Facultad de Ciencias Naturales

Laboratorio de Biotecnologa

UNIDAD No. 2
Cultivo de Tejidos y Celular Vegetal
Clonacin de plantas (micro-propagacin)
Establecimiento, multiplicacin y mantenimiento de tejidos y lneas celulares
Regeneracin de plantas in vitro y aclimatacin al ambiente externo
Aplicaciones
1. OBJETIVOS:
Al finalizar esta prctica el estudiante estar en capacidad de:
Explicar los fundamentos tcnicos y cientficos del cultivo in vitro de tejidos y
clulas vegetales
Explicar el uso del cultivo de tejidos y lneas celulares vegetales en diversos
campos de aplicacin de la biotecnologa ms utilizados en la actualidad
Desarrollar habilidades tcnicas y analticas empleadas en la micro-propagacin in
vitro de plantas, su establecimiento, multiplicacin, mantenimiento y regeneracin
de plantas utilizando como modelo los cultivos de fresa, yuca y arroz

2. INTRODUCCION

Propagacin de plantas por cultivo in vitro:

La expresin cultivo in vitro de plantas, significa cultivar plantas dentro de un frasco de
vidrio en un ambiente artificial. Esta forma de cultivar las plantas tiene dos caractersticas
fundamentales: la asepsia (ausencia de grmenes, etc), y el control de los factores que
afectan el crecimiento. El avance alcanzado por las ciencias biolgicas ha permitido en los
ltimos aos el estudio detallado de las plantas tanto a nivel celular como molecular, y en
condiciones de laboratorio es posible actualmente reproducir todos los factores que puedan
incidir en el crecimiento y desarrollo de las plantas. Este principio general se aplica
tambin al cultivo in vitro de plantas. Haberlandt, un cientfico alemn, postul a principios
del siglo pasado que las plantas eran capaces de reproducir su crecimiento a partir de
clulas aisladas, originando la hiptesis de la totipotencia celular en plantas. Sin embargo,
este investigador no pudo demostrar en forma prctica su hiptesis, debido a que la mayora
de los componentes complejos que integran los medios de cultivo actuales todava no
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haban sido descubiertos. Sera recin en la dcada de 1950 cuando se determina la

importancia del balance hormonal en las plantas, con el descubrimiento de reguladores de
crecimiento vegetales ms usadas en la actualidad.
Reproducir en condiciones de laboratorio todos los factores que conforman el ambiente de
la planta en la naturaleza es tcnicamente muy complejo. Por esa razn se realiza una
simplificacin de la realidad escogiendo aquellos factores que se puedan mantener
controlados. Cuando no se realiza el estudio con todo el ser vivo sino con solamente una
parte del mismo, se utiliza el trmino explante para indicar la parte del rgano tejido
vegetal que se cultiva in vitro. A la dificultad de reproducir las condiciones naturales en
condiciones de laboratorio, se debe aadir en este caso la dificultad de suministrar al
explante todo aquello que antes obtena del sistema completo. En resumen, el cultivo in
vitro de plantas es una tcnica que exige un control especfico del ambiente, tanto fsico
como qumico, en el que se sita al explante. Conviene, por tanto, conocer cules son los
principales factores que conforman dicho ambiente y que debern ser controlados.
La micropropagacin o propagacin clonal, es una de las aplicaciones ms generalizadas
del cultivo in vitro, a travs de la micropropagacin, a partir de un fragmento (explante) de
una planta madre, se obtiene una descendencia uniforme, con plantas genticamente
idnticas, denominadas clones. El explante ms usado para los procesos de propagacin in
vitro son las yemas vegetativas de las plantas. Los frascos que contienen las plantas se
ubican en estanteras con luz artificial dentro de la cmara de crecimiento, donde se fija la
temperatura en valores que oscilan entre los 22C y 30C, de acuerdo a la especie, y por lo
general la oscilacin entre la temperatura mnima y mxima seleccionada no debe ser
mayor a 2 C. Adicionalmente, se debe controlar el fotoperodo (nmero de horas luz
(entre 12 hr y 16 hr), la cantidad (preferiblemente 100 mols-1m-2) y calidad de la luz
(preferiblemente en el rango fotosintticamente activo entre 400 nm and 700 nm). Por su
parte, el medio de cultivo se compone de una mezcla de sales minerales (macro y
micronutrientes), vitaminas, reguladores de crecimiento, fuente de carbono (ej.: sacarosa,
maltosa, etc.), agua y agente gelificante (agar, gelrite, etc.). Algunas veces se utilizan
aminocidos, agentes anti-oxidantes, entre otros componentes. La composicin del medio
depende de la especie vegetal y de la etapa del proceso de micropropagacin.
Con finalidad puramente descriptiva se puede clasificar los principales factores no
biolgicos que afectan al desarrollo del cultivo in vitro , incluyendo:
Ambiente qumico
Composicin del medio de cultivo
pH
Ambiente fsico
temperatura
luz y fotoperodo
humedad

