INTRODUCCION

El taller de Actualizacin en Histologa, tiene como finalidad afianzar los

conocimientos bsicos en esta rea especfica de la Biologa. El curso tiene
como propsito que el estudiante adquiera los conceptos y el entrenamiento
necesario para el procesamiento, identificacin e interpretacin de los tejidos
animales. Asimismo, se busca promover en el alumno el desarrollo de juicio
crtico para evaluar y producir preparaciones histolgicas con fines cientficos y
educativos. Dicho taller, est destinado a los alumnos de las Carreras de
Ciencias Biolgicas que hayan aprobado la asignatura Morfologa Animal.
OBJETIVOS
Analizar los fundamentos de las principales tcnicas histolgicas e
histoqumicas aplicadas en el estudio de los tejidos animales.
Adquirir destrezas y habilidades en el manejo de materiales e instrumental
para la realizacin de preparaciones histolgicas de rutina
. Establecer asociaciones estructurales-tintreas en cada uno de los tejidos
analizados.
Correlacionar las caractersticas estructurales de los tejidos animales con sus
correspondientes funciones.
Reconocer los criterios histolgicos utilizados en el diagnstico diferencial.
Transferir los conocimientos histolgicos a la resolucin de situaciones
problemas simuladas.
Desarrollar juicio crtico para evaluar y producir imgenes histolgicas reales
y virtuales.
Valorar que un adecuado entrenamiento y formacin en el campo de la
Histologa, es parte del conocimiento bsico que debe tener un Bilogo.
Apreciar que la Histologa es una herramienta importante en el futuro
quehacer profesional del Bilogo.

HISTO
TECN
OLOGI
A

La histotecnologa es una subespecialidad de la tecnologa mdica de

laboratorio; una disciplina que estudia los fundamentos tcnicos y la secuencia de
manipulaciones necesarias para llevar a cabo el anlisis de los tejidos de los seres vivos
La Histotecnologa es la disciplina que estudia los fundamentos cientficos y la
aplicacin de tcnicas que abarcan desde la obtencin de la muestra biolgica,
hasta su transformacin en un preparado histolgico. Los procedimientos
establecidos permitirn la preparacin del material para ser observado al
microscopio (ptico o electrnico) y analizar sus caractersticas topogrficas,
estructurales y tintreas, segn corresponda. El preparado deber reunir
ciertas cualidades, ya que posee un valor intrnseco (adems de extrnseco)
por la informacin que de l se puede obtener. Deber ser representativo del
tejido en estudio y haberse respetado los pasos indispensables para su
realizacin, de modo que refleje con la mayor fidelidad posible, las
caractersticas buscadas en la muestra biolgica. En lo que respecta al cuidado de
la salud lo ms comn es ayudar al patlogo a determinar cuando un paciente tiene un
cncer

FUNDAMENTOS GENERALES PARA EL PROCESAMIENTO HISTOLGICO

DE LOS TEJIDOS
Una tcnica histolgica es un conjunto de operaciones a las que se somete una
muestra biolgica a fin de posibilitar su estudio al microscopio. El examen al
microscopio ptico se hace generalmente por luz transmitida, lo que significa
que la luz debe "atravesar" el objeto a examinar para llegar a impresionar
nuestro rgano visual, despus de haber pasado por las distintas lentes del
aparato. Por esa causa, el material de estudio debe ser reducido a lminas muy
delgadas y transparentes mediante una serie de operaciones que se
describirn a continuacin. El proceso abarca desde el momento en que se
toma el material hasta que el preparado puede observarse. PASOS: 1.
1)
2)
3)
4)

Toma de material.
Fijacin
Deshidratacin
Preparacin para la inclusin

5)
6)
7)
8)

Inclusin
Modelado del bloque catalogacin
seccin con el micrtomo extendido de los cortes pegado
Coloraciones: de rutina o especiales

MUESTRA DE TEJIDO
Obtencin de la Muestra De acuerdo a la procedencia de los tejidos y la
finalidad de su estudio es posible distinguir entre material histolgico y
material anatomo-patolgico. Se denomina material histolgico a toda muestra
de tejidos obtenida de un individuo o animal sano (o experimentalmente
sometido a un determinado tratamiento) con la finalidad de investigar su
estructura normal y/o los cambios producidos en la morfologa como
consecuencia de algn tratamiento. El material anatomo-patolgico est
constituido por muestras procedentes de individuos o animales enfermos
utilizadas para el diagnstico y/o la investigacin etiolgica (origen-causa) de
la enfermedad.
Los tejidos para estudio histolgico se obtienen habitualmente a partir de:
a- autopsias: en medicina el trmino se aplica al conocimiento de la causa
de la muerte. Mediante el procedimiento de autopsia se realizan
manipulaciones instrumentales sobre el cadver con el propsito de
obtener muestras de rganos y tejidos e investigar la causa del
fallecimiento. Este mtodo tambin recibe la denominacin de necropsia.
b- biopsias: es una porcin de tejido obtenida de un individuo vivo para su
estudio histolgico o anatomo-patolgico. Las biopsias tienen como objetivo
fundamental el diagnstico de una patologa que no se ha podido
diagnosticar por los mtodos clnicos habituales.
c- extendidos citolgicos: es un conjunto de clulas independientes
procedentes de un tejido y extendidas sobre un portaobjeto formando una
capa delgada y que permite su observacin microscpica. Ejemplos: frotis
de sangre, tejidos hematopoyticos y exfoliacin (o raspado) de mucosas.
Fases en la obtencin de material animal:
En un estudio histolgico descriptivo o experimental la muestra, generalmente,
procede de un animal normal o control y de animales problemas, segn los
casos. Si es posible debe extraerse de un ejemplar vivo y anestesiado. En caso
contrario, cuando el animal est muerto, el o los rganos debern obtenerse lo
ms rpidamente posible despus de la muerte.

