Crystal structure of the lambda repressor and a model for

pairwise cooperative operator binding.

Stayrook, S.E., Jaru-Ampornpan, P., Ni, J., Hochschild, A., Lewis, M.
Journal: (2008) Nature 452: 1022-1025

N-Terminal CI

DNA

Inmunidad a la Superinfeccin
Durante la lisogenia:
. Represor CI

Previene la transcripcin de genes de O por unin a los sitios operadores

Previene la re-infeccin por otro fago por unin a sus sitios operadores

. Bacteria Lisognica Inmune a la superinfeccin con O

Puede ser infectada con otros fagos con sitios
operadores diferentes (CI no puede unirse)

FAGOS
. Heteroinmunes Secuencias operadoras diferentes
. Homoinmunes

Secuencias operadoras iguales

(Independientemente de la similitud o diferencia en el resto de los genes)

Induccin del fago O

. Profago ADN de la clula hospedadora sufre un dao severo por irradiacin o qumicos
Induccin del profago Ciclo Ltico
Proceso de
Reparacin

Auto-

Induccin del fago O- Protena Cro

. Temprano durante la Induccin Continua la sntesis del Represor CI:
Interfiere con el desarrollo ltico
Podra provocar el reestablecimiento de la lisogenia
. Cro previene la sntesis de CI

- Previene la represin por CI

- Activa su propia sntesis

- Previene la unin de CI
- = Operadores OL
- pL no reprimido
Sntesis de Int y Xis

Affinity of oR for Cro: oR3 > oR2 = oR1

Unin de la protena Cro a la regin operadora del ADN

Induccin del fago O Escisin 

. Represor sin accin Transcripcin a partir de pL y pR Escisin del ADN O del cromosoma
. Recombinacin sitio especfica Sitios hbridos attP-attB Int y Xis (luego de la Induccin)

- Transcripcin conjunta
- Xis no es necesaria
- Provocara la escisin
luego de la integracin
Exonucleasa 3-5
Regulacin
postranscripcional

Activacin
por CII

No hay secuencia nutL

No se une N

Retro-regulacin
Regulacin por secuencias
downstream
(mutaciones estabilizan el ARNm)

. Int/Xis Escisin ADN

. O y P se transcriben (pR)
. Replicacin de O ADN
. ADN daado (min) Ciclo ltico

. Nivel CI
. Lisis celular 100 fagos (1h)
(medio y temp)

Competicin entre Ciclo Ltico y Lisognico

No hay CI

Competencia entre el
activador CII y Cro

(MOI Estado metablico de la clula

Medio de crecimiento temp)

(0,1%)

Medio rico
Proteasas
Se degrada CII

Medio pobre
Proteasas
No se degrada CII

DNA dilutes out the CI repressor

ARN antisentido
activado por CII

Competicin entre Ciclo Ltico y Lisognico

Table 8.3

Steps leading to lytic growth and lysogeny

Steps leading to lytic growth

Steps leading to lysogeny

1. Transcription from pL and pR

1. Same as for lytic growth

2. N and Cro are made

2. Same as for lytic growth

3. N allows CII expression

3. Same as for lytic growth

4. CII degraded

4. CII stable

5. Low CII concentration means

5a. High CII concentration activates pI, and

that little CI is made

so Int is made and O DNA integrates

5b. High CII concentration activates pRE,

6. Cro binds at OR3 and OL3,

blocking binding by any low
level of CI that is made
7. Meanwhile, N allows O and P
replication gen transcription
8. A second antiterminator, Q, allows

late-gene transcription, and so O

phage particles are made

and so CI is made
6. CI outcompetes Cro, and so CI binding at
OR3 and OL3 both represses pL and pR
and positively autoregulates at pRM,
mantaining lysogeny

Transduccin Especializada
. Transduccin generalizada el fago porta y puede transducir DNA de la clulas hospedadora
(cualquier regin y solo ADN de la clula)
. Transduccin especializada el fago porta solo genes cercanos a la regin de attachment
(transporta tanto genes de la clula como fgicos)

. Part. transductantes muy raras Potentes tcnicas de seleccin

. Recipiente Gal- medios con Galactosa como nica fuente de C

. Raras transductantes Gal+ integrado el O con genes gal

. Transductantes Gal+ Aislado de colonia HFT lisate
. Fago helper wt

Transduccin Especializada

Di-lisgeno

Otros fagos que forman lisgenos (P2, P4, Mu)

Utilizacin de la forma lisognica de fagos como vectores de clonado

. Fagos atemperados pueden multiplicarse como fagos grandes cantidades de ADN
. Se integra al cromosoma Estudios de complementacin (2 copias del mismo gen)
. Facilita el mapeo gentico y reemplazo de genes:
- Fago sin sitio att con un fcil marcador de seleccin (ATBR)
- Mapeo gentico genes sin fenotipo
- Gen de inters clonado en el ADN del fago
- Se introduce por empaquetamiento in vitro en infeccin o transfeccin
- Recombinacin

