PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

BIO 226E
AO 2016

TCNICAS DE DIAGNOSTICO MOLECULAR DE ENFERMEDADES HEREDITARIAS

INTRODUCCIN
Las tcnicas de diagnstico molecular para la deteccin de mutaciones o
polimorfismos, se basan en los cambios que genera un cambio nucleotdico en las
propiedades fsico qumicas de la molcula de DNA. Los cambios nucleotdicos,
deleciones e inserciones alteran la estructura primaria del DNA. Estos cambios
pueden alterar las propiedades de apareamiento complementario, su tamao, generar
o eliminar sitios de corte de enzimas de restriccin, siendo todas estas alteraciones
reflejadas finalmente en su movilidad electrofortica.
OBJETIVO GENERAL
Familiarizar a los alumnos con tcnicas bsicas de diagnstico gentico, como son el
PCR, el uso de enzimas de restriccin y la tcnica de heterodobletes (HDX), en
conjunto con electroforesis.
Muestras problema: Usted dispondr de la muestra de una paciente con cncer de
mama hereditario y dos familiares. Mediante el uso de electroforesis, deber detectar
mutaciones en los genes BRCA1, BRCA2, usando enzimas de restriccin y la tcnica de
heterodobletes.

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I. DIGESTIN CON ENZIMA DE RESTRICCIN: DETECCION DIRECTA DE UNA

MUTACIN QUE ALTERA UN SITIO DE RESTRICCIN.
Las enzimas de restriccin (ER) son endonucleasas que reconocen secuencias
especficas del DNA. Existen distintos tipos de ER, segn sea el tipo de secuencia
conocida y el lugar de corte. El uso de ER en la deteccin de mutaciones ha sido
ampliamente difundido en el diagnstico molecular. Es importante destacar que para
utilizar esta metodologa el cambio en el DNA debe ser conocido previamente al igual
que el patrn de digestin que se obtendr.
OBJETIVO: Detectar mutaciones y polimorfismos conocidos que hacen perder o ganar
sitios de restriccin.
PROCEDIMIENTO: Usando la tcnica de PCR se amplifica el fragmento seleccionado,
luego el producto de PCR se incuba en presencia del enzima de inters y finalmente se
el producto de la digestin se resuelve mediante electroforesis en gel de agarosa.
Con esta tcnica se analizarn muestras de pacientes con cncer de mama que
presentan mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2. Para esto se le entregarn 6
tubos de los miembros de una familia cuyo DNA ha sido tratado con dos ER
distintas (en tubos distintos) segn los siguientes protocolos:
A. Deteccin de una mutacin presente en el gen BRCA1 con enzima BstNI.
Amortiguador 10X (enzima restriccin BstNI)
BSA (100 mg/ml)
Enzima BstNI (10.000 U/ ml)
H2O
producto de PCR
Volumen total.

Incubar en bao termorregulado a 60C por 4 horas.

5 l
0,5 l
0,5 l
33 l
20 l
50 l

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B. Deteccin de la variante allica presente en el gen BRCA2 con enzima MaeIII.

Amortiguador 10X (enzima restriccin MaeIII)
Enzima MaeIII (10.000 U / ml)
H2O
Producto de PCR
Volumen total.

5 l
0,1 l
24,9 l
20 l
50 l

Incubar en bao termorregulado a 55C por 4 horas.

C. Electroforesis en gel de NuSieve agarosa al 2,5%.

Agregue 1 l de amortiguador de carga 10X a 9 l de producto de la digestin

por ER. Cuidadosamente cargue todo el volumen de cada muestra en los
bolsillos del gel utilizando una micropipeta.
Tapar la cmara horizontal y conectar a la fuente de poder verificando la
polaridad.
Seleccionar el voltaje en 90 V y el tiempo de acuerdo al tamao del fragmento
de DNA que se est analizando (1 hora).

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II. ANLISIS DE DETECCIN DE MUTACIONES PUNTUALES Y POLIMORFISMOS

MEDIANTE LA TCNICA DE HETERODOBLETES (HDX).
El anlisis de heterodobletes se basa en el retardo de la migracin
electrofretica del heterodoblete de DNA, en comparacin a su homodoblete
correspondiente, en un gel de poliacrilamida parcialmente desnaturante.
La tcnica de anlisis por heterodobletes permite analizar en forma ptima
fragmentos que tienen entre 500 y 700 pares de bases, y es ms efectivo cuando el
DNA tiene un bajo contenido de GC (Guanina y Citosina).
En esta tcnica, el producto de PCR del gen que se est analizando es
desnaturado a 95C y luego renaturado lentamente a temperatura ambiente. Durante
el proceso de enfriamiento, las hebras de DNA complementarias se aparean formando
homodobletes de DNA; las hebras parcialmente complementarias tambin se aparean
formando heterodobletes de DNA. Debido a que en el heterodoblete hay segmentos
donde las hebras de DNA no se aparean, presenta una conformacin diferente al
homodoblete, y como consecuencia se mueve ms lento durante la electroforesis.
La formacin del heterodoblete y su estabilidad dependen principalmente del
tipo de mutacin que presente el fragmento de DNA analizado. Inserciones y
deleciones de ms de un nucletido son ms sensibles a la temperatura, a los
solventes y a la fuerza inica del amortiguador.