Para la extraccin de los rganos se requiere tener conocimientos anatmicos

especficos que permitan establecer estrategias de diseccin, conservacin y
tratamiento posterior del tejido.
En la tcnica histolgica muchos componentes se pierden durante los
sucesivos pasos. Aquellos que perduran son en su mayora molculas grandes
que no se disuelven con facilidad en especial despus de aplicar el fijador. Las
macromolculas que forman complejos con otras molculas de gran tamao,
son las que mejor se conservan en un corte: Ej.: - cidos nucleicos asociados
con una protena (nucleoprotena).- Protenas intracelulares del cito esqueleto
que forman complejos con otras protenas.- Protenas extracelulares en grandes
agregados insolubles asociados con otras molculas vecinas similares, a travs
de enlaces cruzados (como sucede en las fibras colgenas) y los fosfolpidos de
las membranas.

Muestreo:
En cuanto la sangre deja de llevar oxgeno y de extraer el anhdrido carbnico
de los tejidos, las enzimas comienzan a actuar y producen la autolisis de las
clulas que los componen.
Las propias estructuras moleculares son deformadas y es lo que precisamente
se debe evitar. Los tejidos y rganos se han de extraer considerando las
siguientes prioridades:
- Las glndulas exocrinas y endocrinas lo ms rpidamente posible.
- El pncreas y el rin deben extraerse no ms de 10 a 15 min. Post-mortem.
- Otros rganos tales como intestino delgado y/o grueso, estmago, hgado, se
deben extraer no ms all de los 30 min.
- Los msculos esquelticos, huesos, piel, encfalo, mdula, ganglios nerviosos
no deben extraerse ms all de 60 min. Postmortem.
Identificacin del Material:
Si se extraen varios rganos se debe tener cuidado en registrar cada trozo de
rgano envolvindolo en una gasa o bien pasando un hilo directamente por un
extremo del rgano, mientras en el extremo opuesto se coloca un trozo de
cartulina resistente donde se escribe con lpiz las indicaciones (rgano,
porcin, etc.) del caso. Esto es necesario cuando las muestras son numerosas,
pues facilitar su reconocimiento.
Las muestras de rganos no deben exceder un volumen de 1x 1x1 cm3 y se
requiere efectuar secciones profundas, en lo posible no tangenciales, para

incluir los constituyentes anatmicos normales como por ej. Cpsula, corteza,
mdula, etc. La cantidad de lquido fijador en el que se embeba la pieza debe
superar aproximadamente 10 a 20 veces el volumen de la muestra.
FIJACIN:
Consiste en la preservacin del tejido del deterioro provocado por la autolisis y
putrefaccin derivada de la muerte celular.
La autolisis es el proceso en el cual, despus de la muerte, se produce la auto
digestin enzimtica debido a la salida del contenido lisosmico de la clula. Se
denomina putrefaccin al efecto ejercido por determinadas toxinas y enzimas
bacterianas sobre los tejidos. Los microrganismos que originan esta accin son
de carcter saprfito y complementan el efecto ltico de la autolisis hasta
conseguir la total destruccin celular. Ambos procesos estn influidos tanto por
la naturaleza del tejido considerado como por la temperatura existente en el
medio donde se encuentra el tejido. As, por ejemplo los tejidos ricos en
enzimas digestivas (estmago, pncreas) o que contienen una importante flora
bacteriana (intestino) sufren estos fenmenos con mayor intensidad.
Con la fijacin del tejido, no slo se interrumpen los procesos de degradacin
postmortem, sino que adems se intenta conservar la arquitectura y
composicin tisular lo ms prxima posible a como se encontraba en el
organismo vivo.
El proceso de fijacin es muy importante en histotecnologa, ya que errores en
el mismo, no pueden ser corregidos, generando artificios (desgarros,
retracciones) que dificultan el diagnstico.
Tipos de fijacin:
En funcin de las caractersticas del estudio microscpico que se vaya a
realizar, se distinguen dos tipos de fijacin.
a) fijacin citolgica o histolgica: Intenta conservar la estructura de
clulas y tejidos, sin considerar los cambios moleculares de los componentes
bioqumicos.
b) fijacin histoqumica: Intenta conservar la composicin molecular y
bioqumica de los tejidos ms que los detalles morfolgicos de los mismos.
Clasificacin de los fijadores:
De acuerdo a la accin que ejercen sobre los tejidos se clasifican en qumicos
y fsicos. Los fijadores qumicos son los ms empleados y dentro de estos, en la
prctica rutinaria, el 9 formaldehdo, formalina o formol es el de uso ms
extendido ya que cumple con la mayor parte de las caractersticas que debe

reunir un buen fijador. Tambin es muy comn el uso de mezclas fijadoras

formadas por la combinacin de dos o ms sustancias con compatibilidad
qumica, cada uno de los cuales es por si solo insuficiente para dar una fijacin
que responda a todas las exigencias. Entre los ms usados se halla el lquido
de Bouin
Caractersticas fundamentales que debe poseer un fijador:
Capacidad para bloquear la autolisis. Este efecto del fijador depende
principalmente de su poder para producir la desnaturalizacin de las protenas,
de modo que la actividad enzimtica del tejido quede paralizada. Adems debe
tener un efecto antimicrobiano que impida la accin bacteriana
desencadenante de la putrefaccin.
Penetrar rpidamente al tejido.
No provocar sobre el tejido retracciones o distorsiones que determinen
anomalas en su estructura. Es decir, evitar la difusin de elementos
constitutivos del tejido durante y despus de la fijacin
Favorecer la inclusin, corte y coloracin posteriores del material biolgico.

Reglas generales a considerar en el empleo de lquidos fijadores:

Para evitar la autolisis, el tejido debe ser colocado lo ms rpidamente
posible en el lquido fijador.
La seleccin del fijador depende del tejido a estudiar, fundamentalmente de
las fuerzas qumicas que interactan para mantener su estructura.
El tejido debe estar seccionado en lminas de 0.5-1cm de espesor mximo.
Calor Fro Desecacin Fsicos Qumicoscos Oxidantes Reductores Acetona cido
Actico Acido Pcrico Tretrxido de Osmio Formaldehdo Paraldehdo Etanol
Metanol FIJADORES 10
Asegurar la permanencia de las muestras en el nivel medio del volumen del
fijador para que dicho reactivo acte homogneamente por todas las caras de
la muestra.
El volumen del fijador est dependiendo del volumen de la muestra. En
general, la relacin entre el volumen del fijador y el de la muestra de tejido es
de 10:1 (el volumen del fijador es 10 veces mayor que el ocupado por la pieza).
La presin osmtica del lquido fijador y la del tejido deben ser equivalentes.

