Revista de Biologa Tropical

ISSN: 0034-7744
rbt@cariari.ucr.ac.cr
Universidad de Costa Rica
Costa Rica

Cabagna Zenklusen, Mariana C.; Lajmanovich, Rafael C.; Attademo, Andrs M.; Peltzer, Paola M.;
Junges, Celina M.; Fiorenza Biancucci, Gabriela; Bass, Agustn
Hematologa y citoqumica de las clulas sanguneas de Rhinella fernandezae (Anura: Bufonidae) en
Espinal y Delta-Islas del ro Paran, Argentina
Revista de Biologa Tropical, vol. 59, nm. 1, marzo, 2011, pp. 17-28
Universidad de Costa Rica
San Pedro de Montes de Oca, Costa Rica

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Hematologa y citoqumica de las clulas sanguneas de Rhinella fernandezae

(Anura: Bufonidae) en Espinal y Delta-Islas del ro Paran, Argentina
Mariana C. Cabagna Zenklusen1,2, Rafael C. Lajmanovich1,3, Andrs M. Attademo1,3, Paola M.
Peltzer1,3, Celina M. Junges1,3, Gabriela Fiorenza Biancucci1 & Agustn Bass1
1.

Ctedra de Ecotoxicologa, Escuela Superior de Sanidad Dr. Ramn Carrillo, Facultad de Bioqumica y Ciencias
Biolgicas, Paraje El Pozo s/n, Santa Fe, Argentina; lajmanovich@hotmail.com, gabifiorenza@gmail.com,
waterboysfire@hotmail.com
2. Ctedra de Morfologa Normal, Facultad de Bioqumica y Ciencias Biolgicas, Paraje El Pozo s/n, Santa Fe,
Argentina; mcabagna@fbcb.unl.edu.ar
3. Consejo Nacional de Investigaciones Cientficas y Tcnicas (CONICET), Paraje El Pozo s/n, Santa Fe, Argentina;
mattademo@hotmail.com, paolapeltzer@hotmail.com, celinaj@arnet.com.ar
Recibido 12-v-2010.

Corregido 15-viii-2010.

Aceptado 17-IX-2010.

Abstract: Hematology and blood cell cytochemistry of Rhinella fernandezae (Amphibia: Anura) from
Espinal and Delta-Islands of Paran River, Argentina. The description of amphibian hematology is scarce
and most of these studies have been done in species from North America, Asia and Europe. With the purpose
to obtain basic hematological information of Rhinella fernandezae, 23 blood samples from Santa Fe and Entre
Ros natural reserves were studied. Blood of each individual was extracted by cardiac puncture and hemograms
were carried out. Morphological and cytochemical description of blood cells were analyzed in slides and were
inspected for extra and intra cellular parasites. Five leucocytes types were observed, being lymphocytes the
predominant ones followed by basophiles. Heterophils and eosinophils were positive to PAS, Sudan B and peroxidase. The erythrocytes and its precursors were negative for cytochemical reactions. Micronuclei and nuclear
alterations frequencies were scarce. No significant differences (p>0.05) were observed between sexes neither
in hemograms nor in blood cells morphology. Microfilarias were the only hemoparasites found with a relative
low prevalence and infection intensity. The hematological characteristics studied were similar to those reported
for other amphibians, suggesting that R. fernandezae individuals present optimal nutritional and immunological
status. Rev. Biol. Trop. 59 (1): 17-28. Epub 2011 March 01.
Key words: Rhinella fernandezae, hematology parameters, blood cell morphology, citochemistry, bufonidae.

La descripcin de la hematologa de los

anfibios anuros es escasa, a pesar de que este
grupo de vertebrados es diverso. La mayora
de los trabajos existentes se relacionan con
recuentos celulares y la morfometra de los
hemates (Alder & Huber 1923, Arvy 1947,
Hutchinson & Szarski 1965, Atatr et al. 1998,
Atatr et al. 1999, Arkan et al. 2003, Coppo et
al. 2005, Arserim & Mermer 2008, entre otros).
Para la familia Bufonidae, se conocen valores
de referencia para algunas de sus especies en
Norteamrica, Asia y Europa (El-Bakary et al.
1995, Dnmez et al. 2009, Gl & Tok 2009).
Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 59 (1): 17-28, March 2011

