FACULTAD DE INGENIERA Y GESTIN AMBIENTAL

TEMA
Microbiologa Ambiental en el estudio de
microorganismos dentro de la Columna de
Winogradsky

Lic. Mic. Alexandra Muoz Blandon

CURSO
Microbiologa Ambiental

JULIO DEL 2014

Microbiologa Ambiental en el Estudio de Microorganismos
dentro de la Columna de Winogradsky
I.

OBJETIVOS:

II.

Establecer el ecosistema microbiano de sedimentos de ambientes naturales

(Lagunas de Villa I de la UCSUR) a partir de la construccin de una
columna de Winogradsky.

Reconocer e interpretar los diferentes estratos de la Columna de

Winogradsky, en base a su microbiota colonizadora y sus interrelaciones.
INTRODUCCIN:
La COLUMNA DE WINOGRADSKY es un instrumento til para estudiar y
demostrar las relaciones entre diferentes tipos de microorganismos en
comunidades mixtas, y constituye una forma de observar cmo los
microorganismos ocupan microespacios altamente especficos, de
acuerdo con sus tolerancias medioambientales y sus necesidades vitales,
como los requerimientos de carbono y energa (altamente especfico).
Adems, constituye una estupenda prctica para comprobar cmo se
establece un ecosistema microbiano, ya que se puede reproducir un
ecosistema natural en el laboratorio, correspondiente a un sedimento con
contenido orgnico de diferente origen (restos de races de plantas,
hojarasca etc.). Es, en sntesis, un sistema completo y autnomo de
reciclaje, mantenido slo por la energa lumnica.

Objetivo de la Columna de Winogradsky

Evidenciar los diferentes metabolismos bacterianos, los cuales generan
ecosistemas complejos y son los protagonistas fundamentales de los ciclos
biogeoqumicos.
III.

PARTE EXPERIMENTAL: (valeska)

III.I. Construccin de la Columna de Winogradsky
a. Materiales
-

2 cilindros de vidrio o plstico transparente.

2 hojas de papel filtro (fuente de carbono y energa para la cadena
trfica microbiana)
Sulfato de calcio
Carbonato de calcio (agente tamponador del pH)
Muestra de sedimento
Arena (color claro)
Agua destilada
Agua de charco
2 platos desechables
Restos de hojas, plantas, ramas, etc.
Papel parafilm
Papel aluminio

b. Procedimiento:

1. Tomar una muestra de sedimento o suelo (60% del volumen).

2. Cortar trozos pequeos de papel filtro.
3. 1 g de sulfato de calcio, y 1 g de carbonato de calcio, restos de hojas,
plantas, ramas, etc. Y con las trozos de papel filtro.
4. Agregar la mezcla al fondo de la columna.
5. Agregar arena.
6. Adicionar agua del lugar de donde proviene la muestra (de preferencia)
hasta casi al borde.
7. Cubrir con papel parafilm la parte superior de la columna e incubar en
presencia de la luz.
8. Realizar el mismo procedimiento desde el punto 1 a 7 con una segunda
columna que se envolver en papel aluminio para incubarla bajo
condiciones de oscuridad.
9. Haga observaciones de su columna diariamente durante una semana y
cada tercer da durante las siguientes tres semanas. Registre los
cambios macroscpicos que se presenten.
10. Mantenga el volumen de agua adicionando agua destilada en caso de
observar evaporacin.
11. Al final del experimento, observar al microscopio muestras de la
columna de agua como del sedimento.
c. Experimentacin: (Realizado el 12 de Mayo del 2014)
La muestra de sedimento fue obtenida de la laguna ubicada en Villa I de la
UCSUR (Fig.1), para lo que se utiliz baldes de 1 litro y guantes quirrgicos
al momento de retirar la muestra. Esta laguna presenta una coloracin
predominantemente verde, lo que podra indicarnos la presencia de microalgas.
El sedimento de la laguna present una coloracin gris con puntos negros,
acompaado de gravas (Fig. 2). La muestra emita un fuerte y
desagradable olor, adems de presentar una textura entre lquida y
gelatinosa. Se trat de obtener la muestra de la mayor profundidad posible
de la laguna, para as obtener gran cantidad y variedad de nutrientes y
microorganismos de la laguna. Paralelamente se extrajo una muestra del
agua de la laguna, la cual present una coloracin amarilla con pequeos
puntos marrones. (Fig.3)
Por otro lado, los restos de hojas, plantas y ramas fueron retiradas de las
reas verdes de villa I (Fig. 4), y la arena fue obtenida de la playa ubicada
en Villa 6 de la misma universidad.

