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CARACTERIZAO QUMICA, ENZIMTICA e CITOTXICA DE UMA

FOSFOLIPASE A2 CIDA ISOLADA DA PEONHA DE Bothrops paulosensis.
Francis Barbosa Ferreira1, Renata Santos Rodrigues1, Thomas Cardoso1, Veridiana de Melo
Rodrigues vila1
Resumo: As fosfolipases A2 catalisam a hidrlise de fosfolipdeos, liberando como produtos
cidos graxos livres e lisofosfolipdeos. As fosfolipases das peonhas de serpentes so
amplamente estudadas devido variedade de seus efeitos farmacolgicos como
neurotoxicidade, miotoxicidade, cardiotoxicidade, ativao ou inibio da agregao
plaquetria, anticoagulao, edema, convulso, hipotenso, hemorragia interna, dentre outras.
Porm, nem todas as PLA2 induzem todos esses efeitos. Este trabalho teve como objetivo a
purificao e caracterizao qumica e enzimtica de uma fosfolipase A2 cida da peonha de
Bothrops pauloensis, bem como a avaliao de sua ao bacterioltica e citotxica sobre
clulas tumorais K-562 (leucemia). A fosfolipase A2 isolada foi denominada de CM1b-F5.
Esta enzima foi purificada por cromatografia de troca inica em CM-Sepharose Fast Flow
seguido por filtrao em Sephadex G-75 e finalizando em Phenyl Sepharose CL-4B. CM1bF5 apresentou uma massa molecular de 15.8KDa, atividade fosfolipsica de 289 U/mg e
atividade hemoltica indireta. No apresentou ao bactericida e baixa atividade citotxica, no
entanto outras linhagens celulares devero ser utilizadas para uma anlise mais criteriosa
dessa ao. Novos estudos devero ser realizados com a PLA2 cida isolada da peonha de
Bothrops pauloensis com intuito de obter novos parmetros estruturais e funcionais que
podero contribuir para a utilizao das mesmas como modelo estrutural para a sntese de
novos agentes teraputicos.
Palavras-chave: fosfolipase A2; Bothrops pauloensis; citotoxicidade
Abstract: The phospholipases A2 catalyse the phospholipids hydrolysis, releasing free fat
acids and lisophospholipids. The snake venom phospholipases are widely studied due to the
variety of their pharmacological effects as neurotoxicity, miotoxicity, cardiotoxicity,
activation or inhibition of the platelet aggregation, anti-coagulation, edema, convulsion,
hypotension, interns hemorrhage, among other. However, nor all of PLA2 induce all those
effects. This work had as objective the purification and chemical and enzymatic
characterization of an acid phospholipase A2 of Bothrops pauloensis snake venom, as well as
to evaluate her bacteriolytic and cytotoxic action on K-562 (Leukemic) tumor cells. The
isolated phospholipase A2 was denominated CM1b-F5. This enzyme was purified by CM1 - Instituto de Gentica e Bioqumica, Universidade Federal de Uberlndia, Av. Par, 1720,
Uberlndia-MG, CEP: 38402-970, francisbbio@yahoo.com.br

Sepharose Fast Flow ionic exchange chromatography following for filtration in Sephadex G75 and concluding in Phenyl Sepharose CL-4B. CM1b-F5 presented a molecular mass of
15.8KDa, phospholipasic activity of 289 U/mg and indirect hemolytic activity. It didn't
present bactericidal action and low cytotoxic activity, however other cellular lineages should
be used for a more discerning analysis of that action. New studies should be carried out with
isolated acid PLA2 of the Bothrops pauloensis snake venom with intention of obtaining new
structural and functional parameters that will can be able to contribute to the use of the same
ones as structural model for the synthesis of new therapeutic agents.
Keywords: phospholipase A2; Bothrops pauloensis; citotoxicity
As PLA2 catalisam a hidrlise