 El pH del fijador debe aproximarse al pH fisiolgico

El tiempo de fijacin es especfico para cada fijador.
Tcnicas de fijacin:
En la prctica existen bsicamente dos modos para fijar un material dado.
a) Fijacin por inmersin: se realiza sumergiendo un pequeo trozo de tejido
en el fijador inmediatamente despus de haber sido extrado.
b) Fijacin por Perfusin: En este tipo de fijacin el lquido fijador se inyecta
a travs del sistema circulatorio, mientras el animal permanece adormecido
bajo efecto de narcticos.
Detencin de la fijacin
Una vez transcurrido el tiempo de fijacin deseado es preciso detener la
fijacin rpidamente, ya que una accin muy prologada de estos agentes
perjudica en general la coloracin ulterior de los cortes y hasta podra alterar la
estructura histolgica.
El fijador que rodea la pieza puede ser eliminado por lavado en:
a- agua corriente de 2 a 24 h.
b- alcohol: Las piezas que han estado en alcohol, cido pcrico o formol, se
llevan directamente al alcohol 70 u 80 llevndose as a cabo el lavado y
el inicio de la deshidratacin.
INCLUSION: La observacin microscpica requiere en la mayora de los casos
que el material de estudio sea muy delgado con el objetivo que los elementos
que lo constituyen se encuentren en un solo plano focal. Este mtodo exige por
un lado la realizacin de cortes delgados, de pocas micras de espesor y de
grosor uniforme, para lo cual se emplean aparatos especiales llamados
micrtomos. La forma de lograr que las muestras fijadas adquieran la
consistencia ms favorable y uniforme, consiste en incorporar al seno mismo
del tejido, una sustancia slida que sirva de sostn a los componentes
histolgicos y que permita obtener cortes aptos para su observacin al
microscopio. Estas sustancias se denominan medios de inclusin.
Diferentes sustancias han sido empleadas como medios de inclusin. La
gelatina, el poli etilenglicol empleadas en soluciones acuosas pueden penetrar
muestras hidratadas. Otras, como la parafina y la celoidina que no son solubles
en agua, requieren para poder penetrar una deshidratacin previa de las piezas
y un tratamiento posterior con un reactivo miscible de los medios de inclusin.
Tambin, pueden emplearse como medios de inclusin resinas acrlicas o
epoxdicas, que permiten obtener secciones mucho ms delgadas que en

parafina, con la posibilidad de distinguir detalles estructurales ms finos.

Generalmente son los medios de inclusin empleados en microscopa
electrnica de transmisin y en el estudio de muestras seas sin descalcificar
de gran dureza (dientes).
Deshidratacin:
Los tejidos contienen grandes cantidades de agua tanto intra como
extracelular, la que debe ser eliminada y reemplazada por parafina. La
deshidratacin
puede
realizarse
por
mtodos
qumicos
o
fsicos
(criodesecacin). En el primer caso se emplea un reactivo anhidro vido de
agua como la acetona, el alcohol etlico, metlico, butlico, etc.
En los mtodos de rutina el agente ms utilizado es el alcohol etlico, el cual
establece una unin lo suficientemente fuerte con las molculas de agua para
extraerlas del tejido.
En la prctica y para evitar alteraciones provocadas por una deshidratacin
brusca, se aconseja proceder escalonadamente utilizando preferentemente,
alcoholes de graduacin creciente (Para la preparacin de las soluciones ver
ANEXO I):
En la prctica de laboratorio de este taller se seguirn los pasos que se indican
en el ANEXO II. Los procedimientos que se describen a modo de ejemplo, son
los que se emplean en trminos generales. Estos pueden variar segn las
necesidades y propsitos de cada operador y/o laboratorios.
Las piezas se envuelven en gasa a manera de bolsitas o se colocan en
cassettes plsticos de deshidratacin. Luego se introducen en frascos anchos y
de cierre hermtico, dejndolas suspendidas en el seno del lquido
deshidratante cuyo volumen debe ser diez veces superior al de la muestra.
Los tiempos de permanencia en cada alcohol dependern del tamao de la
pieza. Se recomienda 1 hora en cada reactivo deshidratante si el espesor de la
muestra es de 0.5- 1 cm.
Las condiciones esenciales de un buen agente deshidratante son:
1234-

No debe alterar la estructura tisular

Ser soluble en el reactivo intermediario
Actuar rpidamente
El endurecimiento de los tejidos debe ser mnimo

Una vez retirada la muestra del alcohol absoluto es necesario efectuar una
desalcoholizacin. Es decir, el alcohol de los tejidos debe ser reemplazado por
un lquido (solvente) que sea soluble en parafina con la que se impregnar el
tejido. Los solventes 70, 80, 96 y 100 absoluto (2 baos) FIGURA 3.

Deshidratacin en cassette 13 utilizados son el xileno o xilol, benceno, tolueno

y butilo. El ms indicado es el xilol por su rpida accin, porque endurece poco
los tejidos y se elimina fcilmente del medio de inclusin. Adems, tiene la
particularidad de alterar el ndice de refraccin de la muestra y la torna
ligeramente translcida. A este paso de la tcnica se la denomina aclaramiento
o diafanizaran. Para realizarlo, las piezas se trasladan a un frasco con xilol que
contenga un volumen aproximadamente 30 veces superior. Si al introducir las
piezas en el solvente se observa que ste se vuelve opalino, significa que la
deshidratacin no ha sido incompleta. En ese caso, se recomienda volver al
alcohol absoluto.
El aclaramiento concluye cuando las muestras se han vuelto difanas y
trasparentes, entonces, pueden pasarse a una solucin mezcla de xilolparafina. En la prctica, suelen utilizarse los siguientes baos de
aproximadamente 1 hora de duracin cada uno:
Alcohol absoluto+ xilol (1:1) y dos baos de xilol puro.

