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ANDALUCIA POLIVALENTES

CETECAL
Auxiliar de Laboratorio de Industrias Alimentarias

CONTROLES ANALITICOS DE AGUAS DE CONSUMO


(Real Decreto 140/2003, de 7 de febrero)
ANLISIS NORMAL
-

Olor y sabor (cualitativo)


Conductividad elctrica.
pH.
Turbidez.
Amoniaco.
Nitratos.
Nitritos.
Oxidabilidad al permanganato.
Cloro residual libre.

Bacterias aerobias a 37 C y a 22C.


Coliformes totales
Coliformes fecales
Estreptococos fecales.
Cl. Sulfitorreductores.

ANLISIS MICROBIOLOGICO
PARAMETRO

VALOR OBTENIDO

Recuento
colonias
aerobias
mesfilas a 37 +/- 1C
Recuento
colonias
psicrotrficas a
22 +/- 1C

VALOR LIMITE
10 ufc/ ml

aerobias
100 ufc/ ml

Coliformes totales

< 1 ufc/ml

Coliformes fecales

< 1 ufc/ml

Estreptococos fecales

< 1 ufc/ml

Clostridium sulfito-reductores

Ausencia/20 ml

Nota: el cloro residual, olor y sabor, sern parmetros medidos in situ por la persona
encargada de la recogida de muestras.
BIBLIOGRAFA:
- M del Rosario Pascual Anderson, Vicente Caldern Pascual. Microbiologa Analtica para
alimentos y bebidas. Ediciones Daz de Santos. 2 Edicin, 2000.
- Manual Bsico de microbiologia Cultimed. Editado por Panreac Qumica S.A. 2 Edicin, 1998.

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RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS (37 Y 22C)


1 DEFINICIN
En general, el recuento de la flora aerobio mesfila es una prueba para conocer las condiciones
de calidad sanitaria del agua analizada.
2 MATERIAL Y MEDIOS DE CULTIVO
-

Pipetas estriles de 1 ml.


Placas Petri estriles de 90 mm de dimetro.
Estufa de incubacin, 37 y 22 +/- 1C
Agar nutritivo de recuento (Mtodos Estndar Agar, APHA)

3 FUNDAMENTO DEL METODO


La composicin del medio basada en la peptona de caseina como aportacin nutritiva, el
extracto de levadura como sustrato vitamnico y la glucosa como fuente energtica, favorece el
crecimiento de la mayor parte de los microorganismos, sin precisar de otros aditivos.
Este medio es empleado para el recuento bacteriano en leches, carnes, aguas, productos
alimenticios en general, productos farmacuticos, productos cosmticos y cualquier tipo de
muestra.
4 PROCEDIMIENTO DE REFERENCIA: METODO DE RECUENTO EN PLACA
Se utiliza para determinar el nmero de microorganismos por mililitro del agua en estudio,
mediante el empleo de tcnicas en placas de agar.
TCNICA:
Paso 1.- A partir de la muestra (o de diluciones de la misma) y por duplicado, depositar con
pipeta estril, 1 ml en placas de Petri estriles de 90 mm de dimetro.
Paso 2.- Aadir a cada placa unos 15 ml de agar de APHA previamente licuado y atemperado
a 47C.
El tiempo transcurrido entre depositar la muestra en la placa y el posterior vertido del medio
de cultivo sobre las mismas, no debe de exceder de 10 minutos.
Paso 3.- Mezclar perfectamente medio e inculo, lo cual se consigue moviendo la placa sobre
la superficie de la mesa en crculos y en forma de cruz, evitando que el medio llegue a
impregnar la tapa de la placa. Dejar solidificar el agar en las placas sobre una superficie
horizontal.
Una vez solidificado el agar, las placas se invierten y se introducen en la estufa de cultivo a una
T de 37 y 22 +/- 1C, durante 72 h.
Paso 4.- Transcurrido el tiempo de incubacin, se cuentan las colonias en aquellas placas que
muestren menos de 300 colonias aisladas. Las colonias contadas sern marcadas con
rotulador, para evitar ser contadas de nuevo.
El nmero total de colonias contadas, multiplicado por el factor de dilucin de la placa elegida
(en caso de necesitarse), da como resultado el recuento total de microorganismos por ml de la
muestra analizada.