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Dentro del proceso de micropropagacin in vitro diferenciamos varias fases o etapas:

0: Seleccin y Preparacin de la planta madre
1: Desinfeccin de las yemas de la planta y/o desinfeccin de semillas
2: introduccin del material seleccionado in vitro
3: Multiplicacin de brotes
4: Enraizamiento
5: Aclimatacin
Esta secuencia de etapas abarca el ciclo completo de la multiplicacin de plantas in vitro.
Puede ser aplicada a diferentes especies vegetales, en cada caso se podrn incluir
simplificaciones o cambios de acuerdo a las caractersticas de las plantas, pero en trminos
generales son comunes al proceso de propagacin in vitro.
FASE 0:
PREPARACIN DE LA PLANTA MADRE
Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantes con
un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para obtener estos explantes es
recomendable mantener a las plantas madre, es decir la planta donadora de yemas, durante
un perodo de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses en un
invernadero bajo condiciones controladas. En ese ambiente se cultiva la planta en
condiciones sanitarias ptimas y con un control de la nutricin y riego adecuados para
permitir un crecimiento vigoroso y libre de enfermedades.
FASE 1:
DESINFECCIN DEL MATERIAL VEGETAL
Una vez elegida la planta madre, se extraern los fragmentos a partir de los cuales se
obtendrn los explantes. Los explantes pueden ser yemas, trozos de hojas, porciones de
races, semillas, etc. Antes de extraer los explantes se har una desinfeccin de los
fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes externos. Los contaminantes
ms comunes son los hongos y las bacterias que habitan en forma natural en el ambiente.
Una vez desinfectado el material vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia.
A efectos de obtener las condiciones de asepsia, se trabaja en cabinas de flujo laminar para
extraer los explantes a partir del material vegetal. Estos explantes se introducen en un
recipiente de cultivo conteniendo medio de iniciacin para poder controlar la sanidad y la
viabilidad, luego de realizar la desinfeccin del material con etanol al 70% seguido por lo
general de hipoclorito de sodio (agua clorada comercial), pura o diluida durante un perodo
determinado segn el material y su origen (si viene de plantas cultivadas en campo o
invernadero), seguido por 3 a 4 enjuagues en agua esterilizada para eliminar el hipoclorito
de sodio.
FASE 2:
INTRODUCCIN DEL MATERIAL IN VITRO
Luego de la desinfeccin superficial, las semillas o las yemas dependiendo del material
seleccionado, se ponen en medio de cultivo estril. En un perodo de una semana o quince
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das, comienza el proceso de germinacin o regeneracin de nuevos tejidos vegetales,

