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PRCTICASDE
MICROBIOLOGAyBIOQUMICAENOLGICA
readeMicrobiologa
DepartamentodeBiotecnologa
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EscuelaTcnicaSuperiorIngenieraAgronmicaydelMedioNatural
UNIVERSIDADPOLITCNICADEVALENCIA
NORMASDESEGURIDADENELLABORATORIODEMICROBIOLOGA
HBITOSPERSONALESARESPETARENELLABORATORIO
Esobligatoriollevarbatadelaboratorio,quesemantendrabrochadaentodomomento.
Enellaboratorioestprohibidofumar,comerybeber.
Nodejarobjetospersonalesenlassuperficiesdetrabajo,manteniendolospasilloslibres.
Utilizarlastaquillas.
Llevarelpelorecogido.
Nollevaraccesorios,mangasanchasniprendassueltasquepuedanengancharse.
Lavarselasmanosantesdeentrarenellaboratorioytrasfinalizarlasesindeprcticas.
UTILIZACINDELMATERIALDELABORATORIO
Seguirentodomomentolasindicacionesdelprofesordeprcticas.
Encenderlosmecherosconprecaucinsinmoverlosdesulugar.Notrasladarnuncaun
mecheroencendidoyapagarloscuandonoseutilicen.
Evitar los guantes de ltex si se trabaja cerca del mechero. Las quemaduras son muy
peligrosas.
Mantener alejados del alcohol los objetos flameados. Asegurarse que estn bien
apagadosantesdeintroducirlosenalcohol.
Notrabajaralavezconelmecheroencendidoyproductosqumicosvoltiles.
Notrabajarseparadodelpuestodetrabajo.
Evitartocarconlasmanosmojadaslosaparatosconectadosalaredelctrica.
ELMANEJODEMUESTRAS
Nopipetearconlaboca.Usarlaspropipetasolaspipetasautomticascalibradas.
Despusdelosanlisis,loscultivosseretirarnparasudestruccinenautoclave.
INDICACIONESENCASODEACCIDENTES
Enelcasodevertidosoroturasaccidentales,notocarnadaeinformarinmediatamente
alprofesordeprcticas.
SISESIGUENCORRECTAMENTEESTASINSTRUCCIONES,ELTRABAJODELABORATORIO
SERSEGUROPARATODOS.
OBJETIVOS
Sepretendeconseguirquelosalumnosconozcan:
BuenasprcticasdetrabajoenellaboratoriodeMicrobiologa.
Manejodetcnicassencillasparaelrecuentodelosdistintosmicroorganismosquenos
podemosencontrartantoenelmostocomoenelvino.
Utilizarsistemasminiaturizadosparalaidentificacindebacteriaslcticas.
Aadirloscomponentesdelmedioenlascantidadesindicadasaunrecipientelimpiocon
lacantidaddeaguadestiladaquesedeseepreparar,disolvindoloscompletamente.
Ajustar el pH del medio. Hay que tener en cuenta que en los medios no tamponados,
despus de esterilizar en el autoclave desciende el pH unas 0,10,2 unidades, a veces
incluso0,4unidades.
Sielmediovaaserslidoosemislidoseleaadeagar.Enelcasodequeelmediose
vayaarepartirentubosesnecesarioenprimerlugarllevarloaebullicinparaqueelagar
sefundayserepartahomogneamente;despusdistribuirenlostubosyesterilizar.Siel
mediosevaarepartirenplacas,seesterilizaenunmatrazyunavezestrilsereparteen
lasplacaspreviamenteesterilizadas.
Muchos de los medios de cultivo estn comercializados; stos tienen sus componentes
previamentemezcladosynecesitanslodelaadicindeaguayesterilizacin.
Paralaconservacindelascepasduranteperiodosdetiempodehasta2semanasyparasuuso
inmediato,laslevadurassepuedenmantenerenplacasPetriconmedioYPDa4C.
Paraperiodosdetiempomslargossepuedenmantenerobiencomocultivoenfrescoentubos
de agar inclinado con YPD a 4C. Tanto las levaduras como las bacterias lcticas de inters se
pueden conservar durante periodos de ms de un ao. Para ello hacer una suspensin de un
cultivode2448horasencriovialescon1,5mldecaldoconglicerolal20%yconservara20Co
a80C.
PreparacindealgunosMediosdeCultivo
YPD(Difco)paralevaduras
Extractodelevadura.....................................10g
Peptona........................................................20g
Glucosa.........................................................20g
Aguadestilada..........................................1000ml
MRS(Merk)parabacteriaslcticas
Peptona............................................................10g
Extractodecarne...............................................8g
Extractodelevadura..........................................4g
D(+)glucosa.....................................................20g
Acetatosdico...................................................5g
Citratotriamnico..............................................2g
Sulfatomagnsico..............................................0,2g
Sulfatomanganoso............................................0,05g
Polisorbato80....................................................1mL
Agar..................................................................17g
Aguadestilada...................................................1L
pHfinal(aprox.)6,3
Medioparalafermentacindecompuestoscarbonados.Mediobasal:
Extractodelevadura.......................................2,5g
Peptona..........................................................7,5g
Azuldebromotimol........................................0,04g
Aguadestilada..........................................1000ml
RepartirentubosconcampanaDurhamcantidadesmedidasde4mlyesterilizar
enautoclave.