En Argentina, Varela & Sellares (1937a, 1937b,

1938) describieron el cuadro hemtico de Rhinella arenarum, siendo ste el nico estudio de
caracterizacin hematolgica para una especie
de anuro nativa.
En anfibios, el componente leucocitario es
propuesto para la evaluacin de los individuos
expuestos a situaciones de stress (Davis et al.
2008, Davis & Maerz 2008), como parmetro
indicativo de poblaciones provenientes de sitios
contaminados (Cabagna et al. 2005, Barni et al.
2007) y como medida del efecto inmunomodulador de plaguicidas (Forson & Storfer 2006).
17

Asimismo, las variaciones en la morfologa

eritroctica se asocian con exposicin de aminas aromticas, metales y estrs (Krauter 1993,
Per et al. 1998, Chiesa et al. 2006, Barni et
al. 2007). Las alteraciones nucleares, como la
presencia de microncleos, son utilizadas como
marcadores de dao cromosmico (Bkaert et
al. 2002, Huanga et al. 2007, Marques et al.
2009). Por otro lado deben considerarse distintos factores, como la variabilidad del cuadro
hemtico a lo largo del ao y la edad de los
individuos, ya que caractersticas citolgicas
normales podran ser confundidas con procesos
patolgicos o respuestas a modificaciones del
ambiente (Varela & Sellares 1937a, Arserim &
Mermer 2008, Marques et al. 2009). El objetivo
de este trabajo fue obtener datos hematolgicos
y citoqumicos basales para Rhinella fernandezae, Gallardo 1957, especie ampliamente
distribuida en Uruguay, noreste de Argentina,
sur de Brasil y Paraguay (IUCN 2009) y cuyas
poblaciones son frecuentes en los agroecosistemas argentinos (Peltzer et al. 2007).
MATERIALES Y MTODOS
Los especmenes de R. fernandezae (n=17
machos y n=6 hembras) fueron capturados
durante los meses de enero 2004, 2006 y 2007
en dos reas protegidas: la Reserva Natural Parque General San Martn (314029
S-602013 W- Paran, Entre Ros) y la
Reserva Ecolgica de la Ciudad Universitaria
(313826 S-604022 W- Santa Fe, Santa
Fe). En ambas se encuentran representados
elementos florsticos de transicin de las ecoregiones Deltas e Islas del Ro Paran y el Espinal (Burkart et al. 1999). Climticamente se
caracterizan por presentar temperaturas medias
anuales de 18C y precipitaciones medias
anuales de 1 000mm. Zoogeogrficamente, se
encuentran incluidas en Dominio Subtropical
(Subregin Guayano-Brasilera) representado
por el Distrito Mesopotmico con una menor
influencia del Distrito Pampsico (Ringuelet
1961). Estas localidades fueron consideradas
como sitios de referencia en estudios previos
en los que se evalu el impacto de plaguicidas
18

en poblaciones de anuros (Lajmanovich et

al. 2004, Cabagna et al. 2005), debido a que,
desde su creacin, no estn relacionadas con
actividades agroindustriales.
Los ejemplares fueron colocados en recipientes plsticos opacos, con fondo hmedo
para evitar la deshidratacin. Estos fueron
transportados al laboratorio y mantenidos a
25C, en oscuridad para disminuir el estrs por
la captura (USEPA 2002) hasta la obtencin de
las muestras de sangre. Los animales fueron
pesados (P, g) usando una balanza semianaltica OHAUS GT 200-S (0.01g de precisin) y
medidos en longitud rostro-cloaca (LRC, cm),
con un calibre milimtrico digital STRONGER, (0.001mm de precisin). Con los datos
de peso y longitud se calcul el coeficiente de
factor animal (FCA) segn la ecuacin (100*P/
LRC3) de Bagenal & Tesch (1978).
Se extrajo sangre por puncin cardaca
usando jeringas estriles heparinizadas (15mm
de longitud), en individuos no anestesiados
para evitar alteraciones en los recuentos celulares (Fudge 2000). Todos los animales fueron
restituidos a los sitios en los que fueron capturados, luego de comprobar su estado de salud
mediante inspeccin externa.
Inmediatamente despus de la extraccin,
se realizaron cuatro extendidos sanguneos para
evitar cambios celulares degenerativos. Posteriormente, uno se colore con May GrunwaldGiemsa para la descripcin morfolgica de las
clulas sanguneas y bsqueda de parsitos
extra- e intracelulares. Los tres restantes se
reservaron para las coloraciones citoqumicas.
Luego de la homogeneizacin de la muestra en un tubo seco y limpio, se procedi a
la realizacin del hemograma. El hematocrito (Hto) se determin por centrifugacin a
12000g durante 5 minutos, la concentracin
de hemoglobina (Hb) por el mtodo de cianometahemoglobina de Drabkin y los recuentos
celulares en cmara de Neubauer utilizando la
solucin de Natt-Herrick como lquido dilutor
(Fudge 2000). El clculo de los ndices hematimtricos, volumen corpuscular medio (VCM),
hemoglobina corpuscular media (HCM) y concentracin de hemoglobina corpuscular media
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(CHCM) fueron realizadas segn Wintrobe