HISTOQUIMICA Y
CITOQUIMICA

INTRODUCCIN

La histoqumica es la aplicacin de reacciones qumicas y bioqumicas en la

tcnica histolgica, con el fin de localizar y determinar de manera cientfica
ciertas sustancias o su actividad.
En todas estas reacciones o bien se tie la sustancia que buscamos o los
colorantes reaccionan qumicamente con ella, como es el caso del PAS.
Los hidratos de carbono o glcidos son polialcoholes oxidados
(polihidroxicetonas o poli aldehdos). Los polisacridos son glcidos formados
por la unin de muchas molculas de monosacridos (ms de 10). Entre los
polisacridos adems de los polisacridos simples como el glucgeno
destacan los polisacridos complejos

HISTOQUMICA Y CITOQUMICA
Histoqumica es el estudio qumico de los tejidos independientemente del
mtodo de anlisis empleado. En la prctica se emplea la palabra para
designar el mtodo junto con el auxilio de los microscopios pticos (MO) y
electrnico (ME).
La citoqumica estudia la composicin qumica de la clula y permite detectar la localizacin
topogrfica de algunos principios inmediatos: enzimas, metales pesados, sustancias orgnicas
molculas de depsito y otras sustancias

Esta tcnica permite la identificacin y localizacin de compuestos o radicales

qumicos en las clulas y tejidos. Esto se consigue provocando reacciones que
dan productos insolubles que son coloreados o electro densos y visibles por el
MO y el ME.

A. PRINCIPIOS BSICOS.
1. QUE LOS COMPUESTOS QUE DEBEN SER ANALIZADOS NO SEAN DIFUSIBLES.

Este problema se resuelve insolubilizando los compuestos que van a ser

estudiados por medio de la fijacin del tejido.
Se recomienda el uso de fijadores con alcohol para el estudio de sustancias
hidrosolubles como el glucgeno.
Hay que evitar los fijadores cidos en las tcnicas de visualizacin del fosfato
clcico.
Los fijadores ms utilizados son:
Formaldehdo para el MO.
Glutaraldehdo para el ME.

2. EL PRODUCTO DE LA REACCIN DEBE SER INSOLUBLE para evitar la

difusin .
3 .EL MTODO UTILIZADO DEBE SER ESPECFICO PARA LA SUSTANCIA O GRUPO
QUMICO QUE SE ESTA ANALIZANDO.
En algunas reacciones la intensidad del color producido es proporcional a la
concentracin de la sustancia analizada.En este caso se puede medir dicha
sustancia con un histofotmetro.
B. PRINCIPALES SUSTANCIAS DE INTERS BIOLGICO DEMOSTRABLE
HISTOQUMICAMENTE.
1. IONES

IN
HIERRO

FOSFATO

DETERMINACIN
EL in frrico se demuestra por la reaccin con la mezcla de FERROCIANURO POTSICO Y CIDO CLORHDRICO que forma un precipitado
azul oscuro de ferrocianuro frrico.
Esta reaccin se usa para localizar los macrfagos del SRE y
diagnosticar enfermedades en las cuales hay depsitos de hierro en
los tejidos .
Reaccionan con NITRATO DE PLATA y se forma fosfato de plata que es
reducido por hidroquinona y forma un precipitado negro. Esta reaccin
se usa para el estudio del hueso.

2. LPIDOS.
Se usan colorantes que se disuelven en las grasas como el SUDAN IV y el
SUDAN NEGRO. Los tejidos se sumergen en soluciones alcohlicas saturadas de
colorantes muy liposolubles y dbilmente solubles en alcohol. Se usa para el
diagnstico de enfermedades metablicas que producen depsitos
intracelulares.
3. CIDOS NUCLICOS.
CIDO
NUCLICO

DETERMINACIN

DNA

Se usa la reaccin de FEULGEN que consiste :

Hidrlisis del DNA con cido clorhdrico para extraer las bases
pricas y dejar en libertad los grupos aldehdicos del azucar.
El reactivo de SCHIFF (fuchsina bsica con anhdrido sulfuroso)
reacciona con el aldehdo y forma un precipitado rojo.
Esta reaccin presenta proporcionalidad entre la intensidad del color
producido y el contenido en DNA del ncleo.

RNA

Tiene gran afinidad por los colorantes bsicos (basoflia) lo que hace
que se tia intensamente con el AZUL DE TOLUIDINA o de METILENO.

4. PROTENAS.
Su identificacin se basa en mtodos de deteccin de aminocidos.
Reaccin de aminobenceno.
Reaccin de Sakaguchi que detecta la arginina de las protenas bsicas como
las histonas y protaminas.
5. POLISACRIDOS.
Se encuentran unidos a protenas o en forma libre. En el caso de ser un
polmero, antes hay que tratar la muestra con un enzima glucogenoltico para
que libere los azucares.
La reaccin ms usada es la del PAS (cido peridico-schiff). El cido oxida a
los azucares en posicin 1-2 y deja grupos aldehdos libres que reaccionan con
el reactivo de SCHIFF dando un compuesto insoluble y coloreado. De este modo
se demuestra la presencia de:

 Glucgeno en el hgado y msculo.

Depsito intracelular de glucgeno en enfermedades congnitas.
Glucosaminoglicano
proteoglicanos.

mucopolisacrido

que

forman

parte

de

los

Glucoprotenas.
Los azucares cidos tambin reaccionan con el colorante AZUL DE ALCIAN.
6. CATECOLAMINAS. El formoaldehdo
produciendo compuestos fluorescentes.

reacciona

con

las

catecolaminas

7. ENZIMAS. Su localizacin se basa en la produccin de un precipitado

fuertemente coloreado o electrodenso en el sitio de actividad enzimtica.
ENZIMA

DETERMINACIN

FOSFATASA CIDA

Se usa el mtodo de GOMORI que consiste en incubar cortes

de tejidos en una solucin que contengan GLICEROL FOSFATO
SDICO y NITRATO DE PLOMO a pH 5 .
La enzima libera el fosfato que reacciona con el plomo y da
un precipitado insoluble.Despus se aade sulfito de amonio
que da color negro y electro denso al precipitado.
Se usa para localizar lisosomas.

