INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

QUMICO FARMACUTICO INDUSTRIAL
*MTODOS DE ANLISIS E INSTRUMENTACIN ANALTICA*
PROFESORA: MARA AURORA GASCA RODRGUEZ
VALIDACIN DE LA DETERMINACIN DE ALCOHOLEMIA POR
CROMATOGRAFA

DE

GASES

CON

AUTOMUESTREADOR

DE

VOLTILES E IDENTIFICACIN DE ACETALDEHDO, ACETONA Y 2PROPANOL

EQUIPO NO.2
LPEZ HERNNDEZ ALEXA ISABEL
VZQUEZ MARTNEZ YAZMN MARIL
GRUPO: 6FM2

VALIDACIN DE LA DETERMINACIN DE ALCOHOLEMIA POR

CROMATOGRAFA DE GASES CON AUTOMUESTREADOR DE
VOLTILES E IDENTIFICACIN DE ACETALDEHDO, ACETONA Y 2PROPANOL
1.- INTRODUCCIN.
La prevalencia del consumo de alcohol en la poblacin colombiana, es un factor de
riesgo que incide negativamente en el orden pblico y privado, comnmente se
encuentra presente en delitos como la violencia intrafamiliar, sexuales, hurtos,
homicidios y en mayor nmero de casos en accidentes de trnsito. La determinacin de
la cantidad de alcohol ingerida por una o varias personas involucradas en un proceso
judicial por algn delito, es importante al momento de esclarecer el mismo. Entre los
anlisis forenses utilizados internacionalmente para determinar alcohol en humanos,
estn:

La determinacin de etanol expirado (Alcohol sensor), prueba poco confiable a

nivel cuantitativo
La determinacin de etanol en sangre total (Alcoholemia) por Cromatografa de
Gases. Que junto al examen clnico cuando se trata de personas vivas, pueden dar
una aproximacin del estado de embriaguez del delincuente o la vctima al
momento de ocurridos los hechos investigados.
La alcoholemia indica el nivel de etanol contenido en sangre total, expresado en
miligramos de etanol en 100 mililitros de sangre (mg Etanol/100mL de sangre o mg%).
Desde el punto de vista analtico, en el anlisis toxicolgico se debe contar con mtodos
analticos selectivos y sensitivos para la evaluacin cualitativa y cuantitativa de las
sustancias toxicas que conduzcan a una correcta interpretacin forense, teniendo en
cuenta que adems de esto una correcta interpretacin, se debe buscar resultados
confiables obtenidos bajo rigurosos controles de calidad. La cromatografa de gases HSGC/FID es la tcnica aceptada internacionalmente para el anlisis de alcoholemia. La
metodologa consiste en someter una muestra de sangre a calentamiento controlado,
tomar una muestra del vapor generado y hacer la determinacin en la columna
cromatogrfica en un cromatgrafo de gases.
Por otro lado, se entiende por validacin de un mtodo; como un proceso documentado
mediante el cual se demuestra que un procedimiento analtico es idneo y apropiado
para el propsito para el cual fue diseado. Tpicamente, los parmetros que se validan

en un mtodo analtico son: exactitud, precisin, especificidad, selectividad, linealidad,

lmite de deteccin y lmite de cuantificacin. Tambin, en el estudio de validacin se
evala la idoneidad del sistema que para mtodos cromatogrficos incluyen: el factor de
simetra, determinacin y estabilidad del tiempo de retencin de cada uno de los
analitos, la resolucin, el factor de capacidad y el nmero de platos tericos. Estos 11
parmetros permiten determinar la capacidad que tiene el sistema cromatogrfico de
arrojar resultados reproducibles cada vez que el mtodo sea aplicado. Se realiza un
anlisis estadstico para la interpretacin de los datos obtenidos, en un estudio de
validacin, la aplicacin de pruebas como anlisis de varianza (ANOVA), anlisis de
regresin lineal, aplicacin t-student, desviacin estndar y coeficiente de variacin, son
utilizadas para demostrar la validez del mtodo. La validacin de un mtodo analtico
permite conocer la confiabilidad del mismo para su aplicacin rutinaria y es fiable
cuando es capaz de conservar los parmetros que se han validado.
2.-OBJETIVO GENERAL.
Validar

la

Determinacin

de

alcoholemia

por

cromatografa

de

gases

con

automuestreador de voltiles e identificacin de acetaldehdo, acetona y 2- propanol en

el Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses de la ciudad de Pereira,
Colombia.
3.-METODOLOGA
La metodologa se establece con base en el procedimiento estandarizado de trabajo
(PET) de la Determinacin de Alcoholemia y metanol por cromatografa de gases con
Automuestreador de voltiles e identificacin de acetaldehdo, acetona y 2-propanol, que
se encuentra documentado en el Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias
Forenses de la ciudad de Pereira.
4.-MATERIALES Y MTODOS.
4.1 MATERIALES Y REACTIVOS.
REACTIVOS
Etanol Estndar Certificado Primario de las siguientes concentraciones: 25%, 40%,

100%, 150%, 300% y 400%.