Fig. 1. Obtencin de la muestra de sedimento de la laguna de Villa I de la UCSUR

Fig. 2. Muestra retirada de la laguna de Villa I de la UCSUR

Fig. 4
de agua
laguna de
la

Muestra
de la
Villa I de
UCSUR

Fig. 4. Restos de plantas, hojas y ramas

La muestra se verti en una probeta transparente de 1000 ml, hasta ocupar

un poco ms de la mitad del volumen (600 ml aproxidamente),
ayudndonos con un cucharn de plstico. A esto se le aadi la arena, los
restos de plantas, hojas y ramas, el gramo de sulfato de calcio y carbonato
de calcio (previamente pesados en la balanza elctrica), y los trozos de
papel filtro.

Por ltimo, se le aadi el agua procedente de la laguna hasta completar

los 1000 ml de la probeta, y se tap la probeta con parafilm. Esta columna
fue rotulada como COLUMNA EXPUESTA. (Fig. 5)
Parte lquida:
ml aproximadamente
Se 1000
procedi
a realizar los mismos pasos para nuestra segunda columna,
conVolumen:
la diferencia
fue tapada con papel aluminio, para evitar que
200que
ml sta
aproximadamente.
tenga
contacto
con
la
luz.
Es
conclta probeta fue rotulada como COLUMNA
Coloracin: Amarillo claro.
TESTIGO.
(Fig. ms
5) alta de la columna se puede observar pequeos restos de hojas
En la parte
Ambas columnas fueron incubadas en el invernadero de Villa 3 ubicadas en
la UCSUR.

Materia orgnica:
Volumen: 800 ml aproximadamente:
Coloracin: Marrn oscuro en los primeros centmetros y pasa a negro en la parte ms
La Materia orgnica o sedimento comienza a descender.
Fig. 5
Testigo

Columna
(izquierda) y
Columna Expuesta (derecha) dejadas a
incubacin

IV.

SEGUIMIENTO DE LA COLUMNA DE WINOGRADSKY: (Astrid)

Las columnas fueron dejadas en incubacin por 7 semanas y 3 das.
IV.I. COLUMNA EXPUESTA A LA LUZ SOLAR
-

13 de Mayo del 2014

27 de Junio del 2014

Segn lo observado el 27-06-14, la columna present 3 zonas diferenciadas:

1. Zona baja: (Materia orgnica)
-

Volumen: 650 ml aproximadamente (descendi desde el primer anlisis)

Coloracin: Entre marrn oscuro y negro.

2. Zona Intermedia:
-

Volumen: 100 ml aproximadamente (entre 650 ml y 750 ml de la probeta)

Coloracin: Present colores en
No se observaba esta fase en los primeros anlisis.

3. Zona alta: (Lquido)

-

Volumen: 300 ml aproximadamente (aument desde el primer anlisis).

Entre 750 ml y 1050 ml de la probeta (se fue aumentando agua a la columna
para mantener el volumen aproximadamente.
Coloracin: Marrn claro (cambio su coloracin desde el primer anlisis).

IV.II. COLUMNA TESTIGO

La Columna Testigo no fue

sometida
a
ningn
cambio.
El aluminio no fue retirado
hasta el da del anlisis de
las
columnas
en
el
laboratorio.

V.

ANLISIS DE RESULTADOS (MILAGROS)

V.I. ANLISIS DE LAS COLUMNAS

El anlisis de resultados se realiz el 03 de julio del 2014 en el laboratorio
de microbiologa.
Este procedimiento consisti, en primera instancia, de remover el agua de
la superficie de la columna, se verti el agua excedente en un recipiente
aparte, para luego utilizar una pipeta de 10mL para extraer el lquido
restante. Luego se utiliz un asa de siembra de ojo para sacar una muestra
y ponerla sobre una placa y observarla bajo el microscopio.
Para cada zona de color encontrada a lo largo de las columnas trabajadas,
testigo y la que fue expuesta a la luz, se realiz tincin Gram para su
observacin en el microscopio.