iniciando el ciclo de cultivo in vitro.
FASE 3:
MULTIPLICACIN DE LOS BROTES
Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron la FASE 1 y 2 originen
brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varias hojas. En la base de cada hoja hay
una yema que se desarrollar luego de ser puesta en contacto con el medio de cultivo.
Peridicamente estos nuevos brotes se deben sub-cultivar en un nuevo medio mediante
divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas
operaciones se realizan en la cmara de flujo laminar o en un lugar aislado que nos permita
mantener las condiciones de asepsia. De esta forma aumenta el nmero de plantas en cada
repique o divisin de las plantas.
El nmero de plantas que se obtiene depender de la especie vegetal y de las condiciones
del medio de cultivo. El nmero de plantas que se obtiene por la va de la
micropropagacin permite alcanzar incrementos exponenciales, considerando que todos los
factores que afectan el crecimiento hayan sido optimizados.
FASE 4:
ELECCIN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS EXPLANTOS
Para enraizar los explantes se utilizan principalmente plantines individuales de un tamao
aproximado de 2 centmetros. Los brotes obtenidos durante la fase de multiplicacin se
transfieren a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga hormonas
del tipo auxinas. Algunas especies de plantas no necesitan pasar por esta etapa y emiten sus
races en el mismo medio de cultivo donde desarrollan yemas nuevas, por lo tanto el
proceso de multiplicacin y enraizamiento transcurren en forma simultnea.
FASE 5:
ACLIMATACIN DE LOS EXPLANTES ENRAIZADOS
Los explantes recin enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera
que el xito o el fracaso de todo el proceso dependen de la aclimatacin. En esta etapa las
plantas sufrirn cambios de diferente tipo que permitirn la adaptacin de las mismas a
vivir en condiciones naturales. En el momento en que se extraen los explantes o plantines
enraizados de los frascos, estn poco adaptados a crecer en un invernculo, ya que estos
explantes han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y
generalmente tienen estomas (estructuras responsables de regular la transpiracin y prdida
de agua en la planta) que no son completamente funcionales frente a descensos de la
humedad relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la desecacin del explante.
Por otra parte, crecer en ambientes tan hmedos tambin suele implicar la falta de una
cutcula con cera bien desarrollada, que representa la barrera fsica para evitar la prdida de
agua a lo largo de toda la superficie de la planta.

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La siguiente lista presenta una comparacin de las caractersticas de una planta en

condiciones de laboratorio (in vitro) respecto a una planta en condiciones naturales (in
vivo):
In vitro
No realiza fotosntesis
Crecimiento en condiciones controladas
Crecimiento en condiciones de asepsia
Alta humedad relativa
Estomas no funcionales
Ausencia de pelos radiculares
Ausencia de cera en la cutcula
In vivo
Realiza fotosntesis
Crecimiento en condiciones no controladas
Exposicin a los patgenos y grmenes del ambiente
Humedad relativa variable
Estomas funcionales
Presencia de pelos radiculares
Presencia de cera en la cutcula
Los plantines enraizados, deben ser aclimatados a las condiciones de humedad del
invernadero disminuyendo progresivamente la humedad relativa e incrementando
progresivamente la intensidad de luz. Estos plantines se plantarn en contenedores
(almcigos) cubiertos por un plstico u otro material transparente para mantener la
humedad relativa elevada. La eleccin de un sustrato con buenas caractersticas fsicas, es
clave para el xito de esta etapa. Para el trasplante, elegimos un sustrato suelto, poroso, con
mezcla de arena turba, cscara de arroz quemado, para permitir un desarrollo y crecimiento
de races muy rpido. Las mezclas son diferentes y muy variadas de acuerdo a la especie
con la que estamos trabajando.
Luego de retirar cuidadosamente el medio gelificado de las races para evitar daarlas, los
plantines se enjuagan y se colocan, dependiendo de la especie, en frascos que contiene
agua y se colocan en el cuarto de cultivo in vitro por 1 semana antes de ser transferidos a
los almcigos en el invernadero, o se transfieren directamente a los almcigos con la
mezcla de sustratos seleccionada y cubiertos. Todos los das se debe controlar el nivel de
humedad en los almcigos. Por lo general, los almcigos se colocan en el invernadero en
una zona con niveles de radiacin tenue para permitir una aclimatacin progresiva de las
plantas. Si es necesario, se aplica un riego con una pulverizadora manual, para mantener un
ambiente hmedo a nivel del sustrato. A los 15 das del trasplante, se puede comenzar a
levantar la cobertura que proteje a las plantas en las horas de menor calor (temprano en la
maana o en la ltima hora de la tarde). Al comienzo las plantas se dejan media hora por
da destapadas. A la semana siguiente se dejan destapadas durante una hora. Al mes del
trasplante, se dejan tapadas durante la noche y si hay crecimiento de nuevas hojas, las
plantas pueden permanecer destapadas, y movidas a zonas de mayor radiacin solar. Las
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condiciones del cultivo in vitro, generan cambios en algunos aspectos anatmicos y