INTRODUO
No Brasil, a morbidade (nmero de

especificamente na ligao 2-acil ster de

envenenamentos) notificada por serpentes

fosfolipdios, liberando como produtos os

do gnero Bothrops de aproximadamente

lisofosfolipdios e cidos graxos livres

15 a cada 100.000 pessoas (CHIPAUX,

(SIX; DENNIS, 2000). Estas enzimas

1998). Devido ao de vrias enzimas,

podem possuir um resduo de aspartato na

especialmente fosfolipases A2 (PLA2) e

posio 49 (D49), ou um resduo de lisina

metaloproteases, os venenos botrpicos

na mesma posio (K49). As D49 so

produzem

tecidos

enzimaticamente ativas e as k49 possuem

biolgicos, bem como a interferncia em

baixa ou nenhuma atividade enzimtica

quase todas as fases da hemostase humana

(OWNBY et al., 1999; KETELHUT et al.,

(HIGUCHI et al., 2007).

2003;). Existem variantes da subclasse

fortes

danos

em

As enzimas PLA2 de venenos de

serpentes

vm

sendo

Lys49, como Arg 49 e Ser 49 presentes em

amplamente

algumas PLA2s de peonhas ofdicas j

estudadas devido variedade de seus

isoladas. Chijiwa et al. (2006) isolaram

efeitos

como

duas PLA2s da peonha de Protobothrops

miotoxicidade,

elegans que possuem um resduo de Arg na

farmacolgicos,

neurotoxicidade,

cardiotoxicidade, ativao e/ou inibio da

posio

agregao

anticoagulao,

PeBP(R)-I e PeBP(R)-II, mas com alto

edema, convulso, hipotenso, hemorragia

grau de homologia com as K49 j isoladas.

plaquetria,

interna, dentre outras, porm, nem todas as

PLA2

induzem

todos

esses

efeitos

49

(Arg49),

atividade

denominadas

enzimtica

destas

enzimas pode ser influenciada por alguns

(FRANCISCHETTI et al., 1998; KINI,

fatores

como

especificidade

pelo

2003; MASUDA et al., 2005).

substrato, a presena de diferentes classes

de fosfolipdios na regio do stio cataltico

importncia

pois

e o poder de penetrao, em que uma PLA2

conhecimentos em reas correlatas como o

com maior penetrao causa um dano mais

desenvolvimento

significativo nos tecidos (KINI, 2003).

tratamento

de

podem

de

subsidiar

drogas

vtimas

de

para

acidentes

As fosfolipases A2 podem ser

ofdicos, desordens hemostticas, bem

divididas em cinco grupos principais:

como para o desenvolvimento de novas

PLA2

drogas

secretrias

(sPLA2),

Ca2+

(cPLA2),

citoslicas

independentes,

com

ao

bactericida

antitumorais. Alm disso, estes estudos

agregao

resultaro em inovadoras oportunidades e

plaquetria (PAF-AH) e as lisossmicas,

caminhos para encontrar respostas para a

divididas de acordo com o mecanismo

toxicidade das PLA2 e tambm para o

cataltico e suas caractersticas funcionais e

desenvolvimento de protenas com novas

estruturais. As PLA2 secretrias foram

funes biolgicas (KINI, 2003). Portanto,

subdivididas em quatorze grupos, de

este trabalho teve como objetivo purificar e

acordo com o nmero de resduos de

caracterizar qumica e enzimaticamente

aminocidos

ligaes

uma fosfolipase A2 cida da peonha de

dissulfeto, sendo que as PLA2 dos venenos

Bothrops pauloensis, bem como avaliar a

de serpentes esto includas nos grupos I e

sua ao bactericida e citotxica sobre a

II (SCHALOSKE; DENNIS, 2006). Essas

linhagem de clulas tumorais K-562

enzimas so pequenas, com o peso

(leucemia).