DESHIDROGENASA
S

Se usan cortes no fijados junto con un compuesto qumico

soluble y debilmente coloreado del tipo TETRAZOL.El tetrazol
es reducido y forma un precipitado coloreado llamado
FORMAZAN.
Se usa para detectar mitocondrias.

PEROXIDASA

Promueve la reduccin de ciertos sustratos, transfiriendo

iones hidrgenos desde el perxido de hidrgeno al sustrato
que se reduce.
Como sustratos se usa el perxido de hidrgeno y el
tetraclorato 3,3-diamino-bencidina que cuando se reduce
forma un compuesto coloreado, insoluble y electrodenso.

B. FLUORESCENCIA.
Sustancia fluorescente es la que absorbe luz de una longitud de onda
determinada y emite luz en otra longitud de onda mayor. En microscopa se
suele usar la excitacin con luz ultravioleta.
1. COMPUESTOS FLUORESCENTES.
Compuestos naturales constituyentes
riboflavina(B2) y las porfirinas.

de

las

clulas:

vitamina

A,

Colorantes con afinidad por las estructuras celulares como el Naranja de

acridina que se une a los cidos nuclicos:
DNA: fluorescencia verde amarillenta.
RNA: fluorescencia roja amarillenta.
Esta prueba se usa en el diagnostico precoz del cncer (clulas ricas en RNA).
2. INMUNOCITOQUMICA (INMUNOFLUORESCENCIA).
Sirve para identificar protenas especificas. Se basa en la reaccin Ag-Ac. Al Ac
se le puede marcar con un compuesto fluorescente. Es la mtodo ms usado
para la deteccin de auto-anticuerpos en enfermedades autoinmunes.
PREPARACIONES PERMANENTES
Describiremos primero las preparaciones histolgicas permanentes (laminas)
para el estudio al microscopio ptico. Con este instrumento los objetos se
examinan por transparencia, siendo pocas las estructuras que se examinan
directamente (mesenterio, cola de renacuajo) y que pueden ser observadas in
vivo, sin fijar y teir, como sucede en las preparaciones permanentes.
Los pasos que se siguen para obtener una preparacin permanente son:
1. Fijacin
2. Inclusin
3. Corte con microtomo
4. Coloracin
A. FIJACIN.

 Se hace a fin de evitar la autolisis y destruccin celular.

Los tejidos deben ser tratados inmediatamente despus de ser cortados.
Tiene por fin endurecer los tejidos, volvindolos mas resistentes a las etapas
subsiguientes de la tcnica histolgica.Hay que conservar la morfologa y la
composicin qumica de los componentes de los tejidos.
Suele durar unas 12 horas.
La fijacin puede ser realizada por procesos:
MTODO

CARACTERSTICAS

FSICO

Calor, como en bacteriloga.

Fri, como en el criostato.

QUMICO (uso de fijadores

que inmovilizan las
protenas de los
tejidos).Es la ms usada
en Histologa.

Fijadores:
Cloruro de mercurio y cido pcrico precipitan
protenas.
Formaldehdo, tetraxido de osmio y glutaraldehdo
apenas causan coagulacin y se usan en ME.
Mezclas fijadoras:
Liquido de BOUIN: pcrico/formol/actico glacial
Liquido de HELLY: dicromato potsico/cloruro de
mercurio/formol

Este paso es ESENCIAL, puesto que las protenas son las principales
responsables de la estructura celular y se degrada despus de la muerte
celular.
Habitualmente se hace una doble fijacin con una solucin tamponada de:
Glutaraldehdo.
Tetraxido de osmio.
B. INCLUSIN.
Da consistencia firme a los tejidos para que se puedan obtener cortes
suficientemente finos.

 Las sustancias ms usadas para este fin son:

GELATINA, CELOIDINA, PARAFINA para la MO.
RESINA EPOXI para la ME.
Hay una serie de tratamientos a los que hay que someter a una pieza antes de
la inclusin:
TRATAMIENTO

CARACTERSTICAS

DESHIDRATACIN

Se extrae el agua de los tejidos con baos de

concentraciones crecientes de etanol ( de 70% a
100%).

ACLARAMIENTO O
DIAFANIZACIN

Sustitucin del etanol por un liquido miscible en

etanol y parafina.Se usa xilol, benzol o toluol que
dejan a la pieza translcida.

INCLUSIN O
IMPREGNACIN

Se colocan las piezas en parafina fundida a 60 C

en el interior de una estufa.
Debido al calor , el xilol o toluol se evaporan y los
espacios que dejan libre son ocupados por la
parafina.
Se lleva la pieza a un recipiente rectangular y se
deja solidificar.
Inconvenientes:
Destruyen muchas enzimas
Eliminan compuestos liposolubles

C. CORTE CON MICROTOMO.

Los bloques de parafina son seccionados por la cuchilla del microtomo,
obtenindose cortes de 3 a 8 micras de espesor. Estos cortes son extendidos
en agua caliente y despus se llevan a un portaobjetos.
Para el microscopio electrnico se requieren cortes de 0.02 a 0.1 micra. El
material se incluye en plsticos bastante duros del tipo epoxi y para cortarlos
se usa un ultramicrotomo equipado con navaja de cristal o diamante.
El microtomo de CONGELACIN SE USA PARA ESTUDIAR LOS LPIDOS DE LAS
ESTRUCTURAS CELULARES, ya que los solventes orgnicos los eliminan. Usa
nieve carbnica para congelar el tejido.