Aadir a cada tubo en condiciones estriles 2 ml del azcar que se quiera
ensayaresterilizandoporfiltracinyalasconcentracionessiguientes:
Glucosa................6%
Melecitosa...........6%
Sacarosa...............6%
Melibiosa.............6%
Maltosa................6%
Trealosa..............10%
Galactosa.............6%
Rafinosa.............10%
Lactosa.................6%
Almidn..............10%
Celobiosa.............6%
YEASTGLUCOSEAGARparaAcetobacter
Glucosa.......................................................100g
Extractodelevadura.....................................10g
CaCO3............................................................20g
Agar..............................................................18g
Aguadestilada..........................................1000ml
OenococcusoeniMedium
Triptona........................................................10g
Extractodelevadura.......................................5g
Glucosa.........................................................10g
Fructosa..........................................................5g
SO4Mg.7H2O...................................................0,2g
MnSO4H2O.......................................................0,05g
Diamoniocitrato............................................3,5g
LCisteinahidroclorada....................................0,5g
Zumodetomatefiltrado.............................100ml
Tween80........................................................1ml
Aguadestilada............................................900ml
Agar...............................................................18g
pH4,8
Agarmosto
Mostodescongeladoyfiltradocongasaestril(medirelvolumenenml)
Cloranfenicol
0.5g/l
Agar
18g/l
Hervirduranteunosminutos,atemperara45CyrepartirenplacasPetri.
Conservarunavezsolidificadasa4C.
2. OBSERVACINDEMICROORGANISMOS
Existenvariastcnicasdetincinparalavisualizacin,diferenciacinyseparacindelos
gruposbacterianossegncaractersticasmorfolgicasyestructurascelulares.
TINCINDEGRAM
LatincindeGram,lamsempleadaenbacteriologa,esunatincindiferencial.Poreste
mtodo se pueden separar las bacterias en dos grandes grupos: Grampositivas y Gram
negativas.
El distinto comportamiento en la tincin es debido a diferencias en la estructura y
composicinqumicadelaparedcelular.
Material
Portaobjetos
Asadesiembra
Cristalizador
Pinzasparaportaobjetos
Mechero
Microscopio
Productos
Violetadegenciana
ReactivodeLugol
Alcoholde96
Fuchsinabsicadiluida
Microorganismoaestudiar
Procedimiento
1.Extensin
2.Desecacinalaire
3.Fijacinalcalor
4.TeirconVioletadeGenciana1minuto.
5.Sinlavar,reemplazarelcoloranteporelreactivodeLugol,arrastrandoprimero
ydejndoloactuar1minuto.
6.Lavarconagua
7.Decolorarconalcoholhastaquesalgaexentodecolorantes.Generalmente
unos30segundosessuficiente.
8.Lavarconagua
9.Teirconfuchsinabsicadiluidadurante3minutos.
10.Lavar,secaryobservaralmicroscopioconobjetivodeinmersin(100x).
Los microorganismos Gram positivos aparecen de color violeta, mientras que los Gram
negativosseobservandecolorrojoorosa.
3.OBSERVACINMORFOLGICADELEVADURASALMICROSCOPIO
Observacindelevadurasenfresco:
1.Sobreunportaobjetosdepositarunagotadeazuldemetileno.Tomarconelasauna
pequeamuestradelalevadurayhacerunasuspensin.
2.Colocarencimaelcubreobjetosprocurandoquenoseformenburbujasdeaire.
3.Observarconelobjetivosecode40Xo60X.
Tincinvitaldelevaduras
1.
Procederigualqueenelcasoanteriorutilizandoelazuldemetilenotamponado
paratincinvital
2.
La levaduras que estn activas metablicamente y por tanto viables se tien de
colorazul,mientrasqueaquellasqueestnmuertasnosetien.
Azuldemetilenotamponadoparatincinvitaldelevaduras:
Azuldemetileno0,1g(refMerck:1.15943.0025)
Potasiodihidrgenofosfato13,5g(refMerck:1.04873.0250)
DiSodiohidrgenofosfatododecahidrato0,12g(refMerck:1.06579.0500)
Enrasarconaguadesionizadaenunmatrazde500ml
Observacinconelobjetivodeinmersin:
1.Realizarunaextensindelalevadurasobreunportaobjetosalqueselehaaadido
previamenteunagotadeagua.
