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RESUMEN
En el presente trabajo se ha desarrollado el cultivo celular de la cepa Kluyveromyces
Marxianus NRRL Y-7571 realizando su manipulacin desde su estado inactiva en agar.
El cual ha seguido una serie de procedimientos secuenciales tales como activacin en
estufa, inoculacin en agar, dndole todas las condiciones y facilidades para que pueda
crecer, asimismo siguiendo con la secuencia se inoculo en un medio denominado rico
(30ml), el cual tiene todos los nutrientes que esta levadura requiere para su ptimo
desarrollo.
Luego de un evidente crecimiento en el medio rico, la totalidad de este medio es diluido
dentro de otro medio al que se denomina mnimo (300 ml) por sus limitaciones en cuanto a
nutrientes, ya que este contiene solo los componentes necesarios para que el
microorganismo pueda subsistir, tales como fuente de carbono que en nuestro caso fue
Fructosa.
Se trata entonces de observar y comparar como se va produciendo el crecimiento celular
con los nutrientes exactamente necesarios para tal accin y al mismo tiempo como va
disminuyendo
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INTRODUCCION
En la actualidad muchos de los alimentos son obtenidos gracias al manejo y
conocimiento del crecimiento de
el
Asumiendo altos valores para estos parmetros, la reduccin mxima puede volverse de
40%. Hoy en da es conocido que un nmero de levaduras fermenta fructosa en etanol,
siendo Kluyveromyces Marxianus de las ms eficientes, especialmente en relacin con el
rendimiento y la proporcin volumtrica. Empleando esta levadura para la fermentacin de
la D-xilosa, la reduccin en el precio del etanol alcanza el 70% del mximo asequible.
Kluyveromyces Marxianus NRRL Y-7571es una de las mejores cepas de levadura
natural capaz de convertir el azcar hexosa, fructosa, en etanol. Para desarrollar una ms
eficiente pentosa en el proceso de fermentacin, la nutricin se basa en estrategias para
mejorar la vitalidad de levadura y la fermentacin se explor la eficiencia mediante el
estudio de variadas culturas en nutrientes tales como: aminocidos, urea, vitaminas, y
minerales.
A. CULTIVO POR LOTES
La fermentacin por lotes se refiere a un sistema completamente cerrado donde todos
los materiales requeridos estn cargados en el fermentador, previamente desinfectados
antes del proceso de fermentacin y los residuos removidos al final. Los nicos
materiales extrados y agregados durante el curso de una fermentacin por lotes son el
intercambio de gases y las soluciones de control de pH, respectivamente. En este modo
de funcionamiento, las condiciones estn cambiando continuamente con el tiempo, y el
fermentador es un sistema de estado inestable.
La ventaja principal es el menor riesgo de contaminacin con respecto a otros procesos
de fermentacin (cultivo continuo y cultivo por lote alimentado.
La desventaja principal del cultivo por lotes es el alto tiempo improductivo entre lotes,
comprendiendo la carga y descarga del fermentador, la limpieza, esterilizacin y
procesos de salida. Otra desventaja es la inhibicin del crecimiento por metabolitos
primarios, secundarios y por la ausencia de nutrientes.
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FISICOQUMICOS
QUE
AFECTAN
LA
RAPIDEZ
DE
CRECIMIENTO.
Efecto del pH y la temperatura sobre el crecimiento
Los microorganismos pueden crecer en una variada gama de pH que va desde
pH=2 para los acidfilos hasta pH=11 para alcalfilos. En general los
microorganismos que toleran pH cidos no toleran pH alcalinos y viceversa.
Independientemente del pH que pueda soportar un microorganismo, es importante
conocer cul es el pH ptimo para el crecimiento. En la fig. 11 est representada en
forma general la variacin de un con el pH para hongos y bacterias. De la misma
surge claramente que en general los hongos tienen un pH ptimo cercano a 5
mientras que para bacterias se da alrededor de pH = 7; adems debido a la forma
"achatada" de las curvas, variaciones de 0.5 unidades de pH alrededor del ptimo
no tienen mayor influencia. Durante el crecimiento los microorganismos modifican
el pH del medio de cultivo, normalmente hacindolo disminuir; por tal motivo es
frecuente incluir en las medias sustancias que acten como tampn (buffer) a fin de
evitar que el pH se aleje del ptimo.