A. Columna expuesta
Esta columna present un total de siete fases de las que se extrajo una
muestra por fase.
La primera de stas es, la fase lquida, de agua superficial. Las siguientes
fases diversas de coloracin morada, amarilla, verde, y las dos ltimas
presentaron una coloracin marrn.
Adems, tambin se realiz la medicin de pH de la columna, donde se
obtuvo un pH 8.
OBSERVACION AL MICROSCOPIO
Se describe a continuacin lo observado en el microscopio por cada una de
las 7 fases encontradas a los largo de la columna expuesta.
1. Primera fase: Fase lquida de coloracin marrn oscura.

Se realiz un fresco de la muestra, encontrando probablemente una

diatomea, la cual fue alcanzada a observar a 10X en el microscopio.
(Fig. 6)

10 X

Fig. 6. Observacin de una diatomea de la fase lquida a 10X

2. Segunda fase:

Fase marrn

Se realiz una tincin Gram de esta fase. Observamos una coloracin

morada, lo que indica la presencia de bacterias del tipo Gram positivo, y
por la forma observada, estas son bacterias Beggiatoas. (Fig. 7)

10

Adems, se observaron formas alargadas, que podran indicar la

presencia de estreptobacilos. (Fig. 7)

100 X

Estreptobacilos
Beggiatoa

Fig. 7. Observacin de Beggiatoas y estreptobacilos a 100X

3. Tercera fase:

Fase morada

Se realiz una tincin Gram de esta fase. Observamos una coloracin

morada, lo que indica la presencia de bacterias del tipo Gram positivo, y
por la forma observada, se determin la presencia de esporas. (Fig. 8)

11

40X

Esporas

Fig. 8.

Observacin de Esporas a 40X

4. Cuarta fase:

Fase amarilla

Se realiz una tincin Gram de esta fase. Observamos una coloracin

rosada lo que indica la presencia de una bacteria Gram negativa. Tambin
se observ la posible presencia de micelios, constituyentes del cuerpo
vegetativo de un hongo. (Fig. 9)

12

100X

Fig. 9. Observacin de bacterias Gram y posible presencia de hongo

vegetativo
5. Quinta fase:

Fase verde

Se realiz una tincin Gram de esta fase. Observamos una coloracin

morada, lo que indica la presencia de bacterias del tipo Gram positivo.
Adems, se observ presencia de bacilos. (Fig. 10)

13

10X

Bacilo
s

Fig. 10. Observacin de bacterias Gram + y bacilos

6. Sexta y Sptima fase:

Fase marrn oscura y negra

Se realiz una tincin Gram de esta fase. Observamos una coloracin

morada, lo que indica la presencia de bacterias del tipo Gram positivo, y
probablemente la presencia de Clostridium, bacterias anaerobias (Fig. 11)

14

10X

Fig. 11. Observacin de bacterias Gram + y Clostridium

B. Columna testigo
Esta columna present un total de cinco fases.
Slo 3 de ellas fueron evidentemente
diferenciadas.
La primera de stas, es la fase lquida o fase
superficial. La fase 2 y 3 presentaron una
coloracin marrn y las restantes, y poco
distinguidas, presentaron una coloracin ms
oscura que las anteriores.

Se realiz medicin del pH de la columna testigo,

para lo que se obtuvo un pH igual a 8.
2y3

FASE 1: Fase lquida de coloracin

amarrilla. (Ocupa 200 ml
aproximadamente)
FASE 2 Y 3: Materia orgnica de
coloracin marrn. (Ocupa 300 ml
aproximadamente)

4y5

FASE 4 Y 5: Materia orgnica de

coloracin marrn oscuro. (Ocupa
500 ml aproximadamente)

15

OBSERVACION AL MICROSCOPIO
1. Primera fase: Fase liquida

Se realiz un fresco de la muestra y pudimos observar filamentos

cilndricos que hacan evidenciar la presencia de hifas dentro de la
muestra. (Fig. 12)