2.Dejarsecaralaireoconcalorsuave
3.Fijarlapreparacinalallamacon34cortedellama
4.Dejarenfriaryteirconazuldemetilenodurante35minutos.
5.Lavarparaarrastrarelrestodecolorante,secarymiraralmicroscopioconaceitede
inmersin(100X).
Morfologadelevaduras:
ayb:Gemacinmultilateral:Saccharomyces
c:Gemacinbipolar:Hanseniaspora
d:Fisinbinaria:Schizosaccharomyces
e:Yemassobrecortostallos:Sterigmatomyces
f:Artroconidios:Trichosporon
g:Balistoconidios:Sporobolomyces
4.RECUENTODEMICROORGANISMOS
4.1.RECUENTOTOTALDEMICROORGANISMOSALMICROSCOPIO.CAMARADETHOMA
Materiales
CmaradeThomaconcubreobjetos
PipetasPasteur
Microscopio
Procedimiento
Estemtodoseutilizaparacontarmicroorganismosenmedioslquidos.
1. Colocar el cubreobjetos sobre la cmara y presionar sobre loa bordes para que
aparezcan los anillos de Newton. Esto se consigue si la cmara y el objetivo estn
perfectamentelimpios
2. Descargar una gota con la pipeta sobre la cmara para llenar el espacio del
cubreobjetos.
3. Llevar al microscopio y observar con objetivos secos de 20X o 40X. Cada cuadrado
tieneunreade1/400mm2,,ylaalturadelasuperficiedelacmarayelcubreobjetoses
de0,1mm;porlotanto,elvolumendellquidosobrecadacuadradoesde1/4000mm3.
Por tanto, 1mm3 contiene 4000 veces el nmero de microorganismos contados. Para
expresarelresultadoenclulaspormlmultiplicamospor1000.
4. EnlafrmuladelapginasiguienteDeselinversodeladeladilucinutilizada,nesel
nmerototaldemicroorganismoscontadosyFelnmerototaldecuadraditoscontados.
Sedebencontardosdiagonales,esdecirF=40.
DIAGONAL1
F
DIAGONAL2
F
4.2 RECUENTODEMICROORGANISMOSVIABLESENMOSTO
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Material
Pipetasestrilesde1ml.
PlacasPetri
Tubosdeensayocon9mldeaguaestril.
BaoMara
Mechero
Productos
Mediodecultivosegnelgrupodemicroorganismosenmatrazatemperadoa4550Co
enplacasyapreparado.
BacteriasLcticas:AgarMRS
AgarOenococcus
Mohosylevaduras:AgarYPD+Cloranfenicol
Procedimiento
1.Pipetearaspticamente1mldemuestrayrealizardilucionesdecimalesseriadasenlos
tubosdeaguadestiladaestril.
2. Siembra en profundidad: Inocular 1 ml de cada dilucin en placas Petri vacas por
duplicado. Verter unos 15 ml de medio fundido, mezclar con suave agitacin y dejar
solidificareinvertir.
2. Siembra en superficie: Inocular 0,1 ml de cada dilucin en placas conteniendo el
medio de cultivo por duplicado. Extender con el asa de Drigalski. Invertir las placas
cuandoestnsecas.
3.Incubaratemperaturaytiempoadecuados.
4.Considerarlasplacasenlasqueelnmerodecoloniasestcomprendidoentre30y
300.Hallarlamedia,ladesviacintpicayelerrortpico.
5. Para el recuento en profundidad multiplicar el nmero medio de colonias por el
inversodeladilucin.
6. Para el recuento ensuperficie multiplicarelnmero decolonias por el inversode la
dilucinypor0,1.
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5.AISLAMIENTODELEVADURASAPARTIRDEUNMOSTOy/oUVA
Paraobteneraisladosdelevaduraspertenecientesalamicrobiotaautctonadenuestras
vides,podemosutilizarmostoobtenidoapartirdelasuvas,unavezmaduras,oaislarlas
levadurasqueseencuentrenadheridasalapruina.
Materiales
Mostosinsulfitarysinconservantes
AgarYPDconCloranfenicol
AgarmostoconCloranfenicol
Tubosdeaguadestiladaestril
Hisoposestriles
CaldoYPD
Procedimiento
Latomademuestrassedeberealizarenunenvaseestrilymantenerloenrefrigeracin
a4Chastasuanlisis.
Serealizandilucionesdecimalesseriadasdelasmuestrasconaguadestiladaestril.
Sembrarmediantelatcnicadesuperficie0.1mldelasdilucionesseleccionadasenlos
distintosmedioseincubardurante3dasa28C.
Si queremos aislar las levaduras que se encuentren adheridas a la pruina de la uva
madura,procederarecogerdeformaasptica,conhisopoestrilhumedecidoencaldo
YPD, todas las partculas presentes en el grano de uva. Sembrar en placa por
agotamiento,enlosmediosanteriormenteseleccionados.
