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En 1910, el botnico ruso M. Tswett describi por vez primera esta tcnica, que fue
aplicada a la separacin de pigmentos de plantas, dndole el nombre de
cromatografa en referencia a las bandas coloreadas de pigmentos que se
separaban por su adsorcin selectiva sobre columnas de yeso ("chroma" (color) y
"graphein" (escribir)).
Tras su descubrimiento, la cromatografa quedo prcticamente olvidada hasta
1930, ao en que fue redescubierta por Kuhn y Lederer, quienes la aplicaron para
la separacin de carotenoides; a partir de este momento, el uso de esta tcnica se
fue extendiendo cada vez ms, al tiempo que se desarrollaban diferentes versiones
de la misma: cromatografa de reparto, de papel, de capa fina, etc.
Un hito importante en el desarrollo de la cromatografa lo constituy el desarrollo
de la cromatografa gas-lquido.
Hoy en da casi no hay campo de la qumica, biologa, medicina, etc. en el que no
se utilice la cromatografa en alguna de sus formas, tanto en su vertiente
preparativa como en la analtica; por otra parte el desarrollo sobre el uso conjunto
de la cromatografa con otras tcnicas analticas, as como el desarrollo de otros
tipos de cromatografa, como es por ejemplo la de fluidos supercrticos, hace
previsible una extensin an mayor de su uso.
La cromatografa es esencialmente un
mtodo fsico de separacin en el que
los componentes a separar se
distribuyen entre dos fases, una
inmvil (fase estacionaria), y otra
mvil (fase mvil) la cual percola a
travs de la primera.
El proceso cromatogrfico se da como
resultado del movimiento de los
componentes de la mezcla arrastrados
por la fase mvil a lo largo de la fase
estacionaria (elucin), producindose
la separacin debido a las diferencias
en las constantes de distribucin de
los componentes de la mezcla entre la
fase estacionaria y la mvil.
A la distribucin final de los
componentes en funcin de su
posicin sobre el lecho estacionario, o
del tiempo en que eluyen se le
denomina cromatograma.
Ejemplo: Se utiliza una columna rellena de CaCO3, en la que se introduce un extracto de hojas
verdes en ter de petrleo, y seguidamente se aade disolvente puro (ter de petrleo)
(eluyente), con el objetivo de separar tres componentes, clorofila, carotenos y xantofilas.
En esta separacin, la fase estacionaria es el relleno (CaCO3), la fase mvil es el ter de petrleo y
los componentes a separar, los distintos pigmentos vegetales, los cuales se encuentran sometidos
a dos fuerzas contrarias: el disolvente tiende a arrastrarlos hacia la salida y el CaCO3 a retenerlos.
Como este ltimo efecto es diferente para los distintos pigmentos, stos se mueven a diferente
velocidad y emergen de la columna a distintos tiempos. Cuando se mide la concentracin de cada
componente a la salida de la columna y se representa en funcin del volumen de fase mvil, o del
tiempo transcurrido desde la introduccin de la muestra, se obtiene una grfica denominada
"cromatograma".
Cromatografa de adsorcin
La separacin depende de los equilibrios de adsorcin/desorcin de los
componentes de la mezcla, entre la fase estacionaria slida (adsorbente) y la
fase mvil lquida o gaseosa.
La fuerza con que es adsorbido un componente depende de: la polaridad del
componente, la actividad del adsorbente y la polaridad de la fase mvil.
En general cuanto ms polar es un compuesto ms fcilmente ser adsorbido.
La cromatografa de adsorcin, es una tcnica apropiada para la separacin de
compuestos de polaridad baja y media. La separacin de compuestos muy
polares requiere, debido a la gran retencin que ofrecen, la utilizacin de
adsorbentes muy poco activos, o bien, tratamientos qumicos previos para la
preparacin de la muestra a fin de reducir su polaridad.
Una caracterstica importante del adsorbente es el tamao de partcula. La
retencin es proporcional al rea superficial, la cual, a su vez, depende del
tamao de partcula y de la estructura interna de las partculas de adsorbente.
Cuanto menor sea el tamao de partcula, mayor ser el rea superficial del
adsorbente y, en consecuencia, mayor el nmero de centros activos
disponibles para la adsorcin.
Cromatografa de reparto
Est basada en la separacin de una mezcla de sustancias mediante el
reparto existente entre la fase mvil (lquido o gas) (por ejemplo un
lquido no polar como el hexano) y la fase estacionaria (lquida)
(generalmente un lquido polar como por ejemplo etilen-glicol), soportada
o ligada sobre un slido adecuado (gel de slice, celulosa, tierra de
diatomeas, poli-estireno, etc.).
La mayor o menor migracin de un compuesto en este tipo de
cromatografa, ser funcin del coeficiente de reparto de ste entre la fase
estacionaria y la fase mvil.
La cromatografa de reparto es utilizable para la separacin de mezclas de
compuestos de polaridad media y alta.
Resumen de los tipos de cromatografa (Separation Process Principles, 3rd Edition; J. D. Seader (University of
Utah); Ernest J. Henley (University of Houston); D. Keith Roper).
Los sorbentes (fases estacionarias pueden venir en muchas formas y composiciones qumicas
debido a las diversas formas que se aplica la cromatografa.
La mezcla a separar, despus de la inyeccin en el fluido portador para formar la fase mvil,
puede ser un lquido (cromatografa lquida) o un gas (cromatografa de gases). A menudo, la
mezcla es inicialmente un lquido, pero se vaporiza por el gas portador, dando una mezcla de
gases como fase mvil.
Los gases portadores son inertes y no interactan con el sorbente o alimento. Los lquidos
portadores pueden interactuar y deben ser seleccionados cuidadosamente.