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posteriores de temperatura inactivan las enzimas que catalizan las reacciones, con lo
que el valor de un decrece rpidamente. La temperatura ptima resulta de la
interaccin de estos dos efectos.
La temperatura: La temperatura ejerce una influencia determinante en el conjunto
de la actividad celular microbiana .A temperaturas bajas esa actividad puede ser
bloqueada totalmente .Dado que es una propiedad comn a todas las reacciones
qumicas, el crecimiento microbiano es acelerado por un aumento de temperatura y
se puede considerar, globalmente, que la velocidad de crecimiento se duplica
cuando la temperatura se eleva en 10 C.
De acuerdo a la temperatura en la cual se observa este fenmeno, las levaduras son
microorganismos mesfilos que prefieren temperaturas intermedias vecinas a
30C .Su crecimiento no se efecta por debajo de 15C , ni por arriba de los 45C
para la mayor parte de ellos. La temperatura ptima para Kluyveromyces marxianus
var. se encuentra entre 30 45 C, Elsevier, 1990.
El pH: Es un parmetro crtico en el cultivo de microorganismos ya que estos slo
pueden crecer en un rango estrecho de pH fuera del cual mueren rpidamente. El
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pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las clulas ya que,
en muchos casos, la obtencin de energa metablica depende de la existencia de
una diferencia en la concentracin de protones a ambos lados de la membrana
citoplsmica. Hay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el pH
del medio de cultivo suele tender a bajar durante el cultivo. El decremento del pH
se puede deber a varios factores, uno de los cuales es la liberacin de cidos
orgnicos de cadena corta (frmico, actico, lctico). Por consiguiente, es necesario
controlar el pH de los cultivos para evitar que un descenso excesivo pueda producir
la auto esterilizacin del cultivo
El potencial redox y el oxgeno: Son factores determinantes del crecimiento y del
metabolismo del cultivo. El potencial redox del medio de cultivo nos indica su
capacidad para aceptar o donar electrones, esto es: sus caractersticas oxidantes o
reductoras. Uno de los factores que intervienen en el potencial redox, aunque no el
nico, es la concentracin de oxgeno, O2. Hay microorganismos que requieren
ambientes oxidantes para crecer, mientras que otros necesitan ambientes
reductores. El requerimiento de condiciones oxidantes o reductoras no debe
confundirse con la necesidad de presencia o ausencia de oxgeno para que se
produzca el crecimiento.
Un microorganismo es aerobio cuando necesita oxgeno para vivir y es anaerobio
cuando o bien no lo necesita (anaerobios facultativos) o anaerobios aerotolerantes
como las bacterias lcticas o cuando muere en presencia de oxgeno (anaerobios
estrictos como los clostridios). El rendimiento Yx/sde los procesos fermentativos es
menor que el de los respiratorios: las bacterias y las levaduras producen menos
biomasa cuando crecen fermentando que cuando lo hacen respirando.
La concentracin de los compuestos que se necesitan para el crecimiento
Es importante porque puede provocar una disminucin de la tasa de crecimiento a
causa de la alta presin osmtica del medio. Hemos visto que en el curso de la fase
exponencial del crecimiento , las tasas de crecimiento era independiente de la
concentracin de los distintos componentes del medio de cultivo .Por debajo de
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CUADRO DE CLASIFICACION
Especies ms frecuentes
Gnero
Caractersticas
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyce unisporus
Candida kefir
Kluyveromyces marxianus var.
marxianus.
LEVADURAS
Levaduras no fermentadoras de
la lactosa, que producen alcohol
y CO2 a partir de glucosa.
Levaduras fermentadoras de la
lactosa.
