Protocolo para la determinacin de amonio por el mtodo de indofenol

(Scheiner, 1976, Water Research 10, 31-36)

Equipos y Materiales
1) Espectrofotmetro
2) pH metro
3) Fiolas de 50 mL usadas exclusivamente para la determinacin de amonio.
Despus de usar, las fiolas se deben lavar con cido cromo-sulfrico o clorhdrico,
fuertemente, lavadas con bastante agua y cuando se almacene se deben tapar para
evitar la contaminacin atmosfrica.
4) Fiolas de 1L, 100 mL
Reactivos
- Reactivo 1: Solucin stock de amonio 1000 mg NH4/L, estable a lo menos 6 meses.
Disuelva exactamente 2.965 g de NH4CL (previamente seco 1 h en 100 C) en agua y
diluya a 1 L.
- Reactivo 2: Solucin intermediaria de amonio 50 mg NH4/L, estable 4 das.
Diluya 5 mL del reactivo 1 a 100 mL.
- Reactivo 3: Soluciones estndares de amonio: 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0 mg
NH4/L
Diluya 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 mL del reactivo 2 a 100 mL. Prepare diariamente como
requiera.
- Reactivo 4: Solucin Tampn.
Disuelva 30 g de fosfato de sodio tribsico (Na3PO4.12H2O), 30 g citrato de sodio
tribsico (Na3C6H5O7.2H2O), 3 g EDTA (etilendiamina tetra-acetato disdico) en agua y
diluir a 1 L. El pH de la solucin aproximadamente 12.0.
- Reactivo 5: Tampn-Fenol-Nitroprusiato
Disolver 60 g de fenol en solucin tampn, adicionar 0.2 g de nitroprusiato de sodio
(Na2Fe(CN)5NO.2H2O) y llevar a 1 L con la solucin tampn. El pH del reactivo es
aproximadamente 9.
Importante:

-Adicionar el nitroprusiato solamente despus de que el fenol ha sido disuelto en la

solucin tampn y el pH del reactivo bajado. A pH 12 el nitroprusiato produce un color
verde-amarillo profundo el cual no desaparece con la subsecuente adicin de fenol.
- El reactivo de fenol se oscurece al reposar, especialmente cuando se expone a la luz
directa. Almacene en una botella de vidrio oscura en un refrigerador.
- Prepare el reactivo fresco cada tres semanas (como mximo) porque la intensidad
del color del indofenol se afecta por la edad del reactivo de fenol. Para asegurar
mximo cuidado, chequee al menos un estndar a las dos semanas de preparado el
reactivo.
- Llevar el reactivo a la temperatura ambiente antes de usar.
- Reactivo 6: Hidrxido de sodio 1N.
Disuelva 40 g de NaOH en agua y diluya a 1 L.
- Reactivo 7: Hipoclorito alcalino.
Adicione 30 mL de leja comercial, 3.5% de cloro disponible (o otra alcuota de acuerdo
con el porcentaje de cloro en la leja) a 400 mL del reactivo 6 y diluya a 1 L. El reactivo
de hipoclorito debe contener entre 0.08 y 0.11 % disponible de cloro y es estable en al
menos 1 mes cuando se preserva en una botella de vidrio oscura en un refrigerador.
Ejemplo:
C1V1 C2V2
C2

3.5 * (30)
1000

C2 0.105 %

La leja que se tiene en el laboratorio tiene 4.9% de cloro, entonces qu volumen de

leja hay que adicionar para preparar 1000 mL de reactivo 7?
C1V1 C2V2
V1

0.105 * (1000)
4.9

C2 21.4 mL

Procedimiento:
- Chequee el pH de la muestra y, s es necesario, neutralice a pH 7 o ms alto
Nota: Sin correccin de pH en el rango de 3-11.5.
- Tome 25 mL de la muestra o diluya la alcuota a 25 mL en una fiola de 50 mL.

- Adicionar 10 mL del reactivo 5, usando una bureta o una pipeta automtica. Mezclar
por agitacin.
- Prontamente adicione el reactivo 7, llenando hasta la marca (un retraso en adicionar
el reactivo 7 podra causar un descenso en la absorbancia).
- Cerrar la fiola y mezclar bien por inversin.
- El desarrollo del color es completo despus de 45 min a temperatura ambiente.
- Medir la absorbancia a 635 nm contra un blanco de reactivo a lo largo del
procedimiento junto con las muestras problemas.
Nota:
Cuando un nmero grande de muestras estn involucradas y hay un retraso entre el
muestreo y la adicin de reactivos, cierre las fiolas despus del muestreo para evitar la
prdida de amonio de la solucin diluida debido a la exposicin atmosfrica
prolongada.
Preparacin de la curva de calibracin
La curva de calibracin es estable. No hay necesidad de realizar una nueva curva para
cada lote de determinacin o an para nuevos reactivos, s ellos han sido preparados
exactamente de acuerdo a las instrucciones mencionadas arriba.
Tomar 25 mL del reactivo en fiolas de 50 mL y tratar los estndares exactamente como
las muestras a lo largo del procedimiento. Lea contra el reactivo blanco.
reactiv
[mg/
o3
Agua
Tubo
L]
(mL)
(mL)
1
0.5
25
2
1
25
3
1.5
25
4
2
25
5
2.5
25
6
3
25
7
3.5
25
8
4
25
Blan
----------co
0 --25

reacti
vo 5
(mL)
10
10
10
10
10
10
10
10

reactiv
o7
(mL)
15
15
15
15
15
15
15
15

10

15

Abs. (635
nm)

Calculo:
Convierta la absorbancia en concentracin de amonio, usando la curva de calibracin
y multiplique por el factor de dilucin.

Curva de calibracin

Para analizar las muestras:

Se procede de la misma manera para realizar la curva de calibracin. Ver
cuadro, por ejemplo si se tiene dos muestras.

Muestr Agua
Fiola a (mL) (mL)
Blan
co
------25
1
25
2
25

reacti
vo 5
(mL)

reactiv
o7
(mL)

10
10
10

15
15
15

Adicionar con bureta

como se hizo para la
curva de calibracin

Abs. (635
nm)