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Inmunologa. Curso 2009-10.

Tema 12

TEMA 12: TCNICAS INMUNOLGICAS III. Enzimoinmunoanlisis.


Seroperfiles y su aplicacin en veterinaria. Western blot. Inmunomigracin.
Inmunohistoqumica.
OBJETIVOS
-

Comprender los fundamentos de las tcnicas inmunolgicas basadas en la


participacin de una enzima y sus sustrato y su aplicacin en el diagnstico
veterinario.

Comprender la aplicacin de los seroperfiles en veterinaria.

TCNICAS QUE EMPLEAN ENZIMAS


Marcadores: enzimas que actan sobre un sustrato para desarrollar color visible, luz o
fluorescencia.
Enzimas ms utilizadas: peroxidasa, fosfatasa alcalina, luciferasa, glucosa-6-Pdeshidrogenasa, etc.
a) ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)(ENZIMOINMUNOANLISIS): Se
utiliza para detectar y cuantificar tanto Ac como Ag. Utiliza placas de poliestireno
con mltiples pocillos que se tapizan con el Ag o con el Ac. La reaccin se
revela aadiendo el sustrato que al actuar sobre la enzima del conjugado da
lugar a un color visible (amarillo, azul, etc) que es cuantificable mediante un
colormetro especial (Lector de ELISA). Es muy utilizada en diagnstico de
numerosas enfermedades humanas (ej. SIDA) y animales (ej: Herpes virus
bovino-1, aspergilosis canina, etc.). Existen diversas modalidades:
Para la deteccin de anticuerpos especficos en el suero problema:
a.1. ELISA indirecto: emplea placas tapizadas con el Ag; Ac anti-Ig
(secundario) unido a la enzima (conjugado).
a.2. ELISA de competicin: emplea placas tapizadas con Ac especfico.
El suero problema se incuba previamente con el Ag antes de aadirlo a la
placa, y por tanto, compite con l. La ausencia de color es positivo.
Para la deteccin de antgeno:
a.3. ELISA directo: Deteccin de Ag, que se fija a la placa, con el Ac
especfico marcado.
a.4. ELISA EN SANDWICH de Ac: Aunque sirve tanto para detectar Ac
como Ag, es la modalidad ms empleada para deteccin de Ag. Emplea

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placas tapizadas con el Ac especfico; Ac especficos marcados o sin


marcar.

ELISA indirecto

ELISA directo

ELISA sndwich (de Ag y de Ac)


DAS
HADAS

b) Inmunoblotting, inmunoelectrotransferencia o Western blot (WB): Se utiliza


para detectar la presencia de Ac frente a mezclas complejas de Ag. Primero se
separa la mezcla de Ag mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y
posteriormente se transfiere a papel de nitrocelulosa. Se utiliza un Ac (anti-Ig)
unido a la enzima (conjugado), para detectar los inmunocomplejos. Tras aadir el
sustrato se observan una o varias lneas de precipitacin segn existan Ac frente
a una o varias protenas.
Pasos:
1) Electroforesis de la mezcla de Ag en geles de poliacrilamida separacin de
protenas
2) Transferencia a papel de nitrocelulosa
3) Inmunodeteccin: adicin de suero, adicin de conjugado, adicin de sustrato
de revelado.
Muestra de clulas infectadas
hervidas en detergente

Electroforesis

Transferencia a papel

Cada tira se enfrenta a:


1. Ac del suero
2. Conjugado
3. Sustrato

protenas
se separan
segn su

tamao

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c) Inmunohistoqumica: Se utiliza para detectar la presencia de Ag en tejidos.


Puede ser directa o indirecta. Generalmente se emplea la peroxidasa
(Inmunoperoxidasa) y puede implicar un complejo de amplificacin: avidinabiotina, estreptavidina, etc.

aadir Ac primarios
aadir conjugado Acenzima
aadir sustrato
de la enzima
tejido fijado o congelado

INMUNOMIGRACIN
Utiliza Ac marcados con metales pesados: selenio (color azul) y oro (color rosa). La
muestra (saliva, orina, sangre, etc.) fluye a travs de una tira porosa reaccionando con
el Ac marcado, al que solubiliza y con el cual forma inmunocomplejos, y despus con
un Ac frente al antgeno inmovilizado, que captura los inmunocomplejos y reacciona con
el sustrato dando color. Es el mtodo empleado en muchos de los kits rpidos de
diagnstico, como por ej. la deteccin de Ag del virus de la leucemia felina:

Deteccin del virus de la leucemia felina (FIV)

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SEROPERFILES Y SU APLICACIN EN VETERINARIA


Estudios serolgicos seriados realizados en una explotacin para conocer su perfil
inmunolgico y sanitario. Se basan en la deteccin de los anticuerpos circulantes
mediante cualquiera de las tcnicas inmunitarias disponibles, con el fin de obtener
informacin sobre la situacin inmune de la poblacin en ese momento o en estados
previos.
Permiten, entre otros, conocer la situacin sanitaria de la explotacin, elegir el mejor
momento para vacunar y prevenir la entrada de enfermedades en la explotacin. Se
aplica fundamentalmente en explotaciones porcinas.

PREGUNTAS:
1- Dado que el Ag-1 y el Ag-2 pueden dar lugar a complejos inmunes estables, Qu
tcnica inmunolgica basada en una reaccin primaria Ag-Ac elegiras para distinguir la
unin del Ac a cada uno de estos Ags de distinto tamao?
2- Enumera cinco razones por las que la tcnica de ELISA es la ms utilizada en el
diagnstico clnico
3- La formacin de Ac frente a los cidos nucleicos de las clulas es caracterstico del
Lupus eritematoso sistmico. Qu tcnica podras utilizar para el diagnstico de esta
enfermedad autoinmune?
4- Al realizar una prueba de ELISA de sndwich se aaden por este orden: solucin de
antgenos, suero bovino problema y Ac-anti Ig bovina marcado con fluorescena. Al
aadir el sustrato no se desarrolla color. Explica qu ha sucedido.

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