(Vives Corrons 2006).
Morfologa sangunea: En los extendidos coloreados con May Grunwald-Giemsa se
realiz el recuento diferencial de leucocitos,
considerando las caractersticas morfolgicas
descriptas por Varela & Sellares (1937a). Se
determin la relacin heterfilos/linfocitos
(H/L), propuesta como medida de los individuos en repuesta al estrs (Davis et al. 2008) y
el ndice de lobularidad (IL=nmero de lbulos
contados/nmero de heterfilos contados) a
partir de la clasificacin de los granulocitos
heterfilos segn Arneth (Charipper 1928),
para evaluar el grado de madurez leucocitario
(Garca Espinosa et al. 1997). Con respecto a
la morfologa de los hemates, se determin
la frecuencia de macrocitos (MA), microcitos
(MI), hemates policromatfilos (PO) e hipocrmicos (HY). Se calcul la frecuencia de
eritrocitos inmaduros, como medida indirecta
de la hematopoyesis, a travs de la cantidad de
eritroblastos y PO (Marques et al. 2009). Tambin se consignaron las alteraciones nucleares
que pudieran presentarse en los hemates:
ncleo arrionado o escotado (KN) o mellado (EN), presencia de lbulos (LN), microncleos (MN) y clulas binucleadas (BN), con las
que se calcul la frecuencia total de alteraciones nucleares (FAN=KN+EN+LN+MN+BN).
Todas las frecuencias fueron expresadas como
porcentajes (%) de hemates maduros.
Para la determinacin de parmetros morfomtricos (rea total, dimetros mximos y
mnimos de clulas y ncleos) se tomaron
microfotografas utilizando el objetivo de 40x,
eligiendo campos microscpicos al azar. La
captura de imgenes se realiz por medio de
una cmara Olympus Camedia 5060 adaptada a un microscopio de luz Arcano L1200B.
Las mediciones se realizaron utilizando el
programa Image Pro Plus 3.0.01.00 (Media
Cybernetics, Silver Spring, MD, USA), en 40
eritrocitos y un nmero comparable de leucocitos y trombocitos elegidos al azar (Arkan et
al. 2003, Arserim & Mermer 2008).

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Para evaluar las diferencias entre sexos,

las variables correspondientes a hemograma y
morfologa sangunea fueron sometidas a una
prueba no paramtrica de Mann-Whitney, por
no cumplirse con los supuestos de normalidad (Prueba de Kolmogorov-Smirnorv). Una
probabilidad inferior a 5% (p<0.05) se consider como estadsticamente significativa (Zar
1999). Los clculos se efectuaron utilizando el
software estadstico InStat Version 3.01.
Citoqumica: Las coloraciones realizadas fueron: para grasas, el Mtodo de
Sudn Negro B, segn Sheenan & Storey,
para peroxidasa Mtodo de Washburn, ambos
segn los procedimientos citados por Grignaschi (1991) y para la determinacin de
mucopolisacridos cidos el mtodo de cido
peridico de Schiff (PAS) (Laboratorio Biopur, Argentina). Para control de las coloraciones se utilizaron extendidos sanguneos de
sangre humana de individuos sanos. Para cada
uno de los especmenes y para cada coloracin
se determin un puntaje o score (Grignaschi
1991, Tamburlin & Glomski 1998).
Hemoparsitos: Debido a que los anfibios
han sido sealados como hospedadores de distintos hemoparsitos (McKenzie & Starks 2008,
Cabagna Zenklusen et al. 2009), todos los frotis
fueron observados con objetivo de inmersin
(100x) para el registro de los hemoparsitos.
Para su caracterizacin se sigui la nomenclatura de NWT (2007) y se determin la prevalencia
(en porcentaje) como el nmero de huspedes
infectados, con uno o ms parsitos, dividido
por el total de huspedes examinados (DeJong
& Muzzall 2000). La intensidad de infeccin
fue estimada calculando el nmero de parsitos
por 100 campos de 40x (ikus 2002).
Los extendidos ms representativos de
la morfologa, citoqumica y visualizacin de
hemoparsitos fueron depositados en la coleccin de la Facultad de Bioqumica y Ciencias
Biolgicas (ESS-FBCB-UNL).