fisiolgicos de las plantas, por esta causa, durante la aclimatacin, los cambios deben ser
muy graduales, para minimizar el estrs y tener mayor tasa de sobrevivencia. Plantas
aclimatadas pueden ser transferidas al campo para permitir su completo desarrollo y
reproduccin.
La propagacin in vitro de tejidos de plantas es utilizada ampliamente para: 1) la
produccin de plantas libres de patgenos como alternativa para la conservacin de
especies silvestres amenazadas o en vas de extincin, 2) multiplicacin y conservacin de
biodiversidad gentica de especies o cultivos, 3) distribucin de material gentico que
cumple con las regulaciones fitosanitarias para el movimiento transfronterizo de especies
vegetales entre pases, 4) multiplicacin de material homogneo, libre de enfermedades con
inters comercial para iniciar plantaciones en invernadero o campo, o 5) introduccin genes
forneos de inters mediante ingeniera gentica.
Esta prctica tiene como propsito la introduccin a los protocolos generales empleados en
micro-propagacin in vitro de plantas, su establecimiento, multiplicacin, mantenimiento y
regeneracin de plantas. Se pretende tambin dar las bases tericas y tecnolgicas de su uso
en diversos campos de aplicacin de la biotecnologa mencionados en el prrafo anterior.

3. CONSULTAS PRELIMINARES A LA PRCTICA

Antes de la realizacin de la prctica el estudiante debe consultar, comprender y realizar un
resumen con conceptos bsicos que le permitan resolver las siguientes preguntas:
1. Qu es cultivo in vitro de plantas?
2. Qu es totipotencia?
3. Cules son los principales factores no biolgicos que afectan al desarrollo del cultivo
in vitro?
4. Por qu es importante controlar la temperatura durante el cultivo in vitro?
5. Por qu es importante controlar el fotoperodo, la cantidad y calidad de luz durante el
cultivo in vitro?
6. Por qu es importante controlar la temperatura durante el cultivo in vitro?
7. Cules son los componentes principales del medio de cultivo in vitro de plantas?
8. Cules son, y describa en forma general, las fases o etapas para la micropropagacin in
vitro?
9. Compare las caractersticas de una planta en condiciones de laboratorio (in vitro)
respecto a una planta en condiciones naturales (in vivo). Por qu esas diferencias,
razone?
10. Mencione 5 aplicaciones ampliamente utilizadas hoy da del cultivo in vitro de plantas

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4. SEGURIDAD DURANTE LA PRCTICA

Durante el desarrollo de la prctica, es importante recordar las normas y conductas de
seguridad y bioseguridad establecidas en la gua No 1 de este curso. Asuma que todos los
cultivos son peligrosos por lo tanto ellos pueden portar virus latentes u otros organismos
que no estn caracterizados. Las siguientes precauciones de seguridad deben tambin ser
observadas.
Utilizar los implementos de bioseguridad bata, (polainas y gorro; opcionales),
antes del ingreso al espacio con la cabina de seguridad
Lave sus manos antes de manejar el cultivo.
Lave con alcohol manos antes de iniciar su trabajo y despus de terminar
descontamine el rea de trabajo con una toalla de papel impregnada con
desinfectante.
Cumplir las reglas de bioseguridad como el uso de batas al ingreso al cuarto de la
cabina de flujo laminar.
No sature o sobrecargue la cabina, deje libre las rejillas para la circulacin
adecuada del aire.
Use pipeteador para evitar la ingestin, no coma, no beba ni fume.
Autoclave todos los desechos antes de eliminarlos.
Use tcnicas antispticas. Almacene todos los desechos lquidos y trate con
blanqueador o desinfectante.

Use guantes, gafas y dems equipo de proteccin.

