFEITO DO pH NA ATIVIDADE ENZIMTICA DA AMILASE

SALIVAR
- -Amilase Salivar (EC 3.2.1.1) uma protena globular de 58 kDa, presente na saliva
humana. uma enzima que hidrolisa ligaes do tipo 1-4 de carboidratos, como as
encontradas no amido, na dextrina e no glicognio.

(A)

(B)

Figura 1: (A) estrutura simplificada das ligaes qumicas que ocorrem no amido 1. (B) estrutura da amilase salivar humana: a imagem est disponvel na pgina do Protein Data Bank, da estrutura
1SMD.pdb.

Materiais
4 biscoitos cream-cracker
Saliva
Soluo de Iodo
gua
Vinagre
Bicarbonato de sdio*
4 placas de Petri
4 pipetas Pasteur
Almofariz (ou garrafa e saco plstico)
4 Mexedores de caf
1 cronmetro
1

Disponvel em: http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/spring2010/Webb/a-amylase.htm

*Soluo de bicarbonato de sdio: adicione 1 colher de caf de NaHCO3 em 10 mL de gua, misture,

deixe decantar e utilize a soluo.

Procedimentos
1. Identifique as placas de Petri de acordo com a condio experimental: controle,
gua, vinagre e bicarbonato.
2. Triture 1 biscoito com o almofariz e deposite na placa identificada como
controle.
3. Mastigue 1 biscoito e deposite em uma das placas, com cuidado para que se forma
uma massa homognea a mida; repita o procedimento com outros dois biscoitos.
4. Adicione gua na amostra de biscoito triturado (controle), aos poucos, at obter
uma pasta de consistncia semelhante dos biscoitos que foram mastigados.
Anote o tempo do cronmetro.
5. Em cada placa, adicione 1 mL de: (a) gua (b) vinagre e (c) soluo de bicarbonato
de sdio e misture bem.
6.

Aps 30 min, pingue de 3 a 5 gotas de soluo de iodo e anote a cor .

Universidade Estcio de S
Aluno (a):

Curso:

Disciplina: SDE 0024 Bioqumica

Data: ___/___/___

AULA 7 Esta aula atende aos objetivos do

Plano de Aula 257205 (semana 5) da disciplina

Perodo:

CINTICA ENZIMTICA EFEITO DA TEMPERATURA NA ATIVIDADE ENZIMTICA DA

BROMELINA teste de estabilidade trmica

- Bromelina (EC: 3.4.22.32 ) uma protena globular de 33,2 kDa. uma protease de
cistena presente no suco de abacaxi que hidrolisa ligaes peptdicas, com preferncia
para clivagem de ligaes peptdicas formadas por Arginina e Lisina, mas podendo
hidrolisar ligaes formadas por Alanina, Tirosina e Glicina.
(A)

(B)

Figura 2: (A) Representao esquemtica da hidrlise de uma ligao peptdica 2. (B) estrutura da
Bromelina obtida por modelagem molecular (1w0q.pdb). A figura foi obtida pelo programa de
visualizao de protenas PyMol.

Materiais
1 pacote de gelatina sem sabor
700 mL de gua
10 mL de Suco de abacaxi
10 tubos de ensaio
Bquer (250 mL)
Caneta de retroprojetor
Estante para tubos
1 pregador para tubos
Proveta de 10 mL
Pipeta de 2 mL
1 cronmetro ou relgio
2

Disponvel em: http://www.studyblue.com/notes/note/n/vi-mechanisms-of-enzyme-action/deck/1815715