acetilhidrolases

fator

posio

de

das

molecular variando de 13 a 18 kDa, e

causam destruio pela interferncia nos

MATERIAL E MTODOS

processos fisiolgicos normais da vtima

Obteno da peonha

(KINI, 2003).
As PLA2 e suas isoformas oferecem
um grande desafio para os pesquisadores,
no sentido de desvendar a sua estrutura e
funo. Pesquisas nesta rea auxiliaro a
determinar os mecanismos dos efeitos
farmacolgicos, bem como ampliar nosso
conhecimento sobre o mecanismo de ao
destas toxinas, seus efeitos deletrios, ou
para efeitos contrrios a algumas doenas
importantes. Estes estudos so de extrema

A peonha da serpente botrpica

foi cedida pela Pentapharm do Brasil
Comrcio e Exportao Ltda. Aps a
coleta,

dessecada

peonha

vcuo

foi
em

imediatamente
temperatura

ambiente e conservado a -20C.

Quantificao de protenas
As dosagens de protenas em
solues de 0,1 a 2,0 mg/2,0 ml de

soluo foram realizadas pelo mtodo de

previamente equilibrada com o tampo

microbiureto

Tris-HCl 10mM com 2M de NaCl, pH 8.5.

conforme

descrito

por

Itzhaki e Gill (1964). A reta padro foi

construda

ambiente, seguido por tampo Tris-HCl

bovina

utilizando
como

soroalbumina

protena

padro,

eluio

10mM,

procedeu

pH

8.5,

com

temperatura

concentraes

considerando-se o seu coeficiente de

decrescentes de NaCl (1 e 0,5 M) at 10

extino em 280 nm 0,666.

mM de Tris-HCl pH 8.5, encerrando o

Purificao da fosfolipase cida da

peonha de Bothrops pauloensis

processo de eluio com gua.

Caracterizao qumica

A purificao da fosfolipase cida

foi realizada de acordo com Rodrigues et

Eletroforese em gel de poliacrilamida

(PAGE) com agente desnaturante:

al. (2007), com modificaes. Cerca de

180 mg da peonha botrpica foram
ressuspendidos em 2,0 ml de tampo
bicarbonato de amnio 50 mM, pH 7.8.
Em seguida a amostra foi centrifugada a
10.000xg por 10 min. a 4C e o
sobrenadante aplicado a uma coluna de
troca inica contendo a resina CM
Sepharose Fast Flow (2,0 x 20,0 cm),
previamente equilibrada com o mesmo
tampo.

amostra

temperatura

foi

eluda

ambiente

em

As

eletroforeses

desnaturante

(SDS)

com

foram

agente

realizadas

segundo a tcnica descrita por Laemmli

(1970). Esta tcnica foi realizada para a
identificao,

estimativa

da

massa

molecular e anlise do grau de pureza da

toxina de interesse.
Ensaios Enzimticos
Atividade Fosfolipsica (PLA2)
Essa atividade foi determinada por

pelo

estabelecimento de um gradiente convexo

titulao

de

tampo

mtodo descrito por De Haas et al. (1968).

bicarbonato de amnio nas concentraes

Como substrato foi utilizada uma emulso

de 0,05 a 0,5 M. Fraes de 3 mL/tubo

de

foram coletadas num fluxo de 20mL/hora.

deoxicolato de sdio 0,03 M e CaCl2 a 0,6

A frao com atividade fosfolipsica foi

M.

coletada e submetida em Sephadex G-75,

enzimaticamente foram titulados com uma

equilibrada com um tampo AMBIC

soluo padro de NaOH 0,1208N em pH

0,05M pH 7.8. A frao ativa foi coletada

8,0 e temperatura ambiente. A atividade

fosfolipsica

concentrao

aplicada

em

usando

Phenyl-Sepharose

potenciomtrica

gema

Os

de

ovo

cidos

foi

em

segundo

presena

graxos

de

liberados

expressa

em

microequivalentes de base consumida por

em repouso. As culturas foram diludas

minuto e a atividade especfica pelo

100 vezes em BHI estril. Retirou-se 2mL

nmero

base

para o plaqueamento em microplaca de 96

consumida por minuto, por mg de protena.