Responsables de formacin de
CO2 y contribuyendo al
caracterstico sabor y aroma.
D. LEVADURA:
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Las levaduras constituyen una rama menor de los hongos en cuanto a nmero de
especies (350 especies reagrupadas en 39 gneros) Tienen una importancia grande por
sus actividades bioqumicas .Algunas realizan fermentaciones que se utilizan desde los
orgenes de la civilizacin (fermentacin alcohlica) Estas actividades tienen
aplicaciones industriales muy importantes.
Su carcter comn es el estado unicelular permanente o predominante en ausencia de un
verdadero micelo cenoctico.
CONDICIONES NECESARIAS PARA LA FERMENTACION:
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Las levaduras tienen necesidad de oxgeno para desarrollarse, pero ellas se adaptan
durante un cierto tiempo a la vida anaerbica.
Metabolismo celular
Macronutrientes
C, N, Mg, S, K y P
Micronutrientes
Autotrfico
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Glucosa C6H12O6
Fuente de N
Fuente de S
Fuente de P
Fuente de K
Fuente de Mg
Fuente de S
OBJETIVOS:
1.1 OBJETIVOS GENERALES:
Disear un medio de cultivo celular por lotes en matraces, usando como
fuente de carbono glucosa y empleando una cepa de Pichiastipitis NRRL Y7124
Determinar los parmetros cinticos de la cepa Pichiastipitis NRRL Y-7124
1.2 OBJETIVOS ESPECFICOS:
Determinar la cintica de crecimiento de Pichiastipitis NRRL Y-7124
Determinar la cintica de consumo de la fuente de carbono glucosa.
Determinar la cintica de generacin de etanol
Determinar el M ,YX/S, YP/S.
Evaluar el valor del pH durante la cintica.
MATERIALES Y METODOS
Material Biolgico: Cepa liofilizada de KluyveromycesMarxianusNRRL Y-7571
PREPARACIN DE SLIDO DE MANTENCIN:
Materiales y Equipos:
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Balanza analtica
Mechero Bunsen
Gradilla
Pipeta de 10 ml.
Vaso de precipitado.
Cocina a gas
Olla a presin.
Varilla de vidrio
Guantes.
Esptula
Reactivos y nutrientes:
Agua destilada.
Extracto de levadura.
Peptona.
Extracto de malta
Agar.
PREPARACIN DE MEDIO DE ACTIVACIN:
Materiales y Equipos:
Balanza analtica
Micropipeta
Estufa
Algodn
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Gasa
Varilla de vidrio
Esptula
Reactivos y nutrientes:
Glucosa
Extracto de levadura
Solucin de sales
Agua destilada
Alcohol
Matraz de 1 L
Varilla de vidrio
Balanza analtica
Gasa y algodn
Olla a presin
Reactivos y nutrientes:
Glucosa
(NH4)2SO4
Solucin de sales
KH2PO4
MgSO4.7H2O
Extracto de Levadura
Agua destilada
Alcohol
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Algodn
Gasa
Agua destilada
Aza bacteriolgica
Shaker
Espectrofotmetro
Balanza Analtica
Centrfuga
Horno Esterilizacin
Agitador
Autoclave
Incubadora
Shaker
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RESULTADOS Y DISCUSION
A.
N
Hora
Tiempo
ABS 640nm
1
09:00
0
0.245
2
10:30
1.5
0.441
3
12:00
3
0.746
4
01:00
4
0.346
5
02:00
5
0.375
6
03:30
6.5
0.411
7
05:00
8
0.448
8
06:30
9.5
0.562
9
08:00
11
0.488
10
09:30
12.5
0.564
11
11:00
14
0.563
12
12:00
15
0.557
CULTIVO CELULAR POR LOTES
X g/L
fd
0.34928315
0.70053763
1.24713262
1.59086022
1.74677419
1.94032258
2.13924731
2.75215054
2.35430108
2.76290323
2.75752688
2.72526882
1
1
1
3
3
3
3
3
3
3
3
3
CINE
TICA
DE
Pgina 3
El medio de cultivo debe aportar todos los elementos necesarios para las sntesis
celulares y para cubrir las necesidades energticas de las levaduras.