Bico de Bunsen ou placa de aquecimento

Banho-maria
Geladeira
Procedimentos
1. Prepare a gelatina sem sabor: Dissolva um pacote de gelatina sem sabor em 250 mL
de gua fervente. Aps dissolver a gelatina adicione 250 mL de gua gelada.
2. Numere os tubos de ensaio, colocando a letra C para o controle e a letra E para as
amostras que tero enzima:
1C e 1E; 2C e 2E; . 3C e 3E; . 4C e 4E; . 5C e 5E.
3. Coloque 2 mL de gua nos tubos com letra C (controle) e 2 mL de suco de abacaxi
nos tubos com letra E (enzima).
4. Os tubos sero mantidos em diferentes temperaturas por 15 minutos, de acordo
com a tabela abaixo:

Tubos de
ensaio
1C
1E
2C
2E
3C
3E
5C*

Contedo

Tratamento 15 minutos

gua
Suco de abacaxi
gua
Suco de abacaxi
gua
Suco de abacaxi
gua

5E*

Suco de abacaxi

Geladeira (8 C)
Geladeira (8 C)
Temperatura ambiente (25 C)
Temperatura ambiente (25 C)
Banho-maria (45 C)
Banho-maria (45 C)
Ferver em banho-maria (100
C)*
Ferver em banho-maria (100
C)*

* RETIRE OS TUBOS DEPOIS DO AQUECIMENTO UTILIZANDO GARRAS/PREGADORES

PARA TUBOS DE ENSAIO!!
No ferva o suco dos tubos 5C e 5E, deixe num banho-maria com gua fervente (use
bico de Bunsen ou placa de aquecimento):
- ferva a gua (100 mL de gua no bquer de 250 mL)
- coloque os tubos 5C e 5E no bquer
- mantenha os tubos na gua fervente por 5 minutos.
5. Aps os 15 min de permanncia nas diferentes temperaturas deixe cada um dos
tubos em temperatura ambiente por 10 minutos.
6. Utilizando a proveta, coloque 10 mL de gelatina em cada tubo.
7. Agite, com cuidado, os tubos para que a gelatina se misture de forma homognea
soluo contida, inicialmente, no tubo.

8. Coloque os tubos no congelador e aguarde cerca de 20 min (o tempo ser o

necessrio para a amostra 1C endurecer!). Retire os tubos do congelador e observe o
aspecto da gelatina em cada tubo.

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Aluno (a):

Curso:

Disciplina: SDE 0024 Bioqumica

Data: ___/___/___

AULA 8 Esta aula atende aos objetivos do

Plano de Aula 257205 (semana 5) da disciplina

Perodo:

CINTICA ENZIMTICA EFEITO DA CONCENTRAO DE SUBSTRATO NA ATIVIDADE ENZIMTICA DA

BROMELINA.

Materiais
Leite em p
100 mL de gua destilada
3 mL de suco natural de abacaxi
Bquer (250 mL)
1 esptula para pesagem
6 placas de petri
Caneta de retroprojetor
6 Pazinhas de plstico pequenas
1 (ou 2) esptula(s) de plstico
Estante para tubos
1 proveta de 10 mL
1 pipeta de 1 mL
1 Cronmetro ou relgio
Balana

Procedimentos
1. Anote nas tampas das placas de petri as condies experimentais com os seguintes
cdigos: use nmeros para identificar a quantidade de leite utilizada (ver item 2) e a
letra C para as amostras Controle (onde ser adicionado apenas gua) e E para as
amostras que tero Enzimas (onde ser adicionado o suco de abacaxi):
6C e 6E

7C e 7E

8C e 8E

9C e 9E

10C e

10E
2. Utilizando as placas de petri, pese o leite em p: 6, 7, 8, 9 e 10 gramas nas
respectivas placas. As placas 6C e 6E contero 6 gramas de leite cada; 7C e 7E, tero 9
gramas, etc.
3. Com o auxlio de uma proveta, coloque 9 mL de gua em cada placa. Misture bem,
com cuidado para no derramar o leite ou a gua, utilizando a esptula de plstico, at