19

Morfologa sangunea: Con respecto al

leucograma, se diferenciaron cinco tipos celulares: granulocitos heterfilos, eosinfilos y
basfilos, monocitos y linfocitos (Fig. 1). Estos
ltimos fueron los leucocitos ms abundantes,
seguidos por los granulocitos basfilos. La
relacin heterfilos/linfocitos fue 0.49.
Los granulocitos heterfilos presentaron
citoplasma incoloro con finas granulaciones
lilceas. El ncleo fue redondeado, escotado
o bilobulado, siendo infrecuente la presencia
de tres o ms lbulos, determinando un IL
de 1.090.67. Los granulocitos eosinfilos
tuvieron citoplasma levemente basfilo con
granulaciones eosinfilas redondas de tamao

RESULTADOS
La longitud rostro-cloacal (LRC) promedio registrada para los animales estudiados fue
5.480.39cm en machos y 5.690.38cm en
hembras. El peso fue 15.403.05g en machos y
16.143.62g en hembras y el FCA, 9.341.58
y 8.670.63, respectivamente. En el cuadro
1 se presentan los valores medios, desviaciones estndar y rangos de los parmetros
hematolgicos. No se observaron diferencias
significativas (p>0.05) entre sexos. La relacin
RGR/RGB fue de 1:114. Las caractersticas
morfomtricas de las clulas se exponen en el
cuadro 2.

CUADRO 1
Parmetros hematolgicos de R. fernandezae
TABLE 1
Hematological parameters of R. fernandezae
Parmetros
Hto (%)
RGR (x1012/l)
Hb (g/dl)
VCM (fl)
HbCM (pg)
CHbCM
RT (x109/l)
RGB (x109/l)
FLR (%)
Heterfilos
Eosinfilos
Basfilos
Linfocitos
Monocitos
Blastos
FLA (x109/l)
Heterfilos
Eosinfilos
Basfilos
Linfocitos
Monocitos
Blastos

Valor medio
27.37
0.505
9.18
535.48
18.15

DS
7.68
0.13
2.80
65.14
38.15

Rango
18-40
0.25-0.68
3.76-14.35
434.78-678.90
103-244.60

33.50
4.81
4.50

4.82
5.14
1.66

21.00-40.40
1.00-15.00
1.70-7.30

19
5
32
41
1
2

13.40
4.30
22.26
20.84
0.76
2.27

3-48
0-16
1-69
14-74
0-3
0-6

0.79
0.19
1.34
1.71
0.01
0.05

0.18
0.04
0.28
0.28
0.01
0.02

0.14-3.50
0-0.70
0.07-4.89
0.05-4.90
0-0.19
0-0.31

Hto: Hematocrito, RGR: Recuento de hemates, Hb: Concentracin de hemoglobina, VCM: Volumen corpuscular medio,
HbCM: Hemoglobina corpuscular media, CHbCM: Concentracin de hemoglobina corpuscular media, RT: Recuento de
trombocitos, RGB: Recuento de leucocitos, FLR: Frmula leucocitaria relativa, FLA: Frmula leucocitaria absoluta. DS:
Desviacin estandar.