La presencia de una concentracin elevada de extracto de levadura y la inclusin de
factores (temperatura y agitacin) de crecimiento en el medio de cultivo
favorecieron el crecimiento de Kluyveromyces Marxianus NRRL Y 7571.
Probablemente el incremento del crecimiento fue por la inclusin de estos factores
fue debido a que la fructosa es un monosacrido y es fcil para la levadura
aprovechar la fuente de carbono que esta molcula pose, lo cual favorece a la
produccin de etanol como producto de la fermentacin.
CRECIMIENTO MICROBIANO
3
2.5
2
CONCENTRACION g/l
BIOMASA
1.5
1
0.5
0
0
10
TIEMPO
hr.
12
14
16
Pgina 3
Pgina 3
extractos
de
levadura
son
excelentes
substratos
para
muchos
LN
(X/Xo)
0
0.6959651
7
1.2727193
7
1.5161472
4
dx
= . dt
x
INTEGRANDO:
ln (
xf
)= .t
xo
Graficando:
Pgina 3
LN(X/Xo)
Linear (LN(X/Xo))
0.5
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5
Tiempo
(h)
dx
= . dt
x
y=0.3833 x +0.0567
mx=0.3833
h-1
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Entonces:
td= ln (2)/0.3833=1.8h
En la tabla 02 y fig. 02 se observa que la cintica de consumo de la fructosa se
encuentra en funcin a la velocidad de crecimiento de la Kluyveromyces Marxianus
dihidrogenofosfato de potasio (
Tiemp
o
0
1.5
3
4
5
6.5
8
9.5
11
12.5
ABS 540nm
Sf g/L
0.594
0.459
0.042
0.014
0.04
0.108
0.116
0.125
0.126
0.123
3.69666457
2.84707363
0.22278162
0.04657017
0.21019509
0.2127124
0.22949444
0.24837424
0.25047199
0.24417873
Graficando:
CONSUMO DE SUSTRATO
4
3.5
3
2.5
CONCENTRACION g/l
SUSTRATO
2
1.5
1
0.5
0
0
TIEMPO
8 10 12 14
hr.
Pgina 3
Hora
Tiempo
ABS
X g/l
ABS S
Sf g/L
0.34928315
0.70053763
1.24713262
1.59086022
1.74677419
1.94032258
2.13924731
2.75215054
2.35430108
2.76290323
2.75752688
2.72526882
0.594
0.459
0.042
0.014
0.04
0.108
0.116
0.125
0.126
0.123
3.69666457
2.84707363
0.22278162
0.04657017
0.21019509
0.2127124
0.22949444
0.24837424
0.25047199
0.24417873
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
09:00
10:30
12:00
01:00
02:00
03:30
05:00
06:30
08:00
09:30
11:00
12:00
0
1.5
3
4
5
6.5
8
9.5
11
12.5
14
15
0.245
0.441
0.746
0.346
0.375
0.411
0.448
0.562
0.488
0.564
0.563
0.557
Graficando:
Pgina 3
CRECIMIENTO DE BIOMASA
4
3.5
3
2.5
CONCENTRACION
BIOMASA
SUSTRATO
1.5
1
0.5
0
0
10 12 14 16
TIEMPO
X
S
REEMPLAZANDO
Yx /s=
(1.590860220.34928315)
(0.046570173.69666457)
YX/S = 0.3401493
PRODUCTIVIDAD EN BIOMASA
Productividad Mxima:
Pgina 3
Qx=
X
t
REEMPLAZANDO
Qx=
( 1.590860220.34928315)
(40)
Qx=0.31039427 g/l.h
Productividad Total :
Qx=
X
t
REEMPLAZANDO
Qx=
( 2.725268820.34928315)
(150)
Si estn disponibles
Parmetro cintico
m (h-1)
0,38
td (h)
1,81
Yx/s (g/g)
0,34
Xmax (g/l)
2.76
CONCLUSIONES
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Se logr disear el medio de cultivo con los componentes necesarios para lograr el
crecimiento de Kluyveromyces Marxianus NRRL Y-7571
El diseo de los diferentes medios tanto activacin como fermentacin debe tener la
adecuada cantidad de fuente de N, fuente de carbono, vitaminas (extracto de
levadura) y otros (las dems sales usadas) para que Kluyveromyces Marxianus
NRRL Y-7571pueda desarrollarse.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Pgina 3
Biotecnologa.