que se forme uma massa homognea. Tampe a placa. Ateno: As placas devem ficar
tampadas durante todas as etapas do experimento.
4. Adicione 1 mL de gua nas placas identificadas como controle (C) e misture bem.
Acione o cronmetro na primeira adio e anote o tempo no qual foi feita cada adio.
5. Adicione 1 mL de suco de abacaxi nas placas identificadas como enzimas (E), misture
bem e anote o tempo de cada adio.
6. A cada 5 minutos, passe a pazinha de plstico pequena no fundo de cada uma das
placas e observe a consistncia do leite. Se voc perceber que a linha de separao
feita no meio da placa demora a voltar a fechar, passe a medir o tempo a cada 1
minuto!
7. Quando formar uma canaleta na massa de leite, que no retorna sua posio
inicial, vamos considerar como o fim da reao. Anote o tempo necessrio para isso
ocorrer em cada uma das placas. Ateno: o padro de separao da massa deve ser o
mesmo para todas as amostras.
No possvel determinar a quantidade de produto formado na reao, mas se
considerarmos um mesmo padro para o final da reao, podemos dizer que a
quantidade de produto muito semelhante nas diferentes condies e pode ser
considerado como igual para fins de clculo de velocidade de reao.
- Anote o tempo de reao para cada amostra em uma tabela.
- Calcule a velocidade de reao como sendo o inverso do tempo (1/tempo).
- Faa um grfico da velocidade de reao em funo da concentrao de substrato.
Concentrao de Substrato (g)

Tempo de reao (min)

Velocidade da reao (1/min)

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Aluno (a):

Curso:

Disciplina: SDE 0024 Bioqumica

Data: ___/___/___

AULA 9 Esta aula atende aos objetivos do

Plano de Aula 257207 (semana 7) da disciplina

Perodo:

IDENTIFICAO DE CARBOIDRATOS BENEDICT, SELIWANOFF E LUGOL

Diferentemente dos aminocidos que apresentam reaes especficas baseadas
principalmente na natureza qumica de seu radical R, os glicdios apresentam
estruturas muito parecidas entre si o que torna quase impossvel identific-los de per
se. Neste caso, o que se faz caracterizar grupos de glicdios utilizando suas
propriedades qumicas comuns.
As reaes utilizadas nesta prtica esto baseadas principalmente em 2 dessas
propriedades:
Desidratao de glicdios em presena de cidos minerais fortes
Poder redutor
1) Desidratao de glicdios em presena de cidos minerais fortes
Hexoses e pentoses colocadas nestas condies so desidratadas, respectivamente a
hidroximetilfurfural e furfural; esses compostos so capazes de se condensar com
substncias fenlicas, com aminas aromticas, tiocompostos, uria, etc. Os complexos
formados so, algumas vezes, coloridos a utilizados para a caracterizao de certos
grupos glicdicos.
Neste caso, situam-se: Reao de Seliwanoff e reao de Bial.
Reao de Seliwanoff
Teste de diferenciao entre aldoses e cetoses.
A reao feita com resorcinol em meio cido (HCl), quente. As cetohexoses do um
produto de colorao vermelha que se desenvolve rapidamente; as aldohexoses
correspondentes reagem mais lentamente. Durante o tempo em que as cetohexoses
so desidratadas e reagem com o resorcinol fornecendo o produto, as aldohexoses
fornecem apenas um produto de cor rosa plido.