20

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CUADRO 2
Morfometra de las clulas sanguneas de R. fernandezae
TABLE 2
Blood cell morphometry of R. fernandezae

Eritrocitos
Heterfilos
Eosinfilos
Basfilos
Linfocitos
Monocitos
Trombocitos

DM (m)

Dm (m)

AC (m2)

AN (m2)

N/C

16.420.85
13.641.54
15.091.14
9.782.10
10.471.19
15.631.35
12.562.77

11.430.94
11.021.42
12.131.15
7.691.18
8.551.08
13.891.49
5.920.95

150.790.20
121.1728.14
147.0124.67
61.2821.96
70.8517.57
171.6331.04
59.8211.41

22.623.20
39.7810.64
50.3515.11
26.362.37
41.2113.05
91.8219.09
25.865.33

0.150.02
0.340.08
0.340.07
0.330.04
0.610.09
0,530,61
0.460.13

DM: Dimetro celular mximo, Dm: Dimetro celular mnimo, AC: rea celular, AN: rea nuclear, N/C: Relacin ncleo/
rea total. Promediodesviacin estndar.

y cantidad variables. El ncleo fue redondeado o escotado. Los granulocitos basfilos

se reconocieron por su granulacin redonda,
rojo-violcea, que en algunos casos fue tan
abundante que no permiti visualizar el ncleo.
En los pocos casos que se pudieron observar,
el citoplasma fue incoloro a levemente acidfilo y el ncleo, redondeado. No se registraron precursores mieloides. La mayora de los
linfocitos fueron pequeos caracterizndose
por su escaso citoplasma basfilo y ncleo
redondo, grande (relacin rea nuclear/rea
celular 0.610.09), con cromatina condensada.
Los monocitos se encontraron en baja cantidad
pudindoselos diferenciar de los linfocitos por
su mayor tamao, cromatina laxa y citoplasma grisceo. Los trombocitos se observaron
comnmente en acmulos de clulas de tamao
pequeo (cuadro 2) semejante a los linfocitos,
y forma redonda o ahusada. Su citoplasma fue
incoloro a acidfilo y el ncleo present cromatina de aspecto laxo y homogneo.
Los hemates fueron elpticos con ncleo
central, con cromatina condensada en grumos.
Fue rara la presencia de MA y MI (3.462.99),
como as tambin de PO e HY (0.320.34) y de
FAN (0.060.11). La frecuencia de eritrocitos
inmaduros (eritroblastos y PO) fue baja, menor
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a una clula por cada cien eritrocitos contados

(0.240.34).
No se observaron diferencias significativas
(U test, p>0.05) entre sexos, entre las variables
correspondientes al hemograma y morfologa
sangunea.
Citoqumica: Debido a que se dificult
la diferenciacin de heterfilos y eosinfilos,
se decidi cuantificarlos en conjunto. Estos
granulocitos resultaron positivos para PAS,
Sudan B y peroxidasa, siendo la mayora de
tipo 2+ y 3+. Los granulocitos basfilos fueron
fuertemente positivos a la coloracin de PAS
(la mayora de tipo 4+), se detect peroxidasa
en el orden de trazas (puntaje<100) y resultaron
negativos para la deteccin de grasas.
En los linfocitos se observaron polisacridos, grasas y peroxidasa, en el orden de
trazas. Los monocitos presentaron PAS-positividad leve (puntaje entre 100 y 200), grasas
en el orden de trazas y fueron negativos para
peroxidasa. En los trombocitos se registraron
trazas de polisacridos y fueron negativos para
peroxidasa y grasas.
Los eritrocitos como sus precursores fueron negativos para las reacciones citoqumicas. El puntaje de las distintas reacciones
21

Fig. 1. Clulas sanguneas de Rhinella fernandezae. (A) Hemates y granulocito heterfilo. (B) Eosinfilo. (C) Basfilos.
(D) Linfocitos pequeo (izq.) y grande (der.). (E) Linfocito pequeo (flecha) y trombocitos. (F) Monocito. Tincin May
Grunwald Giemsa (bar 10).
Fig. 1. Rhinella fernandezaes blood cells. (A) Erythrocytes and heterophil granulocyte. (B) Eosinophil. (C) Basophils. (D)
Small (left) and large (right) lymphocytes. (E) Small lymphocyte (arrow) and thrombocytes. (F) Monocyte. Stained with
May Grunwald Giemsa (bar 10)

citoqumicas para los tipos celulares observados se resumen en el cuadro 3.