40X

Filamentos cilndricos

Fig. 12. Observacin de filamentos cilndricos a 40X

16

2. Segunda fase: Marrn

Entre 760 ml y 650 ml

Se realiz una tincin Gram, donde se observ una coloracin morada,

lo que indica la presencia de bacterias Gram positivas (Fig. 13)

40X

Fig. 13. Observacin de bacterias Gram + de la segunda fase de la

columna testigo

3. Tercera fase: Marrn

17

Entre 650 ml y 500 ml

Se realiz una tincin Gram, donde se observ una coloracin morada,

lo que indica la presencia de bacterias Gram positivas y, por las formas
observadas, la posible presencia de esporas. (Fig. 14)

40X

Fig. 14. Observacin de bacterias Gram + y esporas

4. Cuarta fase: Marrn oscuro.

Entre 500 ml y 300 ml

18

Se realiz un fresco de esta fase. Se encontr filamentos pequeos,

pertenecientes probablemente a la estructura vegetativa de algn
hongo. (Fig. 15)

10X

Fig. 15. Observacin de filamentos

5. Quinta fase: Marrn oscuro.

ltimos 300 ml

19

Se realiz una tincin Gram, donde se observ una coloracin morada, lo

que indica la presencia de bacterias Gram positivas y, por las formas
observadas, se detect la presencia de esporas. (Fig. 16)

40X

Fig. 16. Observacin de filamentos

En ambas columnas se observaron presencia de macroporos, lo que indica

desprendimiento de gases por las bacterias debido a su metabolismo.
Estos macroporos se observaron en mayor cantidad en la columna
expuesta a los rayos solares.
Cada zona de las columnas analizadas fueron estriadas en 4 placas de
petri y analizadas al siguiente da mediante tincin de Gram y tincin de
Esporas.
1. Zona de la superficie aerobia de la Columna Normal o Expuesta (N)
y Testigo (T)

20

2. Zona media o mitad aerobia de la Columna Normal o Expuesta (N) y

Testigo (T).
3. Zona media o mitad anaerobia de la Columna Normal o Expuesta
(N) y Testigo (T).
4. ltima zona anaerobia de la Columna Normal o Expuesta (N) y
Testigo (T).

SUPERFICIE AEROBIA

MITAD AEROBIA

21

MITAD ANAEROBIA

FONDO ANAEROBIA

22

V.II. ANLISIS DE LAS PLACAS PETRI (04/07/14)

a. Superficie Aerobia
-

Columna Normal o Expuesta (N)

Se realiz tincin de espora, donde se pudo observar la presencia de

esporas con coloracin azul.
-

Columna Testigo (T)

23

Se realiz tincin de espora, donde se pudo observar la presencia de

esporas con coloracin azul.
b. Mitad Aerobio
-

Columna Normal o Expuesta (N)

Espor
as

Bacil
os

Se realiz tincin de espora, donde se pudo observar la presencia de

esporas con coloracin azul y bacilos, en forma de palos alargados
verdes.
-

Columna Testigo (T)

Cuando se le someti a Tincin de espora, se observ presencia de
esporas, como pequeos puntos verdes.

24

Cuando se le someti a Tincin de Gram, se pudo observar la presencia

de bacilos y esporas.

c. Mitad Anaerobio
-

Columna Normal o Expuesta (N)

Cuando se le someti a Tincin de espora, se observ presencia de
esporas, como pequeos puntos verdes y bacilos, como palos
alargados rojos.

Espor
as

Bacil
os

Cuando se le someti a Tincin de Gram, se pudo observar la presencia

de bacilos, esporas y cocos.

25

Columna Testigo (T)

Cuando se le someti a Tincin de Gram, se pudo observar la presencia
de bacilos y cilios.

VI.

CONCLUSIONES:
Han proliferado organismos anaerobios, debido a que la columna fue
sellada y nunca fue removida, por lo que no hay forma que su
contenido haya sido oxigenado.
En cada paso del ciclo de los elementos que se observan dentro de la
columna siempre est implicado algn grupo de organismos.