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INVESTIGACION
Y
RECUENTO
DE
COLIFORMES
COLIFORMES FECALES (ESCHERICHIA COLI)

TOTALES

1 DEFINICION
Las Enterobacteriaceae lactosa positivas o grupo coli-aerogenes, pertenecen a la familia de la
enterobacterias y se caracterizan por su capacidad para fermentar la lactosa con produccin de
cido y gas, ms o menos de forma rpida, en un periodo de 48 h y con una temperatura de
incubacin comprendida entre 30-37 C.
Dentro de este grupo, son los coliformes fecales los que tienen significado sanitario y, por
consiguiente, los que ms interesan en el anlisis microbiolgico de agua y alimentos. Este
grupo es considerado como presuntos Escherichia coli.
La determinacin de E. coli en los alimentos, tiene como finalidad servir de ndice de
contaminacin fecal de los mismos.
E. coli es
Debido a
contrario,
alimentos

huesped constante del intestino del hombre y de los animales de sangre caliente.
su especificidad, es considerado un buen ndice de contaminacin fecal. Por el
vive poco tiempo en un ambiente extraentrico, por lo que su presencia en los
es indicativa de una contaminacin reciente.

Se destruye a temperatura de pasteurizacin y tambin durante su almacenamiento en fro,


sobre todo a temperatura de congelacin.
Su escasa resistencia hace que no sea un buen indicador de flora patgena, ya que en algunos
casos como la Salmonella, es mucho menos resistente a las condiciones ambientales y a la
accin del fro.
Pertenecen a la familia de las enterobacteriaceae y dentro de ellas al grupo de los coliformes
ya que son capaces de fermentar la lactosa en presencia de sales biliares con formacin de gas
y cido a T de 30 C y hasta ms de 44 C. Otra caracterstica bioqumica de E. coli, es su
capacidad para producir Indol en Agua de triptona incubada a 44.5C durante 48h.
2 MATERIAL Y MEDIOS DE CULTIVO
-

Pipetas estriles de 1 ml con divisiones de 0.1 ml.


Pipetas estriles de 10 ml con divisiones de 1 ml.
Placas de Petri estriles de 90 mm de dimetro.
Estufas de incubacin de 30 y 44.5 +/- 1C
Bao mara
Asas de siembra
Tubos de ensayo
Campanas Durham
Caldo Lactosado biliado verde brillante (BGBL)
Caldo EC
Agar de Levine (Eosina Azul de Metileno, Agar)
Reactivo de Kovacs
Medio Kliger

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3 FUNDAMENTO DEL METODO


Caldo Lactosado Biliado Verde Brillante: el objetivo de este medio es el de poder inhibir el
crecimiento de los microorganismos distintos de los coliformes, al tiempo que stos puedan
crecer sin restriccin. Con la presencia de la Bilis de Buey y del Verde Brillante (ver
composicin del medio de cultivo), se consigue la inhibicin de casi la totalidad de los
microorganismos gram-positivos y de los gram-negativos distintos de los del grupo de los
coliformes. Es importante conocer que la concentracin de Verde Brillante es crtica para evitar
el crecimiento de microorganismos anaerobios capaces de fermentar la lactosa a 44 C, lo cual
podra falsear los resultados.
Caldo EC: la presencia de sales biliares determina la inhibicin de las esporas y los
estreptococos fecales. La mezcla de fosfatos regula el pH del medio. La Triptosa es el elemento
nutritivo y el sodio cloruro aporta la salinidad necesaria para el buen crecimiento de los
grmenes. La Lactosa favorece el crecimiento de los coliformes, y su consumo se manifiesta
con la aparicin de gas en las campanas Durham.
Agar de Levine: la Eosina y el Azul de metileno, son productos que inhiben parcialmente el
crecimiento de microorganismos Gram positivos, entre ellos los Estreptococos fecales. Adems
la combinacin de ambos componentes, permite la diferenciacin entre los microorganismos
lactosa positivos de los lactosa negativos.
Los coliformes dan colonias violeta oscuro, con centro ms oscuro. E. coli, presenta
unas colonias muy caractersticas ya que van del prpura al verde, con brillo
metlico.
Hierro de Kligler, Agar: a travs de este medio se diferencian los bacilos entricos gram (-)
tanto por la capacidad de fermentar la lactosa y/o glucosa como por la de producir hidrgeno
sulfuro. La acidificacin del medio a causa del proceso fermentativo se pone de manifiesto con
un cambio de color del rojo de fenol que pasa de rojizo a amarillo. Los microorganismos que
slo fermentan glucosa como Salmonella y Shigella, que se encuentra en una concentracin 10
veces inferior a la lactosa, aunque aparece el color amarillo, slo lo hace en la columna vertical
del medio (base del tubo), mientras que en la superficie inclinada se restablece el color rojo
por oxidacin del cido. Cuando el color amarillo obtenido en la acidificacin del medio, es
producido por la fermentacin de la lactosa, es persistente de manera que la superficie
inclinada se mantiene amarilla. Los cultivos que contienen microorganismos capaces de formar
Hierro III Sulfuro, presentan el caracterstico precipitado negro. La produccin de gas se
observa por la aparicin de burbujas de aire e incluso por rotura del propio gel.

