aboratorio de Microbiologa Sanitaria CIV-358

PRACTICA DE LABORATORIO N

Laboratorio Nro. 7

TCNICA DEL FILTRO DE MEMBRANA

PARA MIEMBROS DEL GRUPO COLIFORME
1

Objetivo.

Determinar la existencia de los indicadores de contaminacin fecal,

especficamente al grupo coliforme.
Conocer el desarrollo del procedimiento, caractersticas e interpretacin de
los resultados obtenidos, durante la prctica.

Introduccin

El nmero de organismos coliformes presentes en el agua puede determinarse mediante

la filtracin de volmenes especficos de la muestra a travs de filtros de membrana, que
por lo general, estn compuestos de esteres celulosa, tpicamente con poros de 0,45 mm
de dimetro que retienen bacterias coliformes presentes en la muestra.
Despus se incuban membranas vueltas hacia arriba en un medio selectivo para cada
microorganismo. En la membrana se desarrollarn colonias caractersticas que producen
cido o aldehdo, y son las que se contarn ya sea como organismos coliformes
presuntivos o bacterias coliformes fecales, segn haya sido la temperatura de
incubacin.
Puesto que la produccin de gas no se puede detectar en las membranas, se asumir que
todas las colonias que producen cido o aldehdo tambin producen gas. Sin embargo, la
formacin de gas podr demostrarse ms adelante a travs de las tcnicas de
confirmacin que se apliquen subsecuentemente. Los resultados se expresarn en
trminos del nmero de organismos por 100 ml de la muestra original.
En la prctica, la tcnica de membrana filtrante ofrece resultados comparables a los que
se obtienen con el mtodo de tubos mltiples, no obstante, si se filtra la muestra a travs
de dos membranas, y una se incuba a 35 37 C y la otra a 44 44,5 C, el
procedimiento de confirmacin se simplificar en cierto modo, ya que es posible hacer un
clculo directo del nmero de bacterias coliformes fecales presentes a la temperatura
ms elevada.
Una de las ventajas del mtodo de membrana filtrante es la prontitud con que pueden
obtenerse los resultados y, en consecuencia, se pueden llevar a cabo rpidamente
acciones correctivas y operar de nuevo en forma normal.
Esta tcnica puede aplicarse en el anlisis de casi todos los tipos de agua, excepto en la
que muestra elevada turbiedad, pues la membrana se obstruir antes de que pueda
filtrarse la cantidad suficiente, tampoco es conveniente el empleo de las membranas
cuando se trata de agua que contiene pocos organismos coliformes y muchos otros
organismos que pueden desarrollarse en los medios de cultivo empleados, y estos
ltimos organismos tendern a cubrir la membrana, interfiriendo con el crecimiento de
los del grupo coliforme.
El grupo coliforme se define respecto a esta tcnica, como aquel formado por todas las
bacterias aerobias y anaerobias facultativas, Gram negativas, no formadoras de esporas
y de forma alargada que desarrollan colonias rojas con brillo verde metlico en medios de
cultivo tipo ENDO que contiene lactosa, y se desarrollan tras incubacin a 35 C por 24
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horas.
En la tcnica de membrana filtrante se efecta un recuento directo de las colonias
individuales, pero todava estar sujeto a errores de tipo estadstico, adems del
recuento, se puede tambin analizar la morfologa de las colonias y efectuar subcultura
directa, reducindose, as, la posibilidad de que se produzcan reacciones falsas y
positivas a partir de cultivos mezclados.
Si bien solo es necesario un equipo limitado, suele ser inicialmente ms costoso que el
equipo empleado para la prueba de tubos mltiples, los filtros de membrana pueden
volver a utilizarse, siempre que no hayan sufrido daos despus de que han sido
debidamente lavados y esterilizados mediante ebullicin, y toda vez que se utilicen
nicamente con el mismo medio de cultivo, por otra parte, es preciso sealar que
diferentes membranas tienen diferentes caractersticas; por eso es importante
asegurarse de que sean adecuadas no slo para el desarrollo de los organismos que se
quiere detectar, sino tambin para las particularidades del agua que est analizndose.
Los resultados que se obtienen con la filtracin por membrana no coincidirn
necesariamente con los obtenidos a travs del mtodo de tubos mltiples, aunque en la
prctica ambos ofrecern resultados comparables, en ese sentido, es muy importante
que se lleven a cabo series adecuadas de pruebas paralelas, utilizando ambos mtodos, a
fin de precisar si la tcnica de filtracin con membrana es adecuada para el tipo de agua
que se va a analizar.
2.1 Aparatos y tcnicas de filtracin.
El aparato de filtracin consiste de un disco incrustado sostenido por empaquetaduras de
jebe de silicn y que se ajusta a una base donde puede fijarse un embudo graduado, el
disco incrustado o perforado sostiene el filtro de membrana, al momento de usarlo, el
montaje que sujeta el filtro se coloca encima de un frasco que tiene un brazo lateral
conectado a un sistema de vaco, se puede montar una serie de estos conjuntos en forma
mltiple, conectados a un mismo extractor, permitiendo de ese modo que se filtren varias
muestras a un mismo tiempo, despus que se ha filtrado el agua, se retira la membrana
y se coloca vuelta hacia arriba, ya sea en un medio de agar apropiado o sobre una
almohadilla empapada en un medio de cultivo lquido en una placa petri, para incubacin
a una temperatura adecuada.
Despus de la incubacin, debern examinarse las membranas bajo una buena
iluminacin. La apariencia de las colonias depender del medio de cultivo empleado,
pero todas las colonias caractersticas debern contarse sin tener en cuenta su tamao.
Si fuera necesario, se pueden sub cultivar colonias individuales en un medio lquido con
fines de confirmacin, o hacindolo en un medio slido para asegurar la pureza antes de
pasar a efectuar mayores pruebas de diferenciacin. Cuando se analizan muestras de
agua para determinar la presencia de organismos coliformes (coliforme total) y bacterias
coliformes fecales (Escherichia Coli presuntiva), se necesitar contar con dos membranas
separadas y con los medios de cultivo adecuados, y sern necesarios diferentes grados
de temperatura para la incubacin.
2.2 El medio de cultivo.
Los medios que se van a emplear son los siguientes:
agar m-Endo, para determinar la presencia de coliformes totales
agar m-FC, para determinar la presencia de coliformes termorresistentes
agar m-TEC, , para determinar la presencia de Escherichia Coli
2.3 La incubacin.
Para cada caso, se incubarn los medios:
Para coliformes totales: 35 C por 24 horas.
Para coliformes termorresistentes: 44.5 C por 24 horas
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Para Escherichia Coli: a 35 C por 2 horas, y luego a 44.5 C por 22 horas.