Hemoparsitos: Se hallaron microfilarias
(Nematoda: Filaroidea, Fig. 2), cuya prevalencia e intensidad de infeccin fueron bajas
(4.35%, 0-1 por campo de 40x).
22

DISCUSIN
Para R. fernandezae, al igual que fuera
sealado para una especie simptrica y cogenrica R. arenarum (Varela & Sellares 1937a,
Cabagna et al. 2005), no se observaron diferencias entre sexos en el hemograma ni en la
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CUADRO 3
Puntaje de las reacciones citoqumicas
TABLE 3
Score of cytochemical reactions
Tipo celular
Eritrocitos
H-E
Basfilos
Linfocitos
Monocitos
Trombocitos

PAS

Peroxidasa

Sudam B

0 (Negativo)
32538
35536
4433
11074
718

0 (Negativo)
32146
47
43
0 (Negativo)
0 (Negativo)

0 (Negativo)
30840
0 (Negativo)
713
5087
0 (Negativo)

H-E: Heterfilos y eosinfilos. Promediodesviacin estndar.

Fig. 2. Microfilaria en extendido sanguineo de R.

fernandezae. Tincin May Grunwald Giemsa (bar 10).
Fig. 2. Microfilaria in blood slides of R. fernandezae.
Stained with May Grunwald Giemsa (bar 10).

morfologa sangunea. Asimismo, los recuentos

celulares se encontraron dentro de los rangos
publicados para otras especies de anuros de
distintas regiones del mundo (Glomski et al.
1997, Wojtaszek & Adamowicz 2003). La relacin RGB/RGR fue 1:114 (rango 1:54-222). Si
bien este parmetro es muy impreciso y pierde
validez frente a los recuentos celulares, cobra
importancia como estimador indirecto del
nmero de leucocitos, cuando la nica muestra
disponible es un extendido sanguneo. En otros
especmenes de este gnero, el valor promedio
Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 59 (1): 17-28, March 2011

de esta relacin es de 1:103 (rango: 1:63-1:430,

para Bufo bufo y Pseudepidalea viridis, respectivamente, Gl & Tok et al. 2009).
Con respecto a los leucocitos, como en
otras especies de anfibios, se observaron cinco
tipos celulares donde los linfocitos pequeos fueron los predominantes (42%), pero en
un porcentaje menor que en otros bufnidos
(72.3%, Anaxyrus fowleri, Davis & Durso
2009). La realizacin de los recuentos totales
y relativos de los leucocitos infieren el estado
inmunolgico de los animales, y sus variaciones cuantitativas y morfolgicas, se pueden
relacionar con procesos inflamatorios, neoplasias, malnutricin y estados de estrs (Campbel
2004, Barni et al. 2007). En este punto, la relacin H/L es un parmetro importante, ya que si
se considera que la respuesta hematolgica al
estrs se conserva a travs de los grupos taxonmicos, los cambios observados en mamferos en esta relacin pueden extrapolarse a otros
vertebrados, como por ejemplo, los anfibios
(Bennett & Harbottle 1968, Davis et al 2008).
As, un incremento en la relacin H/L sumada
a un aumento en IL, servira para diferenciar
heterofilias con linfopenias debidas a estrs
agudo (por ejemplo, ocasionado por la captura
o toma de muestra) o de estados infecciosos
que pudieran originar estimulacin medular
(heterofilias con presencia de heterfilos ms
inmaduros y por lo tanto menor IL).
23

En general, la informacin sobre la caracterizacin citoqumica de los leucocitos y trombocitos en anfibios es escasa y solo se consigna
la positividad o negatividad a las reacciones.
Estudios realizados en distintos bufnidos,
sealan la presencia de mucopolisacridos en
leucocitos y trombocitos y actividad peroxidsica en monocitos, granulocitos heterfilos y
eosinfilos (Turner 1988), tambin en basfilos
y trombocitos (Caxton-Martins 1978). En el
caso de R. fernandezae los trombocitos y linfocitos mostraron una positividad variable a la
reaccin de PAS mientras que los granulocitos
fueron positivos. La importancia de la identificacin de polisacridos radica en el hecho
que su presencia est ntimamente ligada con
el abastecimiento de energa para la fagocitosis
(Veiga et al. 2000). La peroxidasa es una enzima caracterstica de los grnulos azurfilos y
juega un importante papel en el mecanismo
bactericida oxgeno-dependiente (Styrt 1989).
Como en otras especies de vertebrados, los
resultados para lpidos son comparables con
los de peroxidasa (Garca Espinosa et al. 1997,
Salakij et al. 2004, 2006).
En anuros, la cantidad de eritrocitos por
litro (RGR) vara de 0.5 a 1.5x1012 (Glomski
et al. 1997); en nuestro estudio fue 0.505x1012/
litro, estando en el lmite inferior de ese rango.
Esto podra deberse al perodo en que se realiz
la recoleccin de ejemplares (enero), sealado
por Varela y Sellares (1938) como uno de los
meses con menor recuento de hemates para
R. arenarum. Este patrn se repite en otras
especies de anfibios, en el que se observan los
mayores recuentos de eritrocitos en primavera,
disminuyendo en los meses de verano, para
llegar a los mnimos valores en otoo (Wojtaszek & Adamowicz 2003, Arserim & Mermer
2008). Por otra parte, si consideramos que la
frecuencia de eritrocitos inmaduros (eritroblastos y PO) representa la eritropoyesis (Allender
& Fry 2008), podemos decir que los ejemplares de R. fernandezae no se encuentran en un
perodo de renovacin eritroctica ya que dicha
frecuencia fue baja (0.240.34).
La morfologa y morfometra de los hemates fue semejante a la informada para otros
24