26

 Un microorganismo particular y sus productos metablicos suele servir

como fuente de nutrientes esenciales para otros organismos,
generndose una red trfica dentro de la columna.
Los procesos bioqumicos utilizados por estos microorganismos para
obtener energa (ATP y poder reductor) y fuente de carbono son los
mecanismos ms eficientes para sortear las condiciones
fisicoqumicas adversas imperantes en estos hbitats.
El nico requerimiento es la fuente de carbono orgnico para generar
los productos de la fermentacin necesarios para las sulfo-reductoras.
Esta columna es un sistema completo y autnomo de reciclamiento,
mantenido slo por la energa de la luz.
Hemos diferenciado los grupos microbianos presentes en un
microambiente tambin pudimos comparar los microorganismos que
crecen a lo largo de la columna en diferentes tiempos, relacionando la
diversidad microbiana presente en un microambiente con algunas de
sus caractersticas fisiolgicas.
Esto es una clsica demostracin de cmo los microorganismos
ocupan micro-sitio muy especfico de acuerdo a su medio ambiente y
sus tolerancias de carbono y las necesidades de energa.
El oxgeno difunde desde la superficie, creando condiciones similares
a las que existe en un largo sedimento ricos en nutrientes.
Con la luz se reproduce la penetracin de la luz solar en la regin
inferior anaerbica, para facilitar el desarrollo, de los microorganismos
fotosintticos anoxignicos y en la parte ms alta se pueden ver
cianobacterias.

VII.

DISCUSIONES:
Al comparar las columnas con las de los dems grupos de estudio,
obtuvimos coloraciones distintas en la estructura de la columna. Much de
esta diferenciacin se debe al tipo de suelo utilizado para la muestra de
nuestra columna.
La coloracin morada es debido a la accin de la Cromatium y a sus
cmulos, debido a sus compuestos carotenoidicos como la okenona (caso
especial es la especie Cromatium okenii.), la cual se puede observar en el
trabajo de Jos L. Perez (2008).
Los ciclos biogeoqumicos, como el del azufre, se observaron de la misma
forma ms de no de la misma particularidad con las dems columnas Jos
L. Perez (2008).

27

VIII.

CUESTIONARIO:
a. Por qu se adiciona el sulfato de calcio a la muestra de sedimento?
Funciona como base de sulfato. Se liberan sulfuros que difunden a la
zona superior oxigenada creando un gradiente en el que se desarrollan
bacterias fotosintticas que utilizan el azufre. Por encima de esta zona
pueden desarrollarse las bacterias purpuras que no utilizan azufre.
Cianobacterias crecen en la parte superior y liberan oxigeno que
mantiene aerobia esta zona.
b. Cul es la funcin de los restos de hojas, plantas, ramas, etc, en la
columna?
La funcin de los restos de hojas, plantas, ramas y dems en la
columna, es simular la materia orgnica que se encuentra de forma
natural en el ambiente. As logrando una simulacin ms real que se
puede dar de forma natural en el medio. Adems la materia orgnica
promueve el crecimiento de microorganismos y para algunos de estos
sirve como nutriente.
c. Por qu razn la columna testigo se mantiene en la oscuridad durante
el transcurso del experimento?
Esta columna se mantiene en la oscuridad con el fin de poder
determinar si en sta podrn proliferar microorganismos en la misma
cantidad o menor cantidad que en la columna expuesta a la luz solas.
Por otro lado, la columna en mencin se mantiene tapada para evitar la
evaporacin.
Adems, esta columna simula un micro-ecosistema o microambiente
que ilustra cmo los microorganismos ocupan micro-espacios altamente
especficos de acuerdo con sus necesidades vitales, tales como:
requerimientos de carbono, energa y oxgeno, as como la
interdependencia, prescindiendo de la energa solar.

28

IX.

ANEXOS
Organismos encontrados en cada fase de la Columna expuesta a la luz
solar

29

X.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS:

Obtenido de:
http://www.redalyc.org/pdf/920/92050311.pdf,
Jos Pedro Lpez Prez, Murcia.

2008,

Atlas,

R.M.y R.
Bartha.
2001. Ecologa microbiana y microbiologa ambiental. Ed. Addison Wesley.

30