poos, na presena ou na ausncia da

Para cada ensaio foram utilizados 10 g de

toxina em concentraes de 0,4 e 0,8

protenas.

g.mL-1 diludas em BHI. Inicialmente e

de

equivalentes

de

aps 6 horas de incubao a 37OC sem

Atividade hemoltica indireta

agitao,

A atividade hemoltica indireta foi

densidade

ptica

foi

monitorada em espectrofotmetro (Leitor

testada em gel de agarose contendo gema

de

de ovo e eritrcitos como substrato. A dose

utilizando-se o filtro de interferncia de

mnima hemoltica indireta (DMHi) foi

600nm.

calculada segundo Guterrez et al. (1988) e

Ensaios de Citotoxicidade

determinada

como

uma

medida

microplacas

Camberra-Packard)

da
Os ensaios de citotoxicidade foram

atividade fosfolipase A2, definida como a

quantidade de protenas que produz um
halo mnimo de 10 mm. Cada ensaio foi

realizados em colaborao com a Profa.

Dra. Elisngela de Paula Silveira Lacerda
do Instituto de Cincias Biolgicas da

expresso pela mdia D.P. (n = 5)

Universidade Federal de Gois. Foram

utilizadas

Atividade bactericida

clulas

tumorais

K-562

(leucemia), fornecidas pelo Ncleo de

Escherichia coli, cepa ATCC
25922, foi adquirida junto ao Laboratrio
Gentica Molecular da UFU, cedidas
gentilmente
Goulart,

pelo
INGEB.

Dr.

Luiz
As

Ricardo
bactrias

individuais, E.coli, foram inicialmente

inoculadas em meio de cultura estril BHI

Estudos

Pesquisas

Txico-

Farmacolgicas, Faculdade de Farmcia da

Universidade Federal de Gois UFG e
clulas normais humanas Human foreskin
fibroblasts HFF (fibroblasto), fornecidas
pelo

Laboratrio

de

Imunologia

da

Universidade Federal de Uberlndia.

(Brain Heart Infusion-Broth infuso

desidratada de corao e crebro 1,75%

Meio de cultura celular para clulas

(m/v), Triptose 0,1% (m/v), glicose 0,2%

tumorais

(m/v), NaCl 0,5% (m/v), Na2HPO4 0,25%

Para a manuteno da linhagem de clulas

(m/v), pH 7,4 0,2 a 25OC da Diagnolab,

tumorais, a dissoluo da toxina testada e a

Espanha) e ativadas por 16 horas a 37OC

realizao dos ensaios de citotoxicidade,

seguiram-se

protocolo

(American

Type

Culture

do

ATCC

Collection),

Da 2 concentrao retirou-se 10
L e acrescenta-se 990 L de meio

utilizando meio RPMI 1640 suplementados

completo

com 10% de soro fetal bovino (SFB), 20

concentrao de 1 mg/mL;

mM de L-glutamina, 7,5% de bicarbonato

obtendo

terceira

O mesmo processo foi continuado,

de sdio e 10g/mL de gentamicina (meio

obtendo-se

completo). Este meio foi preparado na hora

concentraes:

do uso e esterilizado por filtrao em

0,01mg/mL, 0,001mg/mL.

assim

as

outras

0,1mg/mL,

membranas de 0,22m. Como controle

negativo foi utilizado o meio RMPI 1640 com

Para avaliar a atividade citotxica

L-glutamina, suplementado com 10% de soro

da

fetal bovino.