Etanol Absoluto Grado Reactivo Analtico (R.A.)
Metanol R.A.
n-Propanol R.A.
Isopropanol R.A.

 Acetona R.A.
Acetaldehdo R.A.
Cloruro de sodio R.A.
Agua destilada y desionizada.
EQUIPOS
Cromatgrafo de gases con detector de ionizacin de llama (FID), (HP 6890)
Automuestreador de voltiles Head Space Thermo Triplus.
Sistema de manejo de informacin, estacin de datos cromatogrficos de canal simple
Chem Station HP
Columna capilar HP Blood Alcohol Anlisis 7.5 metros x 0.320 mm de dimetro interno.
Sistema de suministro de gases calidad cromatogrfica: nitrgeno, aire e hidrgeno.
Micropipeta de 100 L -1000 L, LABMATE
Balanza analtica con divisin de escala 0.0001g
MATERIAL DE LABORATORIO
Viales de vidrio de 10 mL de capacidad de dimensiones compatibles con el
Automuestreador de voltiles Head Space.
Septas para viales de polipropileno de 20 mm de dimetro.
Balones volumtricos de 50, 100 y 1000 mL
Pipetas volumtricas de 3, 5 y 10 mL
Puntas para micropipetas de capacidad para 100 y 1000uL
Vasos de precipitado de 50 mL
5.-PREPARACIN DE LA MUESTRA.

Cuando la muestra para anlisis de alcoholemia es sangre: Debe ser recogida en

un tubo tapa gris que contiene fluoruro de sodio como conservante y oxalato de
potasio como anticoagulante.
Cuando se trata de humor vtreo se recolecta en un tubo de vidrio o de plstico.
Colocar en un vial de 10 mL nuevo, 100 mg aproximadamente de cloruro de sodio
R.A.
Homogenizar la muestra de sangre total con agitacin manual suave.
Trasvasar 1 mL de sangre aproximadamente a cada vial.
Ubicar los viales en una gradilla sobre hielo seco.
Dispensar 100 L de estndar interno (n- propanol) y luego 200 L de sangre total
en un vial de 10 mL.
Colocar el tapn de polipropileno verificando la hermeticidad manualmente.
Cambiar la punta de micropipeta entre la medicin de cada muestra.
Agitar vigorosamente la muestra utilizando un vrtex durante aproximadamente 5
segundos

Almacenar bajo refrigeracin (Nevera 2 a 10C) hasta el momento de colocarlos

en el carrusel del Head Space para el anlisis.

6-.ANLISIS Y RESULTADOS.
La evaluacin de los parmetros de calidad fue realizada utilizando dos matrices:
Una matriz acuosa denominada sistema que se asemeja al humor vtreo, esto se hace

debido a que es muy difcil la recoleccin de un volumen suficiente de ste para la

preparacin de las soluciones de trabajo.
Una matriz de sangre llamada mtodo, en ella se evala la respuesta del anlisis en
una de las muestras biolgicas ms utilizadas para la elaboracin de dicha prueba.
6.1 REPETIBILIDAD PARA EL ESTNDAR INTERNO
El estndar interno se utiliza en cromatografa de gases con el fin de poder efectuar una
determinacin cuantitativa, ya que la cantidad de analito es proporcional a la intensidad
del pico, para ello se realiza una curva de calibracin con estndares de concentracin
conocida, cada muestra conteniendo el estndar, esta curva es una dependencia entre la
relacin de concentraciones y la relacin de reas (Analito / estndar interno), el
estndar garantiza una relacin constante de reas con los analitos presentes en la
muestra. Por esto se hace necesario inicialmente evaluar la repetibilidad que presenta el
estndar interno en cuanto a sus reas y en su tiempo de retencin. El estndar interno
n-Propanol, fue preparado el 24 de Junio de 2010. En la tabla no.1 se observa que 21
das despus de su preparacin el estndar presenta una buena repetibilidad, ya que, su
desviacin estndar relativa no supera el 5%.
Tabla no.1 Datos de repetibilidad para el estndar interno a los 21 das de su
preparacin.