Conversin Lisognica y Patognesis Bacteriana

Como los fagos pueden contribuir a la patogenicidad de bacterias

. Profagos pueden portar factores de virulencia o toxinas Patogenia de la bacteria lisognica

. Morons (more DNA): Se pueden expresar a partir de su propio promotor aunque otros genes
del fago estn reprimidos
Ejemplos

. E. coli y Disentera: Toxina Shiga (diarrea hemorrgica) I361 E. coli O157:H7

. Corynebacterium diphtheriae (difteria) Lisgeno de fago E gen tox Enzima que mata la cl. eucariota
. Vibrio cholerae (clera) STXI fago filamentoso ssADN genes stx2A y stx2B
. Clostridium botulismo y ttanos

Experimentos Genticos con fago O

Gentica de la Lisogenia de O

. Lisgeno O placas cloudy Debido al crecimiento del lisgeno inmune a infeccin

. Fcil identificacin de mutantes involucradas en la lisogenia Placas claras
Mutantes de tipo C

. Test de Complementacin

Infeccin con 2 fagos mutantes (ambos forman placas claras)

Plaqueo
Monitoreo de formacin de lisgeno
Inmunidad a la infeccin

. Identificacin de mutantes: cI, cII, cIII, Int (trans), vir (oR y oL) (cis)
- CII y CIII necesarias para generar el lisgeno, pero no para mantenerlo
- CI estrictamente requerido para generar y mantener el lisgeno

Experimentos Genticos con fago O

Gentica del represor CI
. Protena Modular (dominios con funciones separables)
. CI primer protena identificada con dominios separables
- C-term Unin a otro monmero dmero
- N-term Unin al ADN
. Experimentos de Complementacin Intragnica
- Clula lisognica con un profago con una mutacin termosensible en cI
- Infectado con fagos con diferentes mutaciones termosensible en cI

- A TEMP. NO PERMISIVA
Lisis Represor CI inactivado
Lisgeno mutaciones complementarias
(slo unas pocas bacterias)
. Mutaciones C-terminal Unin al ADN
N-terminal Formacin de dmero

Experimentos Genticos con fago O

Gentica del represor CI

Experimentos Genticos con fago O

Aislamiento y mapeo de mutantes O nut
. Sitios nut Antiterminacin N
. Mutantes previenen la unin N ARNm se despega la RNApol se frena la transcripcin
. Mutantes nutL raras (genes gam y red, no esenciales)
. Mutantes nutR letales (genes O y P, esenciales)
. Mutantes raras Seleccin positiva:
- Fagos con mutaciones nutL placas
- Fagos wt
no placas
E. coli lisgeno con fago P2 no pueden ser infectados con O wt
Red y Gam (O) Old (P2) Mata a la clula
. Mut nutL (previenen transcrip. gam y red) placas
. wt no placas (mata la clula)
. Mut gam red placas

Aislamiento y mapeo de mutantes O nut

Plaqueo de millones de Omutagenizados sobre
El lisgeno del fago P2
algunas placas mut nutL
. Doble mutantes No frecuentes
. Deleciones ms frecuentes
. Mutgeno Provoca mutaciones puntuales
. Mapeo gentico (tL1)

Experimentos Genticos con fago O

O
Aislamiento de mutantes O nut Mapeo Gentico
. Coleccin Opbio genes Oreemplazados por
genes de E. coli (bio)
. Mutantes (gam red o nutL)
- Crecen en lisgenos P2 (fenotipo)
- Cruza con fago Odonde los genes
gam y red son sustitudos por bio
- Infeccin en E. coli RecA(no se forman concatemeros)
. Recombinantes Red+ Gam+ Placas en
E. coli RecA. Mutantes en N (trans)
. Mutantes en nut (cis)

Experimentos Genticos con fago O

Aislamiento de mutantes nus en el hospedador (Concepto de seleccin gentica)
. Mutaciones nus afectan la anti-terminacin por N (Prot. N no puede actuar sola)
. Mutaciones nus Raras
No hay anti-terminacin

Seleccin positiva: Clula con un profago

Induccin de O wt mata a la clula
Induccin de mutantes en N la clula sobrevive (no Sint. de P)
Mutantes nus la clula sobrevive
Reducir la frecuencia de otro tipo de mutaciones ms frecuentes

. E.coli lisognica fago mutante en CI (termosensible):

. Se induce por temp
. Se cultiva a temp permisiva
. Pocas bacterias sobreviven forman colonias

. Mut nus
. Mut N en el profago
. Bacterias curadas del fago

. Mutantes en el fago por delecin mata a la clula pero no se escinde

. Lisgeno con dos copias del profago (frecuencia de una doble mutacin menos probable)

. Mapeo por Hfr y trasduccin mutantes en el cromosoma de E. coli y no en el profago

Identificacin de nusA, nusB, etc
Terminacin de la transcripcin y anti-terminacin
del hospedador no infectado