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PROTOCOLO.
A. Se le entregarn tubos que contienen las muestras de la paciente con cncer
mama, y sus familiares en las cuales ya se ha amplificado partes de los genes a
estudiar.
B. Prepare las muestras a cargar en el gel de la siguiente manera:
Alicuotar el producto de PCR de cada muestra por separado (preparado
previamente).
Agregar 2,2 l de amortiguador HMA 10X a cada muestra.
Desnaturar las muestras en bao Mara por 5 minutos a 95C.
Dejar enfriar lentamente en el bao hasta que la temperatura del agua llegue a
37C.
Agregar 5 l de solucin de carga 10X y cargar las cantidades como se lo
indique su ayudante.
C. Electroforesis en gel de poliacrilamida.
Los geles han sido preparados previamente, continuando usted con los siguientes
pasos:

Limpiar los bolsillos con pipeta Pasteur y amortiguador, antes de cargar las
muestras preparadas.
Tapar la cmara vertical y conectar a la fuente de poder verificando la
polaridad (positivo y negativo).

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Seleccionar el voltaje en 90 V y el tiempo de acuerdo al tamao del fragmento

de DNA que se est analizando (1,5 hora).

6. Tincin del gel.

En esta etapa pida ayuda a su ayudante:
Una vez terminada la electroforesis, desmontar los vidrios de la cmara.
Separar los vidrios con cuidado para no romper el gel.
Depositar el gel en una cubeta forrada con papel aluminio y agregar una
solucin de tincin con el componente GelRed 3X, en TBE 1X.
Dejar incubando en la solucin por 10 minutos a oscuras y posteriormente
observar el gel en un transiluminador UV.

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III. Anlisis de secuencias de DNA

La secuenciacin de DNA consiste en la sntesis enzimtica de hebras de DNA en
presencia de didesoxinucletidos trifosfato (ddNTPs), los cuales actan como
terminadores de la elongacin de la cadena de DNA naciente. Los
ddNTPs
son anlogos de los desoxinucletidos trifosfato (dNTPs) que participan
normalmente en la sntesis de DNA, pero se diferencian de stos en que carecen del
grupo hidroxilo en la posicin 3 (Figura 1). Un ddNTP puede ser incorporado a una
cadena de DNA naciente mediante la formacin de un enlace fosfodister entre su
grupo hidroxilo-5 y el hidroxilo-3 del ltimo dNTP de la cadena, pero impide la
unin del prximo dNTP, provocando as la terminacin prematura de la sntesis de
la nueva cadena de DNA.
A
B
_

Figura 1: A. Estructura de un desoxinucletido trifosfato (dNTP). B. Estructura de un

didesoxinucletido trifosfato (ddNTP).

En esta tcnica se utiliza un partidor marcado en su extremo 5 el cual se une a la

hebra de DNA que se desea secuenciar. El partidor es elongado por la DNA
Polimerasa en cuatro reacciones separadas que contienen los cuatro dNTPs
normales y, adems uno de los cuatro ddNTPs en una menor concentracin.
Una molcula de ddNTP puede ser incorporada al azar en cualquiera
de las posiciones correspondientes a su dNTP anlogo, y cuando esto ocurre,
se detiene la elongacin de la cadena. De esta forma, cada una de las cuatro
reacciones produce una mezcla de cadenas de DNA terminadas prematuramente
y de distinta longitud, con un extremo 5 comn (determinado por la unin del
partidor a una regin especfica de la hebra de DNA molde) y un extremo 3
variable, que depende de la posicin en la que fue incorporado el ddNTP. Los
fragmentos resultantes que pueden variar en solo un nucletido, pueden ser
separados mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida desnaturante y
la secuencia puede ser leda luego de exponer el gel a una pelcula
autorradiogrfica.

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A. Las 4 reacciones de terminacin de la cadena se realizan en un mismo tubo,

con cada uno de los 4 ddNTPs marcados con distintos fluorforos. En el
secuenciador automtico, las bandas del gel de electroforesis son atravesadas
por un lser que excita la marca fluorescente, la luz emitida es detectada por un
fotomultiplicador, el cual est conectado a un computador que colecta y analiza
los datos.
B. Electroferograma de una secuencia automtica. La secuencia es representada
por una serie de picos de distintos colores, cada uno correspondiente a la
posicin de un nucletido.

Procedimiento:
Usted recibir un electroferograma correspondiente a la mutacin encontrada en la
familia analizada por usted. Lea cuidadosamente la secuencia de DNA anotando los
cambios nucleotdicos encontrados y comparando con la secuencia patrn.