7. VALIDACIN.
IDONEIDAD
DEL
CROMATOGRAFICO

SISTEMA

La idoneidad se
establece cuando
la seal producida
en la etapa de
medicin
puede
ser
atribuida
nicamente
al
analito y no a la
presencia de algo
similar
o
la
coincidencia. Se establecen entonces el tiempo de retencin del analito (tr), el
coeficiente de capacidad (k), simetra, y resolucin (R). Estos parmetros se evalan
usando el nivel 3 de la curva de calibracin secundaria el cual contiene la totalidad de
los analitos estudiados. El cromatgrafo de gases fue operado en las condiciones que se
describen en la Tabla no. 2.

Tabla no.2: Condiciones cromatogrficas para la validacin del mtodo.

IDONEIDAD
DEL
CROMATGRAFICO Y

SISTEMA
ESPECIFICAD

Para determinar la
idoneidad
y
especificidad
del
sistema
cromatogrfico
se
realiz un anlisis
de
estadstica
extendida sobre un
cromatograma correspondiente al nivel 3 de la curva (mostrado en la figura 1), ya que en l se
presentan todos los analitos de inters, los datos presentados en la Tabla no. 3 son un promedio
de los valores reportados en el anexo 1 que son extrados directamente del equipo.

Tabla no.3 Parmetros cromatogrficos para los analitos estudiados.

En la Tabla no. 3, se puede observar que los tiempos de retencin para cada analito presentan
coeficiente de variacin inferior a 0.035%. El factor de capacidad tiene un rango de aceptacin
entre 2 y 10, rango que se cumple para todos los analitos excepto para el n-propanol aunque no
se considera significativo, ya que excede muy poco el rango. Para todos los analitos se cumple
que la simetra es menor de 1, lo que indica que no existen colas en los picos cromatogrficos.
Se muestra que el nmero de platos tericos es significativamente alto, en pruebas anteriores
con una columna desgastada se present el traslape de los picos de acetaldehdo y metanol,
caracterstica que puede servir como un indicador de deterioro de la columna. En cuanto a la
resolucin se sabe que lo ideal es que sea mayor de 2, criterio que aceptan todos los analitos,
para el metanol no aplica la resolucin, ya que es el primer pico que se encuentra despus del
tiempo muerto. Segn estos resultados se puede considerar que el sistema cromatogrfico es
idneo y especifico.
SELECTIVIDAD.
Se realizaron corridas de cada analito por separado y de algunos solventes voltiles para
verificar los tiempos de retencin y determinar posibles interferencias.
Tabla no.4. Parmetros y criterios de selectividad.

Tabla no.5.
retencin de

Tiempos de
los analitos de
inters.

*Cada dato corresponde al

promedio de tres mediciones.

Tabla no.6: Tiempos de retencin para los solventes estudiados.

De la tabla anterior se
determina que no se present
ninguna interferencia entre
los analitos de inters y
analitos voltiles como acetonitrilo, alcohol isoamlico, n-butanol, hexano, tolueno y
acetato de etilo. Para garantizar que no se traslapaba el pico del acetonitrilo, que fue el
nico solvente que mostr respuesta a un tiempo de retencin de 1.73 se realiz una
sobreposicin del cromatograma de este solvente con un cromatograma del etanol,
como se muestra en la Figura no. 2. (El pico azul corresponde al etanol y el rojo es el
correspondiente al acetonitrilo.

8.-CONCLUSIONES.

Se valid el mtodo a las condiciones indicadas del Head Space y Cromatgrafo de

Gases con detector de ionizacin de llama HS/GC/FID HP 6890 con la columna
capilar HP Blood Alcohol Anlisis 7.5 metros x 0.320 mm de dimetro interno. De
manera isotrmica.
En la Tabla no. 3, se puede observar que los tiempos de retencin para cada
analito presentan coeficiente de variacin inferior a 0,035%.
Para todos los analitos se cumple que la simetra es menor de 1, lo que indica que
no existen colas en los picos cromatogrficos.
Segn estos resultados se puede considerar que el sistema cromatogrfico es
idneo y especifico.
Se considera que el sistema cromatogrfico es selectivo.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.
HENAO BETANCUR L., VACA DUQUE E. 2010. VALIDACIN DE LA DETERMINACIN DE
ALCOHOLEMIA Y METANOL POR CROMATOGRAFA DE GASES CON AUTOMUESTREADOR DE
VOLTILES E IDENTIFICACIN DE ACETALDEHDO, ACETONA Y 2-PROPANOL. UNIVERSIDAD
TECNOLGICA DE PEREIRA FACULTAD DE TECNOLOGA QUMICA INDUSTRIAL.PEREIRA,
COLOMBIA.