Comprendre La Biologie Moleculaire

Ann Fr Anesth R6anim
0 Elsevier, Paris
1999 ; 18 : 725-47
Revue gCnCrale
Comprendre
la biologie mol6culaire
V. Laudenbach, 2, J. Mantz, J.M. Desmontsl

Dkpartement
danesthksie-rtfanimation
21aboratoire
de neurologie
du dkveloppement,
chirurgicale,
unite E-9935,
hdpitaux
h6pital
RiSUME
Objectifs : Exposer les bases theoriques et methodologiques de la biologie moleculaire.
lndiquer ses principales
applications dans le domaine medical.
Sources des don&es
: Pour cette revue, les publications
en langues francaise et anglaise, parues dans les journaux
consacres a la recherche en biologie moleculaire
et a
Ianesthesie-reanimation
chirurgicale, referencees dans la
banque de don&es Medline@, ont ete analysees, ainsi que
les ouvrages de la specialite.
Selection
des articles : Ont ete selectionnes : 1) les articles originaux correspondant
aux principales
avancees
ayant abouti a Ietat actuel de la specialite, en particulier
dans le domaine de Ianesthesie-reanimation
chirurgicale ;
2) les revues et mises au point ; 3) certains chapitres
douvrage de synthese.
Extraction
des donnbes : Les donnees extraites correspondent : 1) aux connaissances
actuelles concernant les
mecanismes de conservation et dexpression du genome ;
2) aux principes des techniques experimentales
les plus
courantes ; 3) aux possibilites
dexploitation
de ces
connaissances
et de ces techniques en anesthesie et en
reanimation chirurgicale
; 4) aux developpements
les plus
recents et aux perspectives offertes par les techniques de
biologie moleculaire.
SyntMse
des don&es
: Le terme de biologie moleculaire employe en biologie medicale correspond
essentiellement a letude des acides nucleiques.
Cette mise au
point rappelle les principes generaux selon lesquels le genome est organise. Elle decrit brievement la facon dont il
sexprime. Le developpement
de la biologie moleculaire repose sur Iutilisation doutils enzymatiques,
dont les premiers ont ete les enzymes de restriction bacteriennes.
Ces
outils permettent de couper, lier, synthetiser et lire IADN.
Quelques-unes
des techniques
les plus representatives
Requ le 29 dkcembre
1998 ; accept6 aprhs hision
le 19 avril
1999.
Bichat-Claude
Robert-Deb&
Bernard-Robert
48, boulevard
Deb&
Seruriel;
75018 Paris
7.5019 Paris,
;
France
sont detaillees. Certaines, telles que la PCR, sont couramment employees dans le domaine clinique. Lexperimentation in vivo a donne naissance a des modeles animaux
dont on sait modifier le genome. II devient possible danalyser, sur un organisme entier, les consequences
de ces
modifications.
Recemment,
la possibilite
de cloner un
mammifere, puis celle de cultiver des cellules humaines totipotentes, ont bouleverse les previsions en termes dapplications a Ihomme. Les principes de ces voies de recherthe sont exposes. Le point est fait sur Ietat davancement
des programmes
de therapie genique et de cartographic
du genome humain. 0 1999 Elsevier, Paris
biologie
mol&ulaire
ABSTRACT
To understand
molecular
biology.
Objectives:
To display theorical and methodological
basis
of the molecular biology. To point out its main medical applications.
Data sources:
For this review, we analysed the English
and French literature concerning the research and clinical
aspects of the molecular biology, especially in anaesthesiology and intensive care, using the Medline@ database. The
current textbooks were also used.
Study selection: We selected: 1) the original articles corresponding
to the main advances that resulted in the
present state of this discipline; 2) the reviews; 3) some
chapters of textbooks.
Data extraction:
In this review, we report: 1) the current
knowledge
concerning the conservation
and the expression of the genome; 2) the principles of the most widely
used experimental techniques; 3) the medical applications
of this knowledge
in anaesthesiology
and intensive care;
4) the more recent developments
of this research field.
726
V. Laudenbach
Data synthesis:
Within medical biology, molecular biology
essentially corresponds to the study of nucleic acids. In this
review, the general principles governing the organization
and expression of the genome are discussed. The expansion of molecular biology has been a consequence
of the
widespread
use of enzymatic tools, of which bacterial restriction enzymes were the first. Numerous enzymes are
now available, permitting DNA strands to be cut, linked,
synthesized
and sequenced.
Several of the most representative molecular
biology techniques
are described.
Some of them, such as PCR, are commonly used in clinical situations. Animal experimental
models have also been
generated
by genome altering methods, in order to analyse the phenotypic consequences
of these modifications.
Recently, a viable mammal, deriving from a differentiated
cell, has been cloned. Human embryonic totipotent stem
cells are now available in cultures. These advances have
important ethical implications whilst, at the same time, offering new opportunities for medical applications. The state
of gene therapy and human genome sequencing
programmes is discussed. 0 1999 Elsevier, Paris
molecular
biology
Abreviations : ADN : acide dCsoxyribonuclCique ; ARN : acide

ribonuclkique ; ADNc : ADN complkmentaire ; ARNm : ARN
messager ; ARNr : ARN ribosomal ; ARNt : ARN de transfert.
La biologie moleculaire correspond a lintegration

de toutes les donnees moleculaires necessaires a la
comprehension
des mecanismes biologiques.
Le
terme de biologie moleculaire utilise couramment en
biologie medicale designe letude des acides nucleiques, lacide desoxyribonucleique
(ADN) et lacide
ribonucleique (ARN). Ces molecules sont a lorigine
des phbnomenes
biologiques
impliques
dans la
structure et le fonctionnement
des cellules et des organismes entiers. Ces phenomenes sont la synthese,
la modification
et la degradation des proteines, lipides et sucres, mais aussi des acides nucleiques euxmemes. LADN est le support de linformation
genetique. Ses modifications
peuvent Ctre a lorigine
de pathologies congenitales ou acquises. Les travaux
realids ces 30 dernieres annees ont permis une description extremement
precise, quoique inachevee,
des bases moleculaires
de phenomitnes
observes
chez differents organismes. Lidentification
de certaines modifications
pathologiques du genome peut
etre realisee en pratique courante. On peut detecter
la presence d ADN exogene, bacterien ou viral, dans
et al.
un organisme humain. 11 est desorrnais possible de

<<manipuler )) les sequences dacides nucleiques afin
den controler lexpression dans des cultures cellulaires ou des organismes entiers. Utile dans un systeme experimental, ce controle de lexpression des
genes pourrait Cgalement etre a la base de traitements. La biologie moleculaire sest done &endue
depuis la paillasse des chercheurs pour venir offrir
aux cliniciens des outils precieux pour la prise en
charge des malades. Actuellement, aucune specialite
ne peut plus ignorer cette approche, que ce soit pour
la comprehension des maladies, leur diagnostic, leur
prevention ou leur traitement. En reanimation, les infections graves ou les atteintes respiratoires s&&es
de type syndrome de detresse respiratoire aigu de
ladulte sont des exemples de champs dapplication
de la biologie moleculaire.
Lanesthesiologie
nest
pas exclue de ce mouvement. Quelles informations
lanesthesiste pourra-t-i1 tirer de cette approche ?
Quelles en seront les consequences pour le malade ?
11 est utile, meme si on souhaite privilegier les aspects <<pratiques >) par rapport a la cctheorie >>, de
comprendre les principes generaux de cette discipline, afin de repondre a ces questions. Cette revue
rappelle les concepts de base concernant la structure
des acides nucleiques
et les mecanismes
de
transcription-traduction.
Quelques-uns des outils et
techniques les plus couramment employ& dans les
laboratoires de biologie moleculaire sont detailles.
Nous verrons quelles applications pratiques peuvent
en etre tirees, dans un but de recherche ou a des fins
cliniques.
I-IISTORIQUE
La biologie moleculaire a pris son essor dans le courant des annees 1970. Auparavant, lexistence dun
materiel supportant une information
transmissible
dune generation a lautre Ctait connue. En 1944,
Avery, Mac Leod et Mac Carthy demontrent que
lacide desoxyribonucleique
est le support de cette
information [ 11. Sa structure en double helice est detrite par Watson, Crick et Wilkins en 1953 [2]. Entre
1961 et 1966, le code genetique est Ctabli [3, 41.
Lenchainement
des bases sur une molecule dacide
nucleique constitue a lui seul toute linformation
necessaire a la synthese dune chaine peptidique. Le
code genetique Ctablit le lien entre les differentes
combinaisons
de bases possibles et les acides
Comprendre la biologie moleculaire
727
Tableau I. Le code genetique.

I base
2 base
T
l-l-T
TTC
TTA
TTG
CTT
CTC
CTA
CTG
ATT
ATC
ATA
ATG
GTC
GTA
GTG
Phe
Leu
\
Leu
Ileu
Met
Val
I
3 base
TCT
TCC
TCA
TCG
CCT
ccc
CCA
CCG
ACT
ACC
ACA
ACG
GCT
GCC
GCA
GCG
Ser
Pro
Thr
Ala
TAT
TAC
TAA
TAG
CAT
CAC
CAA
CAG
A AT
AAC
AAA
AAG
GAT
GAC
GAA
GAG
TY~
stop
His
Gin
Asn
LYS
Asp
Glu
TGT
TGC
TGA
TGG
CGT
CGC
CGA
CGG
AGT
AGC
AGA
AGG
GGT
GGC
GGA
GGG
CYS
stop
V-J
Arg
Ser
Arg
GUY
T
C
A
G
T
C
A
G
T
C
A
G
T
C
A
G
Buses; T: thymine ; C : cytosine ; A : adenine, G : guanine ; Acides aminb correspondant

aux codons : Phe : phtnylalanine ; Leu : leucine ;
Ileu : isoleucine ; Met : methionine ; Val : valine ; Ser : serine ; Pro : proline ; Thr : threonine ; Ala : alanine ; Tyr : tyrosine ; His : histidine ;
Gin : glutamine ; Asn : asparagine ; Lys : lysine ; Asp : acide aspartique ; Glu : acide glutamique ; Cys : cysteine ; Trp : tryptophane ; Arg :
arginine ; Gly : glycine. Stop : codons <<non-sens D.
amines correspondants (tableau I). Ce code, qui regit la traduction dun acide nucleique en proteine,
est universel, cest-a-dire identique chez tous les organismes, de la bacterie a lhomme.
Finalement,
cest une serie davandes
methodologiques,
realisees entre 1970 et 1977, qui va offrir aux mains des
experimentateurs les outils leur permettant de developper la biologie moleculaire. On sait, a partir de
cette Cpoque, couper 1ADN en fragments de taille
variable a laide des enzymes de restriction bacteriennes. Lutilisation
de ces enzymes, combinee a
celle de ligases qui permettent de lier entre eux deux
brins dADN,
autorise le clonage de sequences.
Dans le meme temps, on dispose de systemes de
transcription in vitro reposant sur lutilisation
de la
transcriptase inverse des retrovirus oncogenes [5,6].
Enfin, en 1975, puis en 1977, sont d&rites deux
techniques permettant detablir la sequence dune
molecule dADN, cest-a-dire lordre dans lequel
sont agencees les bases qui la constituent [7]. La
combinaison de ces outils enzymatiques permet, une
fois que lon a extrait un acide nucleique dun tissu
ou dune culture cellulaire,
den determiner
le
contenu informatif (sequence codant un fragment
peptidique, sequence regulatrice, ADN non codant).

On peut alors le cliver en fragments utilisables pour
realiser des constructions a des fins experimentales.
Une sequence codante permet notamment, dans les
conditions adequates, la production dune proteine.
CONCEPTS
Organisation
DE BASE
de IADN
La double helice dADN est schematisee sur la

Jigwe I. Elle comporte deux brins complementaires.
Chaque brin est un enchainement
de nucleotides,
form& par lunion dune base et dun sucre, le desoxyribose, phosphoryle en 5. 11 existe deux bases
puriques (adenine, guanine) et deux bases pyrimidiques (cytosine, thymine). Lassociation
de lune
dentre elles avec un desoxyribose constitue un nucleoside (adenosine, guanosine, cytidine ou thymidine). Le terme de nucleotide est reserve aux nucleosides porteurs dun ou plusieurs groupements
phosphates en 5 du desoxyribose. Les nucleotides
sont lies par des liaisons phosphodiesters Ctablies en-
728
V. Laudenbach
jrFigure 1. Double
-hClice de Watson,
Crick
et Wilkins
[2].
tre, <<en amont >>,le groupement OH sit& en 3 dun

desoxyribose et, <<en aval >>, le groupement phosphate situ6 en 5 du desoxyribose suivant. Chaque
brin a une orientation, possedant un groupement 5
phosphate libre a une extremite et un groupement 3
hydroxyle (OH) libre a lautre. Lorientation
5 vers
3 est appelee <<sens XXpar analogie avec lorientation du brin dARN en tours de synthese par 1ARN
polymerase lors de la transcription. Lorientation
3
vers 5 est <<antisens B. Les deux brins sont antiparalleles (orient& en sens contraire). Leur association
est due a letablissement
de liaisons hydrogene entre
leurs bases. Une guanine ne peut etre appariee
quavec une cytosine ; une adenine est toujours appariee avec une thymine. On parle dhybridation
des
deux brins de 1ADN par les liaisons hydrogene. Ces
liaisons sont de type faible et peuvent Ctre rompues
par une augmentation de temperature (denaturation).
La complementarite
des bases, constituant deux
brins apparies, est respectee lors de la realisation de
copies des molecules dADN. Ce mecanisme de copie, realise avec laide de lequipement
enzymatique
de la cellule, est appele replication et precede la mitose. 11 aboutit au doublement de la quantite dADN
presente dans la cellule avant sa division.
Les bases constituant 1ARN sont identiques a celles de lADN, a lexception de la thymine, remplatee par une uracile (le nucleoside correspondant est
luridine). Elles sont associees a un ribose phosphoryle en 5.
Le genome hapldide humain comporte environ
3~10~ paires de bases. Lenchainement
specifique
des bases sur un brin definit linformation
codee.
LunitC de codage est le codon, un triplet de nucleotides. Le code genetique est dit <<dCgCnCre P. Ce
terme illustre lexistence dun plus grand nombre de
codons differents des acides amines utilisables pour
leur traduction (tabEeau I). La combinaison, par tri-
et al
plets, des quatre bases entrant dans la composition