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5. MATERIALES Y REACTIVOS (por equipo de 2 personas c/u):

Equipos

Cantidad

Estereoscopio
1
Cabina de transferencia*
1
Cuarto de Cultivo
1
*Esterilizar previamente con etanol 70% y exposicin a luz UV

Reactivos
Medio de cultivo para propagacin de
fresa (1 frasco de compota)
Medio de cultivo para propagacin de
yuca (1 frasco de mayonesa pequeo)
Medio de cultivo NBA para
embriones de arroz (1 caja)
Etanol al 70% en tubo Falcon
Hipoclorito de sodio al 2.5% en tubo
Falcon
Agua destilada estril (en frasco
estril)
Bandeja con suelo CIAT por grupo
Bandeja con suelo comercial por
grupo
Tubo Falcon con 50 mol de sales
de medio MS

Cantidad
60 ml
40 ml
20 ml
15 ml
15 ml
100 ml
1
1
2

Materiales e Insumos
Caja Petri vaca estril
Pinzas largas estril
Bistur No 3 estril
Cuchillas No 11 para bistur estril
Tubo Falcon de 50 ml con etanol 96% colocado
verticalmente dentro de un frasco para flamear
herramienta
Tubos falcn de 15 ml estril
Beaker de 500 ml
Frasco lavador con etanol al 70%
Bandeja de descarte
Papel toalla estril envuelta en papel de aluminio
Tubo eppendorf con 10 Semillas de arroz con cscara
en Caja Petri con papel lija para descascar la semilla
de arroz

Cantidad
4
2
2
2
1
4
1
1
1
10

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Mechero
Encendedor
Frasco con plantas de yuca propagadas in vitro
Frasco con plantas de fresa propagadas in vitro
Un par de tijeras
Bolsa plstica transparente grande para cubrir
bandejas con plantas por grupo
Papel plstico transparente para envoltura de
alimentos por grupo
Frasco vaco de propagacin de yuca por grupo
Frasco vaco de propagacin de fresa por grupo
Caja para incubar en la oscuridad