2.4 Colonias Tpicas

Las colonias tpicas que se formarn sobre los medios de cultivo, confirmando la
presencia de los microorganismos sern:
Colonias de coliformes totales color rojo con brillo verde metlico
Colonias de coliformes termorresistentes color azul pastel
Colonias de Escherichia Coli color amarillo, las cuales debern ser tratadas con un
pad que contenga 1 a 2 mL de Sustrato de Urea por 15 minutos, para confirmar si
son Escherichia Coli Klebsiella; ya que, al ser la E. Coli urea-negativa, las colonias
permanecern de color amarillo; si existe viraje a color violeta, las colonias son de
Klebsiella.
3

Material y Equipo

El material y equipo empleado fue el siguiente:

Equipo de filtracin.
Frasco Kitasato.
Bomba de vaco
Mechero Bunsen.
Estufa de incubacin.
Bao Mara.
Probetas
Pipetas.
Cajas petri.
Pinzas de punta plana
Autoclave
Filtro de membrana estril (acetato de celulosa).

Resultados obtenidos

Se pudo observar la formacin de colonias tpicas en cada medio de cultivo, para los
distintos volmenes analizados.
Con ayuda de la siguiente expresin calculamos:
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N coloniastpicas
100
volumende muestra
4.1

Coliformes Totales:

Colonias color rojo con brillo verde metlico:

Para un volumen de
4.2

mL tenemos:

UFC 2.5 x10 3 UFC 100ml

Coliformes Termorresistentes:

Colonias de color azul pastel:

Para un volumen de

4.3

mL tenemos:

UFC 2.0 x10 2 UFC 100ml

Coliformes Escherichia Coli:

Colonias de color amarillo:

Para un volumen de

mL tenemos:

UFC 1.7 x10 UFC 100ml

Conclusiones

Los resultados nos muestran la presencia de coliformes totales, lo que significa que el
consumo del agua de esta muestra representa un riesgo para la salud a personas ,
tambin podemos, mencionar la presencia de coliformes termorresistentes y Escherichia
Coli, concluyendo que esta agua presenta contaminacin fecal.
Segn la Norma Boliviana NB-512, el agua de consumo no debera contener coliformes
totales ni Escherichia Coli, (sus concentraciones normadas son de 0 UFC/100 ml, menos
de 2 NMP por cada 100 ml).

Bibliografa
http://www.service membrane_de-microbiologia.
http://trigramas.bireme.br/cgi-bin/mx/cgi=@1?
collection=LILACS.org.TiKwAb&maxrel=10&minsim=0.30&text=Filtros%20de
%20Membrana.
CALIDAD DEL AGUA, Jairo Alberto Romero Rojas, Escuela Colombiana de Ingeniera,
Segunda Edicin, 2005.
Agua Potable. Requisitos Norma Boliviana NB-512

Univ.: Richard Mamani L.

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