Manual
de
Microbiologa
Industrial.
Wolf.
Grueguer.
Pgina 3
ANEXOS
... (1)
Para fuente de carbono,
Para otra fuente,
=0.5
=1
Donde:
(2)
(3)
De (3):
(4)
De (4):
Si
. Entonces;
(5)
FUENTE
=1
=1.5
g/L
% CELULA
FRUCTOSA
ELEMENT
O
C
MgSO4.7H2O
0.01
MgSO4.7H2O
Mg
(NH4)2SO4
% NUTRIENTE
40
Yx/s
S (G/L)
S (G/L)
0.40
4.950
7.4250
11.55
1155.00
0.002
0.0026
0.1
19.86
198.60
0.010
0.0150
21.21
2.36
0.840
1.2603
Pgina 3
(NH4)2SO4
0.01
24.24
2424.00
0.001
0.0012
KH2PO4
28.68
28.68
0.069
0.1036
KH2PO4
0.25
22.79
91.160
0.022
0.0326
Tomar
Pgina 3
ml sol. estndar
1
2
3
4
5
6
7
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.05
0
ml agua
destilada
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.45
0.5
[FRUCTUOSA
]
2
1,6
1,2
0.8
0.4
0,2
0
ABS 540
nm
0.941
0.775
0.585
0,420
0,195
0,086
0
Pgina 3
0.9
0.8
0.7
0.6
ABSORBANCIA 540 NM
abs
0.5
Linear (abs)
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
0.5
1.5
2.5
CONCENTRACION DE AZCAR
ECUACIN GENERAL:
GLUCOSA= ABS. 0.0066
0.4767
Pgina 3
N
Capacho
ml.
caldo
m.o
ml.
agu
a
ABS
(:640nm)
(g) P1
Peso
capacho
(g) P2
Peso
capacho+clula
(g/L)
X
0.1888
(g) P1
Peso
seco
clula
0.0073
2.5
2.5
0.838
0.1815
0.735
0.1998
0.2059
0.0061
1.22
0.444
0.2478
0.2506
0.0028
0.56
0.5
4.5
0.237
0.2298
0.2316
0.0018
0.36
0.3
4.7
0.148
0.2223
0.2233
0.0010
0.2
0.15
4.85
0.086
0.2096
0.2102
0.0006
0.12
1.46
Pgina 3
ABS 640 NM
0.4
ABS
Linear (ABS)
0.2
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
ECUACIN GENERAL
BIOMASA= ABS. 0.0501
0.558
D. CRECIMIENTO CELULAR
El medio rico se prepara y se esterilizara por separado
Para nuestro inoculado al medio rico, se har con cepas ya sembradas en el medio
de activacin, se realizara una azada en el matraces de 1 L.
El matraz preparado se llevara al shaker a 240 rpm, temperatura de 30 C haciendo
un seguimiento por cada hora.
Se toma datos por cada hora y se ira colocando en una tabla de datos.
E. ESTERILIZACIN DE PIPETAS
Las pipetas sern forradas con papel aluminio y puestas a la estufa por un tiempo
20 minutos a temperatura de 140-150 C.
F. TCNICA DE ASEPSIA
Se usara en los das en que hay sembrado e inoculacin de clulas.
Los tubos de ensayo y los matraces que sern utilizados en el medio rico
primero sern lavados, secados y esterilizados en la estufa por un tiempo 20
minutos a temperatura de 140-150 C.
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