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4 PROCEDIMIENTO DE REFERENCIA: METODO NMP
Paso 1.- Siembra en medio BGBL
A partir de la muestra a analizar, tomar 10ml, y aadirlo en los primeros tres tubos de la serie
de nueve tubos con 10 ml de medio BGBL., a los tres segundos aadimos 1ml y a los tres
ltimos 0.1ml. Comprobar que cada uno de los tubos contiene una campana Durham.
Incubar a 30C durante 48 h.
Al cabo del tiempo de incubacin, comprobar la presencia de tubos positivos: turbidez del
medio con leve viraje a amarillo y produccin de gas en la campana. Comprobar el NMP en las
tablas y anotarlo, este sera el resultado de Coliformes totales en 100 ml de muestra.
Paso 2.- Siembra en Caldo EC
De cada tubo positivo en BGBL, tomar 1ml y aadirlo en un tubo con 10 ml de Caldo EC y
campana.
Incubar a 45 C durante 24-48 h.
Los tubos positivos presentan turbidez y gas en la campana. Hacer recuento de los mismos,
comprobar el NMP y anotarlo. Este sera el resultado de Coliformes fecales por 100 ml de
muestra.
Paso 3.- Confirmacin de los tubos positivos
Siembra en Agar de Levine: Sembrar de cada tubo positivo en Caldo EC, dos placas con Agar
de Levine. La siembra se har con asa de platino procurando evitar el acmulo de colonias que
no nos permita observar el caracterstico color verde metlico de las mismas.
Prueba del Indol: de cada 1-2 colonias se siembran tubos con agua de triptona y se incuban en
bao mara durante 24 h a 44.5 C. Transcurrido este tiempo adicionar 0.5 ml de reactivo de
Kovacs y se observa la aparicin de un anillo rojo bermelln en la superficie del medio (prueba
positiva) o amarillento (prueba negativa).
Paso 4.- Otras pruebas confirmativas:
Siembra de colonias en medio Kliger: tomar una colonia bien diferenciada de cada placa y
sembrarla en picadura sobre el medio, de manera que tambin se siembre el pico de flauta. E.
coli va a presentar las siguientes caractersticas:
Superficie inclinada: amarilla
Base: amarilla
Gas: +
H2 S: -

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INVESTIGACION DE ESTREPTOCOCOS FECALES


1 DEFINICIN
De acuerdo con el esquema de Lancefiel, los estreptococos, se agrupan antignicamente
mediante las letras A, B, C, D, etc. Al grupo D de Lancefield, pertenecen los estreptococos
fecales, por ser su hbitat normal el tubo digestivo de animales de sangre caliente. Entre sus
caractersticas peculiares, est el poder crecer a T de 45C, y en medios con un 4% de bilis.
Dentro de los estreptococos fecales estn los enterococos (Streptococcus faecalis y sus
variedades) que viven generalmente en el intestino humano. Otros estreptococos fecales viven
en los animales.
Los estreptococos son considerados indicadores de contaminacin fecal y su presencia en los
alimentos indica falta de higiene o condiciones de almacenamiento defectuosas, excepto en los
alimentos en los que intervienen como flora habitual de procesos fermentativos.
Son muy resistentes a las condiciones adversas (congelacin, desecacin, tratamiento trmico,
etc), por lo que se consideran buenos indicadores para valorar, las condiciones higinicas y de
conservacin de alimentos congelados y desecados cuando aparecen en cifras elevadas.
Preferentemente, se utilizan como indicadores fecales en el agua.
2 MATERIAL Y MEDIOS DE CULTIVO
-

Pipetas estriles de 1 ml con divisiones de 0.1 ml.


Pipetas estriles de 10 ml con divisiones de 1 ml.
Placas de Petri estriles de 90 mm de dimetro.
Estufas de incubacin de 37 +/- 1C
Asas de siembra
Tubos de ensayo
Caldo presuntivo Kanamicina-aesculina-azida (KAA)
Agar confirmativo KAA

3 FUNDAMENTO DEL METODO:


Caldo presuntivo Kanamicina-aesculina-azida (KAA) y Agar confirmativo Kanamicina-aesculinaazida: La selectividad de estos medios para los enterococos es muy elevada e incluso superior
a la de otros medios comparables. La Kanamicina sulfato y la azida sdica innhiben el
crecimiento de la flora acompaante, mientras que los enterococos pueden crecer sin
restriccin. A su vez estos microorganismos hidrolizan la aesculina con la produccin de
glucosa y esculetina, la cual reacciona con el amonio hierro III citrato para dar un complejo de
color variable entre el verde y el negro.
Caldo cerebro corazn (BHI): la peptona, infusin de cerebro de ternera e infusin de corazn
de res, son los nutrientes bsicos de este medio. La glucosa se emplea para la fermentacin y
el fosfato como tampn. Lo emplearemos como paso intermedio en la prueba de la Dnasa.