1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

6. ACTIVIDADES
ACTIVIDAD No 1. Fase 1: Desinfeccin del material vegetal, y Fase 2: Introduccin
del material in vitro - Cultivo de arroz (Oryza sativa)
Objetivo: desinfectar y aislar embriones a partir de semilla madura de arroz, cultivar los
embriones aislados para la induccin de embriones somticos in vitro
Metodologa
Este protocolo fue desarrollado en la Unidad de Investigacin en Biotecnologa del CIAT
por Eddie Tabares y Zaida Lentini (actualmente Universidad Icesi). Este procedimiento
permite la produccin de callos embriognicos de arroz aptos para la transformacin
gentica de arroz y regeneracin eficiente de plantas frtiles de una amplia gama de
variedades que representan la diversidad gentica del cultivo.
Materiales por equipo de 2 personas c/u:
a. 10 semillas de arroz con cscara
b. Caja Petri con papel lija para descascar la semilla de arroz
c. Tubo Falcn de 15 ml con 10 ml de etanol 70%
d. Tubo Falcn de 15 ml con 10 hipoclorito de sodio al 2.5% con 3 gotas de Tween al
20%
e. Botella con 100 ml de agua destilada estril
f. Pinzas largas estril (2)
g. Bistur No 3 estril (2)
h. Cuchillas No 11 para bistur (2)
i. Una Caja Petri vaca estril (1)
j. Una Caja Petri con medio de cultivo NBA
k. Un mechero con etanol del 96%
l. Encendedor
m. Un tubo Falcon con etanol del 96% colocado verticalmente dentro de un frasco
n. Un estereoscopio
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Procedimiento
1. Encender la cabina de flujo laminar al menos 15 minutos antes de iniciar el trabajo
2. Limpiar bien la cabina con etanol 70% la superficie y las paredes de la cmara de
flujo laminar.
3. Introducir el estereoscopio en la cabina de flujo laminar, colocarlo en el rea de
trabajo estril y limpiarlo cuidadosamente con etanol al 70%
4. Preparar todos los materiales listados arriba y ubicarlos en la cmara de flujo
laminar asegurndose de dejar un rea libre de trabajo entre la salida del aire de la
cmara, el estereoscopio y los implementos a utilizar
5. Afuera de la cabina de flujo laminar, tomar 10 semillas de arroz, colocarlas entre las
2 tapas de la caja petri que tiene el papel de lija, hacer movimientos rotativos suaves
para desprender las cscara del arroz sin daar el embrin
6. En la cabina de flujo laminar, colocar las semillas descascaradas dentro del tubo con
el etanol 70% e incubar por 3 minutos. Descartar el etanol con cuidado de no perder
las semillas
7. Colocar las semillas tratadas con el etanol, dentro del tubo con hipoclorito de sodio al
2.5% con 3 gotas de Tween al 20% e incubar por 10 minutos. Descartar la solucin con
cuidado de no perder las semillas
8. Enjuagar tantas veces sea necesario, asegurndose de eliminar el aspecto jabonoso
del agua descartada
9. Colocar las semillas esterilizadas en la caja Petri vaca
10. Separar con cuidado el embrin del endospermo de la semilla, utilizando el lado
romo de la cuchilla del bistur
11. Tomar una caja Petri con el medio de cultivo NBA
12. Abrir la caja cerca del mechero, y colocarla con la parte interna hacia arriba cerca
de la pared interna de la cabina de flujo laminar
13. Colocar cada embrin con el escutelo (el lado que estaba adherido al endospermo)
hacia arriba y el lado opuesto haciendo buen contacto con el medio de cultivo NBA
14. Cerrar la caja y sellarla caja con papel plstico de alimentos, asegurarse que no
queden espacios vacos
15. Colocar el nombre de la variedad, fecha e iniciales de los miembros del equipo en la
parte superior de la caja
16. Incubar en el cuarto de crecimiento por 3 semanas.
NOTA: Observar el cultivo a los 3 das para detectar si hay fuente de contaminacin. Si
est contaminado, debe ser entregado al monitor para ser autoclavado y luego descartado.
Si no se contamina, observa la respuesta de cada embrin al estereoscopio, una vez por
semana. Al cabo de 3 semanas, deben aparecer embriones somticos sobre el tejido
originalmente sembrado. Estos embriones tienen un tamao alrededor de 1 mm. Estos
embriones se separan del tejido original y se sub-cultivan en medio fresco para dar origen a
callos embriognicos los cuales puede ser utilizados para regeneracin de plantas, o
material de partida para la transformacin gentica. Material similar a ste, cultivado
previamente, va a ser utilizado en la prctica de transformacin gentica de plantas

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ACTIVIDAD No 2. Fase 3 Multiplicacin de brotes - Cultivos de fresa (Fragaria

ananassa) y yuca (Manihot esculenta)
Objetivo: Propagar y aprender a diferenciar metodologas para la propagacin clonal de
plantas y aplicaciones
Metodologa
En el caso de la yuca, el protocolo que se va a practicar en este laboratorio es el que se
utiliza en el CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical, Cali) para el
mantenimiento de bancos de germoplasma (coleccin de variedades y especies silvestres)
de yuca a gran escala y envo de materiales libre de patgenos entre pases. El material de
partida, son yemas apicales de plantas colectadas en campo que son tratadas para eliminar
fuente de agentes patgenos (virus, bacterias, hongos). El material propagado el un clon
gentico del material original y certificado de estar libres de patgenos. Con este tipo de
procedimiento, se pueden conservar hasta 5000 accesiones en un cuarto de cultivo como el
que se dispone en el laboratorio de investigacin en biotecnologa y biologa molecular de
la Universidad Icesi. En el caso de la fresa, este protocolo se va utilizar fue optimizado por
la investigadora Tomoko Sakai, FundaCIAT para la multiplicacin comercial de fresa. El
material de partida son plantas provenientes de la germinacin de semillas de fresa y
subsecuente multiplicacin de yemas axilares introducidas in vitro.