2) Poder Redutor
Os acares contm grupos aldedos a cetonas capazes de reduzir sais de metais
pesados; desses so mais usados os sais de Cu2+
. O princpio fundamental de todos os procedimentos analticos que utilizam Cu 2+
sua dissoluo em meio alcalino, em presena de cidos orgnicos - como o cido
ctrico e o cido tartrico - capazes de formar complexos. Tambm podem ser
empregados outros cidos orgnicos como EDTA, cido ltico, cido trihidroxiglutrico
ou um cido sacrico. cidos sacricos so os produtos da oxidao da carbonila
aldedica e do grupamento lcool primrio dos glicdios, sendo portanto cidos
dicarboxlicos. A reao de formao do complexo ocorre, em geral, em meio
fortemente alcalino a isto promove profundas modificaes na estrutura do acar. Os
acares de per se apresentam poder redutor diferente sobre o on Cu 2+; isto significa
que dois tipos de hexoses, em uma mesma concentrao, fornecem quantidades
diferentes de xido cuproso (produto final da reduo). De qualquer forma, os
mtodos podem ser adaptados de modo a se tornarem reprodutveis e a haver
proporcionalidade entre a quantidade de Cu2O produzido e a concentrao de glicdio
presente dentro de um certo limite (ou certa faixa de concentraes). A quantidade de
ons cobre reduzida pelos diferentes glicdios funo do pH, da temperatura, da
concentrao e dos tipos de glicdios e ons orgnicos complexantes. H diversos
mtodos para a determinao do teor de Cu2O como, por exemplo, gravimetria e
colorimetria. No ltimo caso, o Cu2O formado dissolvido em excesso de reagente
como fosfomolibdato, fosfotungstato ou arsnio-molibdato, formando-se um
complexo de cor azul.
Este procedimento muito adequado para a verificao de glicdios em materiais
biolgicos.
Dentre os testes baseados no poder redutor dos glicdios, pode-se destacar os testes
de Trommer, Tollens, Benedict e de Barfoed modificado.

Teste de Benedict - O reagente consiste de uma soluo onde est presente o on Cu2+
(Cu (OH)2) em meio com Na2SO4. Na presena de um acar redutor e submetido a
alta temperatura o on Cu2+ (cprico) reduzido a on Cu+ (cuproso), formando assim
um precipitado de cor vermelho tijolo.
Cu (OH)2 + calor + acar redutor Cu2O (precipitado vermelho tijolo)
3) Identificao de polissacardeos
O iodo em soluo produz reao colorida com polissacardeos. Com o amido produz
cor azul e, com o glicognio produz cor vermelha.
Materiais
Tubos de ensaio e estante
Pipetas volumtricas ou pipetadores automticos
Banho-Maria
Solues de glicdeos 0,1M: glicose, sacarose e frutose
Soluo de amido 1,5%
Sucos de laranja e de banana
Reagentes de Seliwanoff, Benedit e Lugol
Procedimentos
Prepare 3 sries (uma para cada teste) de 8 tubos de ensaio.
- Teste de Seliwanoff
Pipete em cada um dos 8 tubos 0,5ml das seguintes amostras:
1- Glicose
5- Suco de laranja
2- Sacarose
6- Suco de banana
3- Frutose
7- gua (controle)
4- Amido
Adicione 2ml do reagente de Seliwanoff em todos os tubos.
Ferva em banho-Maria por 10min. Observe durante este procedimento, a ocorrncia
de possveis alteraes e anote os resultados.
- Teste de Benedict
Pipete em cada um dos 8 tubos 0,5ml das seguintes amostras:
1- Glicose
5- Suco de laranja
2- Sacarose
6- Suco de banana
3- Frutose
7- gua (controle)
4- Amido
Adicione 1ml do reagente de Benedict em todos os tubos.
Ferva em banho-Maria por 1min. Observe durante este procedimento, a ocorrncia de
possveis alteraes e anote os resultados.

- Teste do Lugol
Pipete em cada um dos 8 tubos 2ml das seguintes amostras:
1- Glicose
5- Suco de laranja
2- Sacarose
6- Suco de banana
3- Frutose
7- gua (controle)
4- Amido
Adicione 2 gotas do reagente de Lugol em todos os tubos e homogeneizar.
Observe durante este procedimento, a ocorrncia de possveis alteraes e anote os
resultados.