 CRIOSTATO es un microtomo de congelacin ms elaborado que permite la

obtencin rpida de cortes sin pasar por todas las etapas anteriores, cuando se
usa parafina.Son muy utilizados en hospitales cuando se requiere un
diagnostico rpido de un material patolgico.
El criostato es tambin muy til en histoqumica , pues no inactiva las enzimas,
pero dificulta la difusin de las molculas.
MTODO DE CONGELACIN-DESECACIN: Se mantiene la actividad
enzimtica. Se congela a -150 C y despus se deshidrata lentamente a vaci.
D. COLORACIN.
Aumenta el contraste de las estructuras y hace a los tejidos visibles y
diferenciables unos de otros.
Se realiza normalmente con MEZCLAS QUMICAS DE COLORANTES.
La mayora de los colorantes se comportan como cidos o como bases y
tienden a formar sales con los radicales ionizables de los tejidos.
Los componentes de los tejidos pueden ser:
SUSTRATO

COLORANTE

EJEMPLOS

BASFILO (tejidos que

se tien fcilmente
con colorantes
bsicos).

BSICO (azul de toluidina

y azul de metileno,
hematoxilina).

Nucleoprotenas y
glicoprotenas cidas.

ACIDFILO (tejidos
que se tien
fcilmente con
colorantes cidos).

QCIDO (orange G, eosina

y la fuschina cida).

Protenas bsicas del

citoplasma.

La doble coloracin por la hematoxilina y la eosina es la ms utilizada en la

tcnica histolgica.
OJO: Los colorantes no proporcionan datos sobre la naturaleza qumica de los
componentes a los que se unen.
TCNICA

COMPONEN
TES

NCL
EO

CITOPLAS
MA

FIBRAS
COLGE
NAS

FIBRAS
ELSTIC
AS

RETICULI
NA

Hematoxili
na-eosina

Hematoxilin
a

Azul

Irregular

Eosina

Rosa

Rosa

Irregular

Hematoxilin
a frrica

Negro

Fuchinacida y
Panceau

Rojo

Verde luz

Verde

Fuchinaresorcina

Fuchina y
resorcina

Prpura

Impregnac
in
argntica

Sales de
plata

Castao

Negro

Tricromo
Masson

Los factores que influyen en la tincin son:

Pureza y concentracin del colorante.
pH y temperatura.
Tiempo.
E. METACROMASIA.
Hay ciertos tejidos, como la matriz cartilaginosa, que al usar colorantes como
el azul de toluidina, se modifica el color azul por unin al tejido, pasando a
prpura. A este fenmeno se le denomina metacromasia.
Los colorantes metacromticos suelen ser bsicos, como el azul de toluidina y
tionina.
Los
componentes
tisulares
que
pueden
colorearse
metacromticamente, denominados cromotropos, son principalmente:
Glucosaminoglicanos sulfatados, fuertemente
cartilaginosa y los mastocitos del tejido conectivo.

cidos

de

la

matriz

Nucleoprotenas.
F. MANIPULACIN EXPERIMENTALES DE CLULAS VIVAS.
Las tcnicas de tincin pueden ser:
VITALES: no provocan la muerte. Se usan colorantes relativamente no
venenosos que son retenidos selectivamente por algunas clulas del
organismo. Se inyecta al animal vivo.
SUPRAVITALES: se agrega el colorante a las clulas o tejidos que permanecen
vivos despus de ser separados del organismo.

Ejemplos:
El carmn y azul tripn se usan para el estudio de la fagocitosis.
El rojo neutro para identificar los distintos tipos de leucocitos.
El verde jano tie las mitocondrias.
La alizarina se une a la matriz sea recin formada y se ha usado para el
estudio de la formacin del hueso.
G. CRIOFRACTURA.
Permite el estudio de la ultraestructura de las clulas sin los posibles artefactos
producidos por la fijacin y la inclusin (ej: membrana plasmtica). Sirve para
el examen de cortes ultrafinos.
Fases:
1. Congelar el tejido a temperatura muy baja.
2. Fracturar con una cuchilla de metal afilada. El tejido fracturado se mantiene
a muy baja temperatura y en alto vaco, as se elimina el agua por sublimacin.
La superficie fracturada muestra elevaciones y depresiones correspondientes a
las diversas estructuras de los tejidos.
3. Hacer una rplica al molde de la superficie fracturada depositando una capa
de carbono.
4. Depositar una capa de metal pesado sobre la superficie de carbono para
dar un aspecto sombreado.
5. Llevar la muestra a presin atmosfrica normal y destruir el tejido por una
sustancia que no ataque el molde (cido fuerte, hipoclorito sdico).
6. Colocar la rplica en una rejilla de cobre y llevarla al

INMU
NOHI
STOQ
UIMIC
A

Introduccin.
Las tcnicas de inmunohistoqumica (IHQ) surgen en los aos 50 como
herramienta para la deteccin de antgenos celulares. Una idea simple y
elegante que ampli la capacidad de diagnstico de la Anatoma Patolgica.
Utilizadas de forma rutinaria en Patologa Humana desde hace aos, su uso
aparece ms restringido en Patologa Veterinaria, siempre mucho ms limitada
por factores econmicos. Sin embargo, de forma progresiva y especialmente
debido a la mejora de los tratamientos oncolgicos, su demanda se va
generalizando.
El objetivo de la tcnica es detectar, amplificar y hacer visible un antgeno
determinado (generalmente una protena). Para la deteccin especfica se
emplean anticuerpos dirigidos especialmente contra el antgeno buscado (es el
llamado anticuerpo primario). Para amplificarlo se emplean tambin
anticuerpos, dirigidos contra el anticuerpo primario (son los llamados
anticuerpos secundarios). Finalmente, para visualizar el conjunto se emplea
una combinacin de Avidina, Biotina y Peroxidasa que permite, mediante una
simple reaccin qumica local, colorear y hacer visible al microscopio la cadena
de anticuerpos.