Materiales por equipo de 2 personas c/u:

a. Un frasco con plantas de yuca propagadas in vitro
b. Un frasco con plantas de fresa propagadas in vitro
c. 2 frascos con medio de propagacin de fresa
d. 2 frascos con medio de propagacin de yuca
e. Pinzas largas estril (2)
f. Bistur No 3 estril (2)
g. Cuchillas No 11 para bistur (2)
h. Un mechero con etanol del 96%
i. Encendedor
j. Un tubo Falcn con etanol del 96% colocado verticalmente dentro de un frasco
k. 2 cajas de Petri vacas y estriles
Procedimiento
1. Limpiar bien el rea de trabajo de la cabina con etanol 70%
2. Preparar todos los materiales necesarios y ubicar en la cmara de flujo laminar
despus de la limpieza con etanol.
3. Yuca
a) Tomar el frasco con plantas de yuca propagadas in vitro
b) Destapar el frasco en el rea de seguridad estril dentro de la cabina de flujo
lamiar
c) Flamear el borde del frasco
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d) Flamear el borde interno de la tapa y colocarla con la parte interna hacia arriba
cerca de la pared interna de la cabina de flujo laminar
e) Introducir un par de pinzas largas estril y con cuidado tome una planta in vitro
sujetndola suavemente en la base del tallo a la altura de contacto con el medio
f) Sacar la planta y colocarla sobre la caja de petri vacia
g) Realizar cortes diagonales a lo largo del tallo tallo aprox a 5 mm por debajo y
arriba de la altura de cada yema axilar
h) Cortar diagonalmente el pecolo aprox a 5 mm entre la lmina de la hoja y el
tallo asegurndose de no daar la yema axilar
i) Colocar cada segmento cortado que contiene la yema axilar, colocando la base
del tallo en contacto con el medio
j) Repetir esta operacin hasta sembrar todos los segmentos en el frasco (mximo
5 yemas por frasco)
k) Flamear el borde del frasco
l) Flamear el borde interno de la tapa y cerrar el frasco cerrar el frasco de forma
hermtica
m) Rotular el frasco con el nombre de la especie, fecha e iniciales de los miembros
del equipo
n) Incubar el material sembrado en un cuarto de cultivo a 12 hr de fotoperodo y 28
C - 30 C por 4 semanas
4. Fresa
a) Para la propagacin de fresa repetir lo pasos de la (3.a) a la (3.f)
b) Realizar cortes suaves para separar cada brote adventicio, haciendo una incisin
hacia la base entre cada brote.
c) Para seleccionar el brote a separar, observe si hay races en la base y trate de
hacer el corte entre grupo de races
d) Repetir esta operacin hasta sembrar todos brotes adventicios separados en el
frasco (mximo 5 brotes por frasco)
e) Flamear el borde del frasco
f) Flamear el borde interno de la tapa y cerrar el frasco de forma hermtica
g) Rotular el frasco con el nombre de la especie, fecha e iniciales de los miembros
del equipo
h) Incubar el material sembrado en un cuarto de cultivo a a 12 hr de fotoperodo y
22 C - 24 C por 4 semanas
NOTA: Observar el cultivo a los 3 das para detectar si hay fuente de contaminacin. Si
est contaminado, debe ser entregado al monitor para ser autoclavado y luego descartado.
Si no se contamina, observa una vez por semana. Al cabo de 4 semanas, el material debe
haber generado hojas nuevas, crecido y en algunos casos mostrar formacin de races. En el
caso de la yuca, cuando las plantas alcanzan una altura de 8 a 10 cm, estn listas para ser
propagadas in vitro nuevamente, o sacadas al proceso de aclimatacin para trasplante al
invernadero y posteriormente al campo. En el caso de la fresa, cuando el brote original
muestre formacin de brotes adventicios vigorosos, las plantas estn listas para ser
propagadas in vitro nuevamente, o sacadas al proceso de aclimatacin para trasplante al
invernadero y posteriormente al campo.
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ACTIVIDAD No 3. Aclimatacin de los brotes o plantas regeneradas y enraizadas.Cultivos de fresa (Fragaria ananassa) y yuca (Manihot esculenta)
Metodologa
La siguiente actividad tiene como objetivo determinar el mejor procedimiento para permitir
la aclimatacin de plantas transferidas de condiciones in vitro al invernadero, para su
posterior transferencia al campo, crecimiento y desarrollo hasta la madurez.
Materiales por grupo de laboratorio:
a. Un frasco con plantas de yuca propagadas in vitro
b. Un frasco con plantas de fresa propagadas in vitro
c. Un par de pinzas largas
d. Dos tubos Falcon con sales de medio MS
e. Una bandeja con suelo CIAT
f. Una bandeja con suelo comercial
g. Papel plstico transparente para envoltura de alimentos
h. Dos bolsas grandes transparentes para introducir cada bandeja con suelo y cerrarla
arriba
Procedimiento
1. Trabajar al lado de lavamanos
2. Destapar el frasco con plantas de yuca y de fresa propagadas in vitro y con races
bien desarrolladas
3. Con las pinzas, tomar las plantas por la base del tallo en contacto con el agar y halar
suavemente asegurndose que el tallo no se quiebre y de no daar las races
4. Retirar cuidadosamente el medio gelificado de las races para evitar daarlas
5. Enjuagar las races cuidadosamente
6. Realizar los siguientes tratamientos:
a. Colocar un grupo de las plantas de cada especie por separado en frascos que
contienen suficiente sales de medio MS para cubrir las races. Asegurarse
que el follaje de las plantas no quede inmerso en la solucin. Sellar la boca
del frasco con papel transparente para envolver alimentos.
b. Colocar el nombre de la variedad, fecha e iniciales de los miembros del
equipo en el frasco
c. Sembrar las plantas de cada especie en las bandejas que contienen suelo
CIAT o suelo comercial por separado
d. Introducir cada bandeja por separado en una bolsa plstica transparente y
cerrarla de manera de generar una cmara hmeda que evite la
deshidratacin de las plantas
7. Incubar el material sembrado en un cuarto de cultivo a 12 hr de fotoperiodo y 22 C 24 C por 2 semanas
8. Primero, incubar en luz indirecta por 1 semana
9. En el caso de las plantas que estn en frascos, aadir suficiente sales de medio MS
para cubrir las races y evitar que las plantas de deshidraten