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4 PROCEDIMIENTO DE REFERENCIA: METODO NMP
Paso 1.- Siembra en caldo KAA
A partir de la muestra, sembrar en una batera de nueve tubos con 10 ml de caldo KAA cada
uno, 10 ml en los tres primeros, 1 ml en los tres segundos y 0.1 ml en los tres ltimos.
Incubar los tubos a 37C durante 24 h.
Los tubos positivos presentarn un ennegrecimiento.
Paso 2.- Siembra en agar KAA
A partir de cada tubo positivo, sembrar con asa de siembra, 0.1 ml en dos placas con agar
KAA.
Incubar a 37C durante 24 h.
Las colonias rodeadas de un halo negro, correspondern a estreptococos fecales.
El nmero de Streptococos D de Lancefield por 100 ml de muestra se obtiene por lectura en la
tabla del NMP de tres series de tres tubos de acuerdo con los tubos positivos en caldo KAA y
confirmados en agar KAA.
Paso 3.- Pruebas confirmativas
Catalasa: se determina la presencia de catalasa aadiendo 1 ml de agua oxigenada de 10
volmenes en un cultivo reciente del microorganismo problema en caldo BHI, pero nunca en
medios que contengan azida sdica. En caso positivo, se producen burbujas por
desprendimiento de oxgeno.
El grupo Streptococos D de Lancefield es catalasa negativo.
Crecimiento en presencia de cloruro sdico al 6.5%: los enterococos, dentro del grupo
Streptococus D de Lancefield, crecen en caldo BHI con 6.5% de cloruro sdico previa
incubacin a 37 C durante 72 h.
St. Equi y St. Bovis no crecen en este medio.
Crecimiento a 45C: tomar un cultivo reciente del microorganismo a estudiar en caldo BHI e
incubar a 45 C durante 24 48 h.
Todo el grupo crece a 45 C.

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RECUENTO
DE
ESPORULADAS)

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CLOSTRIDIUM

SULFITO-REDUCTORES

(FORMAS

1 DEFINICIN
Este grupo de microorganismos se suele utilizar para apreciar la calidad higinica del agua y
productos animales o de origen animal. Su nmero es escaso en productos frescos. La
capacidad de esporular les confiere una gran resistencia.
El grupo bacteriano de los sulfitos-reductores est integrado por microorganismos
pertenecientes al gnero Clostridium, los cuales tienen en comn reducir los sulfitos a sulfuros.
Otra de sus caractersticas es que son anaerobios estrictos.
2 MATERIAL Y MEDIOS DE CULTIVO
-

Tubos de 25 x 150 mm
Pipetas de 10 ml estriles con divisiones de 0.1 ml.
Estufa de cultivo a 46 C
Jarra de anaerobiosis
Bao termosttico
Agar sulfito-polimixina-sulfadiazina (SPS)

3 FUNDAMENTO DEL MTODO


Agar SPS: Para la deteccin de las formas esporuladas de Clostridium sulfito reductores, se
utilizan medios con sulfito de sodio, en los que por la capacidad de estos microorganismos para
reducir esta sustancia, se produce sulfuro de hierro al actuar sobre el compuesto de hierro. La
presencia del sulfuro de hierro se pone de manifiesto por el color negro que presentan las
colonias.
4 PROCEDIMIENTO DE REFERENCIA: RECUENTO EN TUBOS
Para obtener nicamente las formas esporuladas, se aprovecha su termorresistencia
calentando a 80C la muestra. De esta manera se destruyen las formas vegetativas.
Paso 1.- Destruccin de las formas vegetativas
Se toman 100 ml de muestra y se calientan en bao mara regulado a 80C durante 5 minutos.
Enfriar inmediatamente bajo el grifo.
Paso 2.- Regeneracin del medio de cultivo
El medio agar SPS (tubo con 20 ml de medio), se funde y regenera calentndolo en agua
hirviendo durante 10 minutos para expulsar el oxgeno. Despus se enfra hasta alcanzar 47
50C, bajo un chorro de agua fra.
Paso 3.- Tcnica
Sembrar 20 ml de muestra (en cinco tubos con SPS), previamente calentada como en paso 1,
en el medio SPS, previamente regenerado, como en paso 2. Para la siembra, se introduce la
pipeta con cada dilucin hasta el fondo de agar y se va depositando el inculo lentamente de
abajo a arriba. Cubrir la superficie con una capa de parafina estril. Solidificado el medio,
incubar en estufa a 46C, en anaerobiosis (jarra de anaerobiosis), durante 2448 h.
Contar el n de colonias negras crecidas en el agar y multiplicarlo por el factor de dilucin del
tubo (si es que fuera necesario). Esta cifra dar el n de esporas de Clostridium sulfitoreductores por gramo o ml de muestra.

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