Concepto
La inmunohistoqumica es un estudio histopatolgico que se basa en la utilizacin
de un anticuerpo especfico, previamente marcado mediante un enlace qumico
con una enzima que puede transformar un sustrato en visible, sin afectar la
capacidad del anticuerpo para formar un complejo con el antgeno, aplicado a una
muestra de tejido orgnico, correctamente fijada e incluida en parafina. El
complejo antgeno - anticuerpo as formado, mediante la utilizacin de alguna de
las tcnicas especficas (peroxidasa antiperoxidas, fluorescena, etc.), permite ser
localizado e identificado dentro
La aplicacin de los principios bsicos
La tincin inmunohistoqumica en la investigacin biomdica tiene un papel
muy amplio. E implica muchas reas de investigacin. Sin embargo, la tcnica
de inmunohistoqumica tiene sus limitaciones, por ejemplo, las clulas del
tejido que la sustancia de ensayo antgeno, pero tambin es necesario tener
una cierta concentracin antes de la deteccin, la deteccin de la protena
inmunorreactiva no se puede determinar que nueva sntesis celular transporte

de protenas a partir oa travs de protenas de clulas, por lo tanto, en el

diseo experimental debe tener plenamente en cuenta estas caractersticas. Si
el experimento tiene necesidad de demostrar qu tipo de clulas de la sntesis
de protenas conocido requiere el uso de la tcnica de hibridacin in situ para
resolver. Para guiar a los principiantes en el diseo experimental, el uso
razonablemente inteligente de tcnicas de inmunohistoqumica, para aplicar
los principios bsicos que se resumen a continuacin:
1. Identificar los tipos de clulas y tejidos dentro de alguna forma de protenas
especficas de tejido, tales como protena cida fibrilar glial (gial protena cida
fibrilar, GFAP) existe slo en los astrocitos. Neurofilamentos (microfilamentos,
NF) slo est presente en las clulas nerviosas. Estos por lo general tienen una
protena llamada protena marcadora especfica de tejido (Proteiniliaker). La
protena marcada por un anticuerpo especfico para determinar los tipos de
clulas. Algunas clulas (Tabla clulas y clulas de melanoma, etc) en el
microscopio de luz no es fcil de identificar, a travs de la implementacin de
las protenas especficas dentro de la tincin inmunohistoqumica citoplasma,
se puede demostrar claramente que tales clulas contorno. Este papel de la
neurociencia y la investigacin clnica del cncer patologa es particularmente
importante.
2. Uso de los productos de clulas para identificar el origen del producto de
ciertas clulas como antgeno, los anticuerpos correspondientes preparados,
clulas de modo de realizacin de la tincin inmunohistoqumica para
identificar la fuente de productos de clulas. Tal como clulas endocrinas
producen una variedad de hormonas, la mayor parte de las tcnicas de tincin
inmunohistoqumica para identificar disponibles, que pueden examinar la
funcin de las clulas y la clasificacin funcional para tumores endocrinos para
la deteccin de tumores secretores de hormona ectpicos, etc, para entender
la diferenciacin celular. La tincin inmunohistoqumica (DAB cromgeno)
3. Determinar el grado de diferenciacin de clula de un grado de la
diferenciacin del mismo tipo de clulas expresan diferentes protenas de
mltiples icnico, sobre la base de la identificacin de estas diferentes
protenas para determinar el grado de diferenciacin de las clulas. Por
ejemplo, un smbolo de clulas neuroepiteliales protena nestina (nestina),
cuando la diferenciacin de las clulas gliales radiales expres vimentina
(vimentina). En la ocurrencia de la diferenciacin neuronal en las clulas
neuronales se expresa neuronal tubulina (TUJl), una diferenciacin de las
clulas del nervio en neuronas maduras, protena de los neurofilamentos
expresado (neurofilamentos, NF).
4. Seguimiento de las fibras nerviosas y su rea de proyeccin para ello
mtodos inmunohistoqumicos son a menudo asociados con el transporte
axonal Combinacin trazadores para estudiar los vnculos entre las neuronas.
Axonal mtodo de los trazadores de transporte es el uso de ciertas sustancias
puede ser nervio consumo finales. Calidad del haz transporte retrgrado Warp
a las caractersticas del cuerpo celular. Mtodo histoqumica muestra el
esquema de las neuronas. Comnmente se utiliza trazadores peroxidasa de
rbano picante y oro fluorescente. Por ejemplo. Para observar el sistema

nervioso perifrico o el sistema nervioso central de un ncleos de proyeccin

de las fibras nerviosas. En primer trazador inyectado en animales
terminaciones nerviosas de fibra partes de los animales sobrevivieron durante
algn tiempo a la espera de las fibras nerviosas de las partes salientes
dibujadas, primero por medio de trazadores qumicos a travs de
posicionamiento organizacional, re-introduccin de la inmunohistoqumica para
determinar su naturaleza.
5. En las aplicaciones clnicas, tales como la identificacin de las lesiones
patolgicas, las lesiones pequeas encontraron explorar fenotipo diferenciado
de origen tumoral o para determinar el estadio del tumor, el tratamiento y el
pronstico de gua. Asistido diagnstico de la enfermedad y la clasificacin,
encontrar otra etiologa infecciosa.
Operaciones vinculadas
Equipo
1) 18cm olla de acero inoxidable de presin o una estufa o microondas mdica;
2) bao de agua
Reactivos
1) solucin tampn de PBS (pH 7,2 ~ 7,4): NaCl 137mmol / l, Kcal 2,7 mmol / L,
Na2HPO4 4,3 mmol / L, KH2PO4 1,4 mmol / L.
2) 0,01 mol / l de tampn citrato (CB, pH 6,0, 1000 ml): 3 g citrato de sodio, 0,4
g de cido ctrico.
3) 0,5 mol / l de solucin tampn de EDTA (pH 8,0): 700 ml disuelto
186.1gEDTA 2H2O, con 10 mmol / L NaOH se ajust a pH 8,0, agregar agua a
1000 ml.
4) 1 mol / L de tampn TBS (pH 8,0): Base 121gTris disueltos en 800 ml, se
ajust con HCl 1N pH 8,0, aadir agua hasta 1000 ml.
5) digestin de la enzima: una, solucin de tripsina al 0,1%: un 0,1% de CaCl2
(pH 7,8) preparacin. B, solucin de pepsina 0.4%: preparado con HCl 0,1 N.
6) 3% de metanol-solucin de H2O2: con H2O2 al 30% y 80% preparacin de la
solucin de metanol.
7) sello de agente de monta:
TECNICAS