toxina

foi

utilizado

mtodo

colorimtrico com 3-(4,5-Dimetiltiazol-2Atividade citotxica

il)2,5-Difenil Brometo de Tetrazlio), o

foi

MTT. O princpio deste mtodo descrito

utilizada a droga ciclofosfamida, diluda

por Mosman (1983) consiste em medir

em meio incompleto em concentrao de

indiretamente a viabilidade celular pela

5mg/mL. A ciclofosfamida um frmaco

atividade enzimtica mitocondrial das

antineoplsico com amplo espectro de ao

clulas vivas. Quando as clulas esto

antitumoral,

como

vivas as desidrogenases mitocondriais so

rejeio

capazes de agir sobre substratos como o

imunolgica dos rgos transplantados

MTT levando a quebra dessa molcula e a

(CRAIG; STITZEL, 1996).

reduo desta, formando assim o Azul de

Como

alternativa

controle

utilizada
na

positivo,

tambm

supresso

da

Formazan.

Portanto,

quanto

maior

O ensaio foi realizado por meio de diluio

viabilidade celular em uma determinada

seriada da seguinte maneira:

amostra, mais Azul de Formazan

Na soluo padro tem-se a PLA2

Azul

de

Formazan

onde se acrescentou 1000 L de

solubilizado com Dodecilsulfato de Sdio

meio

(SDS) ou Isopropanol em meio cido.

completo,

obtendo

uma

concentrao de 100mg/mL;

formado.

A leitura da quantidade de Azul de

Retirou-se 10 l da soluo padro

Formazan

e acrescentou-se 990 L de meio

espectofotometria, utilizando-se filtro de

completo obtendo-se assim a 2

interferncia de 550 nm.

concentrao de 10mg/mL;

foi

medida

atravs

de

Para avaliar a ao da toxina, foram

Figura

1:

Cromatografia

em

CM-

plaqueadas 2x105 clulas em microplacas

Sepharose de 180 mg da peonha bruta de

de 96 poos. Aps o plaqueamento, as

Bothrops pauloensis. Coluna de 20 x 2 cm,

clulas foram tratadas com 100 L de

equilibrada com tampo bicarbonato de

toxinas nas concentraes descritas acima

amnio 0,05M pH 7,8, com fluxo de

e incubadas por 24h em estufa a 37C

20ml/h, coletadas fraes de 3ml/tubo e

contendo 95% de ar e 5% CO2 . Ao fim da

gradiente convexo de bicarbonato de

incubao, foram adicionados aos poos de

amnio 0,5M pH 7,8.

cultivo celular, 10 L de MTT na

concentrao de 5mg.mL-1. A placa foi
novamente incubada e aps 3 horas foram
adicionados 50 L SDS 10% HCL 0,01 N.
A atividade citotxica foi avaliada
como a capacidade de inibir a proliferao
das clulas.

RESULTADOS

Para cada pico foi testada a

atividade

fosfolipsica

por

titulao

potenciomtrica e verificado o perfil

protico em PAGE-SDS. A eletroforese
em gel de poliacrilamida a 12% com SDS
foi realizada para verificar o grau de
pureza das protenas presentes em cada
frao. Como pode ser observada na figura
2, a frao CM1 constituda pela maioria

Fracionamento e Caracterizao

dos componentes presentes no veneno

Qumica

total, j a frao CM4 e CM5 apresentam

O fracionamento da peonha de
Bothrops pauloensis por cromatografia de
troca inica em CM-Sepharose produziu
seis picos principais (Figura. 1).

um bom grau de pureza, mas necessitam de

novas etapas de purificao (Figura. 2).

Figura

2:

Eletroforese

em

gel

de

frao

CM1b

apresentou

condies

atividade PLA2 (Tabela 1) e foi aplicada

desnaturantes. Tampo Tris-Glicina pH

em Phenyl-Sepharose CL-4B, resultando

8.3. Tempo de corrida 80 minutos a 20mA

em 6 novas subfraes, denominadas

constante e voltagem variando de 100 a

CM1b-F1 a F5 (Figura 4).

poliacrilamida

12%

em

200V. Aps a corrida o gel foi corado com

Coomassie Blue R-250 a 2,5% por 10
minutos e em seguida descorado com cido
actico

10%,

etanol

30%

gua

deionizada.
A frao CM1 apresentou alta
atividade fosfolipsica (Tabela 1) e foi
recromatografada em uma coluna contendo
a resina Sephadex G-75, resultando em 3
fraes principais, denominadas CM1a,
CM1b e CM1c (Figura 3).