Hacertincinconazuldemetilenodelasdiferentescoloniasencontradasparaobservar
lamorfologadelaslevaduras.
Procederasupurificacinmediantetripleestraenlosmediosutilizadosparacultivode
levaduras.
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Ensayodefermentabilidaddecompuestoscarbonados:
1.DeuncultivodelevaduracrecidaenYPDagar,realizarunasuspensinenYPDbroth.
2.Inocular0,5mldelasuspensinanteriorenlostubosdemediodefermentacinde
compuestoscarbonadosconcampanaDurham.
3.Incubara28Cyrealizarlecturasalas24h,48hy72h.
4. Lectura de los resultados. Si hay crecimiento y gas en la campana Durham la
fermentacinespositiva.
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7.IDENTIFICACINDEBACTERIASLACTICASCONELSISTEMAAPI50CH
Este sistema estandarizado esa compuesto por 50 ensayos bioqumicos destinados al
estudio del metabolismo de los hidratos de carbono por los microorganismos. Esta
diseadoparaidentificacindeLactobacillusymicroorganismosprximos.
AntesdeutilizarelsistemaAPI50CHsedebeverificarlapurezadelcultivo.Comprobar
su pertenencia a bacterias lcticas: Bacilos Gram positivos, Catalasa positivos, no
esporulados,anaerobiosestrictosofacultativosycultivablessobreMRS.
1. Prepararunacmaradeincubacin(fondoytapa)yllenarlosalvolosdelfondo
conaguaparacrearunaatmsferahmedaycolocarlastirasenelfondodela
cmaradeincubacin.
2. Realizarunasuspensindensaenuntubodeaguadestiladaestril.
3. Abrir una ampolla de API Suspensin Medium (5ml) o utilizar un tubo de agua
destilada estril y realizar una suspensin de turbidez igual al patrn 2 de
McFarland transfiriendo un cierto nmero de gotas de la suspensin anterior.
Anotarelnmerodegotas(n)
4. AbrirunaampolladeAPI50CHLMediumeinocularcondosveceselnmerode
gotasutilizadasparaprepararlasuspensinanterior(2n).Homogeneizar.
5. Repartir el API 50 CHL Medium as inoculado solo en los tubos, y recubrir con
vaselina.
6. Incubara30Coa37Cdurante48horas.
7. Lecturaderesultados:Encadatuboseinvestigalaacidificacinproducidaquese
traduceenuncambiodeaAMARILLO.Elensayodelaesculina(n25)seobserva
decolornegro.
8. Anotarlosresultadosenlahojaderesultadosyconsultarelbancodedatos
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9. ENSAYOPREVIODECONSERVACINDELVINO:FILTRACIN
Enestaprcticavamosaestudiarlosmicroorganismosviablesquepuedenquedarenel
vino envasado. Se puede realizar por observacin microscpica del vino o por un
recuentodeviablesenplaca,peroenestoscasoselvolumenestudiadoesmuypequeo.
Paraestudiarvolmenesmsgrandesseutilizalatcnicadelafiltracin.
Latcnicadelafiltracinpormembranasebasaenhacerpasarlamuestraatravsdeun
filtro en cuya superficie quedan retenidos todos los microorganismos. Se utilizan
membranas que tienen un tamao de poro de 0,45 micras, ya que la mayora de los
microorganismostienenuntamaosuperior.Unavezfiltradalamuestraseincubasobre
unmediodecultivoadecuadoalatemperaturaytiemponecesario.
Materiales
Sistemadefiltracin
Fuentedevaco
Membranasdefiltracinde0,45micras
Pinzasdeaceroconbordesbiselados
PacasPetriconmediodecultivoadecuado
Procedimiento
1. Flamearlasuperficiedelportafiltros
2. Colocar una membrana sobre el soporte con la ayuda de unas pinzas biseladas
previamenteflameadasconalcohol
3. Situarunembudosobreelsoportepresionandohastaqueestfijo.
4. Verterlamuestradevinoenelembudoyaplicarelvacohastaqueellquidose
hayafiltrado.
5. Romper el vaco y extraer el embudo. Con las pinzas flameadas se extrae la
membranadelsoporte.
6. Colocar la membrana en una placa Petri cobre el medio de cultivo, con la
cuadriculahaciaarriba,procuradoquenoquedenburbujasentrelamembranay
elmedio.
7. Incubarenposicininvertidaatemperaturaytiempoadecuado
8. Realizarlalecturacontandolascoloniascaractersticasencadamedio.Referirel
nmerodeUFCrespectoalvolumendevinoinicialfiltrado.
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Muestra problema
Filtracin
Levaduras
Bacterias
LosresultadosseexpresanennmerodeUFCporvolumendevinofiltrado
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