La fase estacionaria puede ser un slido, un lquido soportado o unido a un slido, o un gel.
Con un adsorbente poroso slido, el mecanismo de separacin es la adsorcin. Si el mecanismo
deseado es el intercambio inico, se utiliza una sustancia cambiadora de iones, polimrica o
sinttica. Con un gel de polmero o un slido microporoso, es posible una cromatografa del tipo
exclusin.
En columnas de relleno (> 1 mm de dimetro interno), los sorbentes son en forma de partculas.
En las columnas capilares (<0,5 mm dimetro interior), el sorbente es la pared interior o un
revestimiento sobre esa pared.
Cada tipo de sorbente se puede aplicar a hojas de vidrio, plstico, o aluminio para su uso en
cromatografa de capa fina (o plana) o a una hoja de material de celulosa para uso en
cromatografa de papel.
Si se utiliza una bomba en lugar de la gravedad para pasar una fase mvil lquida a travs de una
columna de relleno, se utiliza la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC).
Los dos adsorbentes ms comunes utilizados en la cromatografa son almina porosa y gel de
slice poroso. De menor importancia son carbono, xido de magnesio, y carbonatos.
Eficacia de la columna
El tema de la eficacia de un sistema cromatogrfico se aborda desde dos puntos de vista:
La teora de platos: se basa en considerar que la columna est constituida por numerosas,
pero discretas capas estrechas, denominadas platos tericos, en trminos anlogos a lo
que ocurre en la teora de la destilacin fraccionada o de la extraccin en contracorriente.
Se considera que en cada plato se establece un equilibrio del componente entre la fase
mvil y la fase estacionaria, y el desplazamiento del analito a travs de la columna se trata
como una transferencia de la fase mvil desde un plato al siguiente.
La eficacia de la columna aumenta al hacerlo el nmero de estas transferencias, esto es, al
aumentar el nmero de platos tericos.
La teora cintica: considera que el ensanchamiento de las bandas se produce como
consecuencia de que los distintos procesos de transferencia de masa durante el
desplazamiento de una especie a lo largo de la columna ocurren a velocidad finita.
Segn esta teora, la forma de los picos depende de los siguientes factores:
* Difusin por turbulencia y trayectorias seguidas por la fase mvil
* Difusin longitudinal del soluto a lo largo de la columna
* Equilibrio del soluto entre las fases mvil y estacionaria
H=
L
N
Al considerar la eficacia, solamente se han tenido en cuenta los efectos propios de la columna,
aunque existen otros parmetros del sistema (anchura de banda inicial, velocidad de la fase mvil,
etc.) que contribuyen al ensanchamiento de las bandas cromatogrficas.
Eficacia de la columna
La separacin entre dos bandas cromatogrficas, puede estudiarse en funcin de dos parmetros
La retencin relativa o factor de separacin,
=kB'/k'A
La resolucin,
t
Rs = w +w
1 2
2
Una separacin total de dos bandas requerir valores de y de Rs lo ms elevados posible
Un valor elevado de Rs puede conseguirse aumentando la eficacia de la columna (mayor longitud de
columna, menores dispersiones de banda, etc.)
El valor de es constante para cada sistema cromatogrfico y solamente podr variarse alterando la
fase estacionaria o la mvil (cambiando de sistema cromatogrfico).
La solucin de un problema real de separacin entre dos bandas deber darse en funcin de los
valores de y Rs que presente
para valores altos de y bajos de Rs, la separacin podr conseguirse mediante un aumento de
eficacia
para valores bajos de no es practico intentar la separacin en base a un aumento de eficacia y
debe procederse a un cambio del sistema.
La curva AETP
El ensanchamiento de la banda debido a la resistencia a la transferencia de materia, en la fase mvil y
en la fase estacionaria, vendr dado por,
L
=
L
=
d es el dimetro medio de la partcula del lecho estacionario y Cm y Ce coeficientes que dependen
respectivamente de la fase mvil y de la fase estacionaria.
A partir de las ecuaciones anteriores, se puede deducir que la desviacin total de la banda vendr
dada por,
2Dm L
L
L
/
=
+aL +
+
u
Y en consecuencia, la altura equivalente de plato terico, vendr dada por la expresin:
2Dm
"
/
H= =
=
+a +
+
L
u
!
!
Expresin matemtica de la curva de AEPT o ecuacin de Van Deemter
$=
%
+ ( + )&
&
La curva AETP
La altura de plato es funcin del dimetro de las partculas de la fase estacionaria, mejorndose la
eficacia del sistema cromatogrfico a medida que disminuye el tamao de partcula.
La eficacia de una columna cromatogrfica, ser tambin funcin de la velocidad lineal de la fase
mvil
Asismetra de picos
Como primera aproximacin, se ha considerado que los picos cromatogrficos eran
gaussianos (simtricos). En la prctica no es as y la realizacin de clculos en base a esta
suposicin, puede llevar a errores significativos si se trabaja con picos muy distorsionados.
El modelo de la curva de Gauss slo es apropiado cuando se trabaja con picos cuya
asimetra es ligera.
Factor de asimetra,
b+f
FA = b+fw
w=|b-f|
Los factores de asimetra elevados deben ser evitados (por los errores en la cuantificacin
y por la prdida de resolucin). Un pico con FA = 1,1 ocasiona una prdida de eficacia de un
10 %.
La asimetra de los picos puede ser debida a:
resolucin incompleta de dos bandas
reacciones qumicas del compuesto en la
columna
volmenes muertos en el sistema
cromatogrfico
tcnicas de inyeccin incorrectas, etc.