Figura 4: Cromatografia de 16,4 mg da

frao CM1b em Phenyl-Sepharose Fast
Flow (coluna de 20 x 1.2 cm), equilibrada
com tampo Tris-HCl 10mM pH 8.5 +
NaCl 2M com fluxo de 20ml/h. Foram
coletadas fraes de 2,0ml/tubo. A eluio
foi realizada com Tris-HCl 10mM com
concentraes molares decrescentes de
NaCl (1M e 0,5M), finalizando a eluio
com gua.
Na figura 5 observa-se o perfil

Figura 3: Cromatografia em Sephadex G-

eletrofortico em gel de poliacrilamida

75 de 40mg da frao CM1. A resina foi

PAGE-SDS a 12% da peonha bruta e das

equilibrada com o tampo AMBIC 0,05M,

fraes com atividade PLA2 obtidas

pH 7.8 e eluda com o mesmo tampo

durante o processo de purificao.

temperatura ambiente. Este fracionamento

A homogeneidade da frao CM1b-

resultou em 3 subfraes: CM1a, CM1b e

F5 foi mostrada por PAGE-SDS (Figura

CM1c.

5). A protena purificada consiste em um

polipepitdeo de cadeia nica, com massa

frao CM1 e uma recuperao da

molecular de aproximadamente 15.800 Da.

atividade fosfolipsica de 45,15%, para a

mesma

frao.

No

segundo

passo

cromatogrfico, Sephadex G-75, a frao

com atividade fosfolipsica, CM1b, teve
um rendimento protico e recuperao da
atividade fosfolipsica de 41% e 25,62%,
respectivamente.

No

terceiro

fracionamento, em Phenyl-Sepharose, o
rendimento protico foi de 1,82% e a
recuperao da atividade fosfolipsica de
40,29% para a frao CM1b-F5.
Tabela

1:

Rendimento

fracionamento
Bothrops
Figura

5:

Eletroforese

poliacrilamida

12%

em
em

gel

de

condies

desnaturantes. Tampo Tris-Glicina pH 8.3

tempo de corrida 80 minutos a 20mA
constante e voltagem variando de 100 a
200V. Aps a corrida o gel foi corado com
Coomassie Blue R-250 a 2,5% por 10
minutos e em seguida descorado com cido
actico

10%,

etanol

30%

gua

desionizada.
Foi avaliada a recuperao protica
nos diferentes passos cromatogrficos em
relao quantidade total de protena
aplicada em cada fracionamento, bem
como a atividade fosfolipsica das mesmas
(Tabela 1). No primeiro fracionamento, em
CM-Sepharose, obteve-se um rendimento
protico de aproximadamente 22% para a

fosfolipsica.

da

protico

peonha

pauloensis

bruta

do
de

atividade

10

hemlise nos tempos determinados de 3, 6,

CARACTERIZAO ENZIMTICA
Comparao da atividade fosfolipsica
durante as etapas de purificao
A

atividade

fosfolipsica

foi

determinada em triplicata por titulao

pontenciomtrica. Podemos observar que

12 e 24 horas. Porm, a enzima contida na

soluo CM1b-F5 foi significativamente
mais

ativa

analisados.
Figura 7a:

houve uma queda de atividade da frao

CM1 para a CM1b, porm, em comparao
com a frao CM1b-F5, esta atividade
aumentou satisfatoriamente (Figura 6). A
atividade da frao CM1b-F5 quase 5
vezes maior do que a atividade da peonha
bruta.