Universidade Estcio de S
Aluno (a):

Curso:

Disciplina: SDE 0024 Bioqumica

Data: ___/___/___

AULA 10 Esta aula atende aos objetivos do

Plano de Aula 257207 (semana 7) da disciplina

Perodo:

IDENTIFICAO DE ESTERIDES (LIPDEOS)

Os lipdeos, como substncias hidrofbicas, so solveis em solventes orgnicos
relativamente apolares (Clorofrmio, ter, lcool, acetato de etila, tetracloreto de
carbono, etc ou combinao destes). Na matria orgnica eles se depositam em
gotculas ou se adsorvem a molculas proticas ou polmeros glicdicos. Assim para sua
purificao e/ou identificao torna-se necessria a sua prvia extrao dos alimentos.
O colesterol na presena de cido sulfrico desidratado a colestadieno, o qual possui
cor vermelha (reao de Salkowski). Esta reao comum aos esterides que como o
colesterol possuem dupla ligao entre os carbonos 5 e 6 (exemplo ergosterol).

Materiais necessrios
1 ovo.
Soluo salina 100 mL.
02 Bequers com capacidade volumtrica de 100mL.
Funil e basto de vidro.
Proveta com capacidade volumtrica de 100mL.
ter etlico 100 mL.
Erlenmeyer com capacidade volumtrica de 100mL
Estante para tubos de ensaio e 03 tubos de ensaio.
Soluo concentrada de cido sulfrico (H2SO4).
Pipetas volumtricas ou pipetadores automticos
Pissete com gua destilada.
leo de soja e leo mineral.

Procedimentos - Reao de salkowski.

Preparo de extrato tereo de gema de ovo:
Diluir uma gema de ovo em becher de 100 mL com 10 mL de salina e misturar com o
auxlio de basto de vidro. Com a ajuda de um funil, transferir o contedo do becher
para uma proveta com capacidade volumtrica de 50 mL
Ainda com o auxlio do funil, completar o volume da proveta com ter etlico gelado.
Vedar a proveta e agitar vigorosamente (10 segundos).
Deixar descansar por cerca de 30 minutos.
Identifique 3 tubos de ensaio.
Em cada tubo pipete 1ml das seguintes amostras:
1- Extrato etreo de gema
2- leo de soja
3- leo mineral
Inclinar o tubo e adicionar VAGAROSAMENTE pela parede interna do tubo 0,5 mL de
cido sulfrico concentrado (H2SO4). O aparecimento de um disco avermelhado na
interfase cido/ter ou nos leos indicativo da presena de colesterol ou outros
esteroides.

Universidade Estcio de S
Aluno (a):

Curso:

Disciplina: SDE 0024 Bioqumica

Data: ___/___/___

AULA 11 Esta aula atende aos objetivos do

Plano de Aula 257195 (semana 10) da
disciplina

Perodo:

FERMENTAO ALCOLICA
Materiais usados:
Levedura (fermento)
Sacarose
2 Banho-Maria (a 40C e fervente)
Reagente de Seliwanoff
Tubos de ensaio e estante
Tubo Falcon ou tubo de ensaio com tampa
Pipetas volumtricas ou pipetadores automticos
Balana, bcker e erlenmeyer
Procedimentos:
Prepare uma soluo de leveduras com 3g do fermento e 60ml de gua.
Prepare 100ml de soluo de sacarose 10%.
Prepare o Tubo de Fermentao: em um tubo grande e com tampa coloque 10ml da
soluo de leveduras e 5 ml da soluo de sacarose 10%. Complete com gua at
encher o tubo. Tampe e homogeneze.
Coloque o Tubo de Fermentao em Banho Maria a 40C.
Comece a marcar o tempo. No tempo 0 e a cada 15 minutos retire uma alquota de
cerca de 0,5ml do tubo de fermentao, coloque em um tubo de ensaio e ferva por
10min em Banho-Maria.
Dilua esta alquota 10x.
Retire uma alquota de 0,5ml, e dose o teor de carboidratos adicionando 2ml de
Reagente de Seliwanoff e fervendo por 10min em Banho-Maria.