gneros de Rhinella (Gregory 2009). En este

sentido, los eritrocitos de los anfibios son ms
grandes que en otros vertebrados (Campbel
2004) y dentro de esta Clase, los de los urodelos son de mayores dimensiones respecto de los
anuros, pero la cantidad es menor (Arkan et al.
2003). A su vez, los eritrocitos de las especies
de anfibios terrestres son ms pequeos que los
de las especies acuticas (Arserim & Mermer
2008). Desde el punto de vista morfolgico, es
necesario evaluar la presencia de alteraciones
en el tamao, color y forma de los eritrocitos ya
que su frecuencia puede aumentar en casos de
anemias, enfermedades crnicas, malnutricin
(Campbel 2004), intoxicaciones (El Bakari et
al. 1995, Chiesa et al. 2006) y ambientes contaminados (Barni et al. 2007). En el caso de
los animales estudiados, segn los criterios de
Campbel (2004) para la caracterizacin de la
poblacin eritroctica, se puede concluir que
los extendidos presentaron ligera anisocitosis
(frecuencia de MA y MI 3.462.99), e isocromasia (muy baja frecuencia de eritrocitos policromatfilos e hipocrmicos, 0.320.34). Una
consideracin a tener en cuenta es que no se
observaron eritroplstidos. Si bien existen especies en las que es normal su presencia en baja
cantidad, el aumento de su frecuencia en sangre
se considera una adaptacin para aumentar la
captacin de oxgeno (Wojtaszek & Adamowicz
2003, Barni et al. 2007).
En lo que respecta a la presencia de MN
y alteraciones nucleares, fueron escasas en
esta poca del ao y podran ser atribuidas
a eventos espontneos (Al-Sabti & Metcalfe
1995), ya que los ejemplares de R. fernandezae
provenan de reas naturales protegidas, no
relacionadas con actividades agroindustriales.
Cabe resaltar, que el test de los microncleos
es utilizado en peces y anfibios para determinar
la posible genotoxicidad de sustancias en el
medio acutico (Grinfeld et al. 1986, Krauter
1993, Al-Sabti & Metcalfe 1995). En el caso
de los peces silvestres, la determinacin de
la frecuencia de alteraciones nucleares (FAN)
sera una alternativa al ensayo de los MN
(Guilherme et al. 2008). Si bien se proponen
distintos mecanismos por los que se producen
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las alteraciones nucleares, no se sabe a ciencia cierta cmo y porqu se generan. A pesar
de esto, se ha propuesto que se consideren
como alteraciones celulares producidas como
respuesta a los agentes generadores de estrs
(ava & Ergene-Gzkara 2003, Barni et al.
2007). En anfibios adultos, ha sido utilizado
como marcador de genotoxicidad en Pelophylax perezi (Rana perezi Seoane, 1885)
expuestas a efluentes de minas (Marques et al.
2009).
Los datos correspondientes al recuento
de trombocitos para los anfibios son exiguos
y gran parte referidos a especies de la familia
Ranidae (Arserim & Mermer 2008). Varela &
Sellares (1937a), Homtowska et al. (2002),
Wojtaszek & Adamowicz (2003), Campbel
(2004) y Arserim & Mermer (2008) coinciden
en la dificultad de cuantificar los trombocitos
en anfibios, aves, peces y reptiles, ya sea por la
imposibilidad para diferenciarlos de los linfocitos o porque tienden a destruirse o aglutinarse.
Esto sera la causa de la gran variabilidad en
los datos obtenidos, adems de las variaciones
entre los individuos estudiados.
Los anuros, al estar expuestos a numerosos
vectores hematfagos, estn infectados por
una gran diversidad de hemoparsitos intray extracelulares. Entre estos se cuentan las
microfilarias, halladas en este estudio y observadas en distintos lugares del mundo (Walton
1964a, 1964b, Levine & Nye 1977, Barta &
Desser 1984, Desser 2001, Chutmongkonkul et
al. 2006, Mckenzie & Starks 2008). En Argentina se han hallado en el gnero Leptodactylus
(Schurmans Stekhovek 1951) y en Hypsiboas
pulchellus (Cabagna et al. datos no publicados). A pesar de que varias especies de filarias
pueden infectar a anfibios, reptiles y aves, no
son patognicas y slo las que son parsitos
naturales de mamferos pueden ser causantes
de enfermedades zoonticas (Orihel & Eberhard 1998). En lo que respecta a los anfibios,
la presencia de contaminantes podra reducir
la inmunocompetencia del husped, lo que
llevara a un incremento del parasitismo (Carey
et al. 1999, Marcogliese et al. 2009). En este
sentido, estudios llevados a cabo en Lithobates
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pipiens expuestas a mezclas de plaguicidas