Figura 7b:

Figura

6:

Comparao

da

atividade

fosfolipsica da peonha bruta e das

fraes

resultantes

dos

passos

cromatogrficos.
Atividade hemoltica indireta
A atividade hemoltica indireta est
apresentada nas figuras 7a e 7b. Foram
utilizados

5g

da

PB

de

Bothrops

pauloensis ou da CM1b-F5 sobre o

substrato e ambas foram capazes de induzir

em

todos

os

intervalos

11

Inibio de Proliferao (%)

100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0.001 0.01

0.1

1.0

10.0 100.0

C+

PLA2 (mg.ml-1)

Figura 8: Inibio da proliferao de

clulas K562 induzida por diferentes
Figura 7: A- Atividade hemoltica indireta

concentraes da PLA2 cida de B.

com 5 g de PB ou PLA2. B-O halo

pauloensis.

hemoltico foi avaliado em diferentes

intervalos de tempo (3, 6, 12 e 24 horas).
Atividade Citototxica
A figura 8 apresenta a atividade citotxica
da PLA2 cida sobre clulas tumorais K-562
(leucemia). Como pode ser observado a

PLA2

apresentou

baixa

citotoxicidade

quando comparado com o controle positivo

ciclofosfamida.
concentraes

Interessantemente
extremas

nas

Inibio de Proliferao (%)

100
80
60
40
20
0
-20
-40
-60
-80
-100
C-

0.001 0.01

0.1

1.0

10.0 100.0

C+

-1

PLA2 (mg;mL )

testadas

(0,001mg/mL e 100mg/mL) essa inibio

foi mais satisfatria, cerca de 20% de

Figura 9: Inibio da proliferao de

fibroblastos

sobre clulas normais HLL (fibroblastos) a

fibroblasts HFF) induzida por diferentes

PLA2 foi capaz de induzir a proliferao

concentraes da PLA2 cida de B.

celular de uma forma dose dependente

pauloensis.

(Figura 9).

(Human

foreskin

inibio da proliferao. Quando testada

DISCUSSO
As PLA2s representam uma classe de
enzimas versteis, considerando sua funo,

12

localizao, regulao, mecanismo de ao,

al., 2004), duas miotoxinas Lys-49, BnSP-6

seqncia, estrutura e papel dos ons

e BnSP-7 (RODRIGUES et al., 1998) e uma

metlicos bivalentes. Durante os ltimos 20

fosfolipase A2 cida (RODRIGUES et al.,

anos houve um grande interesse em se

2007).

estudar

estas

toxinas,

resultando

No presente trabalho isolamos a

no

isolamento e caracterizao estrutural e

PLA2

funcional de vrias PLA2.

segundo Rodrigues et al. (2007) com

A grande maioria das PLA2s isoladas

de

peonhas

serpentes

de

Bothrops

pauloensis

algumas modificaes. Introduzimos uma

botrpicas,

etapa intermediria, onde substitumos a

descritas at agora, so protenas de carter

utrafiltrao em AMICON YM (30.000)

bsico, ponto isoeltrico variando entre 7.0 e

por uma filtrao em coluna de Sphadex

10.0, que possuem atividade cataltica ou

G-75.

no,

As

pretendamos obter a toxina com um maior

anlises da composio em aminocidos

rendimento e grau de pureza. Com a

indicaram que essas toxinas so ricas em

utilizao deste mtodo, que combina

aminocidos

cromatografias

de

(HOMSI-BRANDEBURGO et al., 1988;

filtrao

interao

SELISTRE et al., 1990; LOMONTE et al.,

conseguimos um alto grau de pureza da

1990 ; MANCUSO et al., 1995; ANGULO

PLA2 (CM1b-F5) de interesse (figura 7).

et al., 1997). Apresentam tambm um alto

No entanto comparando nossos resultados

nmero de resduos de meia-cistina, o que

com Rodrigues et al. (2007) conclumos

sugere a presena de vrias pontes dissulfeto

que o rendimento protico no foi to

intracadeia. As PLA2s txicas so muito

satisfatrio,

estveis, provavelmente como resultado da

atividade PLA2 foi maior (Tabela 1).

sobre

de

cida

substratos

bsicos

artificiais.

hidrofbicos

Com

essa

mas

nova

troca

metodologia

inica,

gel-

hidrofbica,

recuperao

da

extensa ligao cruzada, tornando-as ativas

O primeiro fracionamento, em CM-

em uma ampla faixa de pH e temperatura.