La principal aplicacin de las tcnicas de IHQ radica en la identificacin y

diferenciacin de tipos celulares, especialmente en el caso de neoplasias de
fenotipo dudoso o indeterminable mediante la valoracin habitual con tincin
de hematoxilina y eosina. Existen otras aplicaciones, como la valoracin
pronstica de ciertos tumores (marcadores de progresin) o la identificacin de
agentes infecciosos.
Aplicaciones en Patologa Oncolgica:
1. Clasificacin de neoplasias indiferenciadas: carcinoma / sarcoma /
linfoma / melanoma (Tabla 1)
2. Identificacin de metstasis de origen desconocido.
3. Distincin Carcinoma / Adenocarcinoma (Tabla 2).
4. Distincin Carcinoma / Mesotelioma. 5. Identificacin de carcinomas
neuroendocrinos. 4. Distincin y clasificacin de Sarcomas (Tabla 3)
. 5. Distincin Hiperplasias linfoides / Linfomas y subclasificacin de
Linfomas ( T o B) (Tabla 4).
Relacin de Anticuerpos Primarios disponibles:
Citopat Veterinaria dispone del siguiente banco de anticuerpos primarios:
AE1: protena expresada por la mayora de epitelios simples y epitelio
basal epidrmico.
AE3: protenas (queratinas) de alto peso molecular presentes en epitelios
de transicin (ej. Urotelial) y escamosos (epidermis).
Tincin para GFAP: marcaje especfico para astrocitos (en marrn) en un
corte de tejido nervioso. El marcaje se limita de forma muy especfica a las
zonas que contienen el antgeno buscado. La tincin en azul de fondo se
emplea
como
contraste.
4
CitopatVeterinaria
s.l.
Diagnsticos
Anatomopatolgics Font del Remei, 28-30 08023 Barcelona Tlf. 93
213.68.13 Fax: 93 285.20.91 info@citopatveterinaria.com Alfa-AT (alfa-1antitripsina): protena enzimtica intralisosomal presente en clulas
histiocticas (histiocitomas vs mastocito ms, histiocitosis). Cadenas
Kappa y Lambda: marcadores de clulas plasmticas y sus neoplasias.
CAM5.2: cito queratina de bajo peso molecular. Marcador de clula epitelial
que permite identificar como tales carcinomas pobremente diferenciados.
CD3: marcador muy especfico de clulas T, til en el fenotipaje de linfomas.
CD31: protena expresada por las clulas endoteliales, til en el
diagnstico de angiosarcomas. CD45RA (4KB5): presente en clulas
linfocticas de tipo B, una subpoblacin de clula T y clula monoctica.

CD79a: marcador de clula B, til en el tipaje de linfomas. CEA (antgeno

carcinoembrionario): protena que expresan muchos adenocarcinomas
(pulmn, pncreas, vas biliares, gastrointestinales, endometriales. CROM
(cromogranina) y SYN (sinaptofisina): protenas presentes en muchos tipos
de clula endocrina y neuronal. Presentes en la mayor parte de tumores
neuroendocrinos bien diferenciados. DES (desmina): protena presente en
clulas musculares lisas, estriadas y cardacas, til en la identificacin de
leiomiosarcomas y rabdomiosarcomas, principalmente stos ltimos. ER
(receptores de estrgenos): protena presente en el tejido glandular
mamario. Presente en la mayora de lesiones bien diferenciadas. Su
presencia en neoplasias carcinomatosas tiene implicaciones teraputicas y
pronsticas. GFAP (glial fibrillary acidic protein): presente en astrocitos y
clula ependimarias, ausente en oligodendrocitos y neuronas. Positivo en la
mayor parte 5 CitopatVeterinaria s.l. Diagnstics Anatomopatolgics Font
del Remei, 28-30 08023 Barcelona Tlf. 93 213.68.13 Fax: 93 285.20.91
info@citopatveterinaria.com de astrocitomas (se pierde parcial o
completamente en gliomas multiformes o de alto grado). Presente tambin
en paragangliomas, feocromocitomas. HMB-45: antgeno presente en la
mayor parte de lesiones melnicas, benignas o malignas. LCA (antgeno
leucocitario comn): expresado en linfocitos B y T y sus neoplasias. til en
la identificacin bsica de un linfoma frente carcinomas, sarcomas o
melanomas. MBP (myelin basic protein): protena presente, entre otras, en
clula de schwann, til en la identificacin de neoplasias de este origen.
MIB-1 / Ki-67: protena intranuclear que participa en en el ciclo celular. Su
presencia e intensidad dan idea del ndice de proliferacin de una neoplasia
maligna y tiene, por tanto, utilidad pronstica. NF (neurofilamentos):
protena expresada por neuronas. Positivo en neuroblastomas y
feocromocitomas. NSE: protena poco especfica presente en algunos
gliomas, neoplasias de origen neural y neuroendocrino. PANk: cocktail
de queratinas til en el diagnstico de carcinomas o la deteccin de
micrometstasis. PR (receptores de progesterona): receptores hormonales
presentes en el tejido glandular mamario. Su presencia en neoplasias
carcinomatosas tiene implicaciones teraputicas y pronsticas. S100:
protena til en la identificacin de neoplasias de diferenciacin neural y
melnica. VIM (vimentina): protena presente en las clulas de estirpe
mesenquimatosa. Permite identificar como tales neoplasias sarcomatosas
mal diferenciadas. 6 CitopatVeterinaria s.l.
BIBLIOGRAFIA:
http://www.efn.uncor.edu/departamentos/divbioeco/morfoani/GU
IA%20HISTOTECNOLOGIA%20APLICADA%202015.pdf
http://es.swewe.net/word_show.htm/?
276797_1&La_inmunohistoqu%C3%ADmica