sugieren que stos pueden alterar su sistema
inmune y afectar su capacidad para hacer frente
a una infeccin parasitaria (Christin et al. 2003,
Gendron et al. 2003). Por otra parte, se ha
observado que la alteracin del hbitat a travs
de la conversin de bosques en pasturas puede
impactar a abundancia de los parsitos de los
anfibios y de sus vectores (McKenzie 2007).
Finalmente, todas las caractersticas hematolgicas de R. fernandezae estudiadas son
semejantes a los valores de referencia reportados para otros anfibios, pudindose inferir que
los individuos analizados, se encuentran en un
buen estado nutricional e inmunolgico. Por
otra parte, a pesar que la evaluacin hematolgica puede ser compleja, ya sea por dificultades en la manipulacin de los animales, las
restricciones que implican el escaso volumen
de muestra y la posibilidad de la contaminacin
con linfa, es uno de los mtodos ms sencillos
y menos invasivos que permiten la deteccin
de cambios fisiolgicos y patolgicos de las
poblaciones silvestres, relacionados con factores ambientales (Artacho et al. 2007, Barni et
al. 2007, Davis et al. 2008).
RESUMEN
La descripcin de la hematologa de los anfibios
anuros es escasa, habindose realizado la mayora de los
trabajos en especies de Norteamrica, Asia y Europa. Con
el propsito de obtener datos hematolgicos para Rhinella
fernandezae, fueron estudiados 23 especmenes provenientes de zonas protegidas de las provincias de Santa Fe y
Entre Ros. Se les extrajo sangre por puncin cardaca y se
realizaron hemogramas. En los extendidos sanguneos, se
efectuaron la descripcin morfolgica y citoqumica de las
clulas sanguneas y bsqueda de parsitos. Se observaron
cinco tipos de leucocitos, donde predominaron los linfocitos pequeos. Heterfilos y eosinfilos resultaron positivos
para PAS, Sudan B y peroxidasa; contrariamente, los eritrocitos y sus precursores fueron negativos. Los puntajes de
las reacciones citoqumicas fueron variables para basfilos,
linfocitos, monocitos y trombocitos. Las frecuencias de
microncleos y de alteraciones nucleares fueron escasas.
No se observaron diferencias significativas (p>0.05) entre
sexos en el hemograma ni en la morfologa sangunea. Los
nicos hemoparsitos encontrados fueron microfilarias
(Nematoda: Filaroidea), cuya prevalencia e intensidad de
infeccin fueron bajas. Las caractersticas hematolgicas

25

estudiadas fueron semejantes a los valores reportados para

otros anfibios, pudiendo inferir que los individuos de R.
fernandezae estudiados se encuentran en un buen estado
nutricional e inmunolgico.
Palabras clave: Rhinella fernandezae, parmetros hematolgicos, morfologa de las clulas sanguneas, citoqumica,
bufonidae.

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