10. Evaluar el vigor y crecimiento de las plantas en cada tratamiento

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11. Posteriormente, transferir a luz directa hasta observar que las plantas crecen, y
producen hojas nuevas (aproximadamente otra semana).
12. Evaluar el vigor y crecimiento de las plantas en cada tratamiento
13. Transferir las plantas endurecidas al invernadero
14. Permitir el desarrollo por 3 semanas
15. Evaluar el vigor y crecimiento de las plantas en cada tratamiento
16. Con base a los resultados, definir cul es el mejor procedimiento para la
aclimatacin de las plantas de condiciones in vitro al invernadero, para su posterior
transferencia al campo bajo condiciones estndar de cultivo

PARA FINALIZAR LA PRCTICA

1. Para finalizar el trabajo, sacar todos los materiales de la cabina de flujo laminar
2. Limpiar bien la cabina con etanol 70% la superficie y las paredes de la cmara de
flujo laminar.
3. Apagar la cabina de flujo laminar
4. Eliminar todos los materiales de desecho de acuerdo a las instrucciones del monitor
5. Organizar los implementos de trabajo para ser retirados por el monitor
6. Dejar el laboratorio organizado

7. BIBLIOGRAFA

Experiments in Plant tissue Culture. John Dodds and Lorin Roberts (Eds.). Cambridge
University Press. Cambridge
Cultivo de Tejidos en la Agricultura. Fundamentos y Aplicaciones. William roca y Luis
Mroginski (eds.) CIAT. Cali
Biologa. Scott Freeman (Ed.) 3a Edicin. Pearson Educacin. Madrid

8. PREGUNTAS DE COMPLEMENTACIN A LA PRCTICA:

De acuerdo al material suministrado:
1. Compare las caractersticas de una planta en condiciones de laboratorio (in vitro)
respecto a una planta en condiciones naturales (in vivo). Por qu esas diferencias?
Razone su respuesta.

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2. Mencione 5 aplicaciones ampliamente utilizadas hoy da del cultivo in vitro de plantas

3. Con base a lo que aprendi hoy y su conocimiento general, comente cmo podra
usted utilizar el cultivo in vitro de plantas, para qu y cual especie?

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