Sepharose, indica que a PLA2 uma

Entretanto, vrias PLA2s cidas tambm j

protena cida, pois estava presente na

foram isoladas das peonhas botrpicas,

primeira frao denominada CM1. Esta

como por exemplo: SIIISPIIA, SIIISPIIB,

frao continha as enzimas com carga

SIIISPIIIA e SIIISPIIIB por Ketelhut et al.

negativa, ou seja, que no interagiam com

(2003); P1, P2 e P3 por Daniele et al.

(1995). Da peonha de B. pauloensis j

determinou o pI da PLA2 cida de B.

foram

Duas

pauloensis em torno de 4,34. A massa

fosfolipases A2 Asp-49 (RODRIGUES et

molecular da PLA2 estimada por SDS-

isoladas

vrias

PLA2s.

resina.

Rodrigues

et

al.

(2007)

13

PAGE aproximadamente 15.800 Da,

562 (leucemia) e fibroblastos (Human

valor tambm encontrado por Rodrigues et

foreskin fibroblasts - HFF). Esta enzima

al. (2007). Este valor est dentro da faixa

no

de massa molecular (13.000 a 18.000)

bactericida (resultados no apresentados) e

encontrada para as fosfolipases A2 j

induziu uma baixa atividade antitumoral

purificadas e caracterizadas, (KINI, 2003).

(Figura 8).

foi

capaz

de

induzir

atividade

A atividade especfica aumentou

A ao antitumoral de venenos de

significativamente da peonha bruta para a

serpentes tem sido alvo de vrias pesquisas

frao CM1b-F5, 63 U/mg e 289 U/mg,

atualmente. Muitos desses efeitos so

respectivamente. Porm, pode-se observar

induzidos por PLA2s bsicas cuja ao

que a atividade caiu, quando comparadas

citotxica independe da atividade cataltica

as atividade das fraes CM1 e CM1b.

dessas enzimas (STABELI et al., 2006). A

Ketelhut et al. (2003) verificou que

ao antitumoral de PLA2s cidas isoladas

as fosfolipases A2, geralmente, possuem

de venenos de serpentes ainda no foi

atividade

pois

demonstrado, embora no presente estudo

promovem a hidrlise de lecitinas e

verificamos uma discreta ao citotxica

lisolecitinas, componentes capazes de lisar

sobre clulas tumorais K-562 (leucemia).

a membrana dos eritrcitos. Neste trabalho

Novos estudos com outras linhagens

verificou-se que tanto a peonha bruta de

celulares devero ser realizados para se

Bothrops

verificar o potencial antitumoral dessa

hemoltica

pauloensis

indireta,

quanto

PLA2

(CM1b-F5) isolada da mesma, foram

capazes de induzir a hemlise in vitro. O
aumento

da

atividade

foi

tempo-

toxina.
Estudos na rea de purificao e
caracterizao

de

animais

teve uma atividade quase duas vezes maior

utilizao das mesmas como modelos

do que a peonha para os mesmos

moleculares para a sntese de novos

intervalos de tempo (Figuras 7a e 7b).

agentes teraputicos que podero ser

(2007), algumas fosfolipases A2

o

rompimento

de

para

utilizados na terapia do cncer.

so

capazes de induzir a citotoxicidade, bem

como

perspectivas

toxinas

dependente, sendo que a toxina isolada

De acordo com Villalobos et al.

abrem

funcional

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

membranas

bacterianas. Neste trabalho foi avaliada a

atividade bactericida e citotxica da PLA2
em Escherichia coli, clulas tumorais K-

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