de 1ADN aboutit au total a 43, soit 64 combinaisons
possibles, pour seulement 20 acides amines existants. Cette <<degenerescence X>est, en fait, un avantage double. Dune part, une mutation dune base
(erreur de replication) peut navoir aucune cons&
quence sur la nature de lacide amine finalement intCgrC dans le peptide synthetid. Cest alors une mutation iso-semantique
(mutation
portant sur la
troisieme base dun triplet leucine ou threonine, par
exemple). Dautre part, les acides amines quantitativement les plus representes dans les proteines pos&dent le plus grand nombre de codons. Le codon
ATG, correspondant a la methionine, a un role particulier. 11 est present au debut de toute sequence codant pour une proteine. Cette methionine initiatrice
est situee en position N-terminale
dune sequence
peptidique qui sera excisee apres la traduction dans
la majorite des cas. En fait, seuls 61 des triplets sont
codants, cest-a-dire constituent une information
aboutissant a lintegration
dun acide amine dans la
chaine peptidique synthetisee. Trois combinaisons
(TAG, TGA, TAA) sont appelees codons <<stop >>.11s
sont transcrits en UAG, UGA et UAA, luracile remplacant la thymine sur 1ARNm. 11 sagit de triplets
auxquels ne correspond aucun acide amine. La presence de lun dentre eux a la fin dune sequence codante entraine la terminaison de la traduction de
1ARNm
par le ribosome, puisque aucun acide
amine adapt6 nexiste pour poursuivre lelongation
de la chaine peptidique (voir le chapitre sur la traduction). Larrangement
par codons fait apparaitre
la notion de cadre de lecture. Selon le choix du nucleotide marquant le debut dune sequence, la distribution des codons peut se faire de trois man&es differentes. Ces trois fa$ons de lire la sequence
definissent trois cadres de lecture. Si la repartition
des triplets est faite de telle man&e que chaque codon corresponde a un acide amine, on parle de cadre
de lecture ouvert. Les deux autres combinaisons possibles, obtenues en decalant la lecture dun, puis de
deux nucleotides, sont des cadres de lecture fermes.
LADN nucleaire nest divise en chromosomes,
unites individuelles, que pendant la mitose. Entre les
divisions cellulaires,
il constitue la chromatine.
Celle-ci doit etre compactee pour autoriser le noyau
a contenir une quantite dADN qui, deroule, representerait une longueur physique denviron un metre
cinquante. La structure de base de 1ADN chromati-
Comprendre
la biologie
nien est une sorte de chapelet de particules appelees

nucleosomes. Ce sont des groupes de prottines nommees histones. Elles sont regroupees en octameres
autour desquels senroule 1ADN. Les histones permettent ainsi un premier niveau de compactage de
1ADN. Elles ont Cgalement un role dans la rbgulation de lexpression des genes [8, 91. Lagencement
de 1ADN et des histones realise une fibre dont le
diametre en microscopic Clectronique est de 10 nanometres. Cette fibre peut elle-mCme former une helice, dont le diametre apparent est de 30 nanometres.
Lorganisation
spatiale de la double helice participe
aux mecanismes de regulation de lexpression des
genes. Elle determine laccessibilite
de 1ADN a divers facteurs proteiques. Ces facteurs peuvent etre
impliques dans la transcription des genes ou dans la
replication. Le compactage de la molecule d ADN
permet Cgalement des interactions entre des sequences qui seraient distantes les unes des autres si
1ADN Ctait linearise [lo, 111.
Organisation
g&hale
des ghes
Lhomme
possbde entre 60 000 et 70 000 genes.
Leur expression aboutit a un nombre de proteines
differentes non determine. Les differents elements
dune meme sequence codante peuvent Ctre employ& de facon variable selon lenvironnement
cellulaire, aboutissant a differentes modalites de traduction. Cest le cas du gene de la calcitonine, proteine
produite par les cellules thyroidiennes. Ce gene peut
Cgalement coder pour le CGRP (calcitonin
gene
related peptide), un neuropeptide, selon le choix des
exons effectivement transcrits [12]. En fait, la majeure partie de 1ADN total est non codant. Certaines
des sequences de cet ADN non codant ont un role
dans lorganisation
de la structure de la chromatine
ou, au tours de la mitose, dans celle des chromosomes.
On distingue trois classes de genes, definies en
fonction de la nature de IARN polymerase (I, II ou
III) assurant leur transcription. Les genes de classe I
sont les genes des ARN du ribosome (ARNr). Le ribosome traduit les ARNm dans le cytoplasme. La
classe III est celle des ARN de transfert (ARNt),
Cgalement impliques dans la traduction. Les genes
de ces deux classes sont tres rep&es dans le genome.
Au contraire, la plupart des genes codant pour les
proteines, dits genes de classe II, sont presents en un
molCculaire
729
seul exemplaire. Leur organisation g&-i&ale est illustree par la Jigwe 2. En amont (5) de la sequence
codante, on trouve une region appelee promoteur.
Cette region est celle sur laquelle se fixe 1ARN polymerase. Cette enzyme fait partie dun complexe
proteique qui va transcrire en ARNm la sequence situee plus en aval. Elle se fixe au promoteur par lintermediaire de cofacteurs, au niveau dune sequence
particuliere,
appelee <<boite TATA B (sequence
consensus TATA (A/T)A(A/T)).
Une partie du promoteur, le promoteur <<minimal >> qui contient la
boite TATA, est indispensable
a lexpression
du
gene. On peut trouver Cgalement, dans la region 5,
un ou plusieurs elements plus ou moins critiques
pour lexpression du gene selon le contexte cellulaire. Ce sont des sequences regulatrices damont, ou
cis-regulatrices. 11 sagit de sites de liaison a IADN
pour des facteurs proteiques de regulation transcriptionnelle, les facteurs truns-regulateurs. 11s sont exprimes de facon variable selon les cellules et peuvent cooperer avec 1ARN polymerase
ou, au
contraire, en limiter
lactivite.
Lactivite
transregulatrice dun facteur transcriptionnel
peut etre
modulee en fonction de sa concentration dans le
noyau, de son degre de phosphorylation
ou de ses
interactions avec dautres facteurs transcriptionnels.
En aval du promoteur, a une trentaine de bases de la
boite TATA, se situe le site dinitiation
de la transcription. Au-dela du site de debut de la transcription,
on trouve une altemance de sequences dites exons et
introns. Apres la transcription et avant la traduction,
lARN, appele initialement
pre-messager, subit une
maturation qui aboutit a 1ARNm. Au tours de cette
maturation, les sequences exoniques sont conservees
et les sequences introniques Climinees (voir le chapitre sur la transcription). Dans la partie distale (3)
de la succession des exons et des introns, on trouve
un, parfois plusieurs, codons <<stop >>qui constituent
le signal darret de la traduction. Un seul est fonctionnel. Finalement, tous les exons ne sont pas forcement traduits, certains &ant localises en amont du
codon ATG-methionine,
initiateur de la traduction,
ou en aval du premier codon <<stop B. Les regions
transcrites non traduites peuvent contenir des SCquences regulatrices influant sur le niveau dactivite
transcriptionnelle
de 1ARN polymerase. LARN
polymerase
ninterrompt
pas son activite
de
transcription immediatement
au niveau du demier
codon <<stop >>.La terminaison de la transcription a
730
V. Laudenbach
Initiation
de Is
L__
Promoteur
<c minimum
-.
lnitirtton
de Is
trnnscriptton
Figure 2. Organisation
gCnCrale
. . .
/
2.
..__ j.
_.~
EXONS
(trsduits)
des genes de classe II.
lieu beaucoup plus en aval. Toutefois, chez les

eucaryotes, le transcrit (ARNm) en tours delongation est coupe en aval du codon <<stop >>fonctionnel,
avant la fin de la transcription. Le site exact de coupure peut varier. La region de 1ADN correspondant
au site de coupure de 1ARNm est couramment appelee site de polyadenylation
par analogie avec la
presence, a lextremite 3 de lARNm,
dune succession de quelques centaines dadenosines ajoutees
apt-es la transcription.
Transcription
La transcription du gene en ARNm est un phenomene nucleaire. La traduction a lieu dans le cytoplasme. LARN
polymerase II des eucaryotes ne
peut jouer son role quen association avec les facteurs generaux de transcription [ 13, 141. Ces facteurs
sont tres conserves chez tous les eucaryotes, depuis
la levure jusqua lhomme. Le premier pas, vers la
formation de lappareil de transcription basal, est la
fixation de la TBP (TATA binding protein) sur la
boite TATA. La TBP est une sous-unite du facteur
general TFIID (Trunscription Factor II D). 11 a cependant CtC montre quelle Ctait capable, a elle seule,
dinduire
la formation de lappareil de transcription [ 151. Les facteurs generaux de transcription etablissent ensuite des liens avec la TBP et IARN polymerase II, suivant une organisation qui varie selon
le type de promoteur et lespece consideree. Les facteurs TFIIB, TFIIE, TFIIF et TFIIH sont indispensables. TFIIB Ctablit une <<passerelle )> entre la TBP et
1ARN polymerase, sur une distance de trente nucleotides, qui correspond a la distance separant la
boite TATA du site dinitiation
de la transcription [13]. TFIIH est une helicase, necessaire a la separation des deux brins de lADN, sans laquelle la
et al.
transcription est impossible [16]. TFIIA, qui participe a la cohesion des interactions ADN-TBP,
est
crucial pour la stabilite de lappareil transcriptionnel
dans certains contextes. 11 peut Ctre absent dans
dautres [ 151. La machinerie transcriptionnelle
basale, deja Claboree, ne peut pas jouer son role sans
lintervention
dautres proteines. Chez la levure, le
mediateur, structure peptidique like a lextremite
carboxy-terminale
de IARN polymerase, lui transmet linfluence, activatrice ou inhibitrice, des facteurs transcriptionnels qui se fixent sur les sequences
sit&es plus en amont. Lensemble ARN polymerase
II-facteurs generaux-mediateur
Porte le nom dholoenzyme [17]. Au total, on peut opposer la grande
sophistication de lappareil assurant la transcription
chez les eucaryotes a lexistence dune unique ARN
polymtrase bacterienne, qui ne comporte que quatre
sous-unites [ 181.
Linitiation
de la transcription est un processus
ATP-dependant.
La phosphorylation
de lextremite
carboxy-terminale
de 1ARN polymerase par la fonction kinase de TFIIH entraine la liberation du promoteur par lensemble du complexe. Simultanement,
les facteurs TFIIB, TFIIE et TFIIH sont relargds.
Lelongation
de 1ARNm est amorcee. Un autre
complexe ARN polymerase peut venir se fixer sur la
boite TATA et debuter la synthese dun nouveau
transcrit. Ainsi, plusieurs molecules dARN polymerase peuvent transcrire le meme ADN en paralMe [19]. Le brin de 1ADN sur lequel on lit la sequence (brin <<sens >> 5 + 3) nest pas le brin
transcrit. LARN polymerase progresse de 3 en 5
sur le brin antiparallele
complementaire
(<<antisens >>).Au tours de la traduction, la complementarite joue a nouveau via la sequence anticodon de
1ARNt (voir le chapitre sur la traduction). Au total,
cest done bien le brin G sens >>qui est traduit.
Le transcrit primaire, ou ARN pre-messager, <<premiere version >>de lARNm,
doit subir une maturation. Elle a egalement lieu dans le noyau. La premiere &ape est la fixation dune coiffe nucleotidique
a lextremite 5. Sa presence est necessaire au transport vers le cytoplasme et a linitiation
de la traduction. Une fois la transcription achevee, une polyA
polymerase lie a lextremite
3 une sequence de
quelques centaines dadenosines.
Cette sequence
polyA est impliquee dans la stabilisation du transcrit, cest-a-dire linhibition
des systemes enzymatiques de degradation
des ARNm [20-221. Enfin,
Comprendre
la biologic
1ARNm doit subir un Cpissage (splicing). Cet Cpissage aboutit a lelimination

des sequences non traduites. A chaque extremite des introns, se trouvent
des sequences conservees, dites sequences consensus.
Elles definissent un site donneur et un site accepteur,
au niveau desquels 1ARN pre-messager est clive.
Lintron est lib&C et les deux exons situ& de part et
dautre sont lies par une reaction de transesterification. Lepissage necessite la cooperation des snRNP
(Small Nuclear RiboNucleoProteins),
associant des
proteines et des ARN de petite taille, les snRNA
(pour Small Nuclear RNA). Lordre dans lequel les
introns et les exons sont elimines nest pas constant.
Les &apes successives de la maturation produisent
plusieurs transcrits intermediaires.
Le choix des
exons elimines peut varier selon le contexte cellulaire, generant des transcrits specifiques de tissus.
Cette variabilite dans le choix des exons traduits est
appelee Cpissage alternatif [23, 241.
Traduction
LARNm
est exporte vers le cytoplasme pour etre
traduit. Cest un processus actif qui necessite une
maturation complete de 1ARNm [25]. Dans le cas
de molecules dARN de tres grande taille, la traduction peut debuter avant quelles ne soient totalement
exportees. La synthese dune chaine peptidique fait
intervenir deux nouveaux acteurs : les ribosomes et
les ARNt. Le ribosome est form6 par lassociation
de proteines et dARNr.
I1 comporte deux sousunites : la petite (coefficient de sedimentation 40s)
et la grande (60s). Sa fonction est de lier successivement les acides amines correspondant aux codons
align& sur 1ARNm. 11coop&e avec les ARNt, ARN
de transfer-t. Ces ARN, constitues de 75 a 85 nucleotides, ont une structure secondaire, cest-a-dire une
organisation spatiale qui realise une forme de feuille
de trefle. Lun des <<bras B de cette structure comPorte une sequence dite anticodon, capable de shybrider sur le codon correspondant de 1ARNm. Lextremitt 3 OH de 1ARNt est capable de lier lacide
amine correspondant. La liaison ARNt-acide amine
est Ctablie a laide
dune
aminoacyl-tRNAsynthetase, specifique de lacide amine et de 1ARNt.
11 existe 20 isoformes differentes de cette enzyme,
cest-a-dire, une par acide amine. Un mCme ARNt
peut reconnaitre plusieurs codons differents, sils
731
moltculaire
II
w
60s
Figure
3. Traduction dun ARNm en peptide. LARNt initiateur,
norteur dune methionine. se fixe SLITla sous-unite 40s du ribosome.
Dans un deuxieme temps, IARNm, se lie egalement a cette sousunite. La sous-unite 60s intervient en se liant simultanement a la
40s et a IARNt. La region de 1ARNt situee immediatement en regard de la 60s est celle qui Porte lacide amine. Le site de la 60s
fixant I ARNt charge est annele site P. Le site voisin, nomme site A,
accueille ensuite 1ARNt poiteur de lacide amine qui correspond au
codon suivant sur 1ARNm. La liaison entre ce nouvel acide amine
et la methionine initiatrice est Ctablie par une peptidyltransferase
associte a la sous-unite 60s du ribosome. Une translocation, realisee avec le concours de facteurs delongation (eF), fait passer
lacide amine porte par le site A sur le site, tandis que la methionine initiatrice quitte le site P et le ribosome. Le site A est lib&C et
peut accueillir le prochain acide amine. Le processus se rep&e, entrainant lelonaation de la chaine peptidique: 1ARNm defile sur la
sous-unite 40S-tandis les acides am&s sent successivement lies par
la 60s.
correspondent au m&me acide amine. La cellule synthetise une quarantaine d ARNt differents.
LARNt capable de reconnaitre le codon ATG initiateur de la traduction est different de celui, correspondant a une methionine non initiatrice. Lamorce
de la traduction necessite la formation dun complexe dinitiation.
Celui-ci comporte 1 ARNt initiateur, porteur dune methionine, la petite sous-unite
ribosomale (40s) libre, les facteurs dinitiation
(eIF)
et du GTP. Le processus delongation
est decrit sur
la figure 3. Lorsquil
parvient au premier codon
<<stop >>de lARNm,
le ribosome est incapable de
trouver 1ARNt
correspondant
et le complexe
ARNm-ribosome-peptide
synthetise est dissocie.
Plusieurs ribosomes peuvent traduire simultanement
le m&me ARNm. Ces conditions autorisent un rendement maximal pour lexpression dun gene et la
production de la proteine correspondante.
732
RCgulation
V. Laudenbach
de lexpression
des g&es
Elle permet de nexprimer que les genes requis selon

le stade du developpement de lorganisme, selon le
type cellulaire, ou en reponse a des stimuli externes.
Chez les eucaryotes, on distingue schematiquement
cinq niveaux de regulation possibles : chromatinien,
transcriptionnel,
post-transcriptionnel,
traductionnel
et post-traductionnel.
La regulation de lexpression
des genes bacteriens est presque exclusivement
transcriptionnelle.
Conformation
spatiale de la chromatine
Lexpression des genes necessite que des proteines
regulatrices accedent a 1ADN chromatinien, ce qui
est impossible en cas de compactage excessif. Les
regions actives, contenant des genes effectivement
exprimes, sont souvent delimitees par des zones
dancrage au feuillet interne de la membrane nucleaire. Ces replis encadrent des boucles chromatiniennes dont lorganisation
peut ainsi Ctre modifiee
independamment
des regions adjacentes. Certaines
sequences, comme le LCR (Locus Control Region)
du gene de la chaine B de la globine, sont impliquees
dans les variations de compaction de regions de la
chromatine [26]. Un gene peut Ctre a lorigine inactif, en raison de lagencement de ses differents Cl&
ments. Une recombinaison
peut etre necessaire a
leur expression. Cette recombinaison aboutit au deplacement dune partie du gene sur la molecule
dADN. Elle se fait avec le contours de systemes
enzymatiques
(recombinases)
capables de cliver
1ADN double brin sur des sites specifiques (endonucleases) puis de lier la sequence deplacee sur son
nouveau site (ligases). Un des modeles de ce mecanisme de regulation est le rearrangement des genes
codant pour les immunoglobulines
ou pour les recepteurs des lymphocytes T [27, 281.
Rbgulation
de la transcription
La notion de sequence reconnue par des proteines
trans-regulatrices
a emerge avec lidentification
du
represseur du bacteriophage h. Les phages sont des
virus infectant les batteries. Le represseur est une
proteine codee par le genome viral. Lorsque celui-ci
est integre a 1ADN bacterien, cette proteine se fixe
aux elements regulateurs des genes viraux. Elle inhibe lexpression des proteines necessaires a la synthese de nouvelles particules virales. Son site de
et al.
fixation recouvre partiellement

celui de 1ARN polymerase, quelle empeche de se lier a 1ADN. Le
represseur autorise ainsi le virus a rester quiescent et
a beneficier de lappareil de replication de 1ADN
bacterien pour amplifier ses propres sequences [29].
Les facteurs proteiques truns-regulateurs eucaryotes appartiennent a quatre grandes categories : proteines helice-tour-helice,
helice-boucle-helice,
en
doigt de gant a ion Zinc (Zn++ finger) ou en
fermeture-eclair a leucines (leucine-zipper) [30, 3 11.
Ces facteurs peuvent agir sous forme de monombres
ou de dim&es, parfois en coop&ant avec dautres
proteines. Leur expression est elle-meme soumise a
une regulation. Lactivite de certains facteurs transcriptionnels necessite une induction par un signal
intra- ou extracellulaire.
Differents mecanismes
dactivation
sont decrits : dephosphorylations,
proteolyses, facteurs sequestres dans le cytoplasme et
qui gagnent le noyau apres lyse dune liaison peptidique, facteurs qui ne peuvent gagner le noyau
quapres liaison avec leur ligand. Le recepteur des
glucocorticoides est une proteine cytoplasmique, associee a la proteine hsp 90. La fixation du ligand du
recepteur entraine la rupture de cette liaison. Le recepteur se deplace alors vers le noyau et active les
genes dont le promoteur possede le GRE (Glucocorticoid Responsive Element), sequence cis-regulatrice
(voir le chapitre sur lorganisation
g&r&ale des genes). Cest le cas du gene IKB, codant une proteine
qui sequestre a son tour dans le cytoplasme un autre
facteur, FKB, capable dactiver les genes de differentes cytokines [32]. Cette cascade devenements cellulaires illustre la man&e dont le mode daction
dune molecule, ici anti-inflammatoire,
peut etre dissCquC a lechelon moleculaire.
R&ulation
post-transcriptionnelle
La notion depissage alternatif a deja CtC abordee.
Lattenuation
transcriptionnelle
est un mecanisme
rencontre chez les adtnovirus ou le virus VIH. Lactivite de 1ARN polymerase peut etre diminde,
voire interrompue au niveau de sites situ& en amont
du site de terminaison normal de la transcription.
Les ARN incomplets produits de cette facon ne peuvent pas etre polyadenyles. 11s exercent un retrocontrble negatif sur IARN polymerase. Ce retrocontrole
negatif peut Ctre 1evC par des facteurs proteiques
liant les ARN incomplets [33]. Dans dautres situations, les variations du site de coupure du transcrit
Comprendre
la biologie
primaire
saccompagnent
dune polyadenylation
normale par la polyA polymerase. Elles entrainent
des modifications
de la portion carboxy-terminale
de la proteine. Cest le cas pour les immunoglobulines produites par les lymphocytes B. Dans les cellules pluripotentes
initiales, elles comportent une
portion COOH terminale hydrophobe, ancree dans
la membrane cellulaire. Ce sont alors des recepteurs
membranaires aux antigenes. Apres une stimulation
antigenique induisant une proliferation
clonale, la
portion 3 du transcrit qui correspond aux acides
amines hydrophobes est clivee. La proteine est alors
secretee [33].
La maturation de 1ARNm est un phenomene nucleaire. La traduction necessite au prealable le transport du transcrit vers le cytoplasme au travers des
pores de la membrane nucleaire. Ce transport se fait
de man&e active. 11 nest possible que si la maturation est complete. Lexistence dune regulation du
transport nest pas demontree a ce jour, mais chacurie des modifications
de 1ARNm requises peut
Ctre soumise a un mecanisme de controle [34]. Une
fois dans le cytoplasme, 1ARNm peut etre specifiquement
adresse vers un compartiment
cellulaire [35]. LARNm
codant lactine chez les mammiferes est adresse au <<cortex cellulaire >>,region
riche en filaments dactine. Dans ce cas, le signal
dadressage est sit& dans la region 3 transcrite non
traduite. L ARNm peut etre stock6 dans le noyau ou
le cytoplasme. A la suite de signaux inducteurs, les
stocks peuvent &r-e mobilises et la traduction rapidement augmentee saris necessiter de variations de
la transcription.
La cellule peut aussi modifier la
concentration dARNm et le taux de traduction, saris
modification
transcriptionnelle,
en agissant sur la
stabilite metabolique
des messagers [36]. Les sequences regulatrices impliquees dans les variations
de stabilite sont localisees dans les regions non traduites. Elles fixent des facteurs capables de faciliter,
ou au contraire dinhiber, laction des endonucleases, enzymes responsables de la degradation des
messagers. Deux autres mecanismes de regulation
post-transcriptionnelle
sont connus. 11s sont employes par le trypanosome, le protozoaire responsable de la maladie du sommeil. Le trans-Cpissage est
un Cpissage qui aboutit a la liaison de deux transcrits
differents. Les differentes combinaisons de transcrits
participent a lextreme variabilite des glycoproteines de surface qui permet au trypanosome dechap-
mokulaire
133
per au systeme immunitaire

[37]. Rarement, on peut
observer une modification de la structure primaire de
1ARNm
(RNA editing), par clivage-introduction
duraciles supplementaires. Des ARN <<guides >>cytoplasmiques jouent le role de matrice et de <<donneur duraciles >>[38].
R&&ion
de la traduction
Linitiation
de la traduction necessite la participation des facteurs dinitiation.
Lun dentre eux, eIF2,
peut etre inactive par phosphorylation
[39]. Les kinases responsables de cette inactivation sont induites a la suite de signaux, tels que la production de
<qheat shock proteins >>.La consequence de ces signaux est une reduction du taux de traduction. Elle
nest pas equivalente
pour toutes les proteines.
Linactivation
des facteurs dinitiation
est un des
mecanismes de reduction des syntheses proteiques
dans les cellules qui entrent en phase dite <<G, >>,
cest-a-dire qui quittent le cycle proliferatif. Linitiation de la traduction peut Ctre bloquee Cgalement
par la fixation de facteurs represseurs sur 1ARNm.
Dans certains cas, la petite sous-unite ribosomale
nidentifie pas le codon ATG situe en premiere place
en 5 comme &ant le codon initiateur. Cest alors le
second ou le troisieme ATG rencontre sur 1ARN qui
marque le debut de la chaine peptidique [40]. On
peut Cgalement trouver un site de fixation du ribosome interne a la phase codante, a distance du codon
initiateur [41]. Ces C<Internal Ribosome Entry Sites >X(IRES) peuvent etre employ& a des fins experimentales. 11spermettent a un vecteur recombinant,
par exemple adenoviral, dexprimer simultanement
dans le meme tissu deux proteines distinctes. Pour
cela, il faut avoir introduit chacune des deux sequences dans le vecteur, separees par un IRES et placees
sous le controle dun meme promoteur.
Les differents systemes regulateurs que nous
venons de voir representent autant de moyens de
moduler le produit des informations du genome. On
peut les employer afin danalyser les effets de la
surexpression ou de linhibition
dun gene dans un
organisme. 11 est necessaire de comprendre leurs
variations, qui peuvent Ctre a lorigine de maladies.
Leur exploitation thtrapeutique est possible, soit en
les considerant comme des cibles chez des agents infectieux, soit, a lavenir, en cherchant a corriger
leurs erreurs chez Ihomme.
734
V. Laudenbach et al.
QUELQUES
OUTILS
ET TECHNIQUES
DE BIOLOGIE
MOLkCULAIFW
Enzymes
Enzymes de restriction
Ce sont des endonucleases dorigine bacterienne, capables de couper IADN double brin apres avoir reconnu des sequences specifiques (&we 4). Le site
de reconnaissance est appele site de restriction. Elles
permettent de cliver une molecule dADN en plusieurs fragments, dont la taille est reproductible pour
un meme couple ADN-enzyme.
On parle de digestion de 1ADN. I1 sagit dun mecanisme de defense
des batteries vis-a-vis des virus bacteriophages. Les
enzymes bacteriennes clivent 1ADN viral et empechent ainsi son integration au genome. Elles respectent 1ADN bacterien car celui-ci est methyl6 sur les
adenines ou les cytosines des sequences qui pourraient etre reconnues comme sites de restriction, ce
qui les empeche dy acceder. La protection enzymatique vis-a-vis des virus est restreinte a certaines
souches bacteriennes, en fonction des enzymes
quelles produisent, doti le terme denzymes de restriction Elles permettent de determiner le profil de
restriction dun ADN, cest-a-dire la repartition des
sites de coupure, reflet de la sequence nucleotidique.
En fonction de cette repartition, la digestion enzymatique va produire un nombre donne de fragments
dADN, dont la taille peut etre determinCe par migration en Clectrophorese sur gel. Une autre application frequente est le clonage de sequences, par
coupure-ligation
dans un vecteur.
Polymerases dacides nucleiques
Les polymerases sont capables de lier entre eux une
succession de nucleotides et ainsi de synthetiser un
acide nucleique.
Les ADN polymerases synthetisent le brin complementaire dune matrice (ADN monobrin) a partir
dune amorce (ARN ou ADN).
La transcriptase inverse est une ADN polymerase ARN dependante. Elle est employee pour produire des banques dADN
dits complementaires
(ADNc) a partir des ARN extraits de cellules ou de
tissus.
La Taq polymerase est une ADN polymerase extraite de batteries du genre Thermus aquaticus, decouvertes dans des sources chaudes. Elle est stable a
l
Mw
IkMophor~se
SW gel dagmse
color.6aubromured&hidiwn
nae 111
(3c enzyme emaite
dH. inq7uenzar)
5 GG
CC
3CC
GG
I
Coupure B bous francs
(blunt ends)
Figure 4. Digestion de IADN par des enzymes de restriction. Certaines enzymes de restriction coupent IADN au niveau du site de
restriction, dautres a distance de ce site. Seules les premieres ont
une utilisation courante. Deux types de coupure peuvent etre observes. Les coupures a bouts francs (blunt ends) correspondent a une
coupure realisee au m&me niveau sur les deux brins dADN. II ne
peut pas y avoir de reassociation spontanee des deux brins. Les coupures a bouts cohesifs (sticky ends) sont des coupures realisees en
un point different sur chaque brin, les deux points &ant separes de
quelques bases. Les fragments simple brin situ& de part et dautre
de la zone de coupure peuvent se reapparier spontanement.
des temperatures depassant 90 C. Sa principale application est la methode damplification

par reaction
de polymerisation
en chaine ou PCR.
Les ARN polymerases sont capables de transcrire
un des brins dun ADN double brin.
l
Ligases
Elles sont capables de creer des liaisons phosphodiester entre des molecules dacides nucleiques. La
T4 DNA ligase, produite a partir de batteries infectees par le phage T4, peut lier deux molecules
dADN double brin. Elle est necessaire au clonage
dune sequence.
Clonage
Cloner une sequence dADN consiste a lintegrer
dans un vecteur, de facon a pouvoir lamplifier et la
conserver a des fins experimentales. Le vecteur est
lui-meme une sequence dADN, dont la fonction est
dincorporer la sequence que lon souhaite cloner,
puis dautoriser sa multiplication
dans une celluleh8te. Ce vecteur doit done etre replique dans la cellule-hate. 11 doit posseder des proprietes permettant
735
de lidentifier
de faGon certaine, telles que la presence dun gene de resistance a certains antibiotiques. Afin de faciliter la manipulation des sequences
recombinantes, il doit etre de taille aussi petite que
possible et posseder un grand nombre de sites de restriction uniques. Un CC
polylinker >>(succession de sites de restriction uniques) peut y etre introduit. Differents vecteurs peuvent Ctre employ& : plasmides,
phages, autres virus, cosmides, chromosomes artificiels de levure. Leur choix depend de la taille de
linsert desire, les plasmides &ant capable dintegrer
des sequences dont la taille nexcede pas 10 kilobases, contre plusieurs centaines pour les chromosomes de levure. Un vecteur peut etre destine a la multiplication et a lanalyse de linsert, mais il peut aussi
exprimer une proteine dont il renferme le gene. La
nature de la cellule-hate du vecteur varie. Dans la
majorite des cas, les batteries de type E. cob sont
employees. Elles ont lavantage dun faible coQt et
dun temps de doublement
court (20 minutes a
37 C), autorisant une amplification
rapide de la sequence clonee. Lemploi des cellules eucaryotes (levures, cellules animales ou humaines) est necessaire
si lon veut obtenir lexpression dune proteine necessitant des modifications
post-traductionnelles
specifiques des eucaryotes. Elles constituent Cgalement le stade initial de la generation dorganismes
gtnetiquement
modifies.
La situation la plus simple est celle dun insert de
quelques kilobases que lon veut cloner dans un
plasmide (figure 5). Le plasmide est une molecule
dADN double brin circulaire, qui doit dabord etre
linearise par coupure enzymatique. Pour Cviter la refermeture du plasmide sur lui-meme, ses extremites
sont traitees a la phosphatase alcaline, qui dephosphoryle les nucleotides en 5. Le vecteur ne peut se
recirculariser quen integrant linsert, dont les extremites sont phosphorylees. La ligation de linsert au
vecteur est assuree par une ligase. Le plasmide recombinant est alors introduit dans des batteries,
prealablement
fragilisees pour etre permeables a
IADN
(on parle de <<batteries competentes >>).
Lintroduction
de lADN, ou transformation
bacterienne, est obtenue par un choc thermique bref. Les
batteries transformees sont etalees sur une boite de
Petri. Lidentification
des clones recombinants necessite un marqueur de selection. Le plus courant, le
gene de resistance a lampicilline,
est present dans
de nombreux plasmides commerciaux.
Sur un mi-
Coupure par un ou plusieurs

enzyme(s) de restriction
Plasmide linhts~
Ghe
Gist
A lampicilline
5 P
OH
OHS
P 3
I
t
Ligase
:: OH
OH
-I
5 p
OH
OHS
OH 3
ADN
Transfection
et amplification
sur milieu ampicilline+
Phosphatase
alcaline
B cloner
OHs
P 1
_I
dans E. coli
Figure
5. Clonage dun ADN double brin dam un plasmide. On
doit disposer au moins dun site de coupure unique pour une enzyme de restriction. Dam ce cas, Iinsert est orient6 au hasard par
rapport au plasmide. Si on veut sassurer de IJorientation de linsert,
il faut choisir deux enzymes a sites uniques. A condition que chaque
extrtmite de Iinsert ait une sequence compatible avec un seul des
deux sites, le clonage ne pourra se faire que dam un seul sens. Si
Iinsert est une sequence codant pour une proteine que Ion souhaite
exprimer, Iexpression ne peut se faire correctement que si les CICments de la construction dADN sont agences dans le bon ordre
avec la bonne orientation.
lieu de culture contenant de lampicilline,

seules les
batteries ayant integre le plasmide peuvent pousser.
On peut alors les repiquer sur un autre milieu, les
laisser se multiplier et extraire ensuite 1ADN desire,
dont la quantite aura CtC augmentee de facon exponentielle.
Le terme de clonage peut avoir un sens plus large,
puisquil peut designer lamplification,
non seulement dune sequence dADN, mais aussi dune lignee cellulaire ou dun organisme entier. Dans tous
les cas, il sagit dexpandre lobjet analyse sous formes de copies parfaitement identiques.
Analyse du projil de restriction dun ADN :
la mt%hode du Southern Blotting
Cette methode a Cte mise au point par Southern [42].
Elle necessite de posseder une sonde nucleotidique
capable de shybrider sur une portion de 1ADN analyse, dont elle possede la sequence complementaire.
Cette sonde est marquee par un compose permettant
sa detection. 11 existe differents systemes de marquage reposant sur lutilisation
de composes radioactifs (marquage G chaud >>) ou non (marquage
736
V. Laudenbach
G froid >x). LADN est dig&C par une ou plusieurs

enzymes de restriction. On fait migrer le produit de
cette digestion enzymatique en Clectrophorese sur
gel, qui &pare les differents fragments en fonction
de leur poids molbculaire. Afin de pouvoir hybrider
la sonde, on transfere les fragments du gel de migration a une membrane de nitrocellulose
ou de nylon
(blotting). Lhybridation
de la sonde radioactive est
rCvClCe en autoradiographie.
Chaque fragment
contenant la sequence complementaire
de la sonde
apparait sous la forme dune bande dont la taille, qui
determine lemplacement
sur le gel, depend de la position des sites de restriction.
Lanalyse du profil de restriction permet de detecter des modifications
du genome. 11 peut sagir de
deletions, qui diminuent la taille de certains fragments, ou de mutations, supprimant ou g&Grant un
site de coupure pour une enzyme. Dautre part, les
variations dans la repartition des sites de restriction
constituent des marqueurs, transmis de facon stable
dune generation a lautre. On parle de polymorphismes de restriction ou RFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphism).
Ce sont des alleles, transmis
sur le mode mendelien. 11s permettent des analyses
de liaison gtnetique. 11 existe Cgalement des polymorphismes de repetition. Ce sont des variations
dans le nombre de copies de sequences de quelques
nucleotides rCpCtCes en tandem. On parle de sequences minisatellites
ou VNTR (Variable Number of
Tandem Repeats).
En clinique, cette methode pet-met daffirmer le caractere Cpidemique dune serie dinfections
a un
germe donne. Si les ADN genomiques des differents
isolats bacteriens ont un profil de restriction superposable, il sagit t&s probablement de la meme southe. Dans le cas contraire, sauf mutation, il sagit de
souches differentes du meme germe et non pas dune
Cpidemie [43].
Amplification
du matkriel g&ktique
:
rt!action de polymbisation
en chafne
(polymerase chain reaction-PCR)
Cette technique a CtC developpee en 1985 par Mullis [44]. Elle a offert une solution au probleme des
quantites dacides nucleiques disponibles pour lexperimentateur. Elle permet deviter un grand nombre
de clonages. Elle est aujourdhui employee dans pratiquement tous les laboratoires de bacteriologic et virologie hospitaliers. Le principe de la PCR est indi-
et al.
quC dans la$gure 6. La reaction necessite plusieurs

composants : a) lechantillon
contenant 1ADN a
amplifier ; b) la Taq ADN polymerase ; c) des desoxyribonucleotides
libres ; d) des amorces, sequences dADN simple brin, courtes, complementaires
des deux extremites de la sequence a amplifier. Lensemble des composants est soumis a des variations
thermiques cycliques. Ces variations entrainent une
succession de denaturation-renaturation
de 1ADN.
Comme les oligonucleotides
amorces sont presents
en large excbs et sont beaucoup plus courts que les
brins dADN natif, ils vont shybrider de facon preferentielle aux regions flanquant la sequence a amplifier. A partir de ces amorces, la Taq ADN polymerase synthetise le brin complementaire
de chacun
des brins matrices. La repetition des cycles permet,
par duplications
successives, une augmentation
quasi-exponentielle
de la quantite dADN total. En
fait, le rendement de chaque cycle est plutot de lordre de 80 % initialement
et diminue progressivement. Cette diminution est due a lhybridation
dune
partie des brins dADN entre eux plutot quavec les
amorces, et a une baisse du rapport des concentrations entre les composants de la reaction, en particulier la Taq polymerase et 1ADN amplifie. Lamplification dune sequence de 1 000 bases est assez
aisee. Des appareils automatises assurent maintenant
en routine et avec une grande precision les variations
cycliques de temperature. Cette methode extremement sensible peut detecter des concentrations
d ADN inferieures au fentomolaire ( lo-l5 molLi).
La PCR peut etre appliquee a toutes sortes de prelitvements susceptibles de contenir de 1ADN : liquides biologiques, cultures bacteriennes, coupes histologiques, cheveux, voire fossiles. Plusieurs virus
(CMV, herpes) ou batteries (BK, coqueluche) peuvent Ctre recherches en pratique courante. Les contaminations et les amplifications
parasites, principal
ecueil a Cviter, sont le prix de lefficacite de cette
mtthode. Pour les prevenir, des conditions experimentales rigoureuses doivent Ctre respectees : choix
des amorces autorisant un minimum
de <<mismatchs X>en dehors de la zone dinteret, conditions
de sterilite parfaites, controle negatif systematique.
Dans tous les cas, un resultat positif doit Ctre analyse
de facon critique, dautant plus quil a des implications therapeutiques voire, dans certains cas, medicolegales. La specificite dun resultat doit etre assuree par un contrble. Une possibilite
consiste a

ADN B amplifier
Tampon+Mg++
Amorces
(OligonuclCotides)
dATP,
dCTP,
dGTP
dTTP
Dhaturation
( 94C)
lmin
(Sparation
des brins dADN)
17
Hybridatio;{xnorces
n Cycles
5
3
5
3
( 60C)
5
3
Elongation
( 72C)
min / IOOOpb)
Figure
6.
(Polymerase
Amplification dun ADN par polymerisation en chaine

Chain Reaction, PCR). Le melange est soumis a une
denaturation par chauffage a 94C. A cette temperature, les deux
brins de IADN a amplifier sont stpares par rupture des liaisons hydrogene. 11sjouent le role de matrices pour la Taq polymerase. On
ram&e ensuite la temperature a une valeur de lordre de 55 a 60 C,
de facon a rehybrider les brim complementaires. La temperature
dhybridation optimale varie selon la nature des amorces choisies et
de IADN <<cible S. La temperature de la reaction est ensuite amenCe a 72 C, temperature delongation optimale pour la Taq polymerase. Lenzyme synthetise le brin complementaire de chacune des
deux matrices en integrant les desoxyribonucleotides libres. La progression de la polymerisation se fait a raison denviron 1 kilobase
par minute. La temperature est a nouveau augmentee jusqua 94 C,
entrainant la denaturation des hybrides brin natif-brin ntosynthetist
et le cycle est renouvele N fois (en general 25 a 35 fois). A chaque
cycle, les brins neosynthttises servent de matrice a leur tour. La
quantitt totale dADN correspondant a la sequence amplifiee est
done augmentee de facon quasi exponentielle.
realiser une nouvelle amplification

a laide dun second couple damorces qui encadre une sequence
comprise dans le produit de la premiere reaction
(technique de la PCR <<nichee >>).
Transgenhe
Un organisme transgenique est un organisme, animal ou vegetal, qui a integre dans son patrimoine genetique un gene &ranger, introduit artificiellement.
Cette strategic experimentale permet danalyser les
effets dune proteine surexprimee dans un organisme
dans lequel on a introduit son gene. On peut Ctudier
la proteine dans sa forme native ou mutee, selon que
731
le transgene est normal ou pas. Cette approche est

employee pour creer des modeles de certaines maladies. Des tentatives sont faites pour en tirer de nouvelles sources de production pour certaines molecules therapeutiques (genes de lhemoglobine
humaine
introduits dans le tabac) [45]. Elle a CtC developpee
a une Cchelle industrielle, dans le domaine agricole,
afin dameliorer
les caracteristiques de plantes alimentaires (mais, colza) [46]. Le principe de la construction dun organisme transgenique est resume
dans la j@we 7. La construction dADN que lon
souhaite introduire dans le genome de lanimal G receveur 1) doit comporter tous les elements necessaires a lexpression de la proteine : promoteur, regions
5 et 3 non codantes, codon methionine initiateur,
phase codante, codon stop, sequence de polyadbnylation. Le promoteur choisi peut etre ubiquitaire ou
specifique dun tissu, selon lexpression que lon
veut obtenir. Par exemple, une expression specifique
de muscle sera obtenue en clonant la sequence codante en aval du promoteur de la chaine legere de la
myosine. On preleve les eufs, apres fecondation
dune femelle. La construction dADN est introduite
dans le pronucleus male de lmuf a laide dune micropipette. Elle sintegre au genome, en un point defini au hasard, par recombinaison.
En general, les
transgenes sont regroup& en batteries de plusieurs
centaines de copies. Les ceufs inject& sont cultives
pendant quelques divisions cellulaires, puis reimplant& dans loviducte de la femelle fecondee. Le
taux de succes varie entre 20 et 30 % des ceufs reimplant&. Comme lintegration
du transgene a lieu
avant le debut des divisions de lceuf, elle sera reproduite dans toutes les cellules de lanimal transgenique, gametes compris. Les animaux dits <<fondateurs >> pourront transmettre le transgene a leur
descendance. Toutefois, lintegration
dun transgene
nest pas toujours synonyme dexpression. Selon le
site dinsertion dans le genome, les conditions locales sont plus ou moins favorables (conformation de
la chromatine, interactions avec des sequences voisines ou des facteurs de regulation transcriptionnelle). La presence du transgene peut Ctre detectee
par PCR sur 1ADN de lanimal, extrait dun tissu
(en pratique courante, on preleve un bout de queue).
Son expression peut Ctre recherchee par differents
moyens tels que lhybridation
in situ, qui detecte
1ARNm sur coupes histologiques, ou limmunomarquage avec un anticorps specifique de la proteine
738
RLeioo
RCioa
codante nanqunote
Promateur
I
dune
dans Put&us
femelle pseudo-g&ante
Souris
transghiques
(PCR+)
Figure 7. La transgenkse (voir texte).
exprimee. Parmi les nombreuses lignees danimaux

transgeniques produites, citons les animaux surexprimant le peptide b amyloide, implique dans la maladie dAlzheimer
[47]. Dans le domaine des xenogreffes, une approche testee consiste a exprimer chez
le port les genes de proteines humaines regulatrices
du complement
(CD46, CD55, CD59), dans le but
de prevenir les reactions de rejet vasculaire hyperaigu [48].
Recombinaison
homologue in vivo :
invalidation
dun gtne ou H knock-out M
Au lieu dintroduire
un transgene dans un organisme, il sagit ici de supprimer un gene endogene,
puis detudier les consequences de cette suppression.
11 est ainsi possible de creer des modeles de maladies genetiques transmises sur le mode autosomique
recessif. Le prealable a la production danimaux recombinants a CtC la possibilite de cultiver des cellules embryonnaires totipotentes. Ces cellules sont extraites du blastocyste, la pat-tie de lceuf feconde en
tours de division destinee a devenir le fetus. Le syst&me le plus robuste est celui des cellules ES de souris (Embryonic Stem CeEls). La strategic employee
est resumte par la$gure 8. Elle consiste a inoculer
aux cellules ES en culture une construction dADN
appelee vecteur dinsertion. La recombinaison
est
effectuee par les recombinases cellulaires. Ces enzymes font partie des systemes de <<reparation B de
1ADN genomique, dont la fonction est de cot-tiger
les mutations naturelles. Le taux de recombinaison
varie, selon les conditions, entre 5 et 25 % des cellules. Les marqueurs de selection permettent de determiner les clones de cellules ES dans lesquels un
evenement de recombinaison
ciblee a bien eu lieu.
Le gene de resistance a la neomycine est un marqueur souvent employ& Les cellules ayant integrt ce
gene sont seules capables de proliferer sur un milieu
contenant du G418, analogue eucaryote de la neomycine. Dans certaines cellules, la recombinaison a
lieu au hasard, B distance du gene <<cible B, independamment des sequences homologues. Afin deliminer ces clones, un marqueur de selection negatif peut
etre employ& comme le gene de la thymidine-kinase
de lherpes virus. Dans le vecteur dinsertion,
ce
gene est place, non pas entre les sequences homologues, mais en amont ou en aval. Si la recombinaison
nest pas ciblee, il sera present dans le genome du
clone ES. On applique alors du ganciclovir aux cellules en culture. Lorsque la thymidine-kinase
est exprimee, elle phosphoryle le ganciclovir et le rend actif, entrainant la mort cellulaire. Une fois les clones
recombinants
detect& et amplifies, leurs cellules
sont injectees dans la cavite de blastocystes danimaux normaux. Le developpement
de ces mufs
donne naissance a des animaux <<chimeres )), dont
une partie des tissus est issue de cellules recombinantes. Si les gametes dun animal chimere sont dtveloppees a partir des cellules ES, la mutation est
transmissible a la descendance. La premiere generation est mutee sur le mode heterozygote. Les croisements permettent dobtenir des animaux homozygotes. Certaines
lignees
mutantes
permettent
danalyser le role joue par le gene mute dans le developpement (lignees deficientes en facteurs myogeniques, impliques dans le developpement
musculaire, mutation
des genes homeotiques
chez la
drosophile [49-511). Dautres sont des modeles de
maladies rencontrees chez lhomme,
telles que la
mucoviscidose (gene CFTR) [52]. Les mutants de la
NO synthase neuronale facilitent la comprehension
des voies de signalisation
intracellulaires
et des
consequences de leur activation [53]. Les animaux
mutants pour un gene peuvent etre croises avec une
lignee transgenique. Cest le cas de lignees deficitaires pour le gene de la chaine fl de la globine, mais
739

I
Celluleri ES
Cdulea
ES
GENE <<CIBLE
>>
-Y
rugion 5 banalogue i
,....;i
.,..... ,;
/.
,./.Y; R&ion
3 hmologue
@
R DINSERTION
ccKNOCK
Descendaoce
Nee-R: g&e de r&stance P la nhomycine
NLS-hcZ:
~Galactosidax
TK: thymidine kinnse virnle
egn&
OUT P
chimhique
KO fond&ice
Figure 8. La recombinaison homologue in vivo (knock-ours). On

introduit dans des cellules ES un vecteur de recombinaison. Cette
construction dADN comporte un ou plusieurs marqueurs de selection encadres par deux sequences, homologues a celles situees de
part et dautre du gene (<cible ,) dans le genome. La recombinaison
est effect&e par les recombinases cellulaires. Apres recombinaison,
le gene endogene est remplace par le ou les marqueurs de selection.
Les clones recombinants sont expandus et implant6 dans des blastocystes danimaux normaux. Les animaux de premiere generation
sont des chimtres developpees a partir de deux genomes.
porteuses dun transgene humain exprimant lhemoglobine S, destinees a reproduire les conditions de la
drepanocytose [54]. Une des limites du systeme
G knock out >>est le cat-act&e l&al de la mutation, si
le gene recombine est critique pour le developpement embryonnaire. On peut contourner cette difficult& en produisant des <<knock outs B inductibles [.55, 561. Le principe consiste a introduire dans
le genome, de part et dautre du gene a Climiner,
deux sequences de type lox. Ces sequences sont des
sites de coupure specifiques pour la recombinase
Cre. Les animaux porteurs du gene encadre par les
sequences lox sont croists avec des animaux transgeniques porteurs du gene Cre. Le gene 0-e est
clone en aval dun promoteur inductible, sensible,
par exemple, a la tetracycline. Lexpression de la
0-e peut etre obtenue en donnant de la tetracycline a
lanimal. On entraine ainsi la recombinaison du gene
Ctudie. La comparaison du phenotype des animaux
avant et apres recombinaison
fournit des informations sur le role joue par le gene mute.
BIOLOGIE
MOLkCULAIBE
ET MkDECINE
Les premiers resultats applicables a la medecine ont

CtC produits tres rapidement,
a la fin des annees
1970. Dans un premier temps, lanalyse a Cte purement descriptive. 11 sagissait de decrypter des mecanismes physiologiques ou didentifier des modifications du genome associees a lemergence
de
maladies. Puis, est nee lidee de modifier volontairement le genome dun animal. Les animaux genetiquement modifies sont devenus des modeles de
maladies humaines. Actuellement,
les animaux ou
les plantes transgeniques sont en passe de devenir
des ressources therapeutiques capables, a lavenir, de
produire des molecules voire, pour certains, des or! Une reflexion Cthique se
ganes de remplacement
developpe naturellement
en parallele de ces avantees techniques.
Identification
de g&es morbides
Concernant les maladies genetiques monofactorielles, au nombre denviron 5 000, le gene en cause est
connu dans moins de 10 % des cas. Jusquau debut
des annees 1980, lidentification
dun gene responsable dune maladie reposait sur la connaissance
prealable de la proteine en cause (hemoglobinopathies, hemophilie).
La dtcouverte des polymorphismes de restriction (RFLP) a permis detablir un lien
genttique entre une alteration du phenotype et les
variations allCliques dun locus morbide, saris que le
gene soit connu. Cette strategic est appelee g&r&ique inverse. On clone et lon sequence la region polymorphe, de facon a identifier les mutations. Si le
cadre de lecture est ouvert, le gene correspondant est
un candidat possible pour lanomalie du phenotype
Ctudiee. La sequence du gene permet de predire la
nature de la proteine codbe. Cette strategic a permis
le clonage du gene CFTR, dont les mutations sont
responsables de la mucoviscidose [57]. La sequence
a rev& une structure primaire correspondant a une
proteine-canal
transmembranaire,
permeable
au
chlore. Dans 70 % des cas de mucoviscidose, elle est
mutee par deletions de 3 nucleotides, entrainant labsence de residu phenylalanine en position 508, au niveau du site de liaison de IATP. La distribution tissulaire de la proteine a CtC Ctablie par des
experiences dimmunomarquage
[58]. Une approche
analogue a CtC employee pour dautres maladies genetiques. Elle pourrait contribuer a Clucider certaines maladies polyfactorielles
telles que lhypertension arterielle essentielle, latherome ou le diabete.
740
ThCrapie
V. Laudenbach
gCnique
Le decryptage des mecanismes moleculaires de maladies a conduit a envisager la correction des anomalies responsables au niveau de IADN. Cette approche permettrait deviter le recours a des drogues
defficacite limitee, aux effets secondaires parfois
graves. Elle se heurte a de nombreuses difficult&
methodologiques.
Ses applications en clinique sont
limitees a des protocoles de recherche dont les resultats sont encore tres preliminaires.
11apparait plus
simple de tenter de corriger une perte de fonction,
enzymatique
par exemple, en apportant a lorganisme un gene exogene qui code pour la proteine deficiente, que de <<reparer >>directement lanomalie
de 1ADN. Un gene peut alors devenir <<medicament >>.
Le premier probleme a resoudre est celui du choix
du gene sur lequel on doit agir. Ce probleme est assez facilement resolu dans le cas de maladies genetiques a Iorigine dun deficit en une proteine. Toutefois, si lon cherche a apporter un gene sain pour
pallier ce deficit, on doit pouvoir controler son niveau dexpression, afin deviter une surproduction
deletere. Lexpression du gene apporte doit souvent
etre limitee a un tissu. Dans certains cas, elle devrait
pouvoir &i-e regulee.
Dans le traitement des cancers, plusieurs voies de
recherche sont possibles. Certaines Cquipes ont tent6
dinduire
une reponse immune
antitumorale
en
transferant les genes codant pour differentes cytokines (IL2, IL4, IL7, GM-CSF) dans des cellules malignes, prelevees puis reinoculees [59]. Dautres ont
cherche a surexprimer un anti-oncogene (gene suppresseur de cancer), comme le gene de la proteine
~53. Cette proteine est normalement impliquee dans
linduction
de la mort cellulaire. La mutation ou la
deletion du gene correspondant est a lorigine de certains cancers [60, 611. On peut Cgalement tenter
dinhiber lexpression dun oncogene, ou gene implique dans la naissance de tumeurs, en inoculant un
ARN antisens, cest-a-dire un ARN capable de shybrider avec 1ARNm de loncogene et ainsi den emp&her la traduction [62]. On peut donner un avantage selectif aux cellules saines en transferant un
gene dit <<suicide X> aux cellules tumorales. Par
exemple, si on introduit dans le genome dune cellule maligne le gene de la thymidine-kinase
de lherpes virus (HSV-tk), lapplication
de ganciclovir en-
et al.
traine la mort de la cellule. A linverse, le transfert

aux cellules normales du gene MDR (Multi Drug
Resistance), dont le produit est une proteine transmembranaire impliquee dans lexportation
des drogues en dehors de la cellule, permettrait dintensifier
les chimiotherapies
cytotoxiques [63]. Une derniere
strategic, le transfert de genes marqueurs, est utilisee
pour identifier les lignees cellulaires dans le suivi
des greffes de moelle [64].
Le choix du vecteur dinoculation
est le second
point critique. 11 est guide par la necessite dune expression ciblee sur le tissu sur lequel on souhaite
agir. Parmi les essais cliniques les plus avances, le
choix des vecteurs viraux est privilegie [65]. Les retrovirus, par exemple derives du virus de la leucemie murine de Moloney, sont les plus employ&. 11s
peuvent etre administres notamment par injection intratumorale, intramusculaire (vaccination anti-VIH),
intraveineuse ou en aerosols (virus CFTR + dans la
mucoviscidose).
11s peuvent Cgalement etre utilises
pour transfecter ex vivo des cellules hCmatopoY&iques ou hepatocytes, cest-a-dire pour y introduire
1ADN choisi. Une fois reinoculees, ces cellules vont
coloniser lorganisme. LARN des retrovirus est rCtrotranscrit en ADNc qui integre le genome de la
cellule-cible. Une des limitations de ce type de virus
est leur incapacite a infecter des cellules qui ne se
divisent pas. De plus, leur integration au hasard dans
le genome a CtC responsable de linactivation
dun
gene suppresseur de tumeur dans une serie animale.
11 sagit, en fait, de la seule observation rapportee du
pouvoir transformant dun vecteur. Dautres vecteurs viraux, les adenovirus, posent le probleme
dune forte immunogCnicitC.
De plus, leur localisation est extrachromosomique
et empeche leur replication et leur transfer? aux cellules-filles.
11 existe
Cgalement des vecteurs non-viraux : complexes
ADN-lipides
cationiques (lipofection), ADN plasmidique nu ou transfection (inoculation cellulaire) dite
<<balistique >>utilisant des microparticules
metalliques projetees a grande vitesse dans le tissu cible [66,67]. Linjection
d ADN plasmidique nu presente les avantages dune plus grande simplicite et
dun coat reduit. Son inconvenient principal est la
faible quantite d ADN finalement introduit dans les
cellules. Son indication peut etre trouvee dans le cadre des X<vaccinations geniques >>(hepatite B, virus
influenza, VIH). La voie dinoculation
depend du
Comprendre
la biologie
vecteur et de lindication
: greffe de moelle, injections, aerosols, etc.
Environ 300 protocoles devaluation clinique sont
en tours [65]. Un seul a atteint le stade des essais de
phase III. 11 sagit de limplantation
intratumorale,
dans des glioblastomes,
de cellules murines infectees par un retrovirus porteur du gene HSV-tk [68].
Dans la plupart des autres protocoles, les benefices
se sont pour linstant limit&
a certains patients
consider&
incurables par une prise en charge
conventionnelle.
En revanche, la faisabilite et linnocuite de ce type dapproche ont pu &tre demontrees dans de nombreux cas. Le cas du deficit congenital en adenosine-desaminase
(ADA), a lorigine
dune immunodepression
severe (severe combined
immunodeficiency
syndrome, SCID), doit Ctre souligne. Deux enfants, atteints de cette maladie rare et
jusqualors toujours fatale, ont Cte trait& par inoculation ex vivo de retrovirus ADA + dans leurs lymphocytes T [69]. Letude a debut6 en 1990, avec succ&s a ce jour. Plusieurs autres enfants ont CtC inclus
depuis cette date. En dehors des maladies genetiques
et candreuses, la rest&rose arterielle apres angioplastie est un exemple de theme de recherche. Dans
des systemes experimentaux, les phenomenes dhyperplasie intimale et de remodelage arteriel peuvent
etre inhibes par expression locale de facteurs cytostatiques (proteines Rb, Gax, NO synthase endotheliale) ou cytotoxiques (gkne tk) [70]. Si le grand
nombre detudes experimentales
et cliniques offre
des espoirs, lessor de la therapie genique est actuellement limit6 par les difficult& rencontrees pour infetter un grand nombre de cellules, de facon stable
et definitive. Les problemes de cotit sont incontournables et le recul pris sur les applications cliniques
reste insuffisant a ce jour.
Biologie
molbculaire,
anesthbsie et &animation
Sur le plan experimental, la comprehension des mecanismes daction dagents anesthesiques a pu Ctre
facilitee par le clonage des recepteurs des neurotransmetteurs et par lemploi de lignees animales genetiquement pures ou modifiees. Lexpression de recepteurs des neurotransmetteurs
dans des systemes
in vitro (ovocytes de x&rope) permet danalyser la
contribution
respective de leurs differentes sousunites aux effets des anesthesiques [71, 721. Par
ailleurs, lutilisation
de lignees animales pures per-
molkulaire
741
met des etudes de liaison genetique entre un polymorphisme du genome et la sensibilite aux anesthesiques [73]. Simpson et al. ont identifie un locus,
Lorpl, sit& sur le chromosome 7, dont le polymorphisme de restriction est associe a un delai de reveil
variable apres injection de propofol chez la souris [74]. Lidentification
de la sequence du gene en
cause devrait foumir des informations sur les voies
de signalisation cellulaire, impliquees dans laction
des anesthesiques ou sur leurs voies delimination.
Les lignees employees (souris LSX-SS et LSX-LS
pour Short Sleep et Long Sleep) ont Cgalement une
sensibilite differente a lethanol, a la k&amine, a
letomidate,
a lisoflurane et a lenflurane [75]. En
revanche, leur comportement en reponse a lhalotane
est identique. Ces observations plaident en faveur
dun determinisme polygenique de la sensibilite aux
agents depresseurs du systeme nerveux central.
Plusieurs Cquipes ont produit des lignees de souris
mutantes, deficitaires en recepteurs de neurotransmetteurs ou de neuromodulateurs.
Les genes des recepteurs des opidides (p, K) ont ainsi CtC invalid& [76, 771. Letude des animaux porteurs de ces
mutations a permis detablir la responsabilite respective de ces differents recepteurs dans les mecanismes controlant la douleur, lanxiete et lactivite locomotrice spontanee. Le <<knock out B du gene
codant la sous-unite a6 du recepteur GABA, a montre quelle nest pas impliquee
dans laction de
lethanol ni dans celle du thiopental, comme en temoigne labsence de difference de comportement
des animaux recombinants par rapport aux individus
gdnetiquement
non
modifies [78].
normaux,
Dautres systemes de mutants animaux, chez le nematode Caenorhabditis
elegans et chez Drosophila
melanogaster, ont mis en evidence des liens entre
genotype et comportement
en reponse a differents
anesthesiques [79-931.
Sur le plan clinique, les techniques de biologie
moleculaire
permettent un diagnostic genotypique
chez certains patients, victimes de complications de
lanesthesie (retards de reveil lies a un deficit en
isoenzymes du cytochrome ~450, curarisation prolongee chez les mutants des genes de la butyrilcholinesterase, hyperthermie maligne) [94-991. Ce diagnostic permet de prevenir les recidives chez le
patient et dans sa famille.
En reanimation, les techniques de biologie moleculaire sont quotidiennement
employees dans le
742
V. Laudenbach
domaine des maladies infectieuses. Le profil de restriction du genome de batteries responsables dinfections nosocomiales a CtC realise dans differentes
structures (reanimations
medicales, chirurgicales,
neonatales). Les informations recueillies, sajoutant
aux caracteres phenotypiques
(antibiogramme)
et
immunologiques
des souches isolees, permettent de
distinguer une Cpidemie de lemergence simultade
de plusieurs souches du meme germe. On peut ainsi
Cvaluer limpact des mesures de prevention ou des
traitements employ& [ lOO-1021. Sur un plan plus
fondamental,
les mecanismes cellulaires de situations graves et complexes (traumatismes cerebraux,
chocs septiques, syndromes de detresse respiratoire
peuvent
maintenant
etre
aigus de ladulte)
decrypt& [ 103- 1051. Plusieurs travaux cliniques ont
cherche a Cvaluer la valeur pronostique du niveau
dexpression de proteines impliquees dans ces mtcanismes [106, 1071. Leurs resultats doivent toutefois etre consider& avec prudence car ils sont observes sur des effectifs de patients relativement limit&.
11pourrait exister un determinisme genetique des capacites de defense dun individu vis-a-vis des agressions responsables de telles situations. En particulier, en pathologie infectieuse, certaines mutations de
proteines des systemes de defense immunitaire,
exposant a un risque particulier,
ont et& identifrees [108]. Les genes, dont lexpression est activee
ou reprimee dans ces circonstances, pourraient constituer des cibles therapeutiques.
AVANCtiES
et al
Lensemble des resultats publies est regroup6 dans

plusieurs banques de don&es, dont certaines sont
generales (GenBank/NIH/EMBL)
et dautres specialisees (Fly Base, Mouse Genome Informatics, Saccharomyces Genome Database, etc.). A ce jour, environ 5 % du genome humain ont CtC entierement
ont
sequences. Les marqueurs de polymorphisme
permis detablir une carte physique de 30 18 1 genes
humains. La demiere carte physique avait CtC Ctablie
en 1996 et ne comportait que 16 000 genes environ [109].
Clonage
Jusquen 1997, seul le clonage damphibiens a partir

de cellules differenciees avait CtC rapport& Lequipe
de Campbell a reussi a obtenir le developpement
dune brebis a partir du noyau dune cellule Cpitheliale mammaire [ 1 lo]. Les ovocytes de brebis gestantes ont CtC preleves puis CnuclCCs. Le noyau de
cellules Cpitheliales differenciees, provenant dune
autre lignee de brebis, a CtC transfere dans ces ovocytes Cnuclees. Les ceufs ont CtC ensuite reimplantes.
Le developpement dune descendante normale de la
lignee a laquelle appartenait la cellule mammaire a
montre que le genome dune cellule differenciee
contient toute linformation
necessaire au developpement dun organisme entier. La possibilite de disposer de <ccopies >>dun individu produites a partir
de cellules somatiques conduit a sinterroger sur les
applications medicales Cventuelles.
RlkENTES
Cultures
Projet
dun mammifke
de cellules embryonnaires
humaines
gCnome humain
I1 a CtC lance en 1986. Trois tendances compltmentaires se sont developpees. La cartographic des loci
morbides, cest-a-dire pour lesquels il existe un lien
genetique avec une pathologie, repose sur lanalyse
des RFLP et des polymorphismes
de repetition. Le
sequencage des banques d ADNc, obtenues par
transcription
inverse a partir des ARNm,
limite
lanalyse a 1ADN codant. Le clonage de fragments
dADNc de grande taille est rendu possible par les
vecteurs de type YAC (Yeast Artijcial
Chromosomes) ou cosmides. Enfin, en parallele du genome humain, la cartographic et le sequencage dautres genomes sont realises, en raison de la conservation
dun grand nombre de sequences entre les especes.
Plusieurs lignees de cellules souches totipotentes ont

tte developpees a partir de tissus embryonnaires
(cellules ES) ou de cellules germinales (cellules
EG), chez la souris et chez dautres mammiferes,
dont le singe. Jusqua une date tres recente, aucune
lignte totipotente humaine netait disponible. Deux
Cquipes ont finalement reussi, de facon independante, a produire des cellules souches <cimmortelles >>.Une Cquipe a extrait des cellules de blastocystes humains produits par fecondation in vitro [ 1111.
Ces cellules ont un caryotype normal. Elles ont montre leur capacite a se differencier en tissu musculaire,
neural, digestif ou renal. Shamblott et al. ont publie
parallelement
la production de cellules humaines
totipotentes
d&iv&es
de cellules
germinales,
743
precurseurs dovocytes et de spermatozoides, extraits de produits dinterruption

de grossesse [ 1121.
Ces resultats offrent des perspectives tres larges, en
particulier en ce qui conceme les greffes de tissus ou
dorganes. 11 est envisageable, dans un avenir prothe, que des banques de tissu soient creees et mises
a disposition des malades (cellules neuronales, osseuses, hCmatopoii%iques).
De telles banques permettraient detablir, en dehors de lurgence, le phenotype HLA des tissus <<donneurs >>.On peut meme
imaginer de modifier le phenotype HLA des cellules, par recombinaison et transgenese, de faGon a offrir le plus faible degre de <<mismatch >>au patient
receveur. Toutefois, dimportantes
questions Cthiques devront etre prises en compte avant den parvenir a ce stade.
AUTRES
CHAMPS
DE LA BIOLOGIE
MCdecine
DAPPLICATION
MOLlkULAIRE
ICgale
Lanalyse du profil de restriction de 1ADN genomique est employee pour des etudes de liaison. On recherche, par la technique de Southern Blot, les similitudes
entre deux ADN,
en comparant
les
polymorphismes
de restriction et de repetition. On
peut ainsi etablir une filiation ou determiner le profil
dun suspect. Lamplification
par PCR est un autre
outil developpe par les laboratoires de medecine criminelle. Son extreme sensibilite autorise la detection dADN
depose sur une surface par simple
contact de la peau.
Industrie
Industrie biomhdicale
La liste des medicaments et hormones produits dans
des systemes recombinants aprbs clonage du gene
correspondant sallonge regulierement
(tableau ZZ).
Ce mode de production permet de limiter les problemes de purification des proteines ou de contamination par des agents infectieux dans le cas de molecules times, a lorigine,
dorganismes
vivants.
Lhormone
de croissance recombinante
est venue
ainsi remplacer lhormone humaine, extraite dhypophyses de cadavres, a lorigine de la transmission
Tableau
clinique.
II.
Exemples de molecules recombinantes employees en
Insuline
Hormone de croissance
Erythropoietine
Interferons
tPA (activateur tissulaire du plasminogene)
Urokinase
Facteurs VIII et IX
Antithrombine III
G-CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor)
ctl-antitrypsine
Vaccin antihepatique B (HB VAX DNA)
aux malades dagents infectieux non conventionnels.

La plupart des enzymes employees en biologie moleculaire sont Cgalement produites a partir de vecteurs recombinants.
Zndustrie agro-alimentaire
Lutilisation
dorganismes transgeniques a Cte developpee afin dameliorer
les rendements. 11 sagit
dintegrer au genome un gene codant pour un caract&e qui augmente les capacites dadaptation a Ienvironnement.
Cest le cas des mais, soja et coton
transgeniques, deja commercialist%. Dans le cas du
mais, le transgene code pour une toxine, extraite de
Bacillus thurengiensis, active sur les parasites habituels de la plante. Des lignees de tomates et de pommes de terre surexprimant une anti-protease sont a
letude. Cette anti-protease inhibe les mecanismes
de la digestion des insectes qui colonisent ces plantes. Un des objectifs de ces travaux est la reduction
de la consommation
de pesticides chimiques dans
lagriculture
industrielle. Neanmoins, un debat passionne entoure la mise de ces produits a la disposition du public. Un des arguments avancts par leurs
detracteurs est le risque dun transfert de genes vers
une autre espece. Le probleme pourrait se poser, par
exemple, pour le gene de resistance a lampicilline,
utilise comme marqueur de selection lors de la realisation des constructions dADN. Le risque de recombinaison dans des batteries de la flore digestive
est diffkilement
Cvaluable.
CONCLUSION
En moins de trente ans, les techniques de biologie
moleculaire
ont permis detablir une carte de la
744
moitie des genes humains. A lhorizon des annees

2010, on pense disposer de lensemble des sequences d ADN humain codant et de marqueurs genotypiques pour la plupart des 5 000 maladies genetiques
dont les genes sont actuellement inconnus. On aura
obtenu en mCme temps des informations sur les maladies polygeniques, telles que lhypertension
arterielle essentielle ou le diabete. Lautomatisation
des
techniques, en particulier pour lamplification
de
1ADN et le sequen$age, permet une acceleration
constante du rythme des recherches. La therapie genique conserve actuellement un champ dapplication
restreint. En revanche, les outils a vi&e diagnostique font dores et deja partie des pratiques courantes
en infectiologie,
en onto-hematologie
et dans les
maladies genetiques. Les traitements, en particulier
hormonaux, font appel a un nombre croissant de molecules recombinantes. Les programmes de recherthe decryptent quotidiennement
les mecanismes de
conservation et de regulation de notre patrimoine genetique. 11s ont developpe des outils puissants pour
lanalyse in vivo (transgenese, recombinaison homologue, cultures de cellules totipotentes). Actuellement, les limitations
techniques a une progression
accClCrCe des connaissances semblent Ccartees. Mais
le volume total dactivite developpe pose un probleme de financement. En outre, les modeles experimentaux employ& et lacces direct a linformation
contenue dans le genome humain soul&vent des
questions Cthiques extremement diffrciles.
&&ENCES
Kaplan JC, Delpech M. Biologie moltculaire et mtdecine,
2e edition. Paris: Medecine-Sciences Flammarion ; 1993.
p. 1-11.
Watson JD, Crick FH. Molecular structure of nucleic acids. A
structure for deoxyribose nucleic acid. 1953. Ann N Y Acad
Sci 1995 ; 75 : 13-4.
Nirenberg M, Leder P, Bemfield M, Brimacombe R, Trupin J,
Rottman F, et al. RNA codewords and protein synthesis, VII.
On the general nature of the RNA code. Proc Nat1 Acad Sci
USA 1965 ; 53 : 1161-8.
Nirenberg M, Caskey T, Marshall R, Brimacombe R, Kellogg
D, Doctor B, et al. The RNA code and protein synthesis. In:
Cold Spring Harb Symp Quant Biol. Vol 3 1. New York: Cold
Spring Harbor Laboratory; 1966. p. 1124.
Baltimore D. RNA-dependent DNA polymerase in virions of
RNA tumour viruses. Nature 1970 ; 226 : 1209-I 1.
Temin HM, Mizutani S. RNA-dependent DNA polymerase in
virions of Rous sarcoma virus. Nature 1970 : 226 : 12 11- 13.
Sanger F, Coulson AR. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymer&. J
Mol Biol 1975 ; 94 : 441-8.
8 Steger DJ, Eberharter A, John S, Grant PA, Workman JL. Pu-
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
rified histone acetyltransferase complexes stimulate HIV-1

transcription from preassembled nucleosomal arrays. Proc Nat1
Acad Sci USA 1998 ; 95 : 12924-9.
Utley RT, Ikeda K, Grant PA, Cote J, Steger DJ, Eberharter A,
et al. Transcriptional activators direct histone acetyltransferase
complexes to nucleosomes. Nature 1998 ; 394 : 498-502.
Kaplan JC, Delpech M. Biologie moleculaire et medecine. 2e
edition. Paris : Medecine-Sciences
Flammarion ; 1993.
p. 20-25 ; 95-9.
Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, Watson JD.
Molecular biology of the cell, third edition. New York : Garland Publishine Inc : 1994. D. 342-6. 405-6.
Rosenfeld M< Mermod JJ: Amara SG, Swanson LW, Sawchenko PE, Rivier J, et al. Production of a novel neuropeptide
encoded by the calcitonin gene via tissue-specific RNA processing. Nature 1983 ; 304 : 129-35.
Orphanides G, Lagrange T, Reinberg D. The general transcription factors of RNA polymerase II. Genes Dev 1996 ; 10 :
2657-83.
Roeder RG. The role of general initiation factors in transcription by RNA polymerase II. Trends Biochem Sci 1996 ; 21 :
327-35.
Verrijzer CP, Tjian R. TAFs mediate transcriptional activation
and promoter selectivity. Trends Biochem Sci 1996 ; 21 :
338-42.
Svejstrup JQ, Vichi P, Egly JM. The multiple roles of
transcription/repair factor TFIIH. Trends Biochem Sci 1996 ;
21 : 346-50.
Bjorklund S, Kim YJ. Mediator of transcriptional regulation.
Trends Biochem Sci 1996 ; 21 : 335-7.
Kornberg RD. RNA polymerase II transcription control.
Trends Biochem Sci 1996 ; 21 : 325-6.
Molecular biology of the cell, third edition. New York : Garland Publishing Inc ; 1994. p. 366-8.
Coller JM, Grav NK, Wickens MP. mRNA stabilization bv
poly (A) binding protein is independent of poly (A) and reauires translation. Genes Dev 1998 : 12 : 3226-35.
Takagaki Y, Ryner LC, Manley JL. Separation and characterization of a poly (A) polymerase and a cleavage/specificity
factor required for pre-mRNA polyadenylation. Cell 1988 ;
52 : 731-42.
Wickens M. How the messenger got its tail: addition of poly
(A) in the nucleus. Trends Biochem Sci 1990 ; 15: 277-S 1.
Kaplan JC, Delpech M. Biologie moleculaire et mtdecine,
2 edition. Paris : Medecine-Sciences Flammarion ; 1993.
p. 73-7.
Spector DL. Nuclear organization of pre-mRNA processing.
Curr Onin Cell Biol 1993 : 5 : 442-7.
Enver T, Ebens AJ, Forrester WC, Stamatoyannopoulos G. The
human beta-globin locus activation region alters the developmental fate of a human fetal globin gene in transgenic mice.
Proc Nat1 Acad Sci USA 1989 ; 86 : 7033-7.
Blackwell TK, Alt FW. Mechanism and developmental program of immunoglobulin gene rearrangement in mammals.
Annu Rev Genet 1989 ; 23 : 605-36.
Strominger JL. Developmental biology of T cell receptors.
Science 1989 ; 244 : 943-50.
Ptashne, M, Gann A. Transcriptional activation by recruitment.
Nature 1997 ; 386 : 569-77.
Prendergast G, Ziff E. DNA-binding motif. Nature 1989 ; 341 :
392.

31 Pabo CO, Sauer RT. Transcriptionfactors: structural families
and principles of DNA recognition. Annu Rev Biochem 1992 ;
61 : 1053-95.
32 Barnes PJ, Adcock I. Anti-inflammatory actions of steroids:
molecular mechanisms. Trends Pharmacol Sci 1993 ; 14 :
436-41.
33 Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, Watson JD.
34 Maquat LE. Nuclear mRNAexport. Curr Opin Cell Bioll991 ;
3 : 1004-12.
35 Kislauskis EH, Singer RH. Determinants of mRNA localization. Curr Opin Cell Biol 1992 ; 4 : 975-8.
36 Sachs AB. Messenger RNA degradation in eukaryotes. Cell
1993 ; 74 : 413-21.
37 Agabian N. Trans-splicing of nuclear pre-mRNAs. Cell 1990 ;
61 : 1157-60.
38 Sollner-Webb B. RNA editing. Curr Opin Cell Biol 1991 ; 3 :
1056-61.
39 Rhoads RE. Regulation of eukaryotic protein synthesis by initiation factors. J Biol Chem 1993 ; 268 : 3017-20.
40 Lindahl L, Hinnebusch A. Diversity of mechanisms in the
regulation of translation in prokaryotes and lower eukaryotes.
Curr Opin Genet Dev 1992 ; 2 : 720-6.
41 Oh SK, Samow P. Gene regulation: translational initiation by
internal ribosome binding. Curr Ooin Genet Dev 1993 : 3 :
295-300.
42 Southern EM. Measurement of DNA length by gel electrophoresis. Anal Biochem 1979 ; 100 : 319-23.
43 Davin-Regli A, Monnet D, Saux P, Bosi C, Charrel R, Barthelemy A, et al. Molecular epidemiology of Enrerobacter aerogenes acquisition: one-year prospective study in two intensive
care units. J Clin Microbial 1996 ; 34 : 1474-80.
44 Mullis K, Faloona F, Scharf S. Snecific enzymatic amulification of DNA in vitro: the polymeiase chain reaction. In: Cold
Spring Harb Svmp Quant Biol. Vo15 1. New York: Cold Surina
. .,
Harbor Laboratory; 1986. p. 26373.
45 Dieryck W, Pagnier J, Poyart C, Marden MC, Gruber V, Bournat P, et al. Human haemoglobin from transgenic tobacco.
Nature 1998 ; 386 : 29-30.
46 Estruch JJ, Carozzi NB, Desai N, Duck NB, Warren GW, Koziel MG. Transgenic plants: an emerging approach to pest control. Nat Biotechnol 1997 ; 15 : 137-41.
47 Price DL, Sisodia SS, Borchelt DR. Genetic neurodegenerative diseases: the human illness and transgenic models.
Science 1998 ; 282 : 1079-83.
48 Platt JL. New directions for organ transplantation. Nature
1998 ; 392 Supp16679 : 11-7.
49 Grass S, Arnold HH, Braun T. Alterations in somite patterning
of Mvf-5-deficient mice: a nossible role for FGF4 and FGF-6.
Development 1996 ; 122 : -141-50.
50 Patapoutian A, Yoon JK, Miner JH, Wang S, Stark K, Wold B.
Disruption of the mouse MRF4 gene identifies multiple waves
of myogenesis in the myotome. Development 1995 : 121 :
3347-58.
51 Acampora D, Mazan S, Lallemand Y, Avantaggiato V, Maury
M, Simeone A, et al. Forebrain and midbrain regions are deleted in Otx2-I- mutants due to a defective anterior neuroectoderm specification during gastrulation. Develonment 1995 :
121 : 3279-90.
52 Snouwaert JN, Brigman KK, Latour AM, Iraj E, Schwab U,
Gilmour MI, et al. A murine model of cystic fibrosis. Am J
Respir Crit Care Med 1995 ; 151 : S59-64.
53 Kano T, Shimizu-Sasamata M, Huang PL, Moskowitz MA, Lo
EH. Effects of nitric oxide synthase gene knockout on neurotransmitter release in vivo. Neuroscience 1998 ; 86 : 695-9.
745
54 Paszty C, Brion CM, Manci E, Witkowska HE, Stevens ME,

Mohandas N, et al. Transgenic knockout mice with exclusively
human sickle hemoglobin and sickle cell disease. Science
1997 ; 278 : 876-8.
55 Lam, KP, Rajewsky K. Rapid elimination of mature autoreactive B cells demonstrated by Cre- induced change in B cell
antigen receptor specificity in vivo. Proc Nat1 Acad Sci U S A
1998 ; 95 : 13171-5.
56 Sauer B. Inducible gene targeting in mice using the Cre/lox
system. Methods 1998 ; 14 : 381-92.
57 Tsui LC, Buchwald M, Barker D, Braman JC, Knowlton R,
Schumm JW, et al. Cystic fibrosis locus defined by a genetically linked polymorphic DNA marker. Science 1985 ; 230 :
1054-7.
58 Crawford I, Maloney PC, Zeitlin PL, Guggino WB, Hyde SC,
Turley H, et al. Immunocytochemical localization of the cystic
fibrosis gene product CFTR. Proc Nat1 Acad Sci USA 1991 ;
88 : 9262-6.
59 Saffran DC, Horton HM, Yankauckas MA, Anderson D, Barnhart KM, Abai AM, et al. Immunotherapy of established tumors in mice by intratumoral injection of-interleukin-2 plasmid DNA: induction of CD8+ T-cell immunitv. Cancer Gene
Ther 1998 ; 5 : 321-30.
60 Lang FF, Yung WK, Raju U, Libunao F, Terry NH, Tofilon PJ,
et al. Enhancement of radiosensitivity of wild-type ~53 human
glioma cells by adenovirus-mediated delivery of the ~53 gene.
J Neurosurn 1998 : 89 : 125-32.
61 Spitz FR, Nguyen D, Skibber JM, Meyn RE, Cristiano RJ,
Roth JA, et al. Adenoviral-mediated wild-Tvpe ~53 gene expression sensitizes colorectal cancer cells to i&izmg ridiation.
Clin Cancer Res 1996 ; 2 : 1665-1671.
62 Bos JL. ras oncogenes in human cancer: a review. Cancer Res
1989 ; 49 : 4682-9.
63 Mannoni P. La tberapie genique du cancer: d&sir mythique ou
realitt thtrapeutique de demain? MM Sci 1996 ; 12 : 68-72.
64 Brenner MK, Heslop HE, Rill D, Li C, Nilson T, Roberts M, et
al. Gene transfer and bone marrow transulantation. In : Cold
Spring Harb Symp Quant Biol. Vol 59. New York : Cold
Surinz Harbor Laboratorv : 1994. o. 691-97.
65 Anderson WF. Human gene therapy. Nature 1998 ; 392 Suppl
6679 : 25-30.
66 Langer R. Drug delivery and targeting. Nature 1998 ; 392
Supp16679 : 5-10.
67 Mahvi DM, Sondel PM, Yang NS, Albertini MR, Schiller JH,
Hank J, et al. Phase I/IB study of immunization with autologous tumor cells transfected with the GM-CSF gene by
particle-mediated transfer in patients with melanoma or sarcoma. Hum Gene Ther 1997 ; 8 : 875-91.
68 Oldfield EH, Ram Z, Culver KW, Blaese RM, Devroom HL,
Anderson WE Gene therapy for the treatment of brain tumors
using intra-tumoral transduction with the thymidine kinase
gene and intravenous ganciclovir. Hum Gene Ther 1993 ; 4 :
39-69.
69 Blaese RM, Culver KW, Miller AD, Carter CS, Fleisher T, Clerici M, et al. Treatment of severe combined immunodeficiency
disease (SCID) due to adenosine deaminase deficiency with
CD34+ selected autologous peripheral blood cells transduced
with T lymphocyte-directed gene therapy for ADA- SCID: initial trial results after 4 years. Science 1995 ; 270 :475-80.
70 Feldman LJ, Steg PG. Perspectives de thtrapie gtnique de la
restenose. Medecine Sciences 1996 ; 12 : 47-55.
71 Flood P, Ramirez-Latorre J, Role L. Alpha 4 beta 2 neuronal
nicotinic acetylcholine receptors in the central nervous system
are inhibited by isoflurane and propofol, but alpha 7-type nicotinic acetylcholine receptors are unaffected. Anesthesiology
1997 ; 86 : 859-65.
746
Violet JM, Downie DL, Nakisa RC, Lieb WR, Franks NP. Differential sensitivities of mammalian neuronal and muscle nicotinic acetylcholine
receptors to general anesthetics.
Anesthesiology 1997 ; 86 : 866-74.
73 Crowder CM: Mapping anesthesia genes: why and how?
74 Simpson VJ, Rikke BA, Costello JM, Corley R, Johnson TE.
Identification of a genetic region in mice that specifies sensitivity to propofol. Anesthesiology 1998 ; 88 : 379-89.
75 Marlev RJ, Miner LL, Wehner JM, Collins AC. Differential
effects of central nervous system depressants in long- sleep
and short-sleen mice. J Pharmacol Exp Ther 1986 ; 238 :
72
1028-33.
Matthes HW, Maldonado R, Simonin F, Valverde 0, Slowe S,

Kitchen I, et al. Loss of morphine-induced analgesia, reward
effect and withdrawal symptoms in mice lacking the muopioid-receptor gene. Nature 1996 ; 383 : 819-23.
71 Simonin F, Valverde 0, Smadja C, Slowe S, Kitchen I, Dierich
A. et al. Disruption of the karma-opioid receptor gene in mice
enhances sensitivity to chemical visceral pain, impairs pharmacological actions of the selective kappa-agonist U-50,4888
and att&uates morphine withdrawai. Embo J 1998 ; 17 :
16
Mir B, Iyer S, Ramaswami M, Krishnan KS. A genetic and

mosaic analysis of a locus involved in the anesthesia response
of Drosophila
melanogaster.
Genetics 1997 ; 147 : 701-12.
92 Lin M, Nash HA. Influence of general anesthetics on a specific
neural pathway in Drosophilu
melanogaster.
Proc Nat1 Acad
Sci USA 1996 ; 93 : 10446-51.
93 Krishnan KS, Nash HA. A genetic study of the anesthetic response: mutants of Drosophila
melunogaster
altered in sensitivity to halothane. Proc Nat1 Acad Sci USA 1990 ; 87 :
91
8632-6.
Nelson DR, Koymans L, Kamataki T, Stegeman JJ, Feyereisen

R, Waxman DJ, et al. P450 superfamily: update on new sequences, gene mapping, accession numbers and nomenclature.
Pharmacogenetics 1996 ; 6 : l-42.
95 Dale 0, Olkkola KT. Cytochrome P450, molecular biology
and anaesthesia [editorial]. Acta Anaesthesiol Stand 1998 ;
94
42:
96
97
886-97.
Homanics GE, Ferguson C, Quinlan JJ, Daggett J, Snyder K,

Lagenaur C, et al. Gene knockout of the alpha6 subunit of the
gamma-aminobutyric acid type A receptor: lack of effect on
responses to ethanol, pentobarbital, and general anesthetics.
Mol Pharmacol 1997 ; 51 : 588-96.
79 Boswell MV, Morgan PG, Sedensky MM. Interaction of
GABA and volatile anesthetics in the nematode Caenorhabditis elegans. Faseb J 1990 ; 4 : 2506-10.
80 Crowder CM, Shebester LD, Schedl T. Behavioral effects of
volatile anesthetics in Caenorhabditis
elegans. Anesthesiology
18
1996, 85: 901-12.

81
82
83
84
85
Morgan PG, Sedensky MM, Meneely PM, Cascorbi HF. The

effect of two genes on anesthetic response in the nematode
Caenorhabditis
elegans. Anesthesiology 1988 ; 69 : 246-51.
Morgan PG. Sedenskv MM. Mutations conferring new patterns of sensitivity to- volatile anesthetics in Caenorhabditis
eleaans. Anesthesiologv 1994 ; 81 : 888-98.
Morgan PG, Sedensky?MM. Mutations affecting sensitivity to
ethanol in the nematode Caenorhabditis
elegans. Alcohol Clin
Exp Res 1995 ; 19 : 1423-9.
Morgan PG, Usiak MF, Sedensky MM. Genetic differences affecting the potency of stereoisomers of isoflurane.
Rajaram S, Sedensky MM, Morgan PG. Uric-1 : a stomatin homologue controls sensitivity to volatile anesthetics in Caenorhabditis
elegans.
Proc Nat1 Acad Sci USA 1998 ; 95 :
8761-6.
86
87
88
89
90
Sedensky MM, Cascorbi HF, Meinwald J, Radford P, Morgan

PG. Genetic differences affecting the potency of stereoisomers
of halothane. Proc Nat1 Acad Sci USA 1994 ; 91 : 10054-8.
VanSwinderen B, Shook DR, Ebert RH, Cherkasova VA, Johnson TE, Shmookler Reis RJ, et al. Quantitative trait loci controlling halothane sensitivity in Cae<orhabditis
elegans. Proc
Nat1 Acad Sci USA 1997 ; 94 : 8232-7.
Allada R, Nash HA. Drosophila melanogaster as a model for
study of general anesthesia: the quantitative response to clinical anesthetics and alkanes. Anesth Analg 1993 ; 77 : 19-26.
Campbell DB, Nash HA. Use of Drosophila
mutants to distinguish among volatile general anesthetics. Proc Nat1 Acad Sci
USA 1994 ; 91 : 2135-9.
Nash HA, Campbell DB, Krishnan KS. New mutants of
Drosophila
that are resistant to the anesthetic effects of halothane. Ann NY Acad Sci 1991 ; 625 : 540-4.
98
99
100
101
1025-7.
Jensen FS, Schwartz M, Viby-Mogensen J. Identification of

human plasma cholinesterase variants using molecular biological techniques. Acta Anaesthesiol Stand 1995 ; 39 : 142-9.
Quane KA, Brding H, Keating KE, Manning BM, Heine R,
Bendixen D, et al. Detection of a novel mutation at amino acid
position 6 14 in the ryanodine receptor in malignant hyperthermia. Br J Anaesth 1997 ; 79 : 332-7.
Monsieurs KG, Van Broeckhoven C, Martin JJ, VanHoof VO,
Heytens L. Gly341Arg mutation indicating malignant hyperthermia susceptibility: specific cause of chronically elevated
serum creatine kinase activity. J Neurol Sci 1998 ; 154 : 62-5.
Monnier N, Procaccio V, Stieglitz P, Lunardi J. Malignanthyperthermia susceptibility is associated with a mutation of the
alpha l-subunit of the human dihydropyridine-sensitive L-type
voltage-dependent calcium-channel receptor in skeletal
muscle. Am J Hum Genet 1997 ; 60 : 1316-25.
Nawas T, Hawwari A, Hendrix E, Hebden J, Edelman R,
Martin M, et al. Phenotypic and genotypic characterization of
nosocomial Staphylococcus
aureus isolates from trauma patients. J Clin Microbial 1998 ; 36 : 414-20.
Vancouwenberzhe CJ. Cohen SH. Tann YJ, Gumerlock PH.
Silva J Jr. Gen>mic fingerprinting of epidemic and endemic
strains of Stenotrophomonas
maltophilia
(formerly Xantbomonas maltophilia) by arbitrarily primed PCR. J Clin Microbial
1995;33:
Khatib
1289-91.
102
R, Thirumoorthi MC, Riederer KM, Sturm L, Oney

LA, Baran J Jr. Clustering of Candida infections in the neonatal intensive care unit: concurrent emergence of multiple
strains simulating intermittent outbreaks. Pediatr Infect Dis J
103
Remick DG. Applied molecular biology of sepsis. J Crit Care
1998;
1995;
17:
10:
130-4:
198-212.
Deheinzelin D, Jatene FB, Saldiva PH, Brentani RR. Upregulation of collagen messenger RNA expression occurs immediatelv after lung damage. Chest 1997 ; 112 : 1184-8.
105 Yakovlev AG,-FadeniI.
Molecular biology of CNS injury. J
Neurotrauma 1995 ; 12 : 767-77.
106 Kaufmann P, Tilz GP, Lueger A, Demel U. Elevated plasma
levels of soluble tumor necrosis factor receptor (sTNFRp60)
reflect severity of acute pancreatitis. Intensive Care Med
1997 ; 23 : 841-8.
107 Groeneveld PH, Kwappenberg KM, Langermans JA, Nibbering PH, Curtis L. Nitric oxide (NO) production correlates
with renal insufftciency and multiple organ dysfunction syndrome in severe sepsis. Intensive Care Med 1996 ; 22 :
104
1197-202.
108
Bredius RG, Derkx BH, Fijen CA, De Wit TP, DeHaas M,

Weening RS, et al. Fc gamma receptor IIa (CD32) polymorphism in fulminant meningococcic septic shock in children. J
Infect Dis 1994 ; 170 : 848-53.

109 Deloukas P, Schuler GD, Gyapay G, Beasley EM, Soderlund
C, Rodriguez-Tome P, et al. A physical map of 30,000 human
genes. Science 1998 ; 282 : 744-6.
110 Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ, Campbell KH.
Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells.
Nature 1997 ; 385 : 810-3.
111 Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA,
747
Swiergiel JJ, Marshall VS, et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 1998 ; 282 : I 145-7.
112 Shamblott MJ, Axelman J, Wang S, Bugg EM, Littlefield JW,
Donovan PJ, et al. Derivation of pluripotent stem cells from
cultured human primordial germ cells. Proc Nat1 Acad Sci
USA 1998 ; 95 : 13726-31.

Comprendre La Biologie Moleculaire

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Comprendre La Biologie Moleculaire

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Ann Fr Anesth R6anim

V. Laudenbach, 2, J. Mantz, J.M. Desmontsl

1998 ; accept6 aprhs hision

Abreviations : ADN : acide dCsoxyribonuclCique ; ARN : acide

La biologie moleculaire correspond a lintegration

un organisme humain. 11 est desorrnais possible de

Comprendre la biologie moleculaire

Tableau I. Le code genetique.

Buses; T: thymine ; C : cytosine ; A : adenine, G : guanine ; Acides aminb correspondant

peptidique, sequence regulatrice, ADN non codant).

La double helice dADN est schematisee sur la

tre, <<en amont >>,le groupement OH sit& en 3 dun

plets, des quatre bases entrant dans la composition

nien est une sorte de chapelet de particules appelees

des genes de classe II.

lieu beaucoup plus en aval. Toutefois, chez les

1ARNm doit subir un Cpissage (splicing). Cet Cpissage aboutit a lelimination

Elle permet de nexprimer que les genes requis selon

fixation recouvre partiellement

per au systeme immunitaire

des temperatures depassant 90 C. Sa principale application est la methode damplification

Comprendre la biologie moleculaire

Coupure par un ou plusieurs

lieu de culture contenant de lampicilline,

G froid >x). LADN est dig&C par une ou plusieurs

quC dans la$gure 6. La reaction necessite plusieurs

Comprendre la biologie moleculaire

Amplification dun ADN par polymerisation en chaine

realiser une nouvelle amplification

le transgene est normal ou pas. Cette approche est

Figure 7. La transgenkse (voir texte).

exprimee. Parmi les nombreuses lignees danimaux

Comprendre la biologie moleculaire

Figure 8. La recombinaison homologue in vivo (knock-ours). On

Les premiers resultats applicables a la medecine ont

traine la mort de la cellule. A linverse, le transfert

Lensemble des resultats publies est regroup6 dans

Jusquen 1997, seul le clonage damphibiens a partir

Plusieurs lignees de cellules souches totipotentes ont

Comprendre la biologie moleculaire

precurseurs dovocytes et de spermatozoides, extraits de produits dinterruption

Exemples de molecules recombinantes employees en

aux malades dagents infectieux non conventionnels.

moitie des genes humains. A lhorizon des annees

8 Steger DJ, Eberharter A, John S, Grant PA, Workman JL. Pu-

rified histone acetyltransferase complexes stimulate HIV-1

Comprendre la biologie moleculaire

54 Paszty C, Brion CM, Manci E, Witkowska HE, Stevens ME,

Matthes HW, Maldonado R, Simonin F, Valverde 0, Slowe S,

Mir B, Iyer S, Ramaswami M, Krishnan KS. A genetic and

Nelson DR, Koymans L, Kamataki T, Stegeman JJ, Feyereisen

Homanics GE, Ferguson C, Quinlan JJ, Daggett J, Snyder K,

1996, 85: 901-12.

Morgan PG, Sedensky MM, Meneely PM, Cascorbi HF. The

Sedensky MM, Cascorbi HF, Meinwald J, Radford P, Morgan

Jensen FS, Schwartz M, Viby-Mogensen J. Identification of

R, Thirumoorthi MC, Riederer KM, Sturm L, Oney

Remick DG. Applied molecular biology of sepsis. J Crit Care

Bredius RG, Derkx BH, Fijen CA, De Wit TP, DeHaas M,

Comprendre